56(3)-14(하성호040).fm

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1 Korean Chem. Eng. Res., 56(3), (2018) PISSN X, EISSN 미세조류로부터의에너지효율적인 Astaxanthin 회수기술개발 김선영 오유관 *, 하성호 한남대학교화공신소재공학과 대전광역시유성구유성대로 1646 * 부산대학교화공생명공학부 부산광역시금정구부산대학로 63 번길 2 (2018 년 4 월 10 일접수, 2018 년 5 월 4 일수정본접수, 2018 년 5 월 8 일채택 ) Recovery of Astaxanthin from microalgae Using Simple and Energy-efficient Method Sun Young Kim, You-Kwan Oh*, and Sung Ho Ha Department of Advanced Materials & Chemical Engineering, Hannam University, 1646, Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon, 34054, Korea * Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Pusan National University, 2, Busandaehak-ro 63beon-gil, Geumjeong-gu, Busan, 46241, Korea (Received 10 April 2018; Received in revised form 4 May 2018; accepted 8 May 2018) 요 약 강력한항산화물질인 astaxanthin 의함량이다른천연공급원에비해높아 astaxanthin 생산균주로주목받고있는 Haematococcus pluvialis 는상당한두께의견고한세포벽을가지고있어, 세포파쇄를위해많은에너지가소모되고비용이비싼방법들이이용되고있다. 이에 H. pluvialis 로부터막자와막자사발을이용하여 astaxanthin 을손쉽게효율적으로추출하는방법을제시하였다. 막자와막자사발을이용하여분쇄한후추출용매로 acetonitrile, acetone, methanol, dichloromethane : methanol (1:3, v/v), ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 로사용하여비교하였을때, acetone 을이용하였을때 astaxanthin 을 1.13~1.29 배더높은효율로추출할수있었다. 또한 acetone 으로 H. pluvialis 로부터추출할경우, 1 차추출로 H. pluvialis 에축적되어있는전체 astaxanthin 의 96.7% 를회수할수있을정도로 acetone 은 astaxanthin 추출효율이높았다. H. pluvialis 가세포내에축적하는 astaxanthin 은축적특성상 ester- 형태의 astaxanthin 로다량축적하므로, 추출물내의다양한형태의 astaxanthin 을분리하기위하여농도구배시스템을적용한 HPLC 분석을수행하였다. H. pluvialis 에축적되어있는전체 astaxanthin 중 free astaxanthin 이 45.9% 이고, 나머지 54.1% 는 ester- 형태의 astaxanthin 이었다. Abstract The astaxanthin recovery efficiencies were compared in acetonitrile, acetone, methanol, dichloromethane : methanol (1:3, v/v) and ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) as a extraction solvent after the grinding of the H. pluvialis cells. The astaxanthin extraction yield in acetone was 1.13~1.29 times higher than other extraction solvents. It was also found that 96.7% of astaxanthin accumulated in H. pluvialis could be recovered by a single extraction. Since astaxanthin exists mainly as astaxanthin esters in