목차 장 일반수칙 장 실험기구및기기 장 배지제작 장 순수배양된미생물의이식기술 장 염색법 장 염색법 ( 포자염색 ) 장 진균의형태관찰 장 미생물성장조건 장 미생물동정 장 시료처리 장 일반세균검사 장 대장균군 장 대장균 장 황색포도상구균 장 장염비브리오균 장 살모넬라균 장

Transcription

1 식품미생물학실험서 의생명대학 바이오산업학부식품공학전공 신라대학교

2 목차 장 일반수칙 장 실험기구및기기 장 배지제작 장 순수배양된미생물의이식기술 장 염색법 장 염색법 ( 포자염색 ) 장 진균의형태관찰 장 미생물성장조건 장 미생물동정 장 시료처리 장 일반세균검사 장 대장균군 장 대장균 장 황색포도상구균 장 장염비브리오균 장 살모넬라균 장 바실러스세레우스 부록 배지및시액

3 1 장. 일반수칙 미생물실험을실시하는동안각종실험기구 시약 배지 미생물등을취급하게된다 실험기구는재질이유리인것이많고사용상부주의등으로파손될경우에는외상을입을수있고그내용물은유기용매이거나산또는알카리용액및미생물배양액등으로인체에치명적일수있다 따라서다음과같은사항을반드시지켜야한다 실험실내에서사용하지않는개인용품은실험실밖이나지정된장소에보관한다 필요한기구와실험서만실험대에올려놓는다 복장은단정히한다 실험실에들어올때는반드시단정하게실험복을착용한다 긴머리를뒤로메거나위로묶을것 만일머리털이늘어지면오염가능성이높고알콜램프나버너불에노출될위험성이높음 머리털이위험한시약에노출될경우변색및교차오염을유발 실험실에서는신중한자세로임한다 실험순서 방법 기기조작법 주의사항등을숙지한후정확하게편안한자세로실험에임한다 실험중에무의미한행동을삼간다 동료의실수를놀리거나 잡담또는이상한소리를지르지않는다 실험실내에서뛰거나장난치거나 음식물을먹거나마시거나 담배를피워서는않되며 음식물을보관하여도안된다 실험에관한모든사항을기록한다 조작방법 순서 어려운점 소요시간 실험관찰결과등실험과정의제반사항을빠짐없이메모한다 실험중에일어날수있는안전사고에항시대비한다 실험과정에발생할수있는위험요인을알아둔다 예상치못한시약의폭발 화재 중독등에대비하여항상통로를확보한다 초자기구는무리한힘을가하지않는다 또한함부로시약이나기구의냄새를맡거나먹지않는다 실험대에놓인기구나연구용기구들을허락없이조작해서는안된다 본인이사용한기구는반드시본인이원위치에다놓을것 사용방법을모르는기구는그기구를다룰줄아는사람의도움없이절대사용해서는안된다 멸균기는고온 고압으로작동되므로부주의로인하여화상등의인재가발생하기쉬우므로반드시조교의지시를받는다 - 1 -

4 유기용매의사용시주의점모든유기용매휘발성는지정된장소훔후드에서지시에따라조작할것 시력상실의원인 과량섭취시치명적임 특히흡수가빠름 돌연변이의원인 손상 비극성휘발용매 피부흡수가빠르며폐 신경등의마비를일으킴크로로포름등 비닐 수술용장갑을착용하여손을보호하고 실험복등을착용하여의류및표피 를보호할것 강산의용제 반드시흄후드에서조작하고비닐등의장갑및실험복등의착용을통하여의류를호보할것 손이나의류에묻었을경우즉시수도를통하여세척을실시하여중화 염산휘발성이강하며특히호흡기의점막에치명적 황산표피 의류등의강력한산화력을가짐 표피의손상 의류의구멍에원인 질산등 강알카리 암모니아수 아민종류등강한환원력을가지고있어치명적임 시약에따른표기 제조시약은병에반드시시약명 이름 제조일을기록하여보관한다 실험전후에실험대는젓은수건 걸레 등으로딱은후마른수건으로건조한다 반드시고무장갑을착용하여청소할것 미생물실험을수행할경우소독약으로 소독하고손도반드시비누로씻는다 실험이마무리되면뒷정리를완벽하게한다 모든폐기물은분리하여지정된장소또는용기에폐기한다 조교및관리자의지시에따른다 미생물실험균주의폐기는반드시멸균한후지정된방법에따라처리할것 실험후기구들의사후처리 회용기구 예 주사기 피펫 페트리디쉬등는멸균기내의용기에넣을것 유리기구나시험관은지정된용기에넣어서싱크대에넣을것 실험후재사용기구는청소 세척을통하여지정된장소에반려할것 - 2 -

5 염색물들의사후처리 어떤염색물질을실험대나바닥에엎질렀을경우즉시조교에게알릴것 독자적으로엎어진것을닦으려하지말것 염색그릇은싱크대에넣은후우선수도를틀고그다음염색액을제거할것 기타 반드시실험시간을준수하고실험에필요한토의외에잡담등을금한다 실험복을착용하지않을경우 실험에참여할수없으며태도 출석점수를감점처리한다 규정시간외의실험관찰을수행할경우담당조교에게미리이야기를하여실험에참여한다 - 3 -

6 - 4 -

7 2 장. 실험기구및기기 실험기구 용량측정기구 피펫 피펫 필러 마이크로피펫 메스실린더 삼각플라스크 뷰렛 배양기구 시험관 삼각플라스크 배플플라스크 페트리디쉬 발효관 조제 혼합 및반응기구 시험관 비커 삼각플라스크 마그네틱바 슬라이드 커버글라스 이식기구 백금선 백금이 백금구 스프레더유리봉 가열기구 알콜램프 전기히터 운반기구 바구니 랙 피펫통 기타기구 깔데기 세척병 세척용구 기기 무균대 고압멸균기 원심분리기 교반기 건조기 배양기 배양기 혐기배양 항온수조 자동온도조절기능함유 균질기 또는 냉동및냉장고 포함 초순수제조장치 집락계산기 수소이온농도측정기 광학현미경 - 5 -

8 무균대 가 정의 고효율여과기를거쳐공기중의입자를제거시킨공기를작업대로불어넣어이공기가작업자에게가지않도록흡입하여제거하는장치이다 또한자외선램프를부착하여내부공기를자체적으로살균하도록설계되어있다 공기로부터미생물의오염을막고유해병원균으로부터실험자를보호할수있으므로항상무균상태인내부에서미생물을다루는것이좋다 수직기류형과수평기류형으로나뉘며미생물을취급할경우는수평기류형인 방식을주로이용한다 수평기류형 수직기류형 나 무균대작업에주의사항 무균대내에는항상청결해야하며필요한기구만보존한다 작업하기전에소독제분사 에탄올 와 를 분이상조사한후사용한다 작업에사용하는물건은청결한상태로작업대내로운반한다 그렇지않을경우소독 물기등을제거한후이용한다 작업후 의과정을통하여청결을유지한다 작업을마무리할경우 등 헤파필터의작동을정지한다 다 무균대관리 헤파필터의청결및압력점검 사용시간등을통하여적절하게교체한다 헤파필터의교체시기는 년이나 청소 실험공간의청결유지시수명을연장 필요시작업대낙하균실험을통하여상태를확인 작업대의오염상태는작업대오염균실험을통하여관리상태를점검한다 - 6 -

9 멸균기 가 정의 멸균기는미생물을조작하는데이용되는배지 시약 기구등을무균상태로만드는조작을말한다 멸균에는물리화학적처리방법을이용하는데여기에서는열을이용한방법을소개한다 열을이용할경우배지 시약 기구등이열에안정할경우이용된다플라스틱용기나열에약한시약은안됨 멸균분류 고압증기멸균기 수증기열을이용하는고압증기멸균 분 약 기압 약 파운드평방인치 수분의증발이되어서는안되는유리용기 배지 시약등가장많이이용 건열멸균기 열선을이용한건열멸균 시간 수분을유지해야하는배지나플라스틱용기는안되며대부분유리용기나열에안정한고형물질에이용으로나뉜다 나 고압증기멸균기의청결과유지 멸균기의주된오염원 내부에열선을이용하여증류수로부터수증기를발생하므로배지등의유출에의한오염이자주발생한다 따라서내부의빈번한세척과증류수가고갈되지않도록관리한다 빈번한사용시증류수고갈로가열판의파손원인초래하므로멸균시증류수의수위와밸브의잠금을확인한다 - 7 -

10 다 멸균기의작동관리 멸균은 분을하는것이일반적이다 따라서가열판달팽이히터과온도제어센서의관리가중요하며멸균의실패및장비고장의원인을제공 년에 회보정을하여주어야한다 그렇지않을경우멸균상태를확인할수있는방법멸균테이프 멸균 등으로주기적관리필요 라 작동법 압력장치를 증류수의수위를확인한다 시료를넣는다 압력장치를 전원을 프로그램에온도 시간을설정한다 프로그램시작 멸균작동 멸균종료 온도가 이하일때압력누출장치를 헤치를연다 용기등은직접손으로만지지말고장갑등을이용하여시료를꺼낸다 원심분리기 시료중입자상의부유물을제거하기위해원심력을이용하여빠르게침강을유도하는장치 시간당시간과회전수를증가할수록침전속도가증가한다 실험실에서는최고 인탁상용과 인초고속원심분리기로구분된다 탁상용원심분리기버켓형로터형 - 8 -

11 교반기 와와류혼합기 가 교반기 배지나시약등을제조할때용해및혼합을용이하게하기위해사용되고 교반장치와가열판이부착되어있으며교반속도와온도를조절할수있다 교반시 의하단에자석막대가돌아가게되어있어용기내에작석막대 를삽입한다 나 와류혼합기 와류를형성하게하여시험관에있는액상의시료를균 일하게혼합하는데이용되며주로시험관이나 소형시험관 을사용한다 건조기 시료 초자기등을건조하기위한장비로일반적으로온도는실온 까지올릴 수있으며내부공기의순환을위한열풍식과비열풍식으로구분된다 건조기 초자건조대 - 9 -

