이학석사학위청구논문 프로폴리스와전기분해수에의한 식품위해미생물제어 Control of Foodborne Pathogens by Propolis and Plasma Electrolyzed Water 2011 년 2 월 인하대학교대학원 식품영양학과 김윤하

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2 이학석사학위청구논문 프로폴리스와전기분해수에의한 식품위해미생물제어 Control of Foodborne Pathogens by Propolis and Plasma Electrolyzed Water 2011 년 2 월 인하대학교대학원 식품영양학과 김윤하

3 이학석사학위청구논문 프로폴리스와전기분해수에의한 식품위해미생물제어 Control of Foodborne Pathogens by Propolis and Plasma Electrolyzed Water 2011 년 2 월 지도교수정현정 이논문을석사학위논문으로제출함

4 이논문을김윤하의석사학위논문으로인정함 년 2 월 주심 부심 위원

5 목차 목차 i 국문요약 iv Abstract vi List of Tables ix List of Figures x Ⅰ. 서론 Ⅱ. 문헌고찰 프로폴리스 허들테크놀로지 전기분해수 Ⅲ. 재료및방법 균주 프로폴리스의항균활성 프로폴리스 포자의준비 Agar diffusion assay Culture broth method 을이용한 Bacillus cereus의세포에대한프로폴리스의활성검사 Culture broth method 을이용한 Bacillus cereus의세포에대한프로폴리스의활성검사 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한프로폴리스의항균활성검사 프로폴리스와열을병용한허들테크놀로지 Escherichia coli O157:H7의 D값과 Z값실험 i

6 3.2 프로폴리스첨가후 Escherichia coli O157:H7의 D값과 Z값실험 간돼지고기내 Escherichia coli O157:H7의 D값과 Z값실험 간돼지고기내프로폴리스첨가후 Escherichia coli O157 :H7의 D값과 Z값실험 플라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water, PEW) 의살균효과 병원성균에대한 PEW의살균력실험 주방용품 ( 칼, 도마 ) 내 PEW의살균력실험 플라스틱 ( 장난감용블록 ) 내 PEW의살균력실험 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한 PEW의항균활성검사 통계방법 Ⅳ. 결과및고찰 프로폴리스의항균활성 병원성균에대한프로폴리스의항균활성 Bacillus cereus의세포에대한프로폴리스의항균활성 Bacillus cereus의포자에대한프로폴리스의항균활성 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한프로폴리스의항균활성 프로폴리스와열을병용한허들테크놀로지 프로폴리스첨가유무에따른 E.coli O157:H7의열처리효과 프로폴리스첨가유무에따른간돼지고기내 Escherichia coli O157:H7의열처리효과 ii

7 3. 플라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water: PEW) 의살균효과 병원성균에대한 PEW의살균효과 주방용품 ( 칼, 도마 ) 내 PEW의살균효과 플라스틱 ( 장난감용블록 ) 에접종된 E. coli O157:H7에대한 PEW의살균효과 Transmission electron microscopy (TEM) 를이용한 PEW의살균활성 Ⅴ. 결론및요약 참고문헌 Appendix iii

8 국문요약 식품위해미생물을제어하기위한방법으로서프로폴리스, 프로폴리스와열을병행하여다양한병원성균에대한항균효과를평가하였다. 한국산프로폴리스의병원성식중독균 (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescence) 에대한항균효과는 agar diffusion assay와 culture broth method를사용하여시험하였다. 실험결과프로폴리스는그람양성균에강한항균효과를보였고그중 B. cereus에가장강한항균효과를보였다. 프로폴리스처리후 B. cereus 세포는시간이증가함에따라유의하게감소하였고 (P<0.05), 프로폴리스농도가증가함에따라유의하게감소하였다 (P<0.05). 프로폴리스는농도에따라낮은농도에서는정균효과 (bacteriostatic effects), 높은농도에서는살균효과 (bactericidal effects) 를보였다. TEM사진을통해프로폴리스의항균효과는식중독균의막투과성 (membrane permeability) 이소실됨에따른세포의융해에의한것으로확인되었다. 프로폴리스의 B. cereus의포자에대한항균효과는프로폴리스를처리한군과대조군과의유의적인차이가있었으나 (P<0.05), 프로폴리스의농도나시간에따른유의적인차이는없었다 (P>0.05). 프로폴리스는 B. cereus의포자에대하여포자의발아를억제하는효과 (sporostatic effects) 로작용하였다. 허들테크놀로지는식품의보존을위해서두가지이상의보존방법을병행하는기술이다. 열을단독으로사용한경우각온도 (57, 60, 63 ) 에서의 E.coli O157:H7의 D값은프로폴리스와열을병행처리시유의하게감소하였고 (P<0.05), E.coli O157:H7이접종된간돼지고기내각온도에따른 D값역시프로폴리스와열을병행처리후 iv

9 유의하게감소하였다 (P<0.05). Tryptic soy agar(tsa) 와 eosin methylene blue(emb) 의생균수를비교한결과프로폴리스를첨가하였을때 E.coli O157:H7의열에의한손상을증가시키는것으로보였다. 결과, 균배양액과간돼지고기모두에서프로폴리스병행처리후 D값은감소하고 Z값은증가하였고, 프로폴리스가열에대한감수성을증가시켜상승효과 (synergistic effect) 를가지는것으로보였다. Plasma electrolyzed water (PEW) 는소금없이플라즈마기술을이용하여만든전기분해수를말한다. PEW를사용하여병원성균인 Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus 균과 Escherichia coli O157:H7 균이접종된도마, 블록, 칼의표면에대한살균력을시험하였다. 그결과병원성균뿐만아니라도마, 블록, 칼모두에서 >99.9% 의살균효과를보였다 (P<0.05). Staphylococcus aureus에 PEW 처리후 TEM사진을통해확인한 PEW의항균효과역시막투과성이소실됨에따른세포의융해에의한것으로보였다. v

10 Abstract Control of Foodborne Pathogens by Propolis and Plasma Electrolyzed Water Kim, Youn-Ha Dept. of Food and Nutrition Inha University, Korea This study was performed to control foodborne pathogens by chemical, physical and hurdle technology. For chemical and physical treatment, Korean propolis plasma electrolyzed water were used, respectively Propolis is a hard resinous substance made by bees and is known as one of natural antibiotics. The antimicrobial effects of the Korean propolis was tested against foodborne pathogens including Grampositive (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus) and Gram-negative (Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescence) bacteria by agar diffusion assay. In general, Gram positive bacteria were more sensitive than were Gram negative bacteria. The vegetative cells of B. cereus was the most sensitive among the pathogens tested. The bactericidal and bacterostatic action of propolis showed significant difference depending on the concentration of propolis used and treatment time (P<0.05). Against spores of B. cereus, propolis acted sporostatically and inhibited germination up to 30 hours compared to the control. vi

11 Propolis showed no significant difference between the concentrations of propolis used and the treatment time (P<0.05). Transmission electron microscopy (TEM) showed that the inhibition of cell division and cell lysis by propolis was the possible mechanism of the antimicrobial action of propolis. Hurdle technology applies a combination of two or more preservation methods for improvement of the stability and/or quality of food products. We used heat (57, 60, 63 ) and propolis in combination to control gram negative foodborne pathogens which was not inhibited by propolis alone and determined the thermal inactivation of Escherichia coli O157:H7 in the presence of propolis in culture and in ground meat. The addition of propolis to culture broth and meat rendered the pathogen more sensitive to the lethal effect of heat at all temperatures treated. When compared with survivors on TSA and EMB, heat damage in the presence of propolis was more pronounced in the presence of propolis than without propolis at all temperatures. The data suggest synergistic effect of propolis and heat treatment and potential application in food products. The newly developed plasma technology electrolyzed water (PEW) produces small sized water molecules allowing it to penetrate the membranes which subsequently kill bacteria in the absence of sodium chloride. This study investigated the antibacterial effect of electrolyzed tap water produced by using plasma technology against major foodborne pathogens including E. coli O157:H7, S. aureus, S. typhimurium, B. cereus in culture and on surfaces of kitchen utensils and toy blocks. The result shows that the PEW inhibited the selected vii

12 foodborne pathogens by >99.9% in culture and on the kitchen utensils and toy blocks. TEM showed that the loss of membrane permeability of S. aureus led to a swelling and rupture of the cell membrane, in which the cytoplamic components were flushed out leading to massive cell lysis. Thus, this study suggests potential use of propolis, heat, and PEW in food application to improve food safety. viii

13 List of Tables Table 1. Potential hurdles for use in the preservation of foods Table 2. Antibacterial effects of propolis on various foodborne pathogens Table 3. D and Z-values of Escherichia coli O157:H7in the presence or absence of propolis in culture Table 4. D and Z-values of Escherichia coli O157:H7 in the presence or absence of propolis in ground meat ix

14 List of Figures Fig 1. Zone of inhibition of propolis ethanol extract against Bacillus cereus Fig 2. Inhibition of vegetative cells of Bacillus cereus in TSB in the presence of propolis at Fig 3. Behavior of spores of Bacillus cereus in TSB in the presence of propolis at Fig 4. Transmission electron microscopy (TEM) investigation of antibacterial effects of propolis against Bacillus cereus Fig 5. Thermal-death-time curves of Escherichia. coli O157:H7 in culture Fig 6. Thermal-death-time curves (z-values) of Escherichia. coli O157:H7 in culture Fig 7. Thermal-death-time curves of Escherichia. coli O157:H7 in ground meat Fig 8. Thermal-death-time curves (z-values) of Escherichia. coli O157:H7 in ground meat x

15 Fig 9. Degree of injury by heat and combined treatment of heat and propolis on TSA and EMB media Fig 10. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water foodborne pathogens in bacterial cultures Fig 11. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Escherichia coli O157:H7 on kitchen utensils Fig 12. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Escherichia coli O157:H7 on toy blocks Fig 13. Transmission electron microscopy(tem) investigation of antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Staphylococcus aureus xi

16 Ⅰ. 서론 식중독 (foodborne disease) 발생률은세계적으로계속해서증가하고있는추세로이에따라식품위생은점차사회적인문제로대두되고있다 (Huang, 2006; 김효정, 2003). 식중독에의해가장빈번히나타나는증상으로는구토, 설사, 복통과같은위장염증세로이러한증상은화학적, 물리적인원인보다 E.coli O157:H7, Campylobacter ssp, Salmonella ssp, Staphylococcus aureus와같은병원성미생물에의한것이라고보고되고있으며우리나라뿐만아니라 OECD 국가역시병원성균을식중독을일으키는가장중요한요인으로써간주하고있다 (Rocourt, 2003; Jones, 2004; 최태윤, 1995). 병원성균에의한식중독사례는이제개인적인문제를넘어점차증가하고있는급식산업에의해급식소를기준으로식중독사고의규모가급격히대형화되어발생하고있다. 이에따라식품위생관리대한중요성이부각되자학교급식과국내대기업계열의급식업체에서도 HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) 시스템을구축하고적용하고있는실정이다 ( 곽동경, 2005). 국가차원에서도식중독문제를해결하기위해민간단체를정부가적극지원하고있을뿐만아니라식품을소비하는소비자역시식중독과식품위생에대한인식도및정보요구도가증가하고있는추세이다 ( 김효정, 2003). 식중독을일으키는병원성균을제어하는방법에는열, 압력, 초음파 (Earnshaw, 1995), 전자파, 방사선, 자외선 (Chang, 1985) 등을이용한물리적방법과화학적방법으로식품보존제, 염소, 페놀, 알코올 (Trachoo, 2002; Cardoso, 2008) 등다양한방법이있으나편리함과경제성을이유로열처리, 자외선, 살균제 (Kim, 2006) 등이보편적으로이용되고있는실정이다. 하지만자외선은투과력이떨어져표면살균만 - 1 -