H. pluvialis, a gradient reversed-phase HPLC analysis was carried out for the separation of astaxanthin esters from the extracts of H. pluvialis. Among the astaxanthin inside the H. pluvialis cell, free astaxanthin was 45.9% and astaxanthin esters were the rest. Key words: Astaxanthin, Haematococcus pluvialis, Solvent extraction, Efficiency 1. 서론 현대사회는고령화인구의증가로건강에대한관심이증가하면서삶의질향상뿐만아니라노화억제와질병치료에많은관심을가 To whom correspondence should be addressed. This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 지고있다. 이로인해기능성식품과천연물, 항산화물질에대한관심이증가하고있다. 그중 ketocarotenoid계적색소인 astaxanthin (3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione) 은다른카로티노이드보다최소한 10배이상, 지용성 vitamin E인 α-토코페롤 (α-tocopherol) 보다는 550배이상의항산화활성을가지는강력한항산화물질로알려져있다 [1-4]. 이는 astaxanthin의기본구조에서 C-4와 C-4 에위치한 oxo 그룹때문인것으로보고되어있다 [1]. 특히, astaxanthin은자외선조사로부터피부를방어할수있고, 노화와관련되는망막 376

2 미세조류로부터의에너지효율적인 Astaxanthin 회수기술개발 377 황반의퇴화를개선할수있고, 화학물질에의해발생하는암으로부터방어할수있으며, 고밀도지방단백을증가시키고, 면역시스템강화등의여러다양한기능성이입증되면서기능성식품, 화장품등에사용되면서생물학적응용에대한연구가증가되고있고, 특히의약품이나화장품, 식품산업등에서그소재로서의활용이기대되고있는물질이다 [2,5,6]. 현재사용되는대부분의 astaxanthin은화학적으로합성되는데, 자연계에서생산되는천연 astaxanthin에비해항산화력이낮고생체흡수율또한낮다는단점을가지고있다 [7,8]. 또한높은합성비용과식품안전에대한우려로인한자연식품에대한수요증가로천연 astaxanthin 에대한연구가최근들어활발하게진행되고있다 [8]. 게, 새우등의갑각류나효모, 해양생물등이 astaxanthin의천연공급원이다. 갑각류에서추출된 astaxanthin은추출이쉬운장점은있으나높은회분및키틴함량으로사용이제한되고있다. 효모 Phaffia rhodozyma는소량의 astaxanthin을함유하고생체이용률이낮은형태만을생산하여현재동물사료로만활용되고있는실정이다 [9]. 광합성미생물중의하나인녹색단세포미세조류 (unicellular green microalgae) 인 Haematococcus pluvialis는최근들어주목받는 astaxanthin의생산균주로, astaxanthin의함량이 1.5~3% 수준으로상업적으로이용되고있는 Euphausia pacifica ( 크릴새우, ~120 ppm) 나 Pandalus borealis ( 북극새우, ~1,200 ppm) 와같은다른공급원에비해높은함량 (~40,000 ppm) 을보일뿐만아니라생체내에서안정한형태의 astaxanthin를 95% 이상생산한다 [4,8,10]. 외부환경조건에따라 H. pluvialis는크게두가지형태, 녹색의영양세포형태 (green vegetative cells) 와붉은색의휴면포낭세포형태 (red cyst cells) 로나누어진다 [11,12]. 우호적환경에서는두개의편모를가지고유영하는녹색의영양세포가안정적으로성장하다가, 질소원고갈, 고광도조사, 높은온도등과같은비우호적인환경에노출되면녹색의세포들이이동성이없는붉은색의휴면포낭세포로전환하며, 이때 2차대사산물로 astaxanthin을다량축적한다 [13-15]. 한편상당한두께의견고한세포벽을가진 H. pluvialis로부터 astaxanthin을추출하기위하여 homogenation, sonication, microwave, supercritical fluid 등을이용한공정들이보고되고있으나고온고압의환경과많은에너지를필요로하는장치의사용이라는단점들이있다 [16]. 