12 배양기 개요 미생물의생장에필요한적정온도를유지하도록하는장치로온도감지기가부착되어원하는온도로조절한다 항온기 항온실 진탕배양기등실험목적에따라다양한형태의기기가사용된다 대량의미생물을배양하는경우발효조를이용한다 종류 가 정치배양기또는항온기 고체및액체배지를이용하여미생물을배양하는데이용나 진탕배양기 액체배지를이용하여증식시킬때이용하며산소공급을원활히하기위해좌우또는회전방식으로시료를진탕시킨다 다 이산화탄소 배양기 항온기정치배양기 에추가적으로 의이산화탄소가공급및유지되도록고안된배양기로주로식물및동물세포배양 조직배양 에이용된다 항온기진탕배양기 배양기 라 혐기성배양기 혐기성균의배양을목적으로산소및유해가 스를제거하거나혐기성을유지하기위해질소및이산화탄소등을공급하도록고 안되어있다 혐기성 밀폐된용기에산소의제거를위해양초를이용하거나 수 소와 를발생 수소의경우산소와반응하여과산화수소로전환한다 을첨 가하여소량의배지를배양할때이용 혐기성 혐기성을유지하고멸균조작및배양이가능한장비로혐기성 을유지하기위해질소 수소 이산화탄소를공급하는장치가부착되어있음

13 혐기성 혐기성 배양기의관리 주기적으로청소 온도보정 냉각기능이있을경우 청소 항온수조 자동온도조절기능함유 평판도말법에서멸균된배지의온도유지등을목적으로사용하는장비로내부물증류수등을가열하여일정온도로유지하는장치이다 내부에삼각플라스크등을넣을경우부상되어내용물이유출되는것을방지하기위해링형태로된웨이트를이용한다 항온수조

14 균질기 또는 식품시료를잘게부셔서균질화가잘되도록하는목적으로사용된다 가 균질기 식품에서는멸균된용기비닐백 에시료를넣은후두개의스토마커의면이시료에반복적인힘을주어내부의시료를분쇄하는목적으로이용된다 나 균질기 믹서기와같이모터의힘을이용하여날을회전시켜시료를분쇄한다 실험실에서는모터의속도를고속으로하여미생물까지파쇄가되도록고안된장비를이용한다 스토마커 스토마커백 냉동및냉장고 시료 배지 미생물 시약등을저온또는냉동하여시료의변성을방지하는목적으로이용된다 일반적으로저온 일반적인시료의보존을목적 냉동 시료의변성을막기위해냉동 시료 미생물 효소등 초저온냉동 이하 냉동보존기간을장기화하기위한급속냉동장치로미생물 식물 및동물등의세포 효소 유전자등를주로이용한다 항상온도관리를주기적으로확인해야한다 온도가변하면시료의변성이이루어지므로항상주기적인확인이필요하다 냉장고일반냉동고 초저온냉동고

15 초순수제조장치 가 정의 보통의물 즉수돗물이나우물물등은각종유기물과무기물을함유하기때문에순수하지못하다 각종화학반응 배지등의제조에있어순수한물이필요한경우가많기때문에이런경우에증류수를사용한다 증류수는수돗물이나우물물을가열하여수증기를발생시키고 만들어진수증기를냉각시켜얻을수있다 나 증류수의종류와이용 실험실에서는많은양을소비하기때문에불순물을제거하기위해여러여과장치 활성탄 이온수지 여과지등로된장비를이용하여대량으로생산하며이에따라순수도에따라 차 차 및 차증류수로구분한다 배지등을제조할경우 차증류기만으로도충분하다 그러나화학반응을위해시약등은 차증류수로그리고정밀분석및동식물세포배양등에는 차증류수를이용한다 차증류기 집락계산기 집락을계수할경우집락이잘보이지않아확대경또는스캐네를이용한자동검출장치등이이용되기도한다 그리고숫자를잊어버리는수가있어계산기또는계수기를활용한다 집락계수장치

16 12) 수소이온농도측정기 (ph meter) 수소이온농도를 측정하는 장비로 유리막대로 된 측정부(rod)와 측정된 값을 환산하 여 display 해주는 장치로 구성되어 있다. 배지, 시약을 만든후 수소이온농도를 측정하는 데 이용된다. 측정기는 전원을 킨 후에 표준용액(pH ph 4, 7, 을 이용하여 표준화를 10) 해준다. 측정부는 보존용액 또는 완충용액에 담아 보존한다. ph 13) 조정 용액 meter 저울 및 정용기구들 가. 저울 (balances; weighing machine) : 물체의 무게(질량 또는 중량)을 측정하는 기 계 기구 또는 장치의 총칭. 연구실에서는 측정하는 양이 적기 때문 한다. 대부분 소수점 3자리)와 나. 약수저 까지 측정하는 정밀기계를 사용한다. 일반적으로는 g~ug (spatula) ~10ug(g : 기준 소수점 5 라 microbalances ~1mg(g 기준 자리)가 많이 사용된다. 시료를 시약통에서 시험관이나 비이커로 옮길 때, 혹은 일정량의 시약을 취하기 위해 저울에 유산지를 올려놓고 시약통에서 시료를 덜어낼 때 등 실 험실에서 고체 시료를 옮기는 거의 모든 경우에 약수저로 시료를 옮긴다. 저울 유산지, 시약접시 약수저(spatula)

17 피펫 가 피펫 일정체적의액체또는기체를측정하거나 다른용기에추가하거나할수있는기구를말한다 보통은유리제로 의용적을주로이용된다 정해진일정한체적밖에취할수없는홀피펫전용피펫과임의의체적을측정할수있는메스피펫몰피펫이있다 나 마이크로피펫 측정하는용적이극히미량 일때의마이크로피펫 을이용한다 용량에따라 등으로구분된다 폴리에틸렌등으로된액체를담는용기를 이라한다 이 도용량에따라 으로구분된다 용팁 다 피펫필러 주로고무재질로되어있으며홀피펫이나눈금피펫에끼워서시약을옮기기위한기구이다 필러를끼우고눌러납작하게하면고무의복원력때문에필러내부의압력이낮아진다 이상태에서아래쪽피펫과근접해있는볼을누르면피펫이담겨있는액체를빨아올리게된다 자세한사용법은다음과같다 피펫을필러의밑부분에끼운다 위쪽 라고표시된부분을누른채중간의풍선처럼볼록하게부푼부위를눌러준다 용액에피펫을담그고목부위 라고쓰인부분을천천히눌러주면용액이빨려올라온다 정확한부피만큼채워진후 라고쓰인부위를눌러용액을배출한다 피펫의모세관현상으로용액이일부피펫에잔류가되어있는것을제거하기위해서 라고쓰인부분끝에구멍을손으로막고누르면마지막방울까지나오게된다

18 필러 유리피펫 시험관 등 간단한화학반응에주로사용되는기다란원통형의실험기구로 안팎의지름 의길이를가지며유리를이용해만들어투명한데 실험조건을달리해가며여러번실험해야하는경우에그사용이편리하다 마개는솜 플라스틱마개 스크루마개 실리콘마개등이이용된다 시료를희석스크루마개하거나배지를넣어배양하는용도솜 플라스틱및실리콘등로많이이용된다 시험관시험관꼿이 랙 듀람튜브 페트리접시 엷은유리나플라스틱으로만든원형의얕은접시와그것에맞는하나의뚜껑으로된쌍으로유리용기의일종 독일의 가고안하였다 크기는여러가지가있다 미생물이나동식물조직의평판배양등에이용되며미생물의경우지름 높이 를주로이용함

19 실험실에서는멸균된 된 를이용한다 따라서오염방지를위 한주위가필요 페트리접시 광학현미경 인간의눈으로관찰할수없는미세한물체나미생물을확대하여관찰하는기구이다 초점거리가짧은두개의볼록렌즈로물체를두번확대시킨다 광학현미경은최대 배까지확대가가능하며고배율로갈수로빛의굴절을방지하여해상력을높이기위해유침유 을이용한다 용도에따라복합현미경 해부현미경등이있다 슬라이드 커버글라스 가 슬라이드글라스 광학현미경관찰할때사용되는기구로 시료를올려놓기위한직사각형모양의투명한판유리이다 간단히슬라이드라고도한다 나 커버글라스 슬라이드글라스위에현미경으로관찰할물체를올려놓고 그위를덮는데사용하는얇은유리판 광학현미경해부현미경슬라이드 커버글라스

20 비이커 플라스크및메스실린더 가 비이커 실험용기구로액체를담는용기이다 유리 폴리에틸렌등으로만 들며시약 배지등을만들때이용된다 나 플라스크 부피측정 반응 증류등에사용되는실험용기구로 보통얇은유리 폴리에틸렌로만들어진가는원통형의목부와여러가지모양으로된몸통부를가진 용기이다 주로고형배지를만들때이용되거나미생물을배양하는데이용된다 다 메스실린더 액체의부피를측정하는기구로용량은다양하며유리표면에 단위로눈금이새겨져있다 액체를채우고메니스커스읽는법에따라눈금을읽어부피를측정한다 뷰렛이나피펫에비해정확도는떨어진다 비이커플라스크메스실린더 알콜램프 실험실등에서주로사용하는소형가열기구이다 유리용기속에알코올을넣고여기에 무명으로만든끈모양의심지를담그고알코올을모세관현상에의하여빨아올려연소시킨다

21 백금이와백금선가 미생물을이식하는목적으로이용되는기구로손잡이와이식을위한부분으로나뉜다 이식을위해부분은얇은두께의긴선으로되어있으며주로열전도율이높은백금을이용하나가격때문에니크롬선을많이이용한다 나 백금이 이식부분의끝이둥근형태로된것을백금이라하며이부분을이용하여미생물을묻힌후다른배지의표면에이식하는목적으로이용되며가장많이사용되는기구이다 다 백금선 이식부분의끝이바늘끝처럼된것을백금선이라하며이부분을이용하여미생물을묻힌후다른배지의내부에이식하는목적으로이용된다

22 - 20 -

23 3 장. 배지제작 서론 실험목적 배지분류 제조시주의사항및제조과정에대해기초지식과제조과정 기술 을익힌다 개요 배지 미생물을생육시키기위한각종영양소의혼합물이다 배지의분류가 조성원에따른분류 천연배지천연물질인동식물체로부터얻은다양한조성을가진배지이다 즉 육즙 맥아즙 혈청등을주성분으로한다 합성배지 순수한화합물을배합하여만든배지로화학적인조성이분명하다 나 물리적인성상에따른분류 액체배지 천연또는합성배지에반고형물질인한천이첨가되지않은액상배지로미생물의증균 생리 화학적연구또는대량배양에이용된다 고체배지액체배지에고형물질인젤라틴또는한천이첨가되어고형으로만든배지를말한다 사면배지 호기성균배양 고층배지 혐기성배양 평판배지 가있다 일반적으로고형물질로는한천을대표적으로사용하며첨가농도는 이다 고체배지는미생물의보존 순수분리 발육상태관찰 생균수측정 운동성관찰등으로이용된다 다 사용용도에따른분류 보통배지비선택적으로많은미생물을키울수있는배지로세균류의배양을위한보통한천배지 와곰팡이류의배양을위한 등이있다