17 가능하고열처리는가장많이사용되고있으나열에의한영양소파괴, 제품의손상등을가져와식품의질을떨어뜨리는단점을가진다 (Elamin, 2006). 화학적살균제는식품첨가물로서사용되고있지만인체에독성을주어돌연변이, 발암등여러가지위험을가지고있기때문에사용이감소하고있는추세이다 (Koivunen, 2005; Veschettia, 2003; Kim, 2006). 따라서열처리의단점인식품의질을감소시키지않으면서인체에유해한화학첨가물의사용을줄이는동시에병원성균을사멸할수있는새로운방법에대한연구가활발히진행되고있다 (Elamin, 2006). 이런추세에발맞춰천연항생제및전기분해수, 그리고여러인자들의병용사용하는허들기술에대한관심과연구가점점증가하고있다. 프로폴리스는꿀벌에의해서만들어진것으로식물의수액과꿀벌의분비물인밀납이혼합되어만들어진수지상태의천연의항생물질이다. 프로폴리스는전통적으로항염증, 항암, 항바이러스, 항균, 항산화효과등이많이알려져있으며 (Marucci, 1995; Burdock, 1998), 특히유럽에서는프로폴리스를치아나목등의감염시치료의목적으로사용한기록등이남아있다 (Castaldo, 2002; 조정순, 2005). Lindenfelser(1967), Grange(1990), Erkmen(2008) 외다수는프로폴리스에탄올추출물을병원성균인 S. aureus, Enterococcus spp., B. cereus, P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae을포함하는여러가지균에항균활성을실험한결과프로폴리스가여러균에대한항균효과를보이며특히그람양성균에탁월한항균활성을가진다고보고하였으며 Park(1998) 외다수는충치의원인균인 Streptococcus sanguis, Actinomyces naeslundii, S. mutans에대한프로폴리스의항균효과를보고하였다. 프로폴리스의곰팡이, 바이러스등에대한항생작용도보고되었는데 Amoros(1992) 외다수는 Herpes simplex virus (HSV-1, - 2 -

18 HSV1-R, HSV-2) 에대해프로폴리스가항바이러스효과와세포독성을가져바이러스의성장을억제한다고보고하였고 Drago(2007) 와 Vynograd(2000) 외다수도프로폴리스의항바이러스효과에대해보고하였다. 프로폴리스는일반적으로 45~55% 의수지와방향족화합물, 25~35% 의밀납과지방산, 10% 의정유, 5% 의화분및 5% 의각종유기물과광물질소량의비타민으로조성되어있다 (Castaldo, 2002). 프로폴리스의성분의대부분은폴리페놀로 phenolic acids, phenolic acid esters, galangin, quercetin 같은플라보노이드로구성되어있으며그외에여러유도체들, 다양한스테롤류, 아미노산등으로구성되어있다. 프로폴리스는폴리페놀즉, 플라보노이드에의해서프로폴리스의독특한항균작용과항산화작용을보일뿐아니라그자체의색으로인해프로폴리스의독특한담갈색을띠게한다 (Castaldo, 2002). 프로폴리스에다량함유된폴리페놀은프로폴리스의산화방지효과에도영향을미친다. Wang(2004) 외다수는프로폴리스를첨가했을때항산화지표인 reducing power, scavenging DPPH radicals, hydroxyl radicals, superoxide anions 이증가한다고보고하였고, Isla(2001) 외다수는프로폴리스의플라보노이드함량과산화의지표인 malondialdehyde(mda) 의억제간에양의상관관계가있다고보고하였다. 전기분해수 (electrolyzed water) 는처음일본에서개발된것으로 (Shimizu, 1992) 전기분해장치, 수돗물그리고소량의소금으로만들어지는물을의미한다. 전기분해하면양극에는산성전해수 (electrolyzed oxidizing water, EOW) 와음극에는알칼리전해수 (electrolyzed reduced water, ERW) 로각기다른특징을가지는전해수로나뉘어지게된다. 이중양극에서생성된산성전해수만이 ph 2.7 이하의물로높은산화환원준위 (>1,100mV) 와수소이온과염소이온과 - 3 -

19 같은음이온이많이포함하여독특한항균효과를가지게되며, 보통의열을이용한살균효과가아니라물만으로세균을사멸시킬수있는특징을가진다 (Huang, 2008; Elamin, 2006). 산성전해수의식품에교차오염을야기할수있는작업장의도구들에대해서도살균효과가이미여러연구들을통해입증되었다. 이전의연구를보면인체내식중독을유발하는균인 E. coli O157:H7, S. enteritidis, L. monocytogenes, B. cereus, C. jejuni, E. aerogenes 에대해서산성전해수처리시검출되지않는수준으로살균효과를보였고 (Venkitanarayanan, 1999a; Kim, 2000; Park, 2002), E. coli O157:H7 과 L. monocytogenes에오염된도마나테이블, 문, 키보드에산성전해수를일정시간동안노출시켰을때도마찬가지로강한살균효과를보였다. 병원성균에오염된식품 ( 양상추, 가금류, 생선 ) 내에서도산성전해수를처리하였을때역시살균효과를보였다 (Venkitanarayanan, 1999b; Park, 2002; Huang, 2006; Guentzel, 2008). 그러나식품내에처리하였을때는균에직접적으로처리하였을때보다는더낮은활성을보이는데이는산성전해수의살균효과가식품내의아미노산과단백질같은유기물질에의해서방해받기때문이라고보고하였다 (Oomori, 2000). 허들테크놀로지 (hurdle technology) 는 Leistner에의해서도입된개념으로식품의영양학적인그리고관능적인측면뿐만아니라미생물학적인안전과안정성을위해서식품을보존할수있는다양한허들을혼합하는방법이다. 식품에서식품의보존제로서사용하는중요한허들로는온도, 수분활성도 (Aw), 산화환원준위 (Eh), 보존제 (nitrite, sorbate, sulfate) 등으로이런다양한허들에의해서미생물의기본적인살균, 사멸의원리는크게 homeostasis, metabolic exhaustion, stress reaction 으로설명할수있다 (Leistner, 2000). 각각의허들은미생물에대해서각각작용하여하나의허들로서효과를가지지만병용처리시각각의다 - 4 -

20 른허들이세포안에서서로다른목표대상을갖는다면두개이상의허들이만나상승효과 (synergistic effect) 를갖는다 (Leistner, 1994). 허들테크놀로지에관한상승효과는최근여러연구에서보존제, 열, ph의조합 (Steenstrup, 2002), osmotic dehydration, infrared drying, gamma radiation (Saxena, 2009) 을이용한허들간의상승효과가보고되었다. 또한소시지의 nitrite의함량을줄이고미생물적안전을유지하기위하여수분활성도, 산도, 저장온도, 보존제와같은허들을조합하여이용하는등 (Jafari, 2007) 식품내허들테크놀로지의활용방안이진행되고있다. 본연구에서는식중독을야기할수있는병원성균을제어할수있는방법으로천연항생제인프로폴리스를이용하여프로폴리스의식중독균에대한항균활성을조사하고식품내에서프로폴리스와열두가지허들을병용처리하여프로폴리스만단독으로처리하였을때와열을함께적용시켰을때의병원성균에대한살균효과를비교하고자한다. 또한플라즈마기술을이용한전기분해수 (plasma electrolyzed water; PEW) 을이용하여다양한병원성균에대한항균효과뿐만아니라식품에교차오염을야기할수있는기구에서의항균효과를확인하고자하였다. 본연구를통하여식품안전을위협하는식품위해미생물을제어할수있는방법및허들테크놀로지를개발하여하며식품의보존효과를높이는데기여할수있을것이라생각된다

21 Ⅱ. 문헌고찰 1. 프로폴리스 1. 1 프로폴리스란? 프로폴리스란꿀벌의벌집을구성하는소재의하나로서꿀벌에의해식물의꽃이나잎, 수목의생장점을보호하기위하여분비되는물질 ( 수액 ) 과자신들의분비물 ( 밀납 ) 이혼합되어만들어진것으로, 수지, 밀납, 방향유, 유기산류등으로이루어져있는수지상태의천연에존재하는항생물질이다. 프로폴리스는그리스어원에서알수있듯이앞을나타내는 pre( in front of ) 와도시를뜻하는 polis( city or community ) 의복합어로 벌들의도시를앞에서보호해주는물질 이라는의미이다. 특히꿀벌은이것을봉군보호를위하여벌통내부의오염되기쉬운곳에바르고오염균류나바이러스빛외적으로부터벌집을보호하기위하여사용한물질이다. 특히, 여왕벌이산란하기전에일벌이미리벌방에프로폴리스를엷게발라서알과유충그리고자기자신을미생물로부터안전하게보호할뿐만아니라말벌이나쥐의침입을막는것으로알려져있다 (Burdock, 1998; Kadota, 2000; Castaldo, 2002; Cho, 2005). 프로폴리스는기원전수천년부터사용되어왔으며고대그리스의유명한과학자히포크라테스는상처및궤양의치료에프로폴리스를이용하도록권장하였고그리스의철학자이자양봉가였던아리스토텔레스는피부염종기상처및감염증의치료에프로폴리스를이용하였으며고대메소포타미아에서민간요법으로시행된기록도남아있다. 우리나라에서도프로폴리스의효과가인정되어오래전부터양봉가들에의하여민간요법 - 6 -

22 으로이용되어왔으며한의학에서도이용되어동의보감및본초강목에 프로폴리스의이용이기록으로남아있다 (Park, 2000). 1.2 프로폴리스의기능성 항균효과 (antimicrobial activity) 프로폴리스추출물의항균활성에대한연구는많은연구논문등을통해서보고되고있다. Lindenfelser(1967) 는프로폴리스로부터알코올추출물을사용하여항균작용을실험한결과다양한균중에서 Bacillus barvae에가장높은효과가보였으며, 그람양성구균을포함한 25개의균주에대한강한항균작용을보고하였다. Grange(1990) 외다수는프로폴리스에탄올추출물의 Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae에대한항균활성에대해조사한결과, Pseudomonas aeruginosa와 Escherichia coli 에서는부분적인항균활성을보였고 Klebsiella pneumoniae에대해서는항균활성을띄지않았으며, B. cereus에대해서는낮은농도에서도강력한살균효과를가지는것으로보고하였다. 또한 Park (2008), Erkmen (2008), Marcocci (1995) 외다수는그람음성균보다그람양성균에대한프로폴리스의강력한성장저해효과를보고하였고그람염색성에따라서프로폴리스의항균성이달라지는것은플라보노이드의성분과함량차이를비롯하여항균성성분이세포내로투과되는정도그리고세포벽합성의저해로인한것이라고보고하였다. 또한, 프로폴리스의 Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces israelii, Clostridium perfringens, Eterococcus faecalis와같은병원성균에대한항균활성은강력한근 - 7 -

