308 박주원 김재경 임인수외 1 인 험적항생제요법이사용되므로질환초기의신속한감별진단이중요하다. 특히소아에서심각한임상양상을나타낼수있는지역사회획득폐렴 (community-acquired pneumonia, 원외폐렴 ) 의경우주요세균성원인으로는 Streptococcus pn

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설아 소
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1 대한진단검사의학회지제 29 권제 4 호 2009 Korean J Lab Med 2009;29: DOI /kjlm Original Article Clinical Microbiology 소아의세균성호흡기감염의진단을위한 Seeplex TM Pneumobacter Multiplex PCR 키트의평가 박주원 김재경 임인수 김종완 단국대학교병원진단검사의학과 Evaluation of Seeplex TM Pneumobacter Multiplex PCR Kit for the Detection of Respiratory Bacterial Pathogens in Pediatric Patients Joowon Park, M.D., Jae Kyoung Kim, M.T., Insoo Rheem, M.D., and Jongwan Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, Dankook University Hospital, Cheonan, Korea Background : Rapid identification of the causative agent among potential bacterial and viral pathogens is important for the management of acute respiratory disease. In this study, we evaluated the analytical performance and clinical usefulness of a recently-introduced multiplex PCR assay, Seeplex TM Pneumobacter detection kit (Seegene Inc., Korea) for the identification of respiratory bacterial pathogens. Methods : One hundred and eighty one nasopharyngeal aspirates were collected from pediatric patients with respiratory symptoms and analysed by multiplex PCR for the detection of Streptococcus pneumoniae (S.P), Haemophilus influenzae (H.I), Mycoplasma pneumoniae (M.P), Chlamydophila pneumoniae (C.P), Bordetella pertussis (B.P) and Legionella pneumophila (L.P). A comparison of multiplex PCR with conventional culture for the isolation of S.P and H.I was performed on 112 specimens. The cross reactivity of multiplex PCR was also evaluated. Results : Of 181 cases, 81 cases were positive by multiplex PCR (44.8%): 52 cases for S.P (28.7%), 47 cases for H.I (26.0%), 9 cases for M.P (5.0%), 3 cases for B.P (1.7%) and 1 case for C.P (0.6%) including multiple infection cases. The agreement rates between multiplex PCR and culture for S.P and H.I were 92.9% (kappa index=0.84, P<0.001) and 91.1% (kappa index=0.75, P<0.001), respectively. There was no cross reactivity with common bacterial and viral pathogens. Conclusions : Seeplex TM Pneumobacter detection kit could be a useful screening tool for the rapid detection of respiratory bacterial pathogens. Further studies with lower respiratory tract specimens would be needed for the clinical evaluation of S. pneumoniae and H. influenzae detected by multiplex PCR. (Korean J Lab Med 2009;29:307-13) Key Words : Multiplex PCR, Respiratory infection, Mycoplasma pneumoniae Received : March 19, 2009 Manuscript No : KJLM Revision received : July 9, 2009 Accepted : July 10, 2009 Corresponding author : Joowon Park, M.D. Department of Laboratory Medicine, Dankook University Hospital, 16-5 Anseo-dong, Cheonan , Korea Tel : , Fax : bjwon@hitel.net 서론급성호흡기감염증은소아에서흔히발생하는질환으로대부분경미한증상을보이나환자상태에따라서는입원을요하는중증의호흡기질환을유발하기도한다 [1]. 세균성호흡기감염은바이러스성감염에비하여발생빈도는적으나치료에는흔히경 307