24 특수배지특수한 우리가원한는목적 미생물만을선택적으로배양할수있는배지 증균배지 보통세균과영양요구가달라특별한영양분이필요한배지이다 선택배지 일반배지에특수한물질을넣어특정미새울군의생육을저지하고 목적하는미생물의생육을도와줄수있는배지이다 확인배지 미생물의생화학적성질을이용하여미생물을동정할때사용하는배지이다 배지제조 일반적인배지제조법 배지제조를위한조성에따른배지 초자기 삼각플라스크또는비이커 유산지 접시 스픈 측정기 등을미리준비한다 무게측정배지제조를위한조성분의무게측정은유산지또는접시를사용하여칭량한다 펩톤이나육엑기스 등흡습성이큰재료는종이와함께용기에넣어용해후유산지를건져낸다 한천이첨가된배지를만들경우 우선한천을제외한성분을먼저첨가하여용해한다 그리고 를측정하여조절한후한천을첨가한다 용해 재료를플라스크나비이커등에담고증류수를첨가하여용해시킨다 이때교반기 를이용한다 용해후증발된수분은보충한다 한천을첨가하여 를만들경우 주의 를측정할때한천은전극막에영향을준다 한천이첨가된배지의경우한천을제외한성분을먼저용해한다 이후 를보정한다음한천을첨가한다 한천을첨가하여 를만들경우 위의과정을수행한후가열하여한천이완전히용해한후증발된수분을보충한다 이후시험관등에필요한양을분주한다 조절 는제조하는배지에따라 값이설정되어있으며대부분조성비를합하였을때자동으로 가맞는다 그러나일부변경이되었을때는 와 용액을이용하여조절한다

25 분주 일반적으로한천이들어가지않을경우분주시피펫을이용한다 반면한천이첨가되었을 경우가온상태에서피펫을이용하여신속히수행한다 멸균 고압증기멸균기를이용한다 멸균은 에서 분을수행한다 일반적으로 이내의용기에서멸균할경우 분정도가적당하나 이상을한번에수행할경우는 분정도로한다 멸균시당성분이포함되었을경우 분을하면초코렛현상이나변성이일어날수있다 이럴경우배지제조권고안을따른다 멸균온도와시간을조절하는경우 에서 분 변성성분을여과멸균한후멸균된본배지에첨가하는경우가있다 용도에따른배지제조방법 사면배지 시험관이나스크류캡시험등에배지성분을첨가하여멸균이끝난후긴유리봉이나막대에상부를높이하여배지가경사가지도록유지하여고형화시킨것으로균주보존용으로많이이용한다 고층배지 시험관대 랙 에멸균된배지를꽂아반드시세워서고형화시킨것으로혐기성 균의배양에사용한다

26 평판배지 무균적으로조작된 에주입하여고형화시킨것으로미생물의순수분리및계대에이용한다 평판배지는일반적인규격의경우 정도를첨가한다 그리고멸균된배지의온도에주의해야한다 일반적으로 정도록식은후에첨가하는것이가장좋다 그렇지않으면기체가뚜껑부분에서냉각되어물이맵히는효과가발생한다 표준평판주입배지 이배지는세균의계수에주로이용하는방법으로무균적으로조작된 에시료를먼저주입한후멸균된배지를 정도첨가하여고형화시키는방법이다 이때뜨거운배지를첨가하면시료내미생물이사멸하기때문에미리항온기를이용하여일반적으로 로식힌후주입하여야한다일반적으로한천은 이하에서고형화가시작되기때문임 배지보존 번을제외하고배지가고형화되면고형화과정에서생성된수분을제거하기위해 일정도상온에서보존한후사용한다 오래보존할경우냉장고에보관한다 그러나 일이상보존하지않는다 배지의표면이건조되면미생물의생장에저해가되어정상적인 의형태관찰이어려울경우가발생한다 제조된배지는가능한한일주일이내에이용하도록계획한다

27 2. 실험재료및방법 (1) 실험재료및기구 1) 배지 Nutrient medium Potato-dextrose medium MRS medium 2) 기구 - petri dish, 삼각플라스크, 유산지, 스페츌라 ( 수저 ), 저울, 증류수, 교반기 (magnetic stier), ph meter, 멸균기, 크린벤치 ( 무균대 ), 알콜램프 (2) 실험방법 1 배지제조를위한조성분의무게를측정하여삼각플라스크에첨가한다. - 배지를확인한다 - 저울의 power on으로하고유산지를위에놓고무게를측정하고영점으로조절한다. - 시약스푼을이용하여칭량한다. - 칭량된배지를삼각플라스크에첨가한다. 이후성분을반복하여하나의플라스크에첨가한다. - 단한천은유산지에칭량해놓고첨가하지않는다. 2 용해 - 메스실린더를이용하여증류수를첨가하여용해시킨다. 이때교반기 (magnetic stiror) 를이 용한다. 3 ph 측정및보정 - ph meter 를이용하여측정하고필요시 0.1N NaOH 와 HCl 용액을이용하여조절한다. - 이후한천을첨가한다. 4 Plate 용은멸균기에넣어 121 에서 15 분간멸균한다. 5 Slant 용은가열하여한천을용해시키고피펫을이용하여 5 ml 씩신속하게분주한다. 분주 가끝나면마개를닫고 4 과같이멸균한다. 6 멸균이끝나면 a slant 용은막대등경사대를이용하여고형화한다. 고형화되면 1 일간방치한다

28 b plate 용은 50~60 로냉각시킨후 plate 에 20 ml 정도를분주한다. 분주후배지가고형화 될때까지기다리고이후 plate 를 1 일간건조한다. 3. 결과 (1) 제조된배지를그림또는사진으로남긴다

29 4 장. 순수배양된미생물의이식기술 1. 서론 (1) 목적 : 1 배양을위해무균적으로미생물을제거하고이식하는기술을익힌다. 2 알콜램프의화기에이식도구를정확하게멸균하는기술 3 시험관이나 plate에이식하는손동작의조작을반복적으로익힌다. 4 이식후배양을통하여이식과무균조작이올바른가를확인한다. (2) 원리미생물의이식은순수분리된배양체또는순수분리를확인하는목적으로성장시키기위해새로운배지에운반하는방법을말한다. 이러한이식은무균상태를유지하는것이무엇보다필수적이다. 특히공기중에는많은미생물이존재하기때문에이식과정에서오염될수있다. 또한이식과정에이용되는기구들을멸균또는멸균조작하에서작업을해야하기때문에주의를요한다. 본실험에서는 plate를이용한 4차도말 ( 획선 ) 방법과 slant 를대상으로하는이식기술에대하여소개한다. 1) 4차도말 ( 획선 ) 기술신속한분리방법으로고체배지의표면위에서 loop에묻어있는배양체를획선하면서희석방법에의존하는기술로배지에묻어있는배양체를 3번의반복적인획선과정을수행하여 4차도말 ( 획선 ) 기술 (4 way streak plate technique) 이라고도불린다. 이러한방법은얻어진배양체가단일종 ( 순수종 ) 인가를확인하는방법으로많이이용한다

30 2) Slant로이식하는방법 slant로이식하는방법은기존순수분리된배양체를보존목적이나생화학실험을위해이용한다. 균의접종은 slant의표면에미생물을도말하여접종하고이후 1~2일배양하여균체를성장시킨후에내장상태로보존한다. 이때오염방지뿐만아니라수분의증발상태에따라보존기간이결정된다. 또한생화학시험을목적으로할경우배양기간은시험방법에따라결정된다

31 2. 재료및방법 (1) 재료및기구 1) 미생물 2) 배지 - Nutrient agar medium in slant/plate - PDA medium in slant/plate 3) 기구 - 크린벤치 ( 무균함 ), loop, alcohol lamp, 배양기, 네임펜 (2) 실험방법 1) 4 차도말 ( 획선 ) 기술 1 도말하는미생물의이름과날짜, 도말한사람의이름을뚜껑부분에네임펜으로기 록한다. 2 loop를화염한다. loop( 백금이 ) 를알콜램프의불꽃에대어빨간색이될때까지화염한다. 이때백금선의전체와 loop 봉의끝부분의일부까지화염멸균한다. 이후식힌다. 이때식은열을확인하기위해 plate의뚜껑에 loop를대어김이서림을확인한다, 김이발생하지않을때까지화염부근에서식힌다. 3 4 차도말을위한영역을마음속으로그림을그린다. 4 [1 차도말 ] 화염된 loop 를이용하여목적미생물을묻히고배지의 1 차도말영역에 지그재그방식으로겹치지않도록배지의표면을도말한다. 5 [2 차도말 ] 이후사용된 loop 를알콜램프의불꽃에대어화염멸균하고식힌다. 그리 고 1 차도말의끝부분을가로질러 1 회미생물을묻히고곧바로미생물이묻어있 지않은방향으로동일하게지그재그방식으로도말한다. 6 [3 차도말 ] 이후사용된 loop 를알콜램프의불꽃에대어화염멸균하고식힌다. 그리 고 2 차도말의끝부분을가로질러 1 회미생물을묻히고곧바로미생물이묻어있 지않은방향으로동일하게지그재그방식으로도말한다. 7 [4 차도말 ] 이후사용된 loop 를알콜램프의불꽃에대어화염멸균하고식힌다. 그리

32 고 3 차도말의끝부분을가로질러 1 회미생물을묻히고곧바로미생물이묻어있 지않은방향으로동일하게지그재그방식으로도말한다. 8 이후사용된 loop를알콜램프의불꽃에대어화염멸균하고보관함에보관한다. 그리고도말을한배지는거꾸로뒤집어놓는다. 작업이끝나면배양기에뚜껑이밑으로가게배양대표면에놓아배양한다.( 거꾸로놓는이유는배지의수분이증발하는것을방지하기위함 )

33 2) Slant 로이식하는방법 1 균이접종된배지가 plate 이다. slant 에미생물의이름과날짜, 도말한사람의이 름을 slant 의면반대방향의유리에네임펜으로기록한다. 2 기본적으로왼손으로신선한 ( 오염되지않은 ) 배지를잡고오른손으로 loop를잡고작업을한다. 우선왼손에 slant를잡기전에 plate를잡고화염된 loop에미생물을접종한다. 이후왼손에 plate를원위치시키고신선한 slant를잡는다. 이후 loop를잡은손의 3번에서 4번손가락사이에뚜껑을감싸잡고뺀다 ( 주의 : 화염부근에서작업하여오염이되지않도록한다 ), 3 시험관의끝부분을화염에멸균한다, 이때화염에대면습기가생기고그습기가사라질때까지화염에멸균을한다. 이후신선한 slant의표면에우선미생물을아랫부분에서윗부분으로표면에대어올린다, 그리고다시아랫부분부터좌우로지그재그형태로표면에도말하며윗부분으로이동한다, 4 작업이끝나면 loop 를화염멸균하고왼손의시험관끝부분은다시한번불꽃에 화염하고손가락사이에있는마개를 slant 에끼운다. 이후배양기에서배양한다. 5 미생물이 plate 에있을경우 2 의과정에서우선왼손에 slant 를잡기전에 plate 를잡고 화염된 loop 에미생물을접종한다. 이후왼손에 plate 를원위치시키고신선한 slant 를잡 은후 2~4 과정을수행하여접종한다