23 간소독약으로쓰이는 camphorated paramono-hlorophenol, formocresol, calcium hydroxide와비교했을때효과는다소약하나근간소독약의강한독성을대치할수있어프로폴리스의항생제의가능성에대해보고되었다 (Ferreira, 2007). 프로폴리스의항균활성은성분에따라서차이가있으며프로폴리스의성분은산지나채집시기및주변의식물등에따라서함량과효능에영향을받는다. Kalogeropoulos(2009) 외다수는다른지역에서채집한프로폴리스의구성성분인 phenolic acids, phenolic acid esters, flavonoids, terpenes의함량의차이를보고하였고, 프로폴리스에탄올추출물은지역에따라차이가있으나비병원성균과병원성균에대해강한항균활성을가진다고보고하였다. 또한 Kujumgiev(1999) 외다수는다른지역에서얻은프로폴리스를가지고 S. aureus, E. coli, Candida albicans에대한항균활성을조사한결과지역에따라구성성분에서근소한차이를보였으며 S. aureus와 Candida albicans 대해강한항균활성을가지는것으로보여프로폴리스가병원성균뿐만아니라곰팡이에대해서도활성을가진다고보고하였다. Chee(2002) 역시 Cryptococcus neoformans 와 Candida albicans과같이곰팡이에대한프로폴리스의항균효과를보고하였다. 이외에다른연구에서도역시식중독을유발하는병원성균에대한프로폴리스의뛰어난항균활성에대해서보고하여식품의안전성을높이는천연항균제로서프로폴리스의가능성을보고하였다 (Son, 2003; Lee, 2002). 프로폴리스의항균효과는병원성균뿐만아니라구강내의존재하는균에대해서도활성이보고되었다. 구강내의충치유발은 Streptococcus mutans와같은균의성장, 그리고 Streptococcus mutans가성장과함께분비하는효소인 glucosyltransferase에의해서결정된다. Park (1998) 외다수는구강내에충치를유발하는균인 Streptococcus - 8 -

24 mutans 외 5개균에대한프로폴리스의항균활성및효소에도활성을가진다고보고하였다. 프로폴리스의항균작용은박테리아, 효모, 곰팡이뿐만아니라바이러스에도항바이러스효과를가진다. Dargo(2007) 외다수는 Adenovirus, Influenza virus, Para influenza virus, Herpes virus type 1 에속하는바이러스에프로폴리스를처리하였을때바이러스의성장이저해될뿐만아니라, scanning electron microscopy (SEM) 을통해서바이러스 (Haemophilus influenzae) 가사람의구강세포에부착하는것을방해한다는것을보고하였다. Marcucci(1995) 는프로폴리스추출물이바이러스의전염와전사를방해한다고보고하였는데이는프로폴리스에함유되고있는다량의플라보노이드 (chrysine, kaempferol, acacetin, galangine, quercetin) 의세포독성효과때문이라고보고하였다. 산화방지효과 (antioxidation activity) 프로폴리스의산화방지효과는여러연구에서보고되었다. Isla (2001) 외다수는아르헨티나여러지역에서채집한프로폴리스를가지고시험관상에서산화방지효과를조사하였는데구리로유발된지질의산화시프로폴리스를첨가하였을때프로폴리스의플라보노이드의함량과지질의산화속도, 산화유도기간, 과산물형성, malondialdehyde 형성간에양의상관관계가있음을보고하였다. Kim(2002) 외다수는국산프로폴리스와산화방지제인토코페놀과 BHT을비교분석한결과산화유도기간의연장에있어서다른산화방지제와프로폴리스간의큰차이가없음을밝혔다. Wang(2004) 외다수는초임계추출법과에탄올추출법을통해얻은프로폴리스추출물을가지고 DPPH(1,1-Di-Phenyl-2-picryl hydrazyl), superoxide anions, hydroxyl radical의소거능력그리고쥐의간에 FeCl2-ascorbate에 - 9 -

25 의해유도된지질과산화물의산화억제능력을통해서산화방지효과에대해연구한결과, 프로폴리스의양의증가에따라산화진행정도를측정할수있는 hydroxyl radical의소거능력이증가하였고, 쥐의간에유도된지질산화정도도프로폴리스에의해효과적으로억제되었다고보고하였다. 이외에다른지역에서얻은프로폴리스를가지고총폴리페놀을측정하였고전체적인폴리페놀의양의증가할수록 DPPH와환원력 (reducing power) 역시증가하는양의상관관계를이루어프로폴리스의산화방지효과를입증하였다. 이때프로폴리스의폴리페놀류이외에 phenolic acids와 anhraquinones도산화방지효과와높은상관관계를보였다. 이와같이프로폴리스의산화방지효과는플라보노이드와같은프로폴리스에다량함유된폴리페놀에의한것이며플라보노이드는라디칼의형성을감소시켜주고결과적으로산화로부터지질을보호하는효과를갖는다고보고하였다 (Kalogeropoulos, 2009). Fuliang(2005) 외다수는당뇨병이유발된쥐에프로폴리스에탄올추출물과물추출물을주입시켰을때혈장내혈당, 총콜레스테롤, 중성지질, 저밀도리포단백질콜레스테롤 (LDL-C & VLDL-C) 가감소되었고고밀도리포단백질콜레스테롤 (HDL-C) 은증가되었다고보고하였다. 또한인체내라디칼을제거해주는효소인 superoxide dismutase (SOD) 역시증가하여지질의산화를억제해주었다. 프로폴리스의인체와식품내그리고시험관내산화방지효과는여러연구를통해서보고됨에따라식품의약품안전청에서도건강기능성식품으로서규정되어있는상태이다

26 항염증효과 (antiinflammatory activity) 프로폴리스에대한여러연구들은위에나타난기능성이외에프로폴리스의항염증효과에대해서도보고하였다. Park(1996) 외다수는카라기닌을주입하여뒷발에염증을유도한쥐와관절염이유발된쥐에한국산프로폴리스에탄올추출물을 50mg/kg 을주입하였을때쥐의부종이상당히감소되는것으로보고하였다. Borrelli(2002) 외다수는위와똑같이염증이유발된쥐에게프로폴리스의중요한구성성분인 caffeic acid phenethyl ester(cape) 와 galagin 그리고프로폴리스에탄올추출물을주입하였을때유발된쥐의염증크기가점차감소하는것을확인하였으며그결과프로폴리스의 caffeic acid phenethyl ester(cape) 와 galagin의이두가지화합물이프로폴리스의항염증효과에크게기여한다는것을보고하였고 Lee(1993) 외다수는 flavone, flavonol glycosides의쥐에유발된염증에대한뛰어난항염증효과를보고하였다. 이외에다른연구에서는항염증효과를나타내는프로폴리스의성분은피노셈브린, 페롤라산등이있고, 피노셈브, 벤질에스테르, 사쿠라네틴과같은물질들도살균작용을나타내는물질이며항염증효과의매커니즘은확실하지않지만프로폴리스는박테리아에의한단백질합성을저지하는것으로보고하였다 (Schmit, 1992). 그외의기능프로폴리스는항염증외에항당뇨, 항암, 항위염, 면역조절작용등다양한분야에서활발한연구가진행되고있다. 프로폴리스의항당뇨기능으로한충택 (2003), 정년기 (2005), Melsayed(2009) 외다수는 STZ(streptozotocin) 으로유발된쥐에농도가다른프로폴리스추출물을투여하였을때혈당치가프로폴리스투여군

27 의농도에따라유의하게감소하였으며프로폴리스투여는혈당저하와랑거한스섬의베타세포의재생작용에효과를보여항당뇨효과가있는것으로보고하였다. 또한, 프로폴리스의톨루엔추출물을가지고비율을다르게하여유발위손상실험을시행한결과프로폴리스를투여한군에서모두유의하게위염과위궤양이감소한것을확인하였고약물로사용하는 cimetidine과 sucralfate을대조군으로비교하였을때유사한위손상억제효과를보여프로폴리스가항위염, 항위궤양효과를보인다고보고하였다 (Kim, 1999). 프로폴리스의항암효과는암세포증식억제에효과적이라는연구도보고되었는데 Lee(2000) 외다수는시험관상에서프로폴리스가인체의결장암세포인 HT-29와간암세포인 HepG2 에미치는영향을연구하였고암세포에프로폴리스를처리할때암세포의증식을현저하게감소시킬뿐만아니라암세포의형태를손상시켜암세포가기형적으로변하여암세포의크기가작아져암세포의주기에도영향을미친다고보고하였다. 이런프로폴리스의항암작용은이전에프로폴리스에서분리한 clerodane diterpenoid에의해서생쥐피부암세포의 DNA합성을억제됨이보고된연구에서도확인할수있었다 (Mitamura, 1996). 1.3 프로폴리스의구성성분 프로폴리스의조성은산지에따라서차이가있으나, 일반적으로 45~55% 의수지와방향족화합물, 25~35% 의밀납과지방산, 10% 의정유, 5% 의화분및 5% 의각종유기물 ( 안식향산, 몰직자산 ) 과광물질 ( 철, 동, 아연, 망간, 알루미늄, 비소, 코발트, 칼슘 ) 그리고소량의비타민 ( 비타민 A, 엽산, 니코틴산, 비오틴 ) 으로되어있다 (Castaldo, 2002). 프로폴리스는폴리페놀을포함한 180개가넘는구성성분을가지고있

28 다. 주요한폴리페놀로는 phenolic acids, phenolic acid exters, galangin, quercetin 와같은플라보노이드로구성되어있으며그외에 cinnamic acid 및여러유도체들 (chlorogenic acid, ferrulic acid, caffeic acid phenethyl ester), 다양한스테롤류, 아미노산등으로구성되어있다. 프로폴리스의폴리페놀즉, 플라보노이드는프로폴리스의독특한항균작용과항산화작용에기여할뿐만아니라 (Castaldo, 2002) 프로폴리스의독특한담갈색을띠며프로폴리스에함유되어있는필수지방은프로폴리스만의온화한향에영향을미친다 (Cizmarik, 1976). 플라보노이드는식물계에넓게분포되어있는물질로자연상에있을때는배당체로서존재하지만프로폴리스에서는가수분해되어아글리콘의형태로존재한다. 이는벌이밀납과벌자신이식물체로부터프로폴리스를수집할때분비하는효소인 β-glucosidase를혼합하는데이물질은플라보노이드배당체를플라보노이드아글리콘으로가수분해하기때문이다 (Park, 1998). 1.4 프로폴리스의현재사용실태 일본은 1994년부터프로폴리스시장이형성되어지금까지큰시장을유지하고있다. 1996년에는건강식품에서 200억엔을초과하였으며 (Park, 2000) 점점프로폴리스의항암, 항알레르기등여러가지약리작용이연구되면서건강식품뿐만아니라화장품, 입욕제, 제약등여러가지방면에서프로폴리스의이용과연구활동은꾸준한상태이다. 하지만우리나라의경우를보면건강식품의대한소비자의인식이좋지않고일본과다르게대기업의참여가아직이루어지지않았다는점그리고한국산프로폴리스에대한학계보고나연구활발하지않는여러가지이유때문에프로폴리스의시장규모는크지않은상황이다. 최근에는일

