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용림 영
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1 대한내과학회지 : 제 70 권제 5 호 2006 감염성심내막염환자에서 16S rrna 유전자염기서열분석을통한 Gemella 동정 2예 성균관대학교의과대학삼성서울병원내과 1, 아시아태평양감염연구재단 2 손경목 1 고관수 2 김정 1 이지영 1 오원섭 1, 2 백경란 1, 2 송재훈 1, 2 =Abstract= Identification of Gemella species by 16S ribosomal RNA gene sequencing from two patients with infective endocarditis Kyung-Mok Sohn, M.D. 1, Kwan Soo Ko, Ph.D. 2, Jeong Kim, M.D. 1, Ji-Young Rhee, M.D. 1, Won Sup Oh, M.D. 1,2, Kyong Ran Peck, M.D. 1, 2 and Jae-Hoon Song, M.D. 1, 2 Department of Internal Medicine 1, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea; Asian-Pacific Research Foundation for Infectious Diseases (ARFID) 2, Seoul, Korea Gemella species are opportunistic pathogens, which cause endocarditis, meningitis, musculoskeletal infections, or pulmonary infections. It is difficult to identify all strains of these species by a conventional culture system. Because 16S rrna gene has the interspecific polymorphisms to differentiate the bacterial species, 16S rrna gene sequence analysis could be used to identify these pathogens. To determine the molecular types of two unidentified Gram-positive cocci from two patients with infective endocarditis, PCR amplification and DNA sequencing of the 16S rrna gene were performed. These sequences of the PCR product were compared with known 16S rrna gene sequences using GenBank BLAST search. The 16S rrna gene sequences of two isolates showed > 99% nucleotide similarities with those of Gemella morbillorum (GenBank accession number L14327). Phylogenetic analysis also indicated the close relatedness between these isolates and G. morbillorum. (Korean J Med 70: , 2006) Key Words : Gemella, 16S rrna, Endocarditis 서론 Gemella 속 (genus) 은카탈라아제 (catalase) 음성, 조건무산소성 (facultative anaerobic) 그람양성구균으로현재까지 6종이알려져있다. 이중동물에서분리되는두종을제외한나머지 4종은사람의구강, 상기도혹은 접수 : 2005년 3월 20일 통과 : 2005년 6월 2일 교신저자 : 백경란, 서울시강남구일원동 50, 성균관대학교의과대학삼성서울병원감염내과 ( ) krpeck@smc.samsung.co.kr 소화관의점막에상재균으로존재한다. 하지만간혹면역기능이저하된환자에게치명적인기회감염을일으킬수있다 1). 대표적인감염증으로는감염성심내막염이있으며, 그외에도뇌수막염, 근골격계감염, 폐농양, 농흉, 균혈증등이보고되어있다 2, 3). 사슬알균 (Streptococcus species) 에의한심내막염