34 - 32 -

35 3. 결과 1) 배양후미생물의생장상태를그림으로기록한다. - plate의경우 4차도말법에의해획선에따라미생물이자라고 3 또는 4획선에서하나의콜로니로구분되었는지를확인한다. - slant의경우미생물의성장상태를확인한다. 균이름 : 균이름 : 콜로니의색 : 콜로니의색 : 콜로니의 form 콜로니의 form 콜로니의 Elevation 콜로니의 Elevation 콜로니의 size 콜로니의 size 균이름 : 균이름 : 콜로니의색 : 콜로니의색 : 콜로니의 form 콜로니의 form 콜로니의 Elevation 콜로니의 Elevation 콜로니의 size 콜로니의 size <4 차획선도말법에의한결과 >

36 균이름 : 균이름 : 콜로니의색 : 콜로니의색 : 균이름 : 균이름 : 콜로니의색 : 콜로니의색 : < slant 에서배양균의형태 >

37 참조 : 콜로니의모양

38 - 36 -

39 5 장염색법 1. 서론 1) 실험목적 1 세균의형태관찰을위한기본적인염색법인단순염색과그람염색법을이해하고실험방법을익힌다. 2 현미경에대한기본구조와사용기술을익힌다. 2) 서론 2.1 현미경가. 현미경의구조 현미경은미생물의크기가작기때문에표본을만들어세포의형태를관찰할목적으로이용한다. 일반적으로현미경은여러종류가있지만광학현미경을주로사용하게된다. 현미경은해상력에의해광학현미경과전자현미경으로구분되며, 표본의관찰목적에따라여러종류가있다. 해상력은두개의점을구별할수있는능력으로광학현미경은 0.2um 전자현미경은 0.001um까지관찰이가능하다. 현미경의구조는크게아래와같이네가지로구분된다. 1 조명장치 : 집광기, 차광기 2 확대장치 : 대물렌즈, 접안렌즈. 경통 3 초점조절장치 : 조동나사, 미동나사 4 표본고정장치 : 재물대

40 확대장치의경우접안렌즈는하나가있는단안현미경과두개인쌍안으로구분되며렌즈의배율은 10배또는 15배가있으나일반적으로 10배를표준으로사용한다. 또한대물렌즈는일반적으로여러개가조합되어있으며 4, 10, 40, 100배의렌즈가장착된다. 따라서광학현미경은 1000배까지관찰이가능하다. 접안렌즈배율 대물렌즈배율 배율 10x 4x 400x 10x 10x 100x 10x 40x 400x 10x 100x 1000x 1000배로확대할경우대물렌즈와표본과의접촉시공기층이존재하면빚의굴절에의해해상력을떨어뜨리므로오일을이용하여굴절을최소화한다. 이때사용하는오일을유침유 (immersion oil) 라한다. 사용후대물렌즈에묻어있는 oil을제거하고보관한다. 나. 현미경의종류 1) 광학현미경 [ 관찰방법 ] 1 접안및대물렌즈는처음에저배율로사용한다. 2 표본을제물대에바로위한다. 3 옆에서들여보면서표본의표면이대물렌즈에닿을락말락할때까지제물대를옮긴다

41 4 접안렌즈를들여보면서종도나사로제물대를움직여대략적인상을찾는다. 5 미동나사로정확한상을찾는다. 6 피검체의모양을스케치하거나영상을촬영한다. 취급시주의사항 1 보관시엔습기와먼지가없는보관상자또는먼지덮게를씌워보관한다. 2 렌즈표면은직접손으로만지지않는다. 3 렌즈세척시 lens paper나브드러운거즈등을이용한다. 4 이동시엔오른손으로경주를왼손으로경각 ( 밑바닥 ) 을잡는다. 5 유침유에의한검경후에는반드시 Xylene 으로세척한다. 2) 전자현미경 전자현미경은해상력이 0.2um 인데비하여전자현미경은 0.001um로미생물의미세구조까지관찰할수있다. 전자현미경은목적에따라세포의표면을관찰하기위한주사전자현미경 (Scanning electron microscope, SEM) 과세포의단면을관찰하기위한투사전자현미경 (Transmission electron microscope, TEM) 이있다. 2.2 염색법 미생물세포를현미경으로관찰시경계면이뚜렷하지않아형태를명확히관찰하기어렵다. 따라서물체의관찰을용이하기위해염색법을이용한다. 염색법은한가지염색약을이용하는단일염색법과 2가지염색약을이용하는그람염색법을가장많이이용한다. 가. 단일염색법 단일염색법은한가지염색약을이용하여관찰하는방법이다. 이때사용하는염색약은주로염기성염색약을이용하는데이는세포가음전하를띠는물질을많이가지고있어염색의효율을높이기위해양전하를띄는염기성염색액을이용한다. 여기에는 Methylene blue( 파란색 ), Safranin O( 적색 ), Crystal violet( 보라색 ) 등을이용한다. 염색세척건조 염색접시위에표본을위치하고 Methylene blue 를흔건히묻힌고 1-2 분간염색한다, Tap water 를이용하여세척한다. 세척후 paper 등을이용하여물기를제거하고자연건조한다

42 나. 분별염색 ( 그람염색 ) 그람염색은세균의분류에많이이용하는염색법이다. 세균은세포벽의물리적인특성에차이로그람양성균과그람음성균으로구분된다. 1884년 C. Gram에의해처음창안되었다. 그람양성균은세포벽에펩티도글리칸층이세포벽의 80-90% 를차지하고있어뚜꺼운층을가진다. 반면그람음성균은이펩티도글리칸층이 10-20% 를차지하고있으며나머지부분은인지질, 리포폴리사카라이드, 리포프로테인등으로구성된외막으로구성되어있다. 주된염색부분인펩티도글리칸의함량차이에의해구분이된다. 그람양성균은 1차염색시 Cristal violet-요오드복합체는알콜에의한탈색과정에서여러층의팹티도글리칸을탈수시켜분자간의공간을좁히기때문에세포밖으로배출되지않고 2차염색액 (Sanfranin O) 으로염색을하여도염색이되지않는다. 반면그람음성균은얇은펩티도글리칸층을가지고있으며외막에염색된 1차염색액이알콜에의해쉽게탈수된다. 따라서 2차염색액의색을띄게딘다. 결과적으로그람양성균은보라색을그람음성균은적색을띄어구분을할수있다. 전염색매염탈색후염색 Crystal violet 처리세포는보라색 Gram's iodine 처리세포는진보라 95% 알콜세척 G+: 보라색, G-: 무색 Safranin 처리 G+: 보라색, G-: 적색 실험방법상오류 : 처음세포를고정할때지나치게강한열처리를하거나, 알코올로탈색하는것을지나치게오래하거나, 세척을너무강하게할경우크리스탈바이올렛-요오드복합체를상실하여그람음성으로보일수있다. 또한 24시간이상배양된세균세포, 즉대수증식기를넘어사멸기의상태가오래지속된세균은그람양성균이음성균으로보일수있다

43 2.3 세포의형태 세균세포의모양은일반적으로 3가지로구분되는데구형, 막대형, 나선형이다. 구형의세균 (Cocci) 은쌍구균 (Diplococcus), 연쇄상구균 (Streptococcus), 포도상구균 (staphylococcus) 등을가진다. 막대형의세균 (bacilli, 단수 ) 은쌍간균 (Diplobacillus), 연쇄상간균 (streptobacillus) 등을갖느다. 나선형의세균은굽은형태인 vibrios( 비브리오형균 ), 나선과굳은형의세균은나선균 (spirilla), 그리고나선과꼬인형의세균인스피로케타균 (spirochetes) 로구분된다. 구균 (Coccus) 간균 (Bacillus) 나선균 (Spirillum)

44 2. 재료및방법 가. 재료및기구 1) 미생물 : 4종 (Bacillus subtilis, ) 의미생물을배양하여준비한다. 2) 염색시약 : Cristal violet 용액, Gram' iodine, 95% Alcohol, Safranin O 3) 기구 : Slide glass, Loop, Distilled water( 증류수 ), alcohol lamp, Immersion Oil, Microscope, 색연필 나. 실험방법 1) 표본제작 가 ) 슬라이드글라스를깨끗이닦고화염에열을가한다 (1). 이후색연필을이용하여중 앙에원을그린다 (2, 염색시염색약의흘러넘침을방지하기위해 ) 나 ) 미생물을 Loop를이용하여접종한다. 3 고체의경우증류수를 loop에묻히고슬라이스드글라스의중앙에증류수를이동한다. 이후무균적으로균체를 loop에묻히고증류수를이용하여엷게펴준다. 4 액체배양체를이용할경우무균적으로한 loop를얻어중앙에접종하고엷게펴준다. 다 ) 자연적으로건조를시킨다 (5). 또는빨리건조할경우, 균을엷게펴준슬라이드글 라스를화염위 30cm 지점에위치하여온기를이용하여건조시킨다 라 ) 자연건조된경우고정을위해화염을좌에서우로 3 회이동하여글라스에온기를 주어마지막으로고정을시킨다 (6)

45 1 깨끗이닦은슬라이드글라스를가열한다, 2색연필을이용하여원을그린다, 고체배지를이용할경우 액체배지를이용할경우 3 Loop 를이용하여증류수한방울을묻힌다. 4 Loop 를이용하여배양체를묻힌다 3 Loop 에균체를묻히고증류수와함께도포한다. 4 Loop 를이용하여도포한다. 5 자연건조한다, 6 화염을이용하여건조를종료 2) 단순염색 (simple staining) 가 ) 도말된미생물은 Methylene Blue 용액을흔건하게묻힌후 1분간염색한다. 나 ) 이후 tap water를이용하여세척한다. 단물의속도를느리게하여도말된미생물이씻기지않도록한다. 다 ) 이후자연또는 paper를이용하여건조한후화염위 30cm지점에서열기를이용하여건조한다. 라 ) 이후유침유를묻히고현미경을이용하여관찰한다