2 308 박주원 김재경 임인수외 1 인 험적항생제요법이사용되므로질환초기의신속한감별진단이중요하다. 특히소아에서심각한임상양상을나타낼수있는지역사회획득폐렴 (community-acquired pneumonia, 원외폐렴 ) 의경우주요세균성원인으로는 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae 및 Chlamydophila pneumoniae 등이알려져있으나, 증상이대체로유사하고중복감염이흔하여상당예에서는원인균의진단이어렵고임상적으로바이러스성감염과의감별도용이하지않다 [2-4]. 따라서진단을위해서는검사실적동정이중요한데미생물학적검사를위한흉막액 (pleural fluid) 등의하기도검체의채취는통상적으로시행하기에는부적절하며, 혈액배양검사는민감도가떨어지고최종동정까지시간이소요된다. 또한 M. pneumoniae와같이배양이까다로운균주의경우임상에서많이의뢰하는혈청학적검사는항체의비특이적인증가를보일수있고, 회복기혈청과의비교가필요하므로적절한치료시기를놓칠수있는제한점이있다 [5]. 중합효소연쇄반응 (PCR) 을이용한분자유전학적진단법은호흡기감염을유발하는바이러스및세균의조기검출을가능하게함으로써전통적인검사법의단점을보완할수있다. 특히다중 (multiplex) PCR법은여러종류의감염균을동시에검사할수있어서다양한원인균을신속하게감별해야하는호흡기감염질환의진단에유용하다 [6-10]. 최근에소개된 Seeplex TM Pneumobacter detection 키트 (Seegene Inc., Seoul, Korea) 는 dual priming oligonucleotide (DPO) 기법을이용한다중 PCR 검사법으로 S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae, Bordetella pertussis 및 Legionella pneumophila 등의 6가지호흡기감염균을동시에검출한다. 본연구에서는호흡기증상으로입원한소아환자를대상으로 Pneumobacter multiplex PCR 키트의진단적유용성을알아보고자하였다. 2. 방법 1) 다중 PCR QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) 를이용하여비인두흡인액 300 μl 에서 DNA 30 μl 를추출하였고, Seeplex TM Pneumobacter Detection 키트를이용하여 PCR 반응액 20 μl (DNA 3 μl, 5 Pneumobacter primer 4 μl, 8-methoxypsoralen 3 μl, 2 Multiplex Master Mix 10 μl) 를제조하여 PCR 반응을실시하였다. PCR 반응은 94 에서 15분반응후 94 30초, 분, 분의반응을 40회반복하였고최종연장반응을 72 에서 10분간시행하였다. PCR 결과물 5 μl 를덜어내어 ethidium bromide를포함한 2% 아가로오즈겔에서전기영동하였고 marker DNA와비교하여개별균주의밴드유무를판독하였다 (Fig. 1). 검사에사용된표적유전자의특징에대해서는 Table 1에정리하였다. 2) 다중 PCR의교차반응평가표준균주와임상검체에서분리한 21종의바이러스및세균균주를이용하여다중 PCR법의교차반응성을평가하였다. 3) 호흡기바이러스 PCR 대상군중 128명에대해서는호흡기바이러스다중역전사 M P N 재료및방법 1. 대상 2008년 3월부터 12월까지호흡기증상을주소로단국대학교병원에내원하여호흡기감염균다중 PCR 검사가의뢰된소아환자의비인두흡인액 (nasopharyngeal aspirates) 181검체를대상으로분석하였다. 검체는 DNA 추출전까지 4 에보관하였고추출한 DNA는검사실시전까지 -70 에보관하였다. Fig. 1. Multiplex PCR products of six positive samples. M, 100 bp DNA ladder; lane 1, M. pneumoniae (583 bp); lane 2, L. pneumophila (472 bp); lane 3, S. pneumoniae (350 bp); lane 4, H. influenzae (257 bp); lane 5, B. pertussis (200 bp), lane 6, C. pneumoniae (146 bp); P, positive control ladder; N, negative control.

3 Evaluation of Pneumobacter Detection Kit 309 (reverse transcriptase) PCR 검사가함께의뢰되었으며, Seeplex TM RV Detection 키트 (Seegene Inc., Seoul, Korea) 를이용하여제조사의지침에따라시행하였다 [9]. 4) 미생물검사대상검체중추가검사가가능했던 112검체는혈액한천배지와 chocolate 배지에접종하여 24시간배양후생화학적검사와 VITEK II Inc., Durham, NC, USA) 를이용해서 S. pneumoniae와 H. influenzae 동정검사를시행하였고, 혈액배양검사가의뢰된 106명에대해서는 BacT/Alert 자동혈액배양기 를이용하여검사를실시하였다. 5) M. pneumoniae 혈청학적검사 대상군중 98 명에대하여 M. pneumoniae 항체검사가의뢰되었고, Serodia-MycoII 키트 (Fujirebio Inc., Tokyo, Japan) Table 1. Target genes used in multiplex PCR Organism Target gene Amplicon Accession size (bp) No. S. pneumoniae Pneumolysin (ply) 350 NC H. influenzae Outer membrane protein (P6) 257 NC M. pneumoniae 16S-23S rrna intergenic 583 NC spacer (ITS1) C. pneumoniae Major outer membrane 146 NC protein (ompa) L. pneumophila Macrophage infectivity 472 NC potentiator (mip) B. pertussis Outer membrane protein (prn) 200 NC Abbreviations: S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae; H. influenzae, Haemophilus influenzae; M. pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae; C. pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae; L. pneumophila, Legionella pneumophila, B. pertussis, Bordetella pertussis. 