2 -The Korean Journal of Medicine : Vol. 70, No. 5, 예를분석한연구에서 viridans streptococci의 6%, 모든동정된균의 5% 가 Gemella 종에의한것으로나타났고 4), 또다른단일병원의 70예의심내막염에서동정된균들중 viridans streptococci의 13.3%, 모든동정된균의 2.9% 가 Gemella 종에의한것이었다 5). Gemella 종은그람염색과정에서쉽게탈색되고쌍을이루거나뭉쳐있는형태로보일수있기때문에흔히다른세균으로오인되거나동정이안되는경우가많다 5). 일반적으로미생물검사실에서시행하는그람염색과생물형분석 (biotyping) 은 Gemella 종의정확한동정이어려워전혀다른균주로보고되기도하여, 판독착오를줄이기위한여러가지방법들이제안되고있다 5). 그중에서분자생물학적기법으로 16S rrna 유전자염기서열분석이 Gemella 혹은 Gemella 유사종들을동정하는데있어가장적절한방법으로제시되고있다 5, 6). 16S rrna 유전자는같은속에포함된종들간에그리고종내부에도잘보존되어있어세균들을분류하는새로운표준으로사용할수있다 7). 본원의임상미생물검사실에서 2명의심내막염환자의혈액배양검사에서생물형분석을통하여동정이되지않는균주들이보고되었으며적절한치료를위하여빠르고정확한동정을할필요가있었다. 유전자형결정을위하여 16S rrna 유전자에대한중합효소연쇄반응과염기서열분석을실시하였으며이를통해심내막염의정확한원인균을밝혀임상적으로환자의치료에정보를제공할수있었다. 증례증례 1 심실중격결손으로진단을받았으나특별한치료를받지않은 41세남자환자가타병원에서감염성심내막염으로진단받고항생제치료를받던중에본원으로전원되었다. 경흉부심초음파검사에서 cm 크기의심실중격결손과함께대동맥판막, 삼첨판, 폐동맥판막, 우심실벽에여러개의증식물 (vegetation) 이관찰되었다. 내원후 2일째혈액배양검사 (BACTEC 9240, BD, USA) 에서그람양성구균 (SMC-5676) 이자란다고보고가되었고, 5일째 Streptococcus viridans group으로 cefotaxime, vancomycin, erythromycin에감수성이있는것 (API 20 STREP, Biomerieux, France) 으로보고되 었다. 그러나 viridans streptococci와는다른생물형을보여확정적인동정을하지못하여아시아태평양감염연구소에핵형분석을의뢰하였다. 분석결과를바탕으로 penicillin과 gentamicin 투여와심실중격결손에대한수술을시행한후호전되어외래추적관찰중이다. 증례 2 51세여자환자가갑자기말이어눌해지면서오른쪽팔에힘이빠져본원응급실에내원하였다. 환자는뇌전산화단층촬영상에서뇌경색으로진단되어신경과로입원하였으나, 발열이지속되고범수축기잡음이심첨부에들려혈액배양검사및경식도심초음파를실시하였다. 심초음파상에서심한승모판폐쇄부전과승모판에서증식물을확인할수있었다. 혈액배양검사에서그람양성구균 (SMC-9949) 이자랐으나, 미생물검사실에서는더이상의동정이불가능하여아시아태평양감염연구소로핵형분석을의뢰하였다. 분석결과를바탕으로 ampicillin을투여하였고, 승모판치환술후호전되어현재외래에서추적관찰중이다. 핵형분석방법및결과 1. 16S rrna 유전자염기서열분석을위한 DNA 추출아시아태평양감염연구소로이송된두균주의전체 DNA를추출하기위하여 simple boiling-lysis method 를이용하였다. 균집락을 lysis buffer (100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, and 1% Triton X-100) 에잘섞은후 90 에서약 10분간배양후, 잠깐원심분리하여 aqueous phase를 PCR에이용하였다. 2. 중합효소연쇄반응 (PCR) 과 16S rrna 유전자염기서열분석분리된 DNA와대조군을 0.5 M primer (16S-F0, 5'-GAT CCT GGC TCA GGA AC-3'; 16S-R0, 5'-CTT GTT ACG ACT TCA CCC CA-3'; Bioneer, Daejeon, Korea) 를이용하여증폭하였다. 50 L의 PCR 혼합물은세균의 DNA, PCR buffer (10 mm Tris/HCl, ph 8.3, 50 mm KCl, 2 mm MgCl 2, 0.01% gelatin), 200 M의 dntp, 1.0 U의 Taq 중합효소 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 로구성되었다. 이혼합물은 94 에서 30초 (denaturation), 58 에서 30초

3 - Kyung-Mok Sohn, et al : Identification of Gemella species by 16S rrna gene sequencing SMC-5676 SMC-9949 Gemella morbillorum Gemella haemolysans 2 Gemella cuniculi Gemella bergeri 1 Gemella haemolysans 1 Gemella sanguinis Gemella bergeri 2 Gemella palaticanis Figure 1. Phylogenetic relationships of Gemella species based on 16S rdna sequences. (annealing), 72 에서 1분 (extension) 간총 35회 (cycles), final extension은 72 에서 10분간진행하여증폭하였다 (Perkin-Elmer Cetus, Gouda, Netherlands). PCR purification kit (CoreOne, Seoul, Korea) 를이용해 purification 를하고나서 ABI 3710 자동화염기서열분석장치 (Perkin-Elmer, Foster City, California, USA) 로 primers 16S-F0, 16S-R0, 그리고 16S-F5 (5'-TAT TGG GCG TAA AGC GAG CGC-3') 을사용하여두번염기서열을분석하였다. 