46 염색세척건조 염색접시위에표본을위치하고 Methylene blue 를흔건히묻힌고 1-2 분간염색한다, Tap water 를이용하여세척한다. 세척후 paper 등을이용하여물기를제거하고자연건조한다. 3) 분별염색 ( 그람염색, Differential staining; Gram's staining) 가 ) 전염색액인 Crystal violet 용액을흔건히묻힌후 1분간염색한다. 나 ) 이후 tap water를이용하여세척하고건조한다. 다 ) 매염제인 gram's iodine용액을흔건히묻힌후 1분간염색한다. 라 ) 2) 의과정에의거세척 / 건조한다. 마 ) 탈색을위해 95% 에탄올을흔건히묻힌후 30초간탈색한다. 바 ) 2) 의과정에의거세척 / 건조한다. 사 ) 후염색으로 Sanfranin O를흔건히묻힌후 30초 ~1분간염색한다. 아 ) 2) 의과정에의거세척 / 건조한다. 그리고완전건조를위해화염위 30cm 지점에서열기를이용하여건조한다. ( 너무길어슬라이드글라스가뜨거우면않됨-결과에영향을미침 ) 자 ) 이후유침유를묻히고현미경을이용하여관찰한다

47

48 3. 결과 1) 염색결과요약 균이름 : 균이름 : 그람 - 형 (Gram's type) : 세포모양 : 그람 - 형 (Gram's type) : 세포모양 : 균이름 : 균이름 : 그람-형 (Gram's type) : 그람-형 (Gram's type) : 세포모양 : 세포모양 : 4. 고찰 염색결과에따른고찰, 예상되는결과와일치여부, 일치하지않았을때방법상의문 제점도출

49 11 장일반세균검사 목적및원리 실험목적 식품에존재하는세균의수를검출하는기법과평가방법을익힌다 식품과유형에따른시료의확보와균질화에대한원리를이해한다 균질화와희석법의필요성과방법을이해한다 세균을검출하는방법인표준평판법 도말평판법 건조필름법에대한원리 실험방법및계수방법을이해한다 식품의유형에따른기준과실험결과를비교평가한다 실험원리식품이제조된후유통기간동안오염된세균이증식함으로서식품이갖는고유의품질이변화하여때로는식용하기어려운상태인부패과정이진행된다 따라서제품의제조과정에따른원료나배합 성형및포장과정에서미생물의오염을차단하는것은무엇보다중요하다 단 발효식품의경우오염균의관리 따라서일반적으로제품은제조과정에서오염을최소화하거나완제품을살균또는멸균처리하여오염균을최소화하거나제거하는과정을거친다 제품의안전성을고려하여제품의포장지에유통기한또는상미기간을표시하여소비자에게정보를제공한다 완제품의미생물오염상태를알아보기위한일반세균의검출을위한실험방법에대한이론과과정에대한지식몇가지를알아본다 가 식품과유형에따른시료의확보시기 제품에따른균질화방법을조사정리나 균질화와희석법의필요성과원리를조사정리다 세균을검출하는방법인표준평판법 도말평판법 건조필름법에대해비교하여정리하시오 원리 배지조성 실험과정및계수평가 근거 식품공전 일반시험법 일반세균수 축산물공전

50 검사과정 배지및시액 생리식염수 을 에넣고증류수 를넣고녹인다 시료처리용은 유리병에 을첨가한후 에넣어멸균 분간한다 희석용은마게가있는시험관 개에각 씩을첨가하고상기와같이멸균한다 표준한천배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간 한다 주의 멸균을위해 에넣을때는은박지호일로감싼뒤에넣고뚜껑을살짝열어둔다 꽉닫으면 의압에의해터지거나뚜껑이열리지않을수있다 표준한천배지 위의성분에증류수 에녹여 로조정한후 로 분간멸균한다

51 세균수건조필름배지 세균수건조필름배지와누름판 세균수건조필름배지조성 위의성분을증류수 에녹인후 에서 분간멸균하여건조필름을제조한다 참고사항 배지량은회사마다조금씩차이가날수있으니배지통옆에설명을잘읽어본다 필요량에따라배지양을조절한다 을만들때배지 을증류수 에녹인다 배지를녹일때에는핫플레이트나전자레인지를이용하여녹인다 건조필름배지는냉장보관을하고뜯었을경우잘린부분을봉하고상온에보관할수있다 기구및재료 무균대 고압멸균기 피펫과팁 배양기 시험관 페트리접시

52 실험방법 표준평판법 시료의희석 멸균된시험관 개를준비하여멸균생리식염수 씩일회용피펫및멸균된피펫을이용하여넣고시험관에 를라벨한다 주의 제품에따라희석개수를늘리거나줄일수있다 주의 생리식염수를만들고각각시험관에 씩분주후멸균하여사용할수있다 E S A 필러사용법 를누르고가운데를눌러공기를뺀다 를눌러액을필요한만큼끌어당긴다 를눌러액을빼낸다 피펫끝에액이남았을경우 의구멍을막고눌러준다 씩분주 라벨된시험관 검체채취 멸균백에검체 을취하고멸균생리식염수 을분주한후균질하고준비된시험관하나에균질한시험액 을가해혼합하여 배로희석한후다시희석액 을취해다음시험관에가해혼합하는식으로순차적으로시료를 배 배 배로희석한다 주의 시험관마다뚜껑을열기전에시험관입구를돌려가며알코올램프로살균한다 주의 희석할때마다새로운팁을사용한다

53 검체채취 멸균생리식염수분주 스토마커로균질 분 시험액 채취 배희석 시료액 을 시험관에분주 배희석 배희석된시험관에서 을다른 시험관에분주 배까지반복

54 배지의분주및접종 각희석시료액 씩을각각 매의라벨된페트리디쉬에각각분주한다 주의 각페트리디쉬에분주할때마다희석배수마다새로운팁을사용한다 배를 매에 접종이후 배 배 배까지반복 용해 살균후굳지않게보관된배지를각페트리디쉬에 정도분주한다 주의 배지를분주할때동전크기만남았을때배지분주를멈춘다 각페트리디쉬를좌 우원을그리며샘플과 배지가섞이도록돌린뒤응고시킨다 주의 뚜껑에묻지않게살살돌린다 중층 확산집락발생을억제하기위하여배지위에표준한천배지 를가한뒤응고시킨다 주의 배지가응고된배지위에전체적으로도포가되면분주를멈춘다

55 배양기에넣기 페트리디쉬를 배양 기에거꾸로넣어 시간배양한다 축산물은 시간배양을원칙으로함 주 희석용액의멸균여부를알아보기위해대조시험을시행한다 매에멸균증류수를각 씩첨가한후상기방법에의해배양한다 집락수의산정및세균수의기재보고 식품공전 표준한천배지에집락이발생하면집락수를카운팅한다 카운팅은 안의숫자만계산하고전평판에 개이하의집락만얻었을경우에가장희석배수가낮은것을측정한다 유효숫자는 개이며단위는시료가고체일경우 액체일경우 이다 희석배수 일반세균수 집락수 회 회

56 희석배수 일반세균수 회 집락수 회 축산물 배양후즉시집락계산기를사용하여생성된집락수를계산한다 부득이할경우에는 에보존시켜 시간이내에산정한다 집락수의계산은확산집락이없고 개의평판당 또는 개의집락을생성한평판을택하여집락수를계산하는것을원칙으로한다 전체평판에 개이상집락이발생한경우 에가까운평판에대하여밀집평판측정법에따라계산하며 전체평판에 개이하의집락만을얻었을경우에는가장희석배수가낮은것을측정한다 기록 평판배양법에서산정된균수의기록은셋째자리이하는 로처리한다 만약 번째자리의숫자가 이상과 이하인경우는반올림하고 일경우는 번째자리수가홀수일때는위로반올림하고 짝수일경우는 로처리한다 예를들면 인경우는 으로기록하고 인경우는 으로표기한다 ᄀ CFU/ plate 인경우 N = C / < ( 1 n1 ) + ( 0.1 n2) > (d) N = 식육 g 또는ml당세균집락수 C = 모든평판에계산된집락수의합 n1 = 첫번째희석배수에서계산된평판수 n2 = 두번째희석배수에서계산된평판수 d = 첫번째희석배수에서계산된평판의희석배수 구 분 집락수 희석배수 1:100 1:1, N = ( ) / <(1 2) + (0.1 2)> 10-2 = 537/0.022 = 24,409 = 24,000 CFU/ g( ml ) 24,000 ᄂ 25 CFU / plate 이하인경우 구 분 집락수 희석배수 1:100 1:1, CFU/ g( ml ) <2,

57 ᄃ 250 CFU /plate 이상인경우 구 분 집락수 TNTC : too numerous to count 희석배수 1:100 1:1,000 TNTC 630 TNTC 650 EAPC : estimated aerobic plate count EAPC/ g( ml ) 640,000 세균수산출 소및돼지도체의경우균수는도체표면적당집락수 로서환산되어야한다 희석배수 배지접종량이 일경우 집락수 재료채취용량 개부위채취인경우 단 개부위를채취할경우는 로나누어준다로산출한다 닭의경우는 당으로집락수를환산한다 기타시료는집락수 희석배수로 당또는 당세균수를산출한다 건조필름법 시험조작 앞의표준평판법의 시료의희석에서 의검체채취까지는동일하다 배지의접종각단계별희석용액 을세균수건조필름배지 장에접종한뒤누름판으로누른후 배양기에넣어 시간축산물은 시간 배양한다 주의 필름바깥으로용액이흐르지않도록한다 접종 필름상단에시료명과희석배수 일자를기록한다 겉장을주의깊게올린후각단계별희석용액 을세균수건조필름배지 장에접종한다주의 접종액이중앙에위치 이후겉장을위의깊게내린다

58 누름판으로배지의표면중앙에놓고살짝누른후접종액이배지에흡수되도록 분간놓아둔다 주의 누름판밖으로유출되지않도록주의한다 배양 배양기에넣어 시간 배양한다 축산물은 시간배양한다 주 희석용액의멸균여부를알아보기위해대조시험을시행한다 매에멸균증류수를각 씩첨가한후상기방법에의해배양한다 결과확인 세균이성장할경우적색을띄기때문에적색을띄는균체수를계수한다 집락수산정및기재 앞의가표준평판법과동일 참고사항 검체채취시 고체시료일경우필터가있는멸균백을사용하는것이유용하다 배양은 시간배양보다 시간배양하고카운팅을한다 카운팅시네임펜으로집락을표시하면서카운팅한다