29 본제품에비해서적은종류지만화분, 로얄제리, 레시틴, 대두유등과혼합한캡슐제품, 피부치료화장품과같은제품들도한국에서판매되고있으며 (Lee, 2001) 최근식품의약품안전청에서도프로폴리스에대한여러가지기능성과인체에무해한성분이라는것이입증되면서프로폴리스가 산화방지작용 과 구강에서의항균작용 에도움을줄수있는것으로판단하여건강의약품 ( 페놀류 ) 으로분류하고있다. 기능성이확인된인체적용시험에서는섭취량을고려하여, 총플라보노이드로서 16~17 mg 으로일일섭취량을설정되어있고이섭취량은 산화방지작용 에적용되는것으로, 구강에서의항균작용 기능성을표시할경우에는섭취량이적용되지않는다. 구강에서의항균작용은구강에직접접촉할수있는형태 ( 스프레이또는팅크제 ) 에한하며, 섭취량은별로도정해지지않은상태이다. 2. 허들테크놀로지 허들테크놀로지는식품의영양학적인그리고관능적인측면뿐만아니라미생물학적인안전을위해서식품을보존할수있는다양한허들을혼합하는방법이다 (Leistner, 2000). 허들테크노로지는 1978년 Leistner에의해처음소개된방법으로대부분의연구가 Leistner에의해서이루어졌으며선진국뿐만아니라개발도상국에서도식품의효과적인보존을위해서새롭게도입된식품보존방법이다 (Choi, 1995). 식품에서식품의보존제로서사용하는중요한허들로는온도, 수분활성도 (Aw), 산화화원준위, 보존제 (nitrite, sorbate, sulfate), competitive microorganisms(lactic acid bacteria) 등이이용되고있으며이외에도미생물저감화에물리적, 화학적, 인자들도허들로이용된다 (Table 1). 서로다른허들은미생물에대해서각기작용하기도하지만허들이세

30 포안에서서로다른목표대상을갖는다면상승효과 (synergistic effect) 를가지며 (Leistner, 1994), 허들테크놀로지의미생물억제에대한상승효과는최근에여러논문을통해서보고되고있다. Jafari(2007) 외다수는소시지에들어가는 nitrite의함량을감소하기위해서수분활성도, 산도, 저장온도, 보존제와같은다양한허들을이용하여병용처리하여실험한결과 nitrite 양을감소하고동시에세균수가초기세균수에비하여감소함을보고하였다. Clostridium perfringens 와 C. botulinum의경우에는허들을처리시 nitrite를전혀함유하고있지않은군을제외하고는 nitrite의함량이감소해도음성반응을보였으며결과적으로미생물학적인안전과안정성을유지하면서도인체에유해한아질산염의첨가를감소할수있는효과를보였다. Saxena (2009) 외다수도파인애플슬라이스에 osmotic dehydration, infrared drying, gamma radiation (1kGy), potassium metabisulfate 등허들을조합하여저장일수에따른총균수, 효모및곰팡이에미치는영향을시험한결과단일허들보다는모든허들을조합했을때가장좋은효과를보여허들테크놀로지가식품의유통기한을증가시킨다고보고하였다. 또한 Steenstrup (2002) 외다수는사이다속의 E. coli O157:H7 균에대한허들로열 (47, 50, 53 ), ph, 보존제 (sorbate, benzoate, malic acid) 를처리하여 E. coli O157:H7의불활성정도를측정한결과단독으로열처리하였을때보다다른허들과병용처리하였을경우 D값은감소하고 Z값은증가하여 E. coli O157:H7 균의열에대한저항성이감소하였다고보고하였다. 이렇게허들테크놀로지의상승효과는식품에적용시낮은농도의허들을적용시켜식품의품질 ( 영양과관능적인측면 ) 의손상을줄이고미생물상으로안전성을확보할수있다. 허들테크놀로지를이용한식품은 shelf stable products(ssp) 라고정의내려진것으로가벼운열처리로인해서냉동, 냉장없이저장할수

31 있는수분함량이높은 (Aw>0.90) 제품을말하며고압멸균된소시지, 발효된살라미소시지, 잼, 치즈등이대표적인제품이다 (Choi, 1995; Leistner, 1995). 다양한허들에의한미생물의기본적인살균, 사멸의원리는크게 homeostasis, metabolic exhaustion, stress reaction을설명할수있다 (Leistner, 2000). Homeostasis는미생물자신이끊임없이외부와내부의환경변화를받으면서도스스로생리적으로안정된상태를유지하는것으로 ph, Aw, 보존제와같은허들에의해서미생물은내부항상성유지가어려워지며그결과미생물은더이상유도기를극복하지못하고증식이지연되면서결과적으로는사멸된다. 그러므로식품에처리된허들은미생물의동적평형 (homeostasis) 을방해함으로써식품에안전성을부과하는것이라고보고하였다 (Leistner, 2000; Leistner, 1995a). Metabolic exhaustion은식품내미생물의 auto-sterilization 을야기시킨다. 식품속내미생물은 heat, Aw, 항생제, 보존제와같은허들 Table 1. Potential hurdles for use in the preservation of foods

32 에노출되면미생물은치사량에가깝게상처를입게된다. 따라서미생물은스트레스환경을극복하고상처를치유하기위해서모든에너지를사용하게때문에결국에너지는고갈되고더이상증식하지못하여죽게된다. 즉, 미생물의 metabolic exhaustion 이 auto-sterilization 을이끄는것이다 (Leistner, 1995b). Stress reaction 역시 metabolic exhaustion면으로생각할수있다. 미생물은 heat, ph, Aw, 알코올, 기아와같은 stress 상태에서 stress shock protein을합성함으로써허들에더저항성을갖게되고 Stress shock protein을가진균은식품의안전을위협할수있다. 그러나다양한허들을동시다발적으로미생물에노출시키게되면미생물은그만큼많은 Stress shock protein을합성해야되며그과정에서미생물은자신의에너지를다사용해버리고결과적으로 metabolic exhaustion을야기해허들에의한사멸의효과를볼수있다 (Leistner, 2000). 3. 전기분해수 3.1 전기분해수 전기분해수는처음일본에서개발된것으로 (Shimizu, 1992) 순수한수돗물에 % 소량의염화물 (NaCl) 을녹여음극와양극그리고이온격막을이용하여전기분해하여얻어지며양극에는산성전해수 (Electrolyzed Oxidizing Water, EOW) 와음극에는알칼리전해수 (Electrolyzed Reduced Water, ERW) 로다른특징을가지는전해수로나뉘어지게된다 (Hsu, 2005; Huang, 2008; Elamin, 2006). 알칼리전해수는 ph가 11이상의물로낮은산화환원준위 (oxidationreduction potential; ORP< -800 mv) 와수산이온과 Na 이온등의양

33 이온이많이포함되어있으며강력한환원작용, 산화방지효과를가지며지방과단백질의용해능력이우수하여청정액으로사용하기도한다. 반면산성전해수는 ph가 2.7 그이하의물로높은산화환원준위 (ORP > 1,100 mv) 를가지며수소이온과염소이온과같은음이온이많이포함되어있는산성수이다 (Kim, 2000; Venkitanarayanan, 1999a). 이런특징으로세균등의미생물의생존과번식을억제하는효과가뛰어나며잔류하고있는염소와산소에의해탈취표백작용을갖는다. 전기분해수는가정에서사용하는수돗물과식염으로생성하므로인체에안전하며피부에장애나부작용을일으키지않으나강력한산성과산화작용은금속류를부식시키는단점이있다 (Huang, 2006; Huang, 2008). 3.2 전기분해수의항균작용 전기분해수는강한항균작용을가지며특히산성전해수는낮은 ph와잔류하고있는염소에의해서항균작용을가진다고보고되고있으며많은연구에서강한항균작용이보고되었다. Venkitanarayanan(1999a) 외다수는식중독을야기하는병원성균 E. coli O157:H7, S. enteritidis, L. monocytogenes 대하여산성전해수를시간에따라처리하였을때 3개균모두 15분후에는검출농도이하로떨어져 log 7 이상의감소효과를보여전기분해수의강력한항균효과에대해서보고하였다. Kim(2000) 외다수는병원성균인 L. monocytogenes, E. coli O157:H7, B. cereus 균에시간에따라산성전해수를처리후 3균모두에서유의적인차이로항균효과보였고 L. monocytogenes, E. coli O157:H7 같은경우에는검출농도이하로감소하여 log 9-10의감소를보였지만 B. cereus의세포의경우에는 log 3정도의감소, 그리고 B. cereus의포자는 log 1-2정도의감소를

34 보여 B. cereus가다른균에비해산성전해수에대해서저항성을가진다고보고하였다. Park(2002) 외다수는산성전기분해수의잔류염소량이증가할수록 B. cereus, Campylobacter jejuni, Enterobacter aerogenes, S. aureus을포함한병원성균에대한항균작용은증가하였고산성전해수에포함되어있는염소량이항균작용에영향을미치는것이라고보고하였다. 산성전해수의항균작용은균에직접노출되었을때뿐만아니라가금류, 채소, 해산물등과같은식품이나식품내에교차오염을야기할수있는오염된주방용품에대해서도항균작용을보여미생물오염을감소시킬수있는살균제로의가능성에대해서도보고되고있다. Venkitanarayanan(1999b) 외다수는균에바로산성전해수를처리한것이외에병원성균인 E. coli O157:H7과 L. monocytogenes에오염된도마에산성전해수와이온수와처리하고산화환원준위, ph, 잔류염소량함량을비교분석한결과산성전해수로처리한군은 Log 5~6의감소를보여거의 >99.99% 의살균력을보였지만이온수로처리한군은 Log 1~1.5 감소를보여항균효과가전기분해수에비해확연히떨어지는결과를얻었다. 함량을비교한결과이온수는잔류염소량이검출되지않아전기분해수와큰차이를보여전기분해수에잔류하고있는염소량이전기분해수의항균효과에중요한역할을한다고보고하였다. Guentzel(2008) 외다수는산성전해수의잔류염소량을다르게하여양상추와식품산업현장에서사용되는제품인 table, door, keyboard 등여러가지제품에산성전해수를 10분간처리한결과사용한균주 (E. coli, S. aureus, S. typhimurium, L. monocytogenes, E. faecalis) 에따른차이는있었지만잔류염소함량이증가할수록살균효과는증가하여테이블, 문, 키보드의경우에는미생물의수가 79~ 100% 까지감소하는결과를보였고식품의경우에도 E. coli를제외한