그러므로, 고가의장치없이 H. pluvialis로부터 astaxanthin 을손쉽게추출할수있는방법의시도가필요하다. 이에본연구에서는의약품, 화장품, 식품등에서여러가지다양한기능성이입증되고있는 astaxanthin이높은함량으로축적되어있는 Haematococcus pluvialis로부터유기용매를이용하여 astaxanthin을손쉽게효율적으로추출하기위한방법을시도하였고, 추출횟수에따른추출효율의영향또한알아보았다. Astaxanthin의함량을분석하는방법으로분광광도법과 HPLC 분석방법을확립하여, H. pluvialis로부터추출한 astaxanthin의잔존함량을비교분석하였다. 2. 실험 2-1. 실험재료본연구에사용된 Haematococcus pluvialis는 Haematococcus pluvialis powder A030 (China) 이다. Astaxanthin은이중결합을가진불포화화합물로제조나저장시열과빛에의해쉽게파괴되어활성이감소하기때문에, astaxanthin을추출하기전의 H. pluvialis와 추출후의 astaxanthin은빛에노출되지않도록하면서 -20 o C에서냉동보관하였다. Acetone은 Oriental Chemical Industries Co. Ltd. (Korea) 의제품으로순도 99.0% 이상을, methanol, ethanol, acetonitrile, ethylacetate, dichloromethane은 Burdick & Jackson (USA) 의제품으로모두 HPLC급을사용하였다. 그외모든시약은분석시약급의제품을사용하였다 실험방법 H. pluvialis로부터의 astaxanthin 추출빛에노출되지않도록하면서 -20 o C에서냉동보관한 H. pluvialis 균체분말 40 mg을막자사발에넣고막자로 1분간최대한고르게분쇄하였다. 분쇄가끝나면추출에사용하는용매 3 ml을첨가하여분쇄하였다. 그런후 10,000 g에서 5분간원심분리하였다. 원심분리후상등액을따로분리하여알루미늄호일로잘감싼후보관하였다. 상등액을분리한뒤바닥에남아있는 H. pluvialis 침전물에다시용매를첨가하여추출하는과정을 H. pluvialis 세포의탈색이완전히이루어질때까지반복하여진행하였다 [17] 추출횟수에따른추출효율비교빛에노출되지않도록하면서 -20 o C에서냉동보관한 H. pluvialis 균체분말 40 mg을막자사발에넣고막자로 1분간최대한고르게분쇄하였다. 분쇄가끝나면 acetone 3 ml을첨가하여 2차분쇄를진행한후 10,000 g에서 5분간원심분리하였다. 원심분리후 1차추출상등액을따로분리하여보관하였다. 상등액을분리한뒤바닥에남아있는 H. pluvialis 침전물에다시용매를첨가하여추출하는과정을반복하여진행하면서 2-7차추출상등액을분리하여보관하고, 8-10차추출상등액을역시따로보관하였다. 추출한상등액은알루미늄호일로잘감싼후보관하였다 분광학적 astaxanthin 분석 UV-VIS Spectrophotometer (Biomate 3S, Thermo scientific, USA) 를이용하여실온에서 480 nm의파장에서흡광도를측정하여추출된 astaxanthin의양을분석하였다 [17] Acetone으로추출한추출액의 HPLC 분석추출된 astaxanthin은 high-performance liquid chromatograph (HPLC) 를이용하여분석방법을각각사용하였다 [5,18]. HPLC 는 Agilent 사의 1260 Infinity LC System (Agilent Technologies Inc., USA) 에 Waters Symmetry C 18 column ( mm, 5 μm, Waters, USA) 을이용하여검출기는 UV/visible 검출기 (474 nm) 를사용하였다. Column 온도는 4 o C로유지하였다. 유속은 1 ml/min, 이동상은용매 A (methanol:tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 81:15:4, v/v), 용매 B (methanol:tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 16:80:4, v/v) 를사용하였다. Free astaxanthin과 ester- 형태의 astaxanthin을동시분리하기위하여, 각각의이동상용매는 0~15분까지용매 A를 100% 로한후, 23분까지용매 B를시간에따라 0~100% 선형농도구배를하여점차적으로증가시켰고, 그후 4분동안용매 B의비율을 100% 로유지한다음 8분동안용매 A의비율을 100% 로유지하였다.