59 실험 요약 일반세균수 준비물 - 배지 : 1) 표준한천배지 2) 건조필름배지 - 희석수 : 0.85% NaCl 용액 ( 축산물인산완충용액 ) 표준평판법 시험법 1. (0일) 시료처리 : 시료 25g + 생리식염수 225ml *n-5일경우주의참조 2. (0일) 희석 : 시료 1ml을이용하여 10 -( 1 ) ~10 -( 4 ) 3. (0일) 시료접종 : 희석당 petri dish 2매에무균적으로취함 4. (0일) 배지첨가 : 45 의표준한천배지약 15ml를무균적으로분주 ( 확산집락의발생을억제하기위해다시표준한천배지를 3~5ml가해중첩 ) 5. (0일) 배양 : 냉각응고된 petri dish는꺼꾸로하여 35±1 에서 24~48hr 배양 ( 축산물 48 hr) 6. (1 또는 2일 ) 계수 : 표면과내부에형성된 colony( 집락 ) 를계수한다. 건조필름법 1. (0일) 시료접종 : 희석당 1ml을세균용건조필름배지 2장에접종, 누름판을이용 5분간 2. (0일) 배양 : 35±1, 24~48hr ( 축산물 48 hr) 배양 3. (1 또는 2일 ) 계수 : 붉은색집락수를계수한다. * 주의 ) n-5 일경우식품의경우상기의시료를 5 개를개별시료로준비하여진행 축산물일경우시료 125g+ 멸균인산완충용액 1125ml 을혼합균질화한후 5 반복으로진행한다. 환산 표준평판법과건조필름법 - 식품과축산물의환산법을이용하여최종수결정 - 환산에이용한배수를선정한이유 : 30~300 (25~250) 사이의희석배수를선정한다

60 검사명 실험결과보고서 ( 예시 ) 근거 검사자 시료명 제조사 시약및배지 제조일자 생리식염수 페트리디시매 세균용건조필름배지 분반 조 매 실험과정 실험내용 검사날짜기재 시료제조 년 월 일 시 입고일자 보존방법 희석용생리식염수시험관 평판계수용배지 시료 과생리식염수 을첨가하여 분간균질화하여시험용액으로사용하였다 의시험용액 을 의생리식염수에첨가하는연속 배희석법에의해 까지 희석하여시험용액으로이용하였다 시료접종 년 월 일 시 시험용액은희석별로페트리디쉬 매에각 씩첨가하고약 의표준한천배지를 첨가하고잘혼합한후고형화하였다 총 시험용액은희석별로세균용건조필름배지 매에각 씩첨가하여준비하였다 총 매 멸균희석수를대상으로대조시험 매를수행하였다 배양 년 월 일 시 고형화된배지는 배양기에배양하였다 결과판독 검사날짜기재 세균계수요약 판독일자 년 월 일 시 희석배수 세균수 또는 집락수 회 회 환산식 결과사진 사진 사진 판정 판정근거 식품공전또는축산물공정또는논문등 판 논의 정 적합또는부적합또는기타 결과및판정에대한논의 개 매

61 12 장대장균군 목적및원리 대장균군은그람음성 비포자성간균으로 에서 시간의배양동안유당을분해하여가스와산을발생하는호기성또는통성혐기성균이다 대장균군은분변으로부터유래되기때문에식품및위생관리에있어분변성오염의지표로이용된다 대장균군의정성시험은 단계로구분 추정시험 를이용하여가스발생 à 방법 확정실험 배지검은색금속성광택 완전시험 가스 형태적특성 무아포성간균 정성시험 추정시험 추정시험은실험하고자하는식품을거꾸로뒤집한듀람시험관이포함된유당발효배지에첨가하여 시간배양한다 대장균군 유당을분해산과가스를발생 비장내세균 유당을이용하지못함 유당배지의조성에따른특징 유당에의한표면장력 담즙산은비장내세균의성장을억제 최적수확법 여러희석배수와반복시험관을이용하여얻어진양성시험관의수를이용하여통계적인방법을이용하여양성반응세균군의수를추정하는방법임 유당배지시험관에 개의희석배수즉 와 개의반복수 시간의배양기간동안듀람시험관에가스포집여부로양성과음성을판정 양성시험관을이용하여 인데스에대입하여대장균군의수를 당 으로정량 양성시험관의진위여부는확정및완전시험을통하여결정한다 확정시험 확정시험은추정시험의결과에대한확인을위한방법이다 즉 추정시험에서양성판정이나더라도기원생물이비장내세균에의해나타날가능성이있을수있다 유당배지의양성시험관의배양액을 배지에접종하여재배양하고양성판정여부를한번더확인한다

62 대장균군의선택및분별목적으로사용되는 배지를이용 그람양성균의성장이억제 에의해성장된 주변에침전물에의해 와 을형성 완전시험 확정시험에서 배지에서전형적인 에대해다시한번 배지에서가스생성여부를확인한다 그리고양성을나타낼경우그람시험을통해그람음성 간균 비아포여부를확인 정량시험 시험에의한정량 추정시험에서양성시험관은 의시험을통하여양성여부를판정 최종적인양성시험관을대상으로 인덱스를이용하여대장균군의정량분석을수행 건조필름법에의한정량 대장균군의신속검출을위해최근건조필름배지를이용하여정량 배지내 담즙산비내성비대장균군의성장억제 그람양성균의성장억제 판정 유당을이용하여산을생성하며 에의해 가적색 주변 에가스가생성된집락을계수한다 근거 식품공전 일반시험법 대장균군

63 검사과정 배지및시액 생리식염수 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간한다 유당배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후발효관이들어간시험관에 씩분주한다 분주한시험관을 에넣고멸균 분간한다 배농도유당배지 증류수 에 을녹인다 배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후발효관이들어간시험관에 씩분주한다 분주한시험관을 에넣고멸균 분간한다

64 한천배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간한다 멸균이끝난후 정도되었을때페트리디쉬에분주하여굳힌다 보통한천배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간한다 멸균이끝난후 정도되었을때페트리디쉬에분주하여굳힌다 주의 멸균을위해 에넣을때는은박지 호일 로감싼뒤에넣고뚜껑을 살짝열어둔다 꽉닫으면 의압에의해터지거나뚜껑이열리지않을수 있다

65 대장균군건조필름배지 누름판 참고사항 배지량은회사마다조금씩차이가날수있으니배지통옆에설명을잘읽어본다 필요량에따라배지양을조절한다 을만들때배지 을증류수 에녹인다 배지를녹일때에는핫플레이트나전자레인지를이용하여녹인다 건조필름배지는냉장보관을하고뜯었을경우잘린부분을봉하고상온에보관할수있다 별첨대장균군시험에사용하는배지 유당배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후발효관을넣은시험관에 씩분주하여 에서 분간멸균한다 유당배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후발효관을넣은시험관에 씩분주하여 에서 분간멸균한다 배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후발효관을넣은시험관에 씩분주하여 에서 분간멸균한다

66 한천배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후 에서 분간멸균한다 보통한천배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후 에서 분간멸균한다 대장균군건조필름배지 위의성분을증류수 에녹인후 에서 분간멸균하여건조필름을제조한다

67 실험방법 유당배지법 정성시험 추정시험 검체채취 멸균백에검체 을취하고멸균생리식염수 을분주한후균질한것을시험용액으로한다 검체채취 멸균생리식염수분주 균질 시험액채취 배농도유당배지 개또는 개 유당배지 개또는 개를준비하고 개또는 개의 배농도유당배지에는시험용액 씩분주하고 개또는 개의유당배지에는시험용액 씩 다른 개또는 개의유당배지에는 씩을분주하여 에서 시간동안배양한후가스발생여부를확인하고가스가발생하지아니하였을때에는배양을계속하여 시간까지관찰한다 주의 시험관마다뚜껑을열기전에시험관입구를돌려가며알코올램프로살균한다

68 개또는 개의 시험관에 시료 씩분주 개또는 개의 시험관에 시료 씩분주 개또는 개의 시험관에 시료 씩분주 배양 유당배지결과판정 기포가발생하면추정시험양성이다 가스발생없음 음성 가스발생 양성

69 확정시험 추정시험양성인시험관에서 백금이를취하여 배지에이식하여 에서 시간동안배양한후가스발생여부를확인하고가스가발생하지아니하였을때에는배양을계속하여 시간까지관찰한다 주의 백금이를사용하기전에는꼭알코올램프로화염멸균을하고멸균한백금이를 바로사용하지않고식힌후사용한다 백금이화염멸균 양성시험관으로부터 시료를묻힘 배지에접종 배양 결과판정 배지에서가스가발생하거나갈색으로변하면양성이다 가스발생없음 음성 가스발생 양성

70 배지의양성인시험관에서 백금이를취하여 한천배지에획선도말 분또는 분도말을이용 접종하여배지를거꾸로하여 배양기에서 시간배양한후결과를판정한다 주의 백금이를사용하기전에는꼭알코올램프로화염멸균을하고멸균한백 금이를바로사용하지않고식힌후사용한다 분도말 분도말 양성시험관으로부터 백금이에묻힘 배지에도말 배양

71 결과판정 전형적인집락 녹색의금속성광택 이발생하면확정시험양성이 다 확정시험양성 완전시험 한천배지에서전형적인대장균군의전형적인균체를 백금이취하여유당배 지와보통한천배지에각각접종하여 배양기에서 시간배양한다 + 유당배지 접종 보통한천배지접종 가스발생을확인하고보통한천배지에서배양된균체를취하여그람염색을실시한 다

72 가 슬라이드글라스에증류수한방울을올린다 나 배양한균을슬라이드글라스위에넓게펴준다 다 알코올램프를이용하여열고정 화염으로부터 이상위 라 으로 분간염색 마 세척한다 바 으로 분간고정 사 세척한다 아 로 초간탈색

73 자 세척한다 차 으로 초간염색 카 공기중에건조후유침유점적 타 현미경관찰을한다 그람염색결과판정 그람 무아포성간균이확인되면완전시험은양성이며대 장균군은양성이다 그람염색 붉은색 그람 간균

74 건조필름법 시험조작 앞의표준평판법의 추정시험에서 검체채취까지는동일하다 배지의접종각단계별희석용액 을대장균군건조필름배지 장에접종한뒤누름판으로누른후 배양기에넣어 시간배양또는전형적인집락이검출되지않을경우 시간까지추가배양한다 주의 필름커버를천천히내리고기포가생기지않게한다 가 시료 을접종한다 나 누름판을이용하여흡수 다 배양한다