35 모든균에서 % 의감소효과를보였다. 이외에식품에서의산성전해수의효과는유제품이나가금류, 육류에서식중독을유발할수있는 C. jejuni에감염된닭고기에산성전해수를이용한결과 log 3정도의감소효과를볼수있었고 (Park, 2002), Huang(2006) 외다수는 E. coli, Vibrio parahaemolyticus에오염된생선에산성전해수를 1~10분동안처리후수돗물로처리했을때와비교한결과전기분해수의노출시간이증가할수록살균효과는유의적인차이를보이며증가한다고보고하였다. 일반적으로식품내산성전해수의항균효과는균에직접적으로노출시키거나도마와같은주방용품에적용시킨경우보다는더적은효과를보였으며이것은산성전해수의살균효과가식품내의아미노산과단백질같은유기물질에의해서방해받기때문이라고보고되었다 (Venkitanarayanan, 1999a; Oomori, 2000). 3.3 플라즈마전기분해수 플라즈마는전기적으로중성인원자들로만이루어진고온기체와달리서로반대의전하를띤전자와양이온이뒤섞여존재하는것으로전체적으로는중성이지만국부적으로양이온과전자사이의전하분리에의해전기장, 그리고전하의흐름에전류와자기장이발생되는것을말한다 ( 한국표면공학회, 2007). 이플라즈마기술을이용하면물분자가플라즈마방전에의해초미립자단위로분해되고이때전기분해수와마찬가지로 OH 라디칼이발생되게된다 ( 고경보, 2005). 즉, 플라즈마기술에의해형성된 OH 라디칼에의해살균및소독효과에탁월한효과를나타나게된다 ( 강성종, 2007)

36 Ⅲ. 재료및방법 1. 균주 본실험에서사용된병원성균은그람음성균과그람양성균을포함하여 Salmonella typhimurium (ATCC 19586), Escherichia coli (ATCC 43889), E. coli O157:H7 (ATCC 35150), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Bacillus cereus (ATCC 10876), Pseudomonas fluorescence (ATCC 10145), Staphylococcus aureus (ATCC 12600) 을사용하였으며사용된균주는중앙대학교식품영양학과에서분양받았다. 균주는 stock culture 상태로 (-70 ) 저장보관하였으며실험에사용하기위해서 tryptic soy broth(tsb, Difco., BB Co.) 배지를이용하여 37 에서 18시간배양 (activation) 을 2번거친후실험에사용하였다. 2. 프로폴리스의항균활성 2.1 프로폴리스 본실험에서사용된프로폴리스는 Withealth Propolis co. (Kyungnam, Korea) 에서제공받은 100% 한국산프로폴리스에탄올추출물을이용하였다. 이제품은수용성이므로실험에사용되기전이전의다른연구에서와달리원괴를에탄올을이용해서추출하지않고바로사용되었으며실험에사용되기전까지는냉장온도 (5 ) 에서저장보관하였다

37 2.2 포자의준비 프로폴리스에대하여포자의감수성을시험하기위해서 Bacillus cereus의포자를사용하였다. 먼저 B. cereus의포자를만들기위해서냉동보관되어있는 B. cereus 균한백금이를따서살균된 9ml TSB에넣고 37 에서 18시간배양시켰다. 미리만들어둔 tryptic soy agar(tsa, Difco., BB Co.) 20개에배양된 B. cereus 균현탁액 1ml을도말한후 37 에서 2주간배양하였다. 배양후에살균된증류수를각각의 TSA에 3ml~5ml를넣고멸균된백금이를이용해서 TSA 표면에만들어진포자를 50ml tube에긁어모았다. 모아진포자현탁액을 6,000 rpm(4 ) 에서 20분동안원심분리하였다. 원심분리후상층액을따라버리고다시살균된증류수로채운후다시원심분리하는작업을 3번 ~4번반복하였다. 50ml tube에포자가모아지면증류수를넣은후냉장보관 (5 ) 하였다. 수확된포자의농도는 10 8 spores/ml를가졌다. 2.3 Agar diffusion assay 프로폴리스와접종된균이고루퍼질수있도록 TSB 100ml 에 Bacto agar (Difco., BB Co.) 0.75g 을넣어 soft TSA 를만든다. TSB 에 37 에서 18 시간배양시킨각각의병원성균현탁액 0.1ml 을 Soft TSA 100ml 와섞어 10 6 CFU/ml 가되도록도말하였다. 프로폴리스농도는 1/2 희석을통해서 2.3 mg/µl, 1.15 mg/µl, 0.58 mg/µl, 0/29 mg/µl, 0.14 mg/µl, mg/µl, mg/µl 로준비하였다. 각균이도말된 0.75% soft TSA 에살균된유리실린더를올려놓고미리희석하여농도가다른프로폴리스 50 µl 을주입한후 37 에서 18시간배양시켰

38 다. 프로폴리스의항균활성은배양후실린더주변에생기는띠 (inhibition zone) 의반경을통해서결정하였다. 2.4 Culture broth method 을이용한 Bacillus cereus 의세포에대한프 로폴리스의활성검사 Agar diffusion assay에서사용한균주중프로폴리스에가장감수성이높은 B. cereus 균을가지고배양액에서의프로폴리스에대한감수성을실험하였다. 18시간동안배양된 B. cereus의균배양액이 10 6 CFU/ml 이되도록적절히희석하여 TSB에접종하였다. 희석된균배양액에농도가다른프로폴리스 (7.2 mg/ml, 1.8 mg/ml, 0.45 mg/ml) 를처리후 37 에서배양하였으며대조군으로멸균된증류수를사용하였다. 배양액안에서 B. cereus에대한프로폴리스의항균활성은배양후생성되는집락 (colony) 의수를통해서확인하였다. 2.5 Culture broth method 을이용한 Bacillus cereus 의포자에대한프 로폴리스의활성검사 Bacillus cereus의포자는위의 2.2 에서와같이준비하였다. 포자배양액을 10 5 ~10 6 CFU/ml 정도로희석하고다른농도의프로폴리스 (287.5 mg/ml, 575 mg/ml, 1150 mg/ml) 를처리후 37 에서 30시간배양시켰다. 대조군으로프로폴리스를첨가하지않은순수한 TSB를사용하였다. 포자배양액안에서포자에대한프로폴리스의항균활성은배양후생성되는집락의수를통해서확인하였다

39 2.6 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한프로폴리스의 항균활성검사 Bacillus cereus의세포 (10 8~9 CFU/ml) 에프로폴리스 7.2 mg/ml을 40 분간처리한군과프로폴리스처리하지않은군을대조군으로하여 TEM을통해서프로폴리스가 B. cereus의세포에미치는영향을확인하였다. TEM의표본을만들기위해서 B. cereus의세포를 13,000rpm 에서 5분동안원심분리하였다. 원심분리후아래가라앉은 pellet을 Modified Karnovsky s fixtive 2% paraformaldehyde 와 2% glutaraldehyde 이포함된 0.05M sodium cacodylate buffer (ph 7.2) 를이용해 4 에서 2~4시간동안세포를고정시켰다 (primary fixation). 고정후 10분동안 0.05M sodium cacodylate buffer을이용하여씻어내는작업을 3번반복하였다. 그리고나서 1% osmium tetroxide 이포함된 0.05M sodium cacodylate buffer을이용하여다시한번세포를고정한후증류수를이용해서 2번씻어내렸다 (post fixation). 30분동안 0.5% uranyl acetate 을이용하여염색한후 30, 50, 70, 80, 90, 100% EtOH을이용하여각각 10분간격으로탈수하였다 (dehydration). Propylene oxide 와 spurr s resin 이용하여 1:1, 0:1, 0:1의비율이되도록각각만들고각각 2시간, 12시간, 2시간동안반응시켰다 (infilteration). 만들어진표본은 70 에서 24시간동안건조 (polymerization) 한후 TEM(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany) 을이용하여검사하였다

40 3. 프로폴리스와열을이용한허들테크놀로지 3.1 Escherichia coli O157:H7 의 D 값과 Z 값실험 E. coli O157:H7의균배양액을적절하게희석하여 10 6 CFU/ml 로맞추었다. 1.0ml을멸균된 aluminum test cell에넣고 57±0.1 에서 0~20분, 60±0.1 에서 0~5분, 63±0.1 에서 0~2분간가열처리한후멸균된 0.1% peptone water로적절히희석하였다. 희석후 TSA에 0.1ml씩분주하여도말하고 37 에서 18시간배양한후생성된집락을계수하였다. D값은열처리후각온도에서계수된생균수를로그값으로치환하여 y축에, x축은처리시간으로하여그래프의기울기를가지고계산하였으며, Z값은각온도의 D값을로그값으로치환하여 y축에, x축은온도로하여그래프의기울기를가지고계산하였다. 3.2 프로폴리스첨가후 Escherichia coli O157:H7 의 D 값과 Z 값실험 E. coli O157:H7의균배양액을적절하게희석하여 10 6 CFU/ml 로맞추었다. E. coli O157:H7의균배양액 10ml에프로폴리스를처리하여프로폴리스농도를 8.98 mg/ml로맞추었다. 프로폴리스처리된균현탁액 1.0ml을멸균된 aluminum test cell에넣고 57±0.1 에서 0~2.5분, 60±0.1 에서 0~100초, 63±0.1 에서 0~50초간가열처리한후멸균된 0.1% peptone water로적절히희석하였다. 희석한후 TSA에 0.1ml씩분주하여도말하고 37 에서 18시간배양한후생성된집락을계수하였다. D값과 Z값은 3.1과같은방법으로구하였다

41 3.3 간돼지고기내 Escherichia coli O157:H7 의 D 값과 Z 값실험 마트에서구입한간돼지고기를 121 에서 20 분간살균하였다. 살균 한간돼지고기 10g 에적절히희석된 E. coli O157:H7 의균배양액 1.0 ml 을접종하여 10 6 CFU/g 로맞춘후균배양액이간돼지고기내잘 섞이도록하였다. 간돼지고기내에 E.coli O157:H7 균이잘부착될수있도록냉장온도에서 30분정도저장한후 1.0g을멸균된 aluminum test cell에넣고 57±0.1 에서 0~16분, 60±0.1 에서 0~4분, 63± 0.1 에서 0~2분간가열처리하였다. 가열처리후간돼지고기를 0.1% peptone water 9ml에넣고 E.coli O157:H7 균이잘떨어질수있도록 vortex 하였다. 적절히희석하여 TSA와 EMB(eosin methylene blue, Difco., BB Co.) 배지에각각 0.1ml씩접종하여도말하고 37 에서 18시간배양한후생성된집락을계수하였다. D값과 Z값은 3.1과같은방법으로구하였다. 3.4 간돼지고기내프로폴리스첨가후 Escherichia coli O157:H7 의 D 값과 Z 값실험 실험 3.3과같은방법으로간돼지고기에 E.coli O157:H7 균을접종시킨후간돼지고기 10g에프로폴리스를처리하여프로폴리스농도를 mg/g로맞추었다. 프로폴리스가간돼지고기내로적절히스며들수있도록 10 분간잘섞어준후냉장온도에서 30분정도저장하였다. 간돼지고기 1.0g을멸균된 aluminum test cell에넣고 57±0.1 에서 0~6분, 60±0.1 에서 0~4분, 63±0.1 에서 0~80초간가열처리한후가열처리후간돼지고기를 3.3와같은방법으로적절히희석하여 TSA와 EMB배지에접종하여도말하고 37 에서 18시간배양한후생