분석된염기서열은 BLAST search를이용하여 GenBank에있는알려진 16S rrna 유전자염기서열과비교하였다. 그리고 CLUSTALX program 을이용하여염기서열들을정렬한후 Neighborjoining 방법을이용하여계통도를작성하였다 ( 그림 1). 3. 결과 SMC-5676은 1354bp의 DNA 염기서열분석결과 99.1% 의유사도로 Gemella morbillorum으로동정되었다 (GenBank accession no. L14327). 이결과는다시미 생물검사실로보고되었으며 ANI card (Biomerieux, France) 로재검하여 Gemella 종을확인할수있었다. SMC-9949도 1390bp의 DNA 염기서열분석결과 99.0% 의유사도로 Gemella morbillorum으로동정되었다 (GenBank accession no. L14327). 16S rrna 유전자분석을바탕으로동정된두균주의계통발생학적관계는그림 1과같으며, Gemella 종들과의유사도는표 1과같았다. 고찰 Gemella 종은사람과항온동물의점막에상재하는균으로, 드물게기회감염을일으킨다. 전자현미경과 DNA 분석상전형적인그람양성균의세포벽을가지고있으나두께가얇아 (10~20 nm) 염색과정에서쉽게탈색되어그람음성균으로오인되기도한다 5). 실제로 Gemella haemolysans는 1938년에그람음성균인 Neisseria haemolysans 로처음기술되었다. 이후생화학적으로 Neisseria 종들과는전혀다르다는것이밝혀졌고, 1961년에 Gemella 속이제안되었다 8). Gemella morbillorum은 1917년에 42명의초기홍역환자들로부터동정되었고 Diplococcus rubeolae로명명되었다 9). 이후 Diplococcus morbillorum으로불리다가혐기성균인 Peptostreptococcus 속에포함되었다. 그러나주요대사산물로 lactic acid가발견되면서다시 Streptococcus 속으로분류되었다가 1988년에 16S rrna 유전자염기서열분석, DNA-DNA 부합화 (hybridization), G+C 함량분석등을통해 Gemella 속으로재분류되었다 10). 1998년에사람으로부터 Gemella bergeriae와 Gemella sanguinis 가분리되었고, Gemella palaticanis는개의인두에서 Gemella cunicula는토끼의하악선에서분리되어보고되었다 11, 12). Gemella 는주로혈관내감염을일으켜지금까지세 Table 1. Dissimilarities of 16S rrna gene sequences between SMC strains and other Gemella species G. morbillorum G. cuniculi G. haemolysans G. sanguinis G. palaticanis G. bergeri SMC % 3.0% 1.1~1.4% 2.2% 5.6% 4.7~5.2% SMC % 3.4% 1.3~1.7% 2.4% 5.5% 4.6~5.2%

4 - 대한내과학회지 : 제 70 권제 5 호통권제 549 호 계적으로약 35건의 Gemella에의한심내막염이보고되어있다 13). 이외에도뇌수막염, 관절염, 폐농양, 농흉, 관절치환술후감염, 골수염, 균혈증등을일으키는것으로알려져있다 2, 3). Gemella 종의항생제감수성은 viridans Streptococci 와유사하여 penicillin 및 3세대 cephalosporin에가장감수성이높다. Vancomycin, chloramphenicol, rifampin 에도감수성이있으며일부균주는 tetracycline, erythromycin에도감수성이있는것으로알려져있다 4, 5, 14). 대부분의경우 benzyl penicillin 혹은 amoxicillin을 gentamicin과병합하여성공적으로치료하였다 2). 국내에서보고된 Gemella haemolysans에의한심내막염 1 례는 vancomycin, gentamicin, ceftriaxone으로성공적으로치료하였다 14). Gemella는쌍으로혹은 4개씩뭉쳐서보이기도하며짧은사슬을형성하기도한다. 때로는길쭉한세포모양을보이기도한다. 이러한그람염색과형태학적특성으로동정이애매한경우가많으며, 판독오차를줄이기위한여러가지방법들이제안되어있다. 전자현미경으로세포벽의구조를확인하는방법이나 16S rrna 유전자염기서열분석, 세포벽내지방산분석, vancomycin과 colistin에대한감수성을이용하는방법등이있다 5). 항생제감수성을이용하는방법은 vancomycin에내성인 Gemella haemolysans가알려져있어한계가있다 15). 