75 결과확인 페트리필름에가스가발생한붉은집락수를카운팅한다 집락수산정및균수기재카운팅은 안의숫자만계산하고전평판에 개이하의집락만얻었을경우에가장희석배수가낮은것을측정한다 유효숫자는 개이며단위는시료가고체일경우 액체일경우 이다 희석배수 대장균군 집락수 회 회 희석배수 대장균군 집락수 회 회 참고사항 검체채취시 고체시료일경우필터가있는멸균백을사용하는것이유용하다 카운팅시네임펜으로집락을표시하면서카운팅한다

76 참조최확수법에의한정량시환산법 최확수란이론상가장가능한수치를말하여동일희석배수의시험용액을배지에접종하여대장균군의존재여부를시험하고그결과로부터확률론적인대장균군의수치를산출하여이것을최확수 로표시하는방법이다 최확수는시험용액 및 와같이연속해서 단계이상을각각 개씩별표 또는 개씩별표 발효관에가하여배양후얻은결과에의하여검체 중또는 중에존재하는대장균군수를표시하는것이다 예로검체또는희석검체의각각의발효관을 개씩사용하여다음과같은결과를얻었다면최확 수표에의하여시험검체 중의 은 로된다 이때접종량이 일때에 는 으로한다 시험용액접종량 가스발생양성관수 개 개 개 시험용액접종이 단계이상으로행하여졌을때에는다음표와같이취급한다 예 가스발생양성관수 유효숫자 예 개양성을표시한최소접종량부터시작한다 예 양성을인정한접종량을중간으로한다 예 최소유효접종량보다 단계적은접종량에서양성을인정한때에는양성 을인정한수를최소유효접종량의양성관수에더한다 단계의양 성관의수를 단계의양성관의수에더함

77 실험 요약 대장균군 준비물 시험법 배지 보통한천배지 건조필름배지 대장균군 희석수 용액 생리식염수시험관 유당시험법 추정시험 시료처리 시료 생리식염수 시료접종 에시료 개 개 개 을접종 배양 에서 배양 판정 생성확인 추정시험음성 가스비발생 추정시험양성 가스발생 확정시험진행 확정시험 에 배양액접종후배양 생성확인 가스미생성 음성 중단 가스생성 양성 번으로 에 차도말접종후배양 판정 음성 금속성광택을띄는집락미형성 중단 양성 금속성광택을띄는집락형성 완전시험진행 완전시험 전형적인집락 금속성광택집락 을유당배지 및보통한천사면배지에이식 에서 시간배양 그람염색 유당배지에서양성인시료를대상으로보통한천배지의집락을대상으로그람음성무아포성간균확인 건조필름법 희석 시료 을이용하여 시료접종 희석당 을대장균군용건조필름배지 장에접종 누름판을이용 분간 배양 배양 계수 붉은색집락 가스생성콜로니수를계수한다

78 유당시험법 정성시험및정량시험 희석비율 양성 시험 관수 그람염색 판정 최종결과 환산 희석 또는 건조필름법 희석배수 대장균군 집락 수 + 1회 ( ) 2 = 2회 = CFU/g 환산에이용한배수를선정한이유 사이의희석배수를선정한다

79 검사명 실험결과보고서 ( 예시 ) 근거 검사자 시료명 제조사 시약및배지 제조일자 생리식염수 페트리디시매 배지 평판배지 대장균군용건조필름배지 사용된시험관수 분반 조 개 매 실험과정 실험내용 검사날짜기재 시료제조 년 월 일 시 입고일자 보존방법 희석용생리식염수시험관 배지 배지 보통한천배지 그람염색시약 사용된듀람시험관수 개 시료 과생리식염수 을첨가하여 분간균질화하여시험용액으로사용하였다 의시험용액 을 의생리식염수에첨가하는연속 배희석법에의해 까지희 석하여시험용액으로이용하였다 정성 정량시험 추정시험 년 월 일 시 확정시험 년 월 일 시 완전시험 년 월 일 시 정량시험 건조필름법 년 월 일 시 결과판독 검사날짜기재 정성시험결과요약 표식 양성 음성 시험하지않음 희석비율 날짜 추정 확정 완전 그람염색 최종결과 개

80 정량시험 법 년 월 일 시 결과 환산식 최확수표에의거하여최확수를결정한다 최확수 희석 또는 건조필름법 년 월 일 시 희석배수 세균수 또는 집락수 회 회 환산식 결과사진 정성시험 희석비율 추정 사진사진사진 사진사진사진확정 사진사진사진 완전 사진사진사진 그람염색 사진사진사진 건조필름법 희석비율 사진 사진 사진 사진 사진 사진 사진 사진 판정 판정근거 식품공전또는축산물공정또는논문등 판 논의 정 적합또는부적합또는기타 결과및판정에대한논의

81 13 장. 대장균 목적및원리 가 목적 식품으로부터대장균의검출을위한정성분석에대한원리와실험기술을익히고평가하는능력을배양한다 대장균용건조필름과 인덱스를이용한정량분석방법을익힌다 나 원리대장균군중에서도대장균 배지 발효관에접종한다음 에서 시간배양할때유당을분해하여가스와산을생성하는균을분변성대장균군 이라하여분변오염의지표로대장균군보다더정확하다 주로 로구성되지만일부 균주들도이조건을만족한다 따라서한도시험으로 와그람염색을통해그람음성 비포자성간균을확인한후생화학적시험을통하여대장균을판정하여야한다 또한정량시험의경우추정시험은 배지가지희석배수에 또는 반복시험관 를이용한가스생성여부를판정한후확정시험으로 한천배지에서금속성광택을띄는콜로니를확인한후완전시험으로그람염색과생화학시험을통하여추정시험의양성시험관을기준으로 인덱스를이용하여대장균의정량분석을수행할수있다 또한건조필름법을이용하여대장균의수를정량한다 근거 식품공전 일반시험법 대장균

82 검사과정 배지및시액 생리식염수 그림은 장 배지및시액참조 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간한다 희석수용시험관 개를멸균한다 배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후발효관이들어간시험관에 씩분주한다 분주한시험관을 에넣고멸균 분간한다 한천배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균한 분간다 멸균이끝난후 정도되었을때페트리디쉬에분주하여굳힌다

83 보통한천배지 을 에넣는다 증류수 를넣고녹인후 에넣고멸균 분간한다 멸균이끝난후 정도되었을때페트리디쉬에분주하여굳힌다 주의 멸균을위해 에넣을때는은박지 호일 로감싼뒤에넣고뚜껑 을살짝열어둔다 꽉닫으면 의압에의해터지거나뚜껑이열 리지않을수있다 대장균건조필름배지 누름판

84 참고사항 배지량은회사마다조금씩차이가날수있으니배지통옆에설명을잘읽어본다 필요량에따라배지양을조절한다 을만들때배지 을증류수 에녹인다 배지를녹일때에는핫플레이트나전자레인지를이용하여녹인다 건조필름배지는냉장보관을하고뜯었을경우잘린부분을봉하고상온에보관할수있다 별첨대장균시험에사용하는배지 배지 위의성분을증류수 에녹여 로조정한후발효관을넣은시험관에 씩 분주하여 에서 분간멸균한다 대장균건조필름배지 위의성분을증류수 에녹인후 에서 분간멸균하여건조필름을제조한다

85 기구및재료 무균대 고압멸균기 피펫과팁 배양기 시험관 발효관 페트리접시 광학현미경백금이

86 실험방법 한도시험정성시험 추정시험 검체채취 멸균백에검체 을취하고멸균생리식염수 을분주한후균질한것을시험용액으로한다 검체채취 멸균생리식염수분주 균질 시험액채취 배지 개를준비하고시험용액 씩분주하고 에서 시간배양한다 주의 시험관마다뚜껑을열기전에시험관입구를돌려가며알코올램프로살균한다 주의 시험관마다뚜껑을열기전에시험관입구를돌려가며알코올램프로살균한다 검체 씩분주 배양

87 배지결과판정 기포가발생하면추정시험양성이다 가스발생없음 음성 가스발생 양성 확정시험 추정시험양성인시험관에서 백금이를취하여 한천배지에획선도말로접종하여배지를거꾸로하여 배양기에서 시간배양한후결과를판정한다 주의 백금이를사용하기전에는꼭알코올램프로화염멸균을하고멸균한백금이를바로사용하지않고식힌후사용한다 양성시험관으로부터백금이에묻힘 배지에도말 배양

88 결과판정 흑녹색의금속성광택의집락이발생하면확정시험양성이다 금속성광택가진흑녹색집락 양성 완전시험 한천배지에서전형적인대장균의균체를 백금이취하여유당배지와보통한천배지에획선도말로각각접종하여 배양기에서 시간 시간배양한다 + 유당배지 접종 보통한천배지접종 가스발생을확인하고보통한천배지에서배양된균체를취하여그람염색을실시한 다 장대장균군 완전시험 의그림참조

89 그람염색결과판정 그람 무아포성간균이확인되면완전시험은양성이며생 화학테스트를실시한다 그람염색 붉은색 그람 균 를사용한다 주의 매뉴얼책자를보며실험을하고판독표를보며확인한다 가 스트립의준비 를준비하고약 의멸균증류수를 에부어서수분을유지하도록한다 스트립을 위에올려놓는다

90 나 접종액의준비 의앰플을열고하나의 를취한후골고루부유 되도록접종한다 다 스트립의접종 은큐플까지균액으로가득채운다 나머지는큐플을제외하고튜브만채운다 는혐기적인조건을만들어주기위해광유 로큐플을채운다 호기적인상태에서 시간배양한다 큐플 튜 브 균부유용액접종 큐브 큐플 혐기성용큐플에 첨가 배양

91 라 스트립의판독 배양후판독표를참조하여결과를읽고판독표에표시된부분은시약을첨가한다 시약을한방울첨가하고바로결과를리딩한다 과 를각각한방울씩첨가하고 분기다린후결과를리딩한다 결과지에발생한모든결과를기록한다 만약 가양성이거나 개이상의테스트가양성이면보조시약을첨가한다 에 시약과 시약을한방울씩떨군후 분기다린다 빨간색은양성 이고노란색은음성이다 음성일경우에 을 떨구고 분후에여전히노란색으로남아있으면양성이고빨간색으로변하면음성이다 가 발색반응 나 에 시약을첨가 다 첨가 다 첨가

92 반응전 반응후 건조필름법 시험조작 앞의표준평판법의 추정시험에서 검체채취까지는동일하다 배지의접종각단계별희석용액 을대장균군건조필름배지 장에접종한뒤누름판으로누른후 배양기에넣어 시간배양한다 주의 필름커버를천천히내리고기포가생기지않게한다 가 시료 을접종한다 나 누름판을이용하여흡수 다 배양한다