를이용한입자응집 (particle agglutination) 법으로시행하였다. 양성판정기준은제조사의지침에따라단일혈청항체가가 1:40 이상인경우혹은급성기혈청과회복기혈청간에 4배이상의항체가증가를보인경우로하였다. 6) 통계통계분석에는 SPSS version 15.0 K (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용하였다. 1. 다중 PCR 결과 결 총 181검체중 81 예 (44.8%) 에서다중 PCR 결과가양성이었다. 중복양성을포함한 S. pneumoniae 양성은 52예 (28.7%) 이었으며, H. influenzae와 M. pneumoniae 양성은각각 47예 (26.0%) 와 9예 (5.0%) 이었다. B. pertussis와 C. pneumoniae Table 2. Results of analysis on 181 nasopharyngeal aspirates by multiplex PCR Organisms isolated Positive N (%) S. pneumoniae (S.P) 23 (12.7%) H. influenzae (H.I) 20 (11.0%) M. pneumoniae (M.P) 6 (3.3%) C. pneumoniae (C.P) 1 (0.6%) B. pertussis (B.P) 2 (1.1%) S. pneumoniae+h. influenzae 25 (13.8%) S. pneumoniae+m. pneumoniae 1 (0.6%) S. pneumoniae+b. pertussis 1 (0.6%) S. pneumoniae+h.i+m.p 2 (1.1%) Total 81 (44.8%) Abbreviations: See Table 1. 과 Table 3. Analytical specificity of multiplex PCR with 21 different microorganisms Organism ATCC No. PCR result Organism ATCC No. PCR result Staphylococcus aureus D-5 (-) Staphylococcus epidermidis 35984D-5 (-) Streptococcus agalactiae BAA-611D (-) Streptococcus mitis KCTC (-) Klebsiella pneumoniae D-5 (-) Klebsiella oxytoca D (-) Pseudomonas aeruginosa 47085D (-) Serratia marcescens (-) Haemophilus aphrophilus KCCM (-) Haemophilus parainfluenzae KCTC 5485 (-) Mycoplasma genitalium 33530D (-) Mycoplasma hominis 23114D (-) Chlamydia trachomatis VR-1500 (-) Influenza A VR-544 (-) Influenza B VR-101 (-) PIV 1 VR-1380 (-) Rhinovirus A VR-1131 (-) RSV A VR-26 (-) hmpv Korean isolation (-) CoV OC43 VR (-) CoV 229E VR-740 (-) Human gdna (-) Plasmid vector (-) Abbreviations: PIV, parainfluenza virus; RSV, respiratory syncytial virus; hmpv, human metapneumovirus; CoV, coronavirus.

4 310 박주원 김재경 임인수외 1 인 는각각 3예 (1.7%) 와 1예 (0.6%) 에서검출되었고, L. pneumophila는양성예가관찰되지않았다 (Table 2). 2. 다중 PCR의교차반응평가결과호흡기감염의흔한원인바이러스와세균및검출대상균과유사한균주등에대한다중 PCR법에서교차반응은관찰되지않았다 (Table 3). 3. 호흡기바이러스 PCR 결과호흡기바이러스다중역전사 PCR 검사를함께시행한 128예중세균 PCR 양성인검체에서호흡기바이러스가양성인경우는 47예 (36.7%) 이었다. S. pneumoniae와 H. influenzae의중복양성환자에서 human metapneumovirus (hmpv) 가같이발현된경우가 5예로가장많았으며, 바이러스단독양성은 30예 (23.4%) 에서관찰되었다 (Table 4). 4. 미생물검사결과대상군중 112예에서시행한배양검사결과 S. pneumoniae 는 34검체 (30.4%), H. influenzae는 21검체 (18.8%) 에서각각양성이었다. 배양양성검체는모두다중 PCR에서도양성으로나온예였으며, PCR과배양검사간의일치율은 S. pneumoniae 와 H. influenzae에서각각 92.9% 및 91.1% 이었다 (Table 5). 혈액배양결과는검사를시행한 106예중 3예에서양성이었으며 S. pneumoniae가 2예, Staphylococcus epidermidis가 1예에서분리되었다. S. pneumoniae 양성 2예는 PCR과배양검사에서도모두 S. pneumoniae가동정된경우였으며, S. epidermidis 가분리된 1예는오염으로해석하였다. 5. M. pneumoniae 혈청학적검사결과 Table 4. Results of multiplex PCR for potential respiratory bacterial and viral pathogens Respiratory viruses S.P S.P+H.I H.I Abbreviations: See Table 2, 3. S.P+H.I+ M.P M.P B.P Virus only Influenza A Influenza B PIV PIV 2 1 PIV 3 2 RSV A RSV B Adenovirus Rhinovirus hmpv CoV 229E 1 1 CoV OC43 1 Total Table 5. Comparison of