42 성된집락을계수하였다. D 값과 Z 값은 3.1 과같은방법으로구하였다. 4. 플라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water, PEW) 의살균효과 4.1 병원성균에대한 PEW 의살균력실험 본실험에서사용된병원성균은 Salmonella typhimurium (ATCC 19586), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Bacillus cereus (ATCC 10876), Escherichia coli O157:H7 (ATCC 35150) 를이용하였 다. 각각의균배양액을적절히희석하여 10 4~5 CFU/ml 로맞추었다. 플 라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water, PEW) 는 2L의수돗물에전기분해수발생기 (Cleaz, Haan, CSOL-200SL) 의살균모듈을이용하여 3분간작동시켜만들었다. 희석된균배양액에 PEW를 1, 3, 5, 7, 10분간노출시켰다. PEW 처리후살균된 0.1% peptone water를이용하여적절히희석하여 TSA에 0.1ml씩접종하여도말하고 37 에서 18시간배양하였다. 플라즈마전기분해수의살균효과는배양후생성된집락을계수하여측정하였다. 4.2 주방용품 ( 칼, 도마 ) 내 PEW 의살균력실험 주방용품 ( 칼, 도마 ) 을마트에서구입하여실험에사용하기전 121 에 서 20 분간살균하였다. 적절히희석된 E.coli O157:H7 균 0.1ml 을도 마와칼의칼날부분에떨어뜨려균을접종시켜최종농도가 10 6 CFU/cm 2 가되게하였다. 접종된주방용품을살균벤치에놓고균이 잘부착되도록 1 시간동안건조시킨후 4.1 과같은방법을통해생성 된 PEW 에칼과도마를 1, 3, 5 분간노출시켰다. 살균처리된칼과도

43 마의 50cm 2 면적을 swab(3m, BB Co.) 을이용하여균이접종된부분을문질러닦아냈다. 한번더 swab을이용해반복한후 0.1% peptone water를이용하여적절히희석하였다. 4.1과같은방법으로 TSA에도말하여 37 에서 18시간배양한뒤생성된집락을계수하였다. 4.3 플라스틱 ( 장난감용블록 ) 내 PEW 의살균력실험 장난감블록을마트에서구입하여사용하기전 121 에서 20분간살균하였다. E.coli O157:H7 균배양액을희석하여 10 5 CFU/ml 로맞춰진균현탁액에살균된장난감블록을 1분간넣어균을접종시켰다. 접종된장난감블록을살균벤치에놓고균이잘부착되도록 1시간동안건조시킨후 4.1 과같은방법을통해생성된 PEW에칼과도마를 1, 3, 5 분간노출시켰다. 살균처리한블록을 99ml 0.1% peptone water에넣고블록에부착되어있는균이잘떨어질수있도록 1분간힘껏흔들어주었다. 적절히희석하여 4.2와마찬가지로배양한뒤생성된집락을계수하여살균력을측정하였다. 4.4 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한 PEW 의항균 활성검사 PEW가병원성균인 Staphylococcus aureus의세포에미치는영향을 TEM을통해서확인하였다. PEW에 10분간노출시킨 S. aureus의표본을 2.6과같은방법으로실시한후 TEM(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany) 을이용하여검사하였다

44 5. 통계방법 각실험결과는 SAS Package (Statistical Analysis System, version 9.1. SAS Institute Inc., U.S.A.) 를이용하여분산분석 (Analysis of variance), Duncan의다중범위검정 (Duncan s multiple range test), t-검정 (Independent sample T test) 을실시하였다

45 Ⅳ. 결과및고찰 1. 프로폴리스의항균활성 1.1 병원성균에대한프로폴리스의항균활성 병원성균에대한프로폴리스의항균력은 agar diffusion assay를이용하였다 (Table 2). 프로폴리스처리후주변에생기는띠 (Inhibition zone) 의반경을측정한결과프로폴리스는 S. typhimurium, E. coli, P. fluorescence 균보다는 B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus 에대해서강한살균효과를가지는것으로보였다. 같은농도에서프로폴리스에대한감수성을비교하면그람양성균인경우에는실린더주변의띠의크기가크고선명하여살균효과를보이지만프로폴리스는그람음성균에대해서는항균효과가없어실린더주변에띠를형성하지못하였다. 그러나그람음성균인 P. fluorescence 균에대해서는높은농도에서약간의항균력을보였다. 실험결과일반적으로프로폴리스는그람음성균보다는그람양성균에대하여큰활성을가진것으로보였다. 그람양성균을같은농도에서프로폴리스에대한감수성을비교한결과사용된병원성균중에서특히 B. cereus에강력한항균활성을보였다 (Fig 1). B. cereus에프로폴리스를처리시생성되는띠는다른그람양성균에비해크고선명했으며낮은농도에서도살균효과를확인할수있었다. 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration: MIC) 는저해를나타내기시작하는물질의최소농도로프로폴리스의 MIC는 agar diffusion assay에서프로폴리스처리후실린더주변의띠형성정도로결정하였으며실험결과고체배지에서 B. cereus에대한프로폴리스의 MIC는 36 mg/ml 이었다. 에탄올을사용하여프로폴리스와항균력을비

46 교한결과에탄올은균의성장에는영향을미치지못한것으로보여실험에서사용한프로폴리스에탄올추출물의항균효과가에탄올때문이아님을입증하였다. Grange(1990) 와 Marcucci(1995) 외다수는 B. cereus, B. subtilis, L. monocytogenes, S. aureus 과같은그람양성균이프로폴리스에탄올추출물에더효과적인항균활성을보인다고보고하였고, 또 Fernandes (2001) 외다수는그람양성균과그람음성균에프로폴리스에탄올추출물을처리한결과그람양성균이더영향을받기쉽다고보고하였다. 이러한이유는프로폴리스에함유된 pinocembrin, galangin, caffeic acid, ferulic acid, pinobanksin, benzyl ester, sakuranetin, pterostilbene과 Table 2. Antibacterial effects of propolis on various foodborne pathogens microorganims propolis concentration (mg/µl) B.cereus S.aureus L.monocytogenes Sal.typhimurium E.coli P.flourescence no inhibition; + little inhibition; ++ moderate inhibition; +++ good inhibition

47 Fig1. Zone of inhibition of propolis ethanol extract against Bacillus cereus. 같은비휘발성물질때문이라고설명하였다. Mirzoeva(1997) 외다수는프로폴리스가가지는천연항균특징은프로폴리스에존재하는 cinnamic 과플라보노이드와같은구성성분들이세포질막에서세포활동에필요한에너지를제공하는에너지변환을감소시키고박테리아의이동을방해하기때문이라고보고하였다. 또한 Park(2008) 와 Kim(2007) 외다수는그람양성균에프로폴리스가더높은활성을보이는것은위에서언급한플라보노이드성분뿐만아니라그람양성균과그람음성균의세포막을구성하는구조의차이와성분에따라항균성성분의세포내투과성또는박테리아복제에관여하는 RNA polymerase 저해에의한세포벽합성저해때문이라고도언급하였다. 본실험결과프로폴리스가그람양성균에더강한항균활성은보이는것은이전의문헌들과비교해보았을때비슷한결과를확인할수있었다

48 1.2 Bacillus cereus 의세포에대한프로폴리스의항균활성 Bacillus cereus의균배양액내에서프로폴리스의항균효과는다음과같다 (Fig 2). 프로폴리스는 B. cereus의세포에대해서처리한농도에따라균의성장을억제하는정균효과와균을사멸하는살균효과를보였다. B. cereus의세포에프로폴리스 0.45 mg/ml를처리한결과대조군과비교해보았을때유의한차이를보였으며 (P<0.05) B. cereus의성장을저해하는정균효과 (bacteriostatic activity) 를보였다. 프로폴리스 1.8 mg/ml와 7.2 mg/ml의농도에노출되었을때는시간에따라유의적인차이를보이면서감소하였고 (P<0.05) 100분이되었을때는모두검출한계까지떨어져두개의농도에서모두살균효과 (bactericidal effect) 를보였다. 프로폴리스 7.2 mg/ml의경우에는초기균수인 log 5.48 CFU/ml 로부터 20분안에 log 2-3 CFU/ml 정도가감소하였고시간이지나 40분이되었을때는검출한계까지감소하여대부분의 B. cereus의세포는 20분이지났을때활성을잃었다. 액체배지에서 B. cereus에대한프로폴리스의항균작용은고체배지에서의 MIC 36 mg/ml 보다낮은농도로프로폴리스가균배양액즉, 액체배지에서더강한감수성을보이는것으로보였다. 본실험결과프로폴리스는 B. cereus의세포에대해서처리한프로폴리스의농도와처리한시간에따라정균효과또는살균효과를보였다 (P<0.05)

49 Fig 2. Inhibition of vegetative cells of Bacillus cereus in TSB in the presence of propolis at 37. ( ) no propolis ; ( ) propolis 0.45 mg/ml; ( ) propolis 1.8 mg/ml; (Χ) propolis 7.2 mg/ml

50 1.3 Bacillus cereus 의포자에대한프로폴리스의항균활성 Bacillus cereus의포자에대한프로폴리스의항균효과는다음과같다 (Fig 3). B. cereus 포자에대한프로폴리스의항균력을확인하기위해포자를 B. cereus의세포와같은농도로처리한결과항균효과를볼수없었고세포보다높은농도의프로폴리스와오랜처리시간을필요하였다. B. cereus의포자를프로폴리스 mg/ml 에서처리한결과포자는 30시간동안발아하지못하였으며, 대조군과비교하였을때유의한차이를보였다 (P<0.05). 포자에대한프로폴리스의살균효과를보기위해프로폴리스농도를높여 575 mg/ml, 1150 mg/ml 에서 30시간동안처리한결과 1 log정도의감소를보였지만프로폴리스농도간의유의적인차이는없었다 (P>0.05). 실험결과프로폴리스첨가는첨가하지않은군과유의한차이를보였지만 (P<0.05) 프로폴리스처리농도와시간의증가에따른유의한차이는없었고 (P>0.05) B. cereus 포자에대하여포자의성장을억제하는효과 (sporostatic effects) 로작용하였다. 프로폴리스는세포에비해포자에대해서는약한항균활성을가졌으며포자를사멸시키기위해서는높은농도와시간을필요로할것이라고생각되었다. 이는포자가영양결핍, 화학적소독제, 온도, 방사선, 건조상태와같은혹독한환경에대해서저항성을가지는포자의독특한구조때문에의한것으로보였다

51 Log CFU/ml Time (hour) Fig 3. Behavior of spores of Bacillus cereus in TSB in the presence of propolis at 37. ( ) no propolis ; (Χ) propolis 287.5mg/ml; ( ) propolis 575mg/ml; ( ) propolis 1150mg/ml