93 결과확인 페트리필름에가스가발생한검은집락수를카운팅한다 집락수산정및균수기재유효숫자는 개이며단위는시료가고체일경우 액체일경우 이다 희석배수 대장균 집락수 회 회 참고사항 검체채취시 고체시료일경우필터가있는멸균백을사용하는것이유용하다 실험시균별로사용하는 가다르기때문에매뉴얼책자를보고균에알맞은스트립을사용한다 카운팅시네임펜으로집락을표시하면서카운팅한다

94 실험 요약 대장균 준비물 배지 배지 보통한천배지 건조필름배지 대장균 희석수 용액 생리식염수시험관 한도시험법 추정시험 시료처리 시료 생리식염수 시료접종 개의 시험관에시료 씩을접종 배양 에서 배양 판정 생성확인 추정시험음성 가스비발생 추정시험양성 가스발생 다음시험진행 확정시험 에 차도말접종후배양 판정 음성 금속성광택을띄는집락미형성 중단 양성 금속성광택을띄는집락형성 완전시험진행 시험법 완전시험 전형적인집락 금속성광택집락 을유당배지 및보통한천사면배지 에이식 에서 시간배양 그람염색 유당배지에서양성인시료를대상으로보통한천배지의집락을대상으로그람음성무아포성간균확인 배지에서성장된콜로니를이용하여 시험실시 시험결과 를이용하여 확인 스트립의준비 트레이에증류수첨가 에한콜로니취한후잘혼합 스트립에부유액접종 큐플까지균액을채우고나머지는튜브만채운다 는큐플에광유를채운다 호기조건에서 시간배양한다 판독 에는 시약 에는 시약을한방울첨가 에는 과 시약을한방울씩첨가 분후판독 만약 가양성이면보조시약을첨가한다 결과지에기록하고프로그램을이용하여검색한다

95 건조필름법 시험법 희석 시료 을이용하여 시료접종 희석당 을대장균용건조필름배지 장에접종 누름판을이용 분간 배양 배양 계수 파란색집락 가스생성콜로니수를계수한다 한도시험법 희석비율 결과 양성 시험 관수 그람염색 결과 최종결과 건조필름법 희석배수 일반세균수 집락 수 회 ( 100 ) 2 = 15,850 16,000 2회 = CFU/g 환산에이용한배수를선정한이유 사이의희석배수를선정한다

96 실험결과보고서 ( 예시 ) 검사명 근거 검사자 시료명 제조사 시약및배지 제조일자 생리식염수 페트리디시 매 평판배지 액체배지 그람염색시약 사용된시험관수 분반 조 개 실험과정 실험내용 검사날짜기재 시료제조 년 월 일 시 입고일자 보존방법 희석용생리식염수시험관 액체배지 보통한천배지 대장균용건조필름배지 개 사용된듀람시험관수 시료 과생리식염수 을첨가하여 분간균질화하여시험용액으로사용하였 다 의시험용액 을 의생리식염수에첨가하는연속 배희석법에의해 까지 희석하여시험용액으로이용하였다 한도실험 정성시험 추정시험 년 월 일 시 확정시험 년 월 일 시 완전시험 년 월 일 시 정량시험 건조필름법 년 월 일 시 결과판독 검사날짜기재 매 개 개 정성시험결과요약 표식 양성 음성 시험하지않음 희석비율 날짜 추정 확정 완전 그람염색

97 정량시험 건조필름법 년 월 일 시 희석배수 세균수 또는 집락수 회 회 환산식 결과사진 정성시험희석비율 추정 사진 사진 사진 확정 사진 사진 사진 완전 사진사진사진그람염색사진사진사진 결과사진및프린트물 건조필름법 희석비율 사진 사진 사진 사진 사진 사진 사진 사진 판정 판정근거 식품공전또는축산물공정또는논문등 판 정 적합또는부적합또는기타 논의 결과및판정에대한논의

98 참조 : 즉석섭취 편의식품류 정의즉석섭취 편의식품류라함은소비자가별도의조리과정없이그대로또는단순조리과정을거쳐섭취할수있도록제조가공 포장한즉석섭취식품 즉석조리식품 신선편의식품을말한다 다만 따로기준및규격이정하여져있는식품은그기준규격에의한다 원료등의구비요건 제조가공기준 식품유형 즉석섭취식품동 식물성원료를식품이나식품첨가물을가하여제조 가공한것으로서더이상의가열 조리과정없이그대로섭취할수있는김밥 햄버거 선식등의식품을말한다 즉석조리식품동 식물성원료를식품이나식품첨가물을가하여제조 가공한것으로서단순가열등의조리과정을거치거나이와동등한방법을거쳐섭취할수있는국 탕 스프등의식품을말한다 신선편의식품농 임산물을세척 박피 절단또는세절등의가공공정을거치거나이에단순히식품또는식품첨가물을가한것으로서그대로섭취할수있는샐러드 새싹채소등의식품을말한다 규격 대장균 당 이하신선편의식품에한하며즉석섭취식품은음성이어야한다 세균수 당 이하 즉석조리식품에한하며 발효제품또는유산균첨가제품은제외한다 황색포도상구균 당 이하 살모넬라 음성이어야한다 장염비브리오균 음성이어야한다해산물함유제품에한한다 바실러스세레우스 당 이하즉석섭취식품 신선편의식품에한한다 대장균 음성이어야한다신선편의식품에한한다 클로스트리디움퍼프린젠스 당 이하즉석섭취식품 신선편의식품에한한다

99 17 장바실러스세레우스 (Bacillus cereus) 목적및원리 목적 바실러스세레우스의실험원리와정성및정량분석기술을익힌다 원리식품중식중독및미생물의오염여부를판별하여소비자의건강을보호하고식품의안전과품질을확보하기위함이다 바실러스세레우스는자연계에널리존재하는중요한부패원인균으로식품에혼입될기회가많아서통조림을비롯한가공식품의보존상문제가되는균이며 그람양성통성혐기성간균 내열성아포형성균 시간내열성 이다 근거 식품공전 일반시험법 클로스트리디움퍼프린젠스

100 검사과정 배지및시액 멸균인산완충희석액 한천배지 보통한천배지 와 별첨배지조성 한천배지 위의성분을증류수 에녹이고 로조정한후 플라스크에 씩분주하고 에서 분간멸균하여 로식힌다음 용액 와난황액 시액 를각각넣어혼합한다

101 기구및재료 무균대 고압멸균기 피펫과팁 배양기 시험관 페트리접시 현미경 백금이및백금선 도말봉 실험방법 정성시험가 분리배양 멸균백에검체 을취하고멸균인산완충희석액 를분주한다 를이용하여 분간균질한다 시험액에서 백금이를취해 한천배지에획선도말로접종한다 시간배양한다 판정 혼탁한환을갖는분홍색집락이발생하면확인시험을실시한다 이때명확하지않을경우 시간더배양하여관찰한다 < 혼탁한환을갖는분홍색집락 ( 양성 )> 나 확인시험 배지에서혼탁한환을갖는분홍색집락을취해보통한천배지에획선도말로접종한다 시간배양한다 그람염색 보통한천배지에서배양된균체를취하여그람염색을실시한다 판정 그람 긴형태의간균을확인

102 그람염색 보라색 그람 균 운동성시험및 환원능시험 보통한천배지에서백금선으로이용하여 가운데에밑으로찔러접종한다 시간배양후확인한다 < 운동성 ( 양성 ), 표면에붉은반응 (Nitrate 양성 ) > 표준한천배지에서 백금이를 에접종한다 시간배양한다 <β-hemolysis : Blood Agar 에서용혈반응 ( 양성 )>

103 와 를사용한다 < 반응 ( 배양 ) 전 > < 반응 ( 배양 ) 후 - 바실러스세레우스 >

104 정량시험가 균수측정 멸균백에검체 을취하고멸균인산완충희석액 를분주한다 를이용하여 분간고속으로균질한다 한천배지 장에 씩총접종액이 이되게도말봉으로도말한다 사용된배지는건조시킨다 시간배양한다음집락주변에 를생성하는혼탁한환을갖는분홍색집락을계수한다 < 혼탁한환을갖는분홍색집락 ( 양성 )> 나 확인시험 계수한평판에서 개이상의전형적인집락을선별하여보통한천배지에접종한다 시간배양한후앞의 정성시험법 확인시험에따라시험을실시한다 다 균수계산 전형적인총집락 확인된동정된균수 선별한전형적인집락수 희석배수 개배지에서혼탁한환을갖는분홍색집락이총 개이고 개를선별하여동정한결과 개가바실러스세레우스으로확인되었다

105 실험 요약 준비물 배지 한천배지 보통한천배지 가포함된 한 천배지 와 희석액 멸균인산완충희석액 시액 한도시험법 분리배양 검체 또는 의인산완충희석액 한천배지에접종 첨가 시간배양 혼탁한환을갖는분홍색집락을취함 확인시험 전형적인집락을보통한천배지에접종 시간배양 그람염색 그람양성 간균확인 시험법 운동성시험및 환원능시험 가운데에밑으로찔러접종 시간배양후확인 운동성양성 질산환원양성 적색 에접종 시간배양 베타용혈반응 동정 와 정량시험 균수측정 검체 의인산완충희석액 한천배지 장 에 씩접종후도말 첨가 시간증균배양 혼탁한환을갖는분홍색집락을계수

106 확인시험 평판에서 개의전형적인집락을보통한천배지에접종 시간배양 정성시험법 확인시험수행 균수계산전형적인총집락 확인된동정된균수 선별한전형적인집락수 희석배수 한도시험법 결과 분리배양 확인시험 항목판정비고 한천배지에접종 그람염색 환원능시험 운동성시험 와 혼탁한환을갖는분홍색집락 그람양성 간균 양성 양성 베타용혈 이상일치 최종판정 정량시험 전형적인총집락 확인된동정된균수 선별한전형적인집락수 희석배수

107 검사명 실험결과보고서 ( 예시 ) 근거 검사자 분반 조 시료명 입고일자 제조사 보존방법 시약및배지 제조일자 실험과정 실험내용 검사날짜기재 한도시험 분리배양 년 월 일 시 확인시험 년 월 일 시 정량시험 균수측정 확인시험 결과판독 검사날짜기재 한도시험결과요약 표식 양성 음성 시험하지않음 분리배양 확인 시험 항목판정비고 한천배지에접종 혼탁한환을갖는분홍색집락 그람염색그람양성 간균 환원능시험양성 운동성시험양성 베타용혈 와 이상일치 최종판정

108 정량실험 결과사진 증균 분리 확인 결과사진및프린트물 판정 판정근거 식품공전또는축산물공정또는논문등 판 정 적합또는부적합또는기타 논의 결과및판정에대한논의