3 378 김선영 오유관 하성호 3. 결과및고찰 3-1. Astaxanthin의추출에미치는용매의영향 Haematococcus pluvialis로부터 astaxanthin을효율적으로추출하기위해서는 H. pluvialis의세포벽을파쇄하는방법이중요하다. 세포벽파쇄를위해막자와막자사발, 균질기, 초음파, 마이크로파, 효소등을사용하여분쇄하는방법들이알려져있는데 [16,19,20], 고온고압의환경과높은에너지를필요로하는장치나고가의효소를사용하는방법대신막자와막자사발을이용하여도 H. pluvialis 세포내에축적된 astaxanthin을간편하면서도효율적으로용매로추출할수있어서본연구에서는막자사발에 H. pluvialis 바이오매스분말을넣고막자로분쇄하였다. 물에는난용성물질인 astaxanthin을 H. pluvialis로부터효율적으로추출하기위한용매선정을위하여 acetonitrile, acetone, methanol, dichloromethane : methanol (1:3, v/v), ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 을사용하여비교하였다. Dichloromethane : methanol (1:3, v/v) 은가장널리이용되는추출용매이고, acetonitrile 과 acetone은추출효율이높다고알려진용매이며, 그리고 ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 은기존에사용되는유기용매들의독성영향을줄이기위해사용되는친환경적인용매여서선정하여비교하였다. H. pluvialis 균체분말을막자사발에넣고막자로 1분간최대한고르게분쇄한후추출용매를첨가하여추가로분쇄하였을때, 세포에축적된 astaxanthin이용매로추출되었다. Acetone을추출용매로사용하여 H. pluvialis로부터 astaxanthin을추출할때추출횟수에따라 astaxanthin이용매로추출된변화를 Fig. 1(a) 와 (b) 가보여준다. H. pluvialis로부터 acetone으로 1회추출하더라도많은양의 astaxanthin이용매로추출되며, 용매로 7회 Fig. 2. Effect of solvents on the astaxanthin extraction from H. pluvialis (DCM : dichloromethane, MeOH : methanol, EA : ethylacetate, EtOH : ethanol). 추출한후의 H. pluvialis debris는 1회추출한후의 H. pluvialis debris에비해탈색이완전히이루어진것으로확인할수있듯이, 7 회추출하면 H. pluvialis에있는 astaxanthin이대부분추출되었다. Ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 을추출용매로사용하였을때에도유사한결과가나오는것을확인할수있었으며 (Fig. 1(c) 와 (d)), 그외다른용매들을사용하였을경우에도최대 7회까지추출을하면원심분리후 H. pluvialis 침전물에서더이상붉은색이보이지않고탈색된것으로 astaxanthin이거의존재하지않음을확인할수있었다. H. pluvialis로부터위의다섯가지용매들을각각이용하여 7회까지추출한후각용매로추출된 astaxanthin의양을 spectrophotometer를이용하여 480 nm에서흡광도를측정하여비교하였다. Fig. 2에보인바와같이 acetone을이용할경우다른 dichloromethane : methanol (1:3 v/v), acetonitrile, methanol, ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 용매에비해흡광도가 1.13~1.29 배더높았는데, 이는 acetone을이용하였을때 astaxanthin을 1.13~1.29 배더높은효율로추출할수있음을보여주는것이므로, 향후실험에서는 acetone을추출용매로선정하여사용하였다. Fig. 1. Images of extracts from H. pluvialis (a) after 1 st extraction, (b) after 7 th extraction with acetone and (c) after 1 st extraction, (d) after 7 th extraction with ethylacetate : ethanol (1:1, v/v), respectively 추출횟수에따른추출효율비교 H. pluvialis로부터의 astaxanthin를가장효율적으로추출할수있는용매로선정된 acetone을이용한적절한추출횟수를선정하기위하여 1차추출상등액, 2-7차추출상등액, 8-10차추출상등액을 HPLC로분석하여 astaxanthin 추출량을비교하였다 (Fig. 3). H. pluvialis가붉은색의휴면포낭세포로전환하며 2차대사산물로세포내에축적하는 astaxanthin은축적특성상 ester-형태의 astaxanthin로다량축적할뿐만아니라그 ester-형태의 astaxanthin 도여러형태의 astaxanthin 이성질체와다양한지방산이결합하여형성되므로그종류도다양하다 [17,21]. Ester-형태의 astaxanthin과 free astaxanthin을분리하기위하여 HPLC에서이동상용매 A (methanol: tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 81:15:4, v/v) 와용매 B (methanol:tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 16:80:4, v/v) 를사용하여농도구배시스템을적용하였으며, acetone을이용하여 H. pluvialis로부터추출한 astaxanthin의크로마토그램을 Fig. 3이보여준다. Retention time이 9분에나타나는