52 1.4 Transmission electron microscopy(tem) 을이용한프로폴리스의 항균활성 프로폴리스첨가시 Bacillus cereus 세포에미치는영향을전자현미경 (transmission electron microscopy; TEM) 을통하여관찰하였고결과는 Fig 4와같다. 대표적인간균류에속하는 B. cereus가 TEM 사진상에서는원형, 타원형등으로보이는것은 TEM 검사시얇게절단하는과정에의한것으로보였다. Fig 4(a) 사진은프로폴리스를첨가하지않은 B. cereus의세포로그람양성균의특징인두꺼운펩티도글루칸층 (peptidoglucan layer) 을확인할수있었고세포질과세포벽의경계가뚜렷하며세포벽이세포질을단단히감싸고있는모습이었다. 그리고맨오른쪽 TEM 사진을통해서 B. cereus가이분법을통해서증식하는것을확인할수있었다. Fig 4(b) 사진은프로폴리스 7.2 mg/ml를 40분동안처리한후 B. cereus의세포에나타나는변화를보여주는사진으로 (a) 와확연한차이를보였다. 단단하게세포질을감싸고있던세포벽이얇아지고경계가흐려지고점차세포벽이붕괴되면서세포내의물질들이빠져나오는것을관찰할수있었다. 세포벽의붕괴가진행됨에따라결과적으로세포는융해되었고 (b) 의마지막사진을통해서균이이분법하는과정에도프로폴리스가작용하여균의증식에영향을미치며결국균을사멸시킨다는것을확인할수있었다. TEM 사진을종합한결과프로폴리스를 B. cereus의세포에처리하게되면막투과성 (membrane permeability) 이소실됨에따라세포는팽창하게되고결국세포벽은파열되고이때세포질의내부구성성분들이빠져나와전반적인세포의분해가이루어져강력한살균효과를보이는것으로보였다

53 (a): without propolis (b): with propolis Fig 4. Transmission electron microscopy (TEM) investigation of antibacterial effects of propolis against Bacillus cereus

54 2. 프로폴리스와열을병용한허들테크놀로지 2.1 프로폴리스첨가유무에따른 Escherichia coli O157:H7 의열처리 효과 Escherichia coli O157:H7은그람음성대장균으로이전의 agar diffusion assay 실험에서그람양성균에비해그람음성균이프로폴리스에대한감수성이떨어지는것을확인하였다. 이번실험은 E.coli O157:H7에프로폴리스와열을함께처리하여프로폴리스첨가유무에따른열처리효과를확인하였다. 프로폴리스첨가유무에따른열처리효과는균의열저항성을나타내는 D값과 Z값으로확인하였으며 D값과 Z 값은 thermal-death-time curves(tdt) 를통하여결정하였다 (Fig 5, Fig 6). TDT를통해얻은 E.coli O157:H7의 D값과 Z값은다음과같다 (Table 3). 프로폴리스를첨가하지않고열처리하였을경우 E.coli O157:H7의 D값은각각 D 57 =7.33±1.33, D 60 =1.34±0.29, D 63 =0.85 ±0.04(min) 의결과를보였고 D값을통해산출한 Z값은 6.4 를얻었다. 이전에보고된 E.coli O157:H7의 D값은 D 50 =129.2, D 55 =27.1, D 60 = 2.4(min) 으로연구마다약간의차이를보였지만온도범위내에서비슷한 D값을확인할수있었다 (Kwon, 1997). 프로폴리스 8.98 mg/ml를 E.coli O157:H7의균배양액내소량첨가하여열처리를한경우 D값은각각 D 57 =0.53±0.02, D 60 =0.25±0.00, D 63 =0.17±0.00(min) 의값을얻었다. E.coli O157:H7에프로폴리스를소량첨가하여열처리한경우에는첨가하지않은경우보다 D값이유의적으로감소 (P<0.05) 하였고프로폴리스첨가가 E.coli O157:H7 균의열에대한감수성을증가시키는것으로보였다

55 Log CFU/ml Log CFU/ml (a) without propolis Time (min) (b) with propolis Time (min) Fig 5. Thermal-death-time curves of Escherichia. coli O157:H7 (a)without propolis (b) with propolis in culture: ( ) 57 ; ( ) 60 ; ( )

56 Log D-value 3 2 Z = 6.4 R² = Z = 10.3 R² = Temperature ( ) Fig 6. Thermal-death-time curves (z-values) of Escherichia. coli O157:H7 without propolis ( ); with propolis ( ) in culture. 본실험에서사용한프로폴리스의농도는 8.98 mg/ml으로 agar diffusion assay 실험당시 E. coli O157:H7에대해항균력을보이지않았던농도였으나프로폴리스와열을병용처리시열에의해 E.coli O157:H7의세포막이약해지고약해진세포막을통해세포질안으로프로폴리스의침투가용이하게되어열과프로폴리스의항균력이효과를보이는것으로보였다. 이로써열과프로폴리스의병용처리는 E.coli O15:H7 균주의프로폴리스에대한감수성을현저하게상승시켜본균주의살균에효과적이었다. 프로폴리스의첨가에따라 D값이감소한것에비해상대적으로 Z값은프로폴리스첨가후 6.4 에서 10.3 으로 3.9 정도증가하였고 (Fig 6), 항균제첨가에따른미생물의 Z값의증가는이전의연구에서도

57 Table 3. D and Z-values of Escherichia coli O157:H7 in the presence or absence of propolis in culture Temp.( ) D-values(r 2 ) heat alone heat + propolis ±1.33 1) (0.99) 2) 0.53±0.02(0.94)* ±0.29(0.99) 0.25±0.00(0.94)* ±0.04(0.89) 0.17±0.00(0.98)* Z-value(r 2 ) 6.4 (0.90) 10.3 (0.99) * Indicates that the value was significantly different (P<0.05) in the independent sample t test, at 5% significance level. 1) D-values shown are the means of three experiments, each performed in duplicate and expressed as mean±standard deviation. 2) Correlation coefficients in parenthesis. 비슷한결과를확인할수있었다. Steenstrup(2002) 외다수는 E.coli O15:H7이접종되어있는사이다에 malic acid, potassium sorbate, sodium benzoate와같은보존제비율을다르게하여첨가한후열처리한결과 Z값이 6.3 에서최대 26.5 까지증가한결과를보였고 Z값의증가는미생물이온도가증가함에따른민감도가감소함을의미한다고보고하였다. 따라서, E.coli O15:H7에프로폴리스와열을병용처리시프로폴리스와열에대한저항성은감소시키지만온도증가에대한감수성은감소한결과를얻었다

58 2.2 프로폴리스첨가유무에따른간돼지고기내 Escherichia coli O157:H7 의열처리효과 간돼지고기내프로폴리스첨가유무에따른 E.coli O157:H7 균의열처리효과는균배양액에서와마찬가지로 D값과 Z값으로확인하였으며 D값과 Z값역시 thermal-death-time curves(tdt) 를통하여결정하였다 (Fig 7, Fig 8). 프로폴리스를첨가하지않고열처리했을경우간돼지고기내접종된 E.coli O157:H7의 D값은각각 D 57 =4.88±0.23, D 60 =0.77±0.00, D 63 =0.37±0.00(min) 이었으며 D값을통해산출한 Z값은 5.4 를얻었다 (Table 4). 식품에서의 E.coli O157:H7 균의열저항성을측정한연구에따르면간쇠고기에접종한 E.coli O157:H7 균을 55~65 에서열처리하였을때각각 21.13, 4.95, 3.17, 0.93, 0.39(min) 의 D값을보였고간닭고기에서는 11.83, 3.79, 1.63, 0.82, 0.36(min) 의 D값을얻었다고보고하였다 (Juneja, 1997). Ahmed(1995) 과 Line(1991) 외다수는간돼지고기내의지방함량을다르게하여 E.coli O157:H7의열저항성을시험한결과전반적으로식품내의지방함량이높을수록 D값이증가하였고이실험결과는지방질의낮은열전도도에의한것이라고보고하였다. 이전의연구결과와실험결과와비교해보았을때간돼지고기내 E.coli O157:H7의 D값은온도에따라근소한차이를보였지만온도내에서비슷한결과를확인할수있었다. 그러나지방이함유된간돼지고기내에서의 D값이균배양액에서보다낮게나와이전의연구와차이를보였다. 이는살균과정에서간돼지고기내의지방이거의녹아열전도에영향을미치지못한것이라고사료되었다

59 Log CFU/g Log CFU/g (a) without propolis Time (min) (b) with propolis Time (min) Fig 7. Thermal-death-time curves of Escherichia coli O157:H7 (a) without propolis (b) with propolis in ground meat: ( ) 57 ; ( ) 60 ; ( )

60 Log D-value 3 2 z = 5.4 R² = z = 5.5 R² = Temperature ( ) Fig 8. Thermal-death-time curves (z-values) of Escherichia coli O157:H7 without propolis ( ); with propolis ( ) in ground meat mg/g 와열을병용하여처리한결과간돼지고기내 E.coli O157:H7의 D값은각각 D 57 =2.98±0.02, D 60 =0.46±0.03, D 63 =0.26 ±0.02(min) 의값을얻었으며간돼지고기내에서도프로폴리스첨가유무와관계없이배양액에서와마찬가지로열처리시간이증가함에따라 logarithmic하게감소하는것을확인할수있었다. 간돼지고기내프로폴리스의처리농도를균배양액에서와같은농도인 8.98 mg/g를첨가하고열처리한결과 D값은프로폴리스를처리하지않은군에비해약간의감소를보였지만유의적인차이를보이지않았다 (P>0.05). 그러나간돼지고기내프로폴리스농도를 mg/g으로증가하여열처리한결과처리하지않은군보다 D값이유의적으로감소한것을확인할수있었다 (P<0.05). 그결과식품에서는균배양액보다

61 Table 4. D and Z-values of Escherichia coli O157:H7 in the presence or absence of propolis in ground meat Temp.( ) D-values(r 2 ) heat alone heat + propolis ±0.23 1) (0.98) 2) 2.98±0.02(0.89)* ±0.00(0.99) 0.46±0.03(0.93)* ±0.00(0.99) 0.26±0.02(0.95)* Z-value(r 2 ) 5.4 (0.94) 5.5 (0.92) * Indicates that the value was significantly different (P<0.05) in the independent sample t test, at 5% significance level. 1) D-values shown are the means of three experiments, each performed in duplicate and expressed as mean±standard deviation. 2) Correlation coefficients in parenthesis. 프로폴리스에대한감수성이떨어져높은농도를필요로하는것으로보였다. 간돼지고기에서 E.coli O157:H7의 Z값은프로폴리스를처리하지않았을때 5.4 에서프로폴리스 mg/g를처리하였을때는 5.5 로큰차이를보이지않았다. 이는균배양액에서의 Z값이프로폴리스처리에의해 6.4 에서 10.3 로증가한것과는차이를보였으며식품에서는프로폴리스의첨가가 E. coli O157:H7의온도변화에대한감수성에덜영향을미치는것으로보였다. 본실험결과, 균배양액뿐만아니라간돼지고기내열과프로폴리스의병용처리는 E.coli O15:H7 균주의프로폴리스와열에대한감수성을현저하게상승시켜본균주의살균에효과적이었고식품내에서병원성