세포벽내지방산분석은확정적인동정을할수없고, 전자현미경의사용은정확하기는하나시간과비용이많이들어가고특수한장비가필요하다 5). 따라서 16S rrna 유전자증폭및염기서열분석법이확진을위한가장정확한방법으로제안되고있다 6). 16S rrna 유전자는모든유박테리아 (eubacteria) 에서매우잘보존되어있고, 유전자사이사이에다양한염기서열을가진부분들이있다. 분리도비교적용이하며보존적특성으로다양한비교분석이가능하고종의수준까지분석이가능하여새로운종을찾는데활용되기도한다. 일반적으로 16S rrna 유전자의유사도가 97% 이하일경우 DNA-DNA 유사도가 70% 이하이고, 다른종으로간주된다 16). 그러나이러한 rrna 유전자염기서열분석만을사용하여계통학적으로동정하는것은한계가있다. rrna 유전자염기서열분석에의한정보가 DNA-DNA 유사도나표현형과일치하지않는경우가있다 17, 18). 전혀다른종임에도 16S rrna 유전자염 기서열이일치하는경우도있고, 반대로같은종내의다양성도존재한다. 따라서 16S rrna 유전자염기서열이일치한다고해서반드시같은종은아니다 16). 그러므로최종적인판단은데이터베이스의질과유사성을고려하여개별적으로이루어져야한다. 미생물검사실의결과와 16S rrna 유전자염기서열분석을통한결과의비교연구를살펴보면 Streptococcus pneumoniae 이외의 α-hemolytic streptococci 균혈증 302예에서 95% 이상의신뢰도로 API system (20 STREP) 와 Vitek system (GPI) 모두 Gemella 를판별해내지못하였으며 95% 미만의신뢰도에서는 74예가 Gemella로동정되었다. API system은 G. morbillorum 을 Leuconostoc sp. ( 신뢰도 60%), Streptococcus mitis (28%) 로 G. haemolysans는 G. haemolysans (94%), G. morbillorum (6%) 으로동정하였다 6). 본증례들에서는임상미생물검사실의생물형분석으로는동정이되지않는균주를확인하기위해서 16S rrna 유전자의염기서열을분석하였고, 이미알려진데이터베이스의염기서열과비교하여종을확인할수있었다. 또한이러한결과를바탕으로생물형분석을다시시행하여 Gemella 종을확인하였다. Millar 등 19) 에의하면 PCR과염기서열분석은배양음성심내막염의경우에한하여사용해야한다고했으나, Gauduchon 등 5) 은 1) 감염성심내막염을거의일으키지않는균주에의한심내막염 2) 혈액배양이단한번만양성인경우 3) 동정된균이애매할때 4) 비감염성이유로판막치환을했으나조직소견상심내막염에합당할경우에는 PCR 증폭과 rrna 유전자염기서열분석이유용하다는것을보여주고있다. 또한감염성심내막염의새로운주진단기준으로 16S rrna 유전자분석과같은분자생물학적기법이제안되고있다 19). 하지만일반적으로 rrna 유전자분석은현재시행하고있는임상미생물검사들보다민감도가떨어진다. 539개의임상에서얻은검체를대상으로광범위세균의중합효소연쇄반응과 rrna 유전자분석을시행한결과 rrna 유전자분석은배양및임상적판단과비교하여민감도는 74.2%, 특이도는 98.7~99.6% 로나타났으며, 현재로서는배양이까다로운균이나항생제사용중에얻은검체에서 rrna 유전자분석이배양보다우월한것으로나타났다 20). 또한 rrna 유전자분석은항생제감수성을알수없다는단점이있다

5 - 손경목외 6 인 : 16S rrna 유전자염기서열분석을통한 Gemella 동정 - 결론적으로 16S rrna 유전자염기서열분석은노력과비용이많이들고, 장비가갖추어져있어야하나, 추가적인생물형검사나특이적항체검사를시행하지않아도되고, 새로운병원균을찾아낼수있으며, 장비만있다면실험실간의동정결과의차이가없다는장점이있다 2). 또한여러연구결과에서배양하기가까다로운균이나항생제사용중에얻은검체, 배양음성심내막염등에서는그유용성이알려져있다. 그리고위의예에서살펴본바와같이동정결과가애매한균주의경우 16S rrna 유전자분석이정확한정보를제공할수있다. 앞으로추가적인연구가진행되고분자생물학적기법이발달함에따라임상에서의활용도가증가할것으로예상된다. 요약 Gemella 속은항온동물의점막에상재하는그람양성구균으로염색과정에서쉽게탈색되고, 그형태도다양하게나타나정확한동정이어려운경우가많다. 이러한 Gemella 속은 16S rrna 유전자염기서열분석으로정확한동정및분류가가능하다. 임상미생물검사실에서는동정이되지않는심내막염의원인균을경험하였으며빠르고정확한동정을통해실제환자치료에정보를제공할목적으로 16S rrna 유전자염기서열분석을실시하여 BLAST 검색을통해 GenBank 데이터베이스와비교하였다. 두균주모두 Gemella morbillorum의 16S rrna 유전자염기서열과 99% 이상의유사도를보였으며, Gemella morbillorum을동정할수있었다. 이결과를바탕으로임상에서환자를성공적으로치료할수있었다. 