4 미세조류로부터의에너지효율적인 Astaxanthin 회수기술개발 379 Fig. 3. HPLC chromatograms of extract from H. pluvialis (a) after 1 st extraction, (b) after 2 nd -7 th extraction and (c) after 8 th -10 th extraction. 피크가 free astaxanthin이고, 20-26분사이에해당하는피크들이 ester-형태의 astaxanthin 성분들이다 [22]. Acetone으로 H. pluvialis로부터 astaxanthin을추출할경우, 10회에걸쳐추출하더라도 1차추출상등액에 H. pluvialis에축적되어있는전체 astaxanthin의 96.7% 이상이있을정도로 acetone 은 astaxanthin 추출효율이높았다 (Fig. 3). 이는 acetone을이용하여 1회만추출하더라도 H. pluvialis로부터의 astaxanthin 추출에효과적임을보여준다. 또한, H. pluvialis에축적되어있는전체 astaxanthin 중 free astaxanthin은 45.9% 이고, 나머지 54.1% 는 ester-형태의 astaxanthin인데, 추출쵯수별상등액에존재 하는 free astaxanthin의비율은 1차추출상등액에 45.9% 이고, 2-7 차추출상등액에는 45.8%, 8-10차추출상등액에는 56.7% 이다. H. pluvialis에비해 astaxanthin을소량생산하는효모균주인 Phaffia rhodozyma는대부분이 free astaxanthin으로축적하는반면 H. pluvialis에는 54.1% 가 ester-형태의 astaxanthin을축적하고있다. 추출한 ester-형태의 astaxanthin들은 cholesterol esterase와같은효소처리나 methanol에용해한 NaOH와같은염기성용매를이용해에스터결합을제거하는가수분해처리를통해 free astaxanthin 형태로전환할수있다 [22-24].

5 380 김선영 오유관 하성호 4. 결론 상당한두께의견고한세포벽을가지고있는 astaxanthin 생산균주인 Haematococcus pluvialis로부터고온고압의환경과높은에너지를필요로하는장치없이세포벽을파쇄하여 astaxanthin을손쉽게효율적으로추출하는방법을시도하였다. 막자와막자사발을이용하여분쇄하여도 H. pluvialis 세포내에축적된 astaxanthin을간편하면서도효율적으로용매로추출할수있었다. 본연구에서 acetonitrile, acetone, methanol, dichloromethane : methanol (1:3, v/v), ethylacetate : ethanol (1:1, v/v) 을추출용매로사용하여비교하였을때, acetone을이용하였을때 astaxanthin을 1.13~1.29 배더높은효율로추출할수있었다. H. pluvialis가세포내에축적하는 astaxanthin은축적특성상 ester-형태의 astaxanthin로다량축적하므로, 추출물내의다양한형태의 astaxanthin을분리하기위하여이동상용매 A (methanol:tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 81:15:4, v/ v) 와용매 B (methanol:tert-butyl methyl ether:1% (w/v) phosphoric acid, 16:80:4, v/v) 를사용하여농도구배시스템을적용한 HPLC 분석을수행하였다. H. pluvialis에축적되어있는전체 astaxanthin 중 free astaxanthin이 45.9% 이고, 나머지 54.1% 는 ester- 형태의 astaxanthin 이었으며, acetone으로 H. pluvialis로부터추출할경우, 1차추출물에 H. pluvialis에축적되어있는전체 astaxanthin의 96.7% 이상이있을정도로 acetone은 astaxanthin 추출효율이높았다. 이상의결과는막자와막자사발을이용하여분쇄한후 acetone을추출용매로사용하면 H. pluvialis 세포내에축적된 astaxanthin을간편하면서도효율적으로추출할수있는공정임을보여준다. 감 이논문은 2017년도한남대학교학술연구조성비지원에의하여연구가수행되었습니다. 사 References 1. Hong, S. P., Kim, M. H. and Hwang, J. K., Biological Functions and Production Technology of Cartenoids, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 27, (1998). 2. Guerin, M., Huntley, M. E. and Olaizola, M., Haematococcus Astaxanthin; Applications for Human Health and Nutrition, Trends Biotechnol., 21(5), (2003). 3. Mann, V., Harker, M., Pecker, I. and Hirschberg, J., Metabolic Engineering of Astaxanthin Production in Tobacco Flowers, Nature Biotechnol., 18, (2000). 4. Han, D, Li, Y. and Hu, Q., Astaxanthin in Microalgae: Pathways, Functions and Biotechnological Implications, Algae, 28, (2013). 5. 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