62 균을조절하여식품의보존성을높일수있는가능성을보였다. 간돼지고기내프로폴리스첨가에따른 E.coli O157:H7의열손상정도를알아보기위하여일반배지 (TSA) 와선택배지 (EMB) 를이용하여배양하였다. TSA(triptic soy agar) 배지는충분한영양성분이있어열에의해손상된세포들도회복이가능하고다시성장할수있는특징을가지지만 EMB(eosin methylene blue) 배지는대장균군외의균의성장을억제하는성분이있어손상된세포는성장이억제되며건강한세포만생육할수있다. 이러한배지의특징을이용하여열과프로폴리스병용처리에의해서손상받은세포의정도를파악하였다 (Fig 9). Fig 9 (a) 는 E.coli O157:H7 균이접종된간돼지고기를단독으로열처리만한결과이며 Fig 9 (b) 는프로폴리스와열을병용처리한결과이다. 프로폴리스를첨가하지않은군과프로폴리스를처리한군간의각온도에따라비슷한처리시간별로 TSA와 EMB의생균수간의차이를살펴보았다. 57 4분에서는열처리시 log 0.2, 열과프로폴리스병행시 4.5 분에서는 log 0.92으로정확히같은시간의열처리는아니었지만증가한결과를보였다. 60 1분에서는 log 0.08에서 0.13으로조금증가하였고, 2분에서는 log 0.98에서 0.71로감소한듯하나프로폴리스를첨가하였을때생균수가 >log 4이상감소하여사멸효과가손상효과보다큰것으로보였다. 63 1분에서도 log 0.86에서 0.11으로증가한결과를보였으며병용처리시생존수에있어서도큰감소를보였다. 실험결과 TSA와 EMB의차이를통해 E.coli O157:H7의손상정도를파악해보면, 각온도 (57, 60, 63 ) 마다프로폴리스를첨가한군이 TSA와 EMB의차이가증가하였고, E.coli O157:H7의열에의한손상이증가하는것으로보였다. 프로폴리스와열을병용하여처리한결과병원성균에대한항균작용에있어서열저항성은감소시키고프로폴리스에대한감수성은증가시키는상승효과를갖는것으로보였다

63 Log CFU/g (57 ) Log CFU/g (60 ) Log CFU/g (63 ) Fig 9. Degree of injury by heat and combined treatment of heat and propolis on TSA and EMB media ( )TSA ; ( )EMB (a) without propolis Time (min) Time (min) Time (min)

64 Log CFU/g (57 ) Log CFU/g (60 ) Log CFU/g (63 ) (b) with propolis (35.92 mg/g) Time (min) Time (min) Time (min)

65 3. 플라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water: PEW) 의살균효과 3.1 병원성균에대한 PEW 의살균효과 본실험에서플라즈마전기분해수 (plasma electrolyzed water: PEW) 의살균효과는 PEW 처리후에생성된균의집락을통해서측정하였다. 다양한병원성균 (Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium) 에대한 PEW의살균효과는다음과같다 (Fig 10). E.coli O157:H7의초기균수는 log 4.94±0.09 CFU/ml로 1분간살균처리한후 3.52 CFU/ml가감소하였고 3, 5분후에도계속감소하여 7분과 10분에는모두살균되어균이집락을형성하지못하였다. 즉, PEW에노출시킨지 10분안에검출한계까지내려가 >99.9% 의살균력을보였다. Sal. typhimurium와 S. aureus는살균처리하기전초기균수 log 4.59±0.2 CFU/ml, log 4.74 ±0.17 CFU/ml에서 1분간살균처리후집락이형성되지않아검출한계까지감소한결과를보여 E.coli O157:H7 보다 PEW에더강한감수성을가진것으로보였다. 반면 B. cereus는다른병원성균에비해낮은초기균수인 3.61±0.27 CFU/ml로 PEW 처리 1분후 log 2.18 CFU/ml 정도가감소하여 log 1.43±0.43 CFU/ml까지떨어졌지만검출한계까지감소하지못하고살균처리 10분후에도집락이검출되었다. 결과 B. cereus에대한 PEW의살균효과는다른세종류의병원성균에비해떨어지는것으로보였다. 이전의논문에서도 Bacillus 균을포함한여러병원성균을가지고처리한결과 Bacillus에대한산성전해수의항균효과는다른균에비해서떨어진다고보고되었으며 (Hung, 2000), PEW 역시 Bacillus 균에대한살균효과는다소떨어지는비슷한결과를확인할수있었다

66 log CFU/ml 결과적으로초기균수가 5 log를가진병원성균에대해서 PEW를이용하여살균처리시 10분안에 3 log 정도의감소 (>99.9%) 를보였다. PEW의살균효과는그람양성균과그람음성균간의차이는보이지않았으며노출시킨시간에따른유의적인차이는없었다 (P>0.05). PEW 의항균효과는 Venkitanarayanan(1999), Fabrizio(2003), Vorobjeva (2003) 외다수에의해서보고된문헌의산성전해수의살균효과와유사한결과를보였다 Tap water 1min 3min 5min 7min 10min Treatment (min) Fig 10. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water foodborne pathogens in bacterial cultures; ( ): E.coli O157:H7, ( ): S. aureus, ( ): S. typhimurium, ( ): B. cereus; All values are mean±se. Values with different superscript letters (a,b) are significantly different at 0.05 level by Duncan s test

67 3.2 주방용품 ( 칼, 도마 ) 에접종된 E. coli O157:H7 에대한 PEW 의살균 효과 주방용품내 PEW의살균효과는다음과같다 (Fig 11). 주방용품내 E.coli O157:H7균을접종한후아무처리도않은군을초기균수로나타내었고수돗물과 PEW로처리후생성된균의집락을통해서측정하였다. Fig 11. (a) 는주방용품중칼에서 PEW의항균효과로수돗물로처리하였을때는 E.coli O157:H7의초기균수 log 5.18±0.22 CFU/cm 2 에서 4.27±0.19 CFU/cm 2 정도로 1 log 정도감소하였지만유의적인차이는보이지않았다 (P>0.05). PEW로각각 1, 3, 5 분처리하였을때는 log 2.77± ±0.5, 1.93±0,08 CFU/cm 2 로감소하였고수돗물로처리한대조군과비교한결과 3, 5 분처리하였을때유의적인차이로감소하여 PEW의항균효과를확인하였다 (P<0.05). 그러나 PEW 처리시간의증가에따른감소는유의적인차이를보이지않았다 (P>0.05). Fig 11. (b) 는주방용품중도마에서 PEW의항균효과이다. 도마의경우수돗물로처리하였을때초기균수 log 5.24±0.16 CFU/cm 2 에서 log 2.93±0.08 CFU/cm 2 로칼보다크게감소하여유의적인차이를보였다 (P<0.05). PEW로각각 1, 3, 5 분처리하였을때는초기균수에서 log 2.0±0.0, 2.0±0.0, 2.0±0.0 CFU/cm 2 으로감소하였다. 대조군인수돗물로처리한것과각각비교해보았을때는 1, 3, 5 분처리하였을때모두유의적인차이로감소하였고도마에서도 E.coli O157:H7에대한 PEW의항균효과를확인하였다 (P<0.05). 그러나칼과마찬가지로 PEW 처리시간의증가에따른유의적차이를보이지않았다 (P>0.05)

68 (a): Knife a ab Log CFU/cm bc c c Initial population Tap water 1min 3min 5min Treatment (b): Cutting board a Log CFU/cm b c c c Initial population Tap water 1min 3min 5min Treatment Fig 11. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Escherichia coli O157:H7 on kitchen utensils. (a):knife; (b):cutting board. All values are mean±se. Values with different superscript letters (a,b,c) are significantly different at 0.05 level by Duncan s test

69 실험결과주방용품중칼과도마에서모두 PEW는 E. coli O157:H7 에대하여 >99.9% 의강한항균효과를보였다. PEW는칼보다는도마에접종된 E. coli O157:H7 에대해더강한항균효과를보였으며, 시간에따른유의적인차이는없었다 (P>0.05). 실험결과는주방용품내에서식중독균에대한 PEW의항균효과를다룬이전의연구들과일치하는결과를보였다 (Venkitanarayanan, 1999b; Guentzel, 2008). 3.3 플라스틱 ( 장난감용블록 ) 에접종된 E. coli O157:H7 에대한 PEW 의 살균효과 장난감용블록내 PEW의살균효과는다음과같다 (Fig 12). 수돗물로처리하였을때는초기균수 log 5.54±0.46 CFU/ml에서 3.8±0.6 CFU/ml로감소하였지만유의적인차이를보이지는않았다 (P>0.05). PEW로블록을각각 1, 3, 5 분처리하였을때는초기균수에서 log 2.27± ±0.39, 2.15±0.15 CFU/ml로감소하였다. 수돗물로처리한군과비교한결과 1, 5 분처리하였을때유의적인차이로감소하였으며 (P<0.05), 장난감블록에접종된 E. coli O157:H7에대해서도 PEW이살균효과를가짐을확인할수있었다. 그러나주방용품과마찬가지로 PEW 처리시간의증가에따른감소는유의적인차이를보이지않았다 (P>0.05) 실험결과 E. coli O157:H7이접종된플라스틱블록과주방용품의표면에 PEW 처리시살균효과를보였지만그효과는병원성균배양액내 PEW의항균효과보다는낮은결과를보였다

70 Log CFU/ml a 5.0 b c bc c Initial population Tap water 1min 3min 5min Treatment Fig 12. Antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Escherichia coli O157:H7 on toy blocks. All values are mean±se. Values with different superscript letters (a,b,c) are significantly different at 0.05 level by Duncan s test. 3.4 Transmission electron microscopy (TEM) 를이용한 PEW 의살균 활성 PEW에처리한 S. aureus의 TEM의결과는 Fig 13 이다. PEW에노출되지않는 S. aureus의세포는세포질과세포벽의경계가뚜렷하고꽤두꺼운세포벽이관찰되었으며세포질을단단히감싸고있는모습이었다. 그러나 PEW에노출된 S. aureus의세포는전자현미경결과곳곳에서단단한세포벽의경계가흐려지고, 세포벽과세포질간의결합력이떨어짐이관찰되었다. 그리고세포벽이붕괴되면서세포내의물질들이빠져나와결과적으로융해되는모습을보였다 (Fig 13 (b))

71 따라서 PEW를처리하게되면 S. aureus의막투과성이소실됨에따라세포는팽창하게되고, 세포막이파괴되면세포질의내부구성성분들이빠져나와전반적으로세포의분해가이루어져강력한살균효과를보이는것으로보였다

72 (a): No treatment (b): Treatment of plasma electrolyzed water (PEW) Fig 13. Transmission electron microscopy (TEM) investigation of antibacterial effects of plasma electrolyzed water against Staphylococcus aureus