중심단어 : 심내막염, 유전자염기서열분석 REFERENCES 1) Collins MD, Hutson RA, Falsen E, Sjoden B, Facklam RR. Description of Gemella sanguinis sp. nov., isolated from human clinical specimens. J Clin Microbiol 36: , ) Debast SB, Koot R, Meis JF. Infection caused by Gemella morbillorum. Lancet 342:560, ) Garcia-Lechuz JM, Cuevas-Lobato O, Hernangomez S, Hermida A, Guinea J, Marin M, Pelaez T, Bouza E. Extra-abdominal infections due to Gemella species. Int J Infect Dis 6:78-82, ) Durack DT, Kaplan EL, Bisno AL. Apparent failures of endocarditis prophylaxis: analysis of 52 cases submitted to a national registry. JAMA 250: , ) la Scola B, Raoult D. Molecular identification of Gemella species from three patients with endocarditis. J Clin Micribiol 36: , ) Woo PC, Lau SK, Fung AM, Chiu SK, Yung RW, Yuen KY. Gemella bacteremia characterized by 16S ribosomal RNA gene sequencing. J Clin Pathol 56: , ) Olsen GJ, Woese CR. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J 7: , ) Berger U. The sensitivity of Gemella haemolysans to some commonly used antibiotics. Arch Hyg Bakteriol. 144:12-16, ) Tunnicliff R. The cultivation of a micrococcus from blood in pre-eruptive and eruptive stage of measles. JAMA 68: , ) Valipour A, Koller H. Pleural empyema associated with Gemella morbillorum : report of a case and review of the literature. Scand J Infect Dis 37: , ) Hoyles L, Foster G, Falsen E, Collins MD. Characterization of a Gemella-like organism isolated from an abscess of a rabbit: description of Gemella cunicula sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 50: , ) Collins MD, Rodriguez Jovita M, Foster G, Sjoden B, Falsen E. Characterization of a Gemella-like organism from the oral cavity of a dog: description of Gemella palaticanis sp. nov. Int J Syst Bacteriol 49: , ) Elsayed S, Zhang K. Gemella bergeriae endocarditis diagnosed by sequencing of rrna genes in heart valve tissue. J Clin Microbiol 42: , ) 김윤철, 이민수, 김보영, 이정우, 강정아, 임대승, 김정희, 성보영, 최성준, 성인환, 전은석. 심실중격결손에서 Gemella haemolysans 에의해유발된감염성심내막염 1 예. 순환기 30: , ) Reed C, Efstratiou A, Morrison D, Woodford N. Glycopeptide-resistant Gemella haemolysans from blood. Lancet 342: , ) Stackebrandt E, Goebel BM. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rrna sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Bacteriol 44: , ) Martinez-Murcia AJ, Benlloch S, Collins MD. Phylogenetic interrelationships of members of the genera Aeromonas and Plesiomonas as determined by 16S ribosomal DNA sequencing: lack of congruence with results of DNA-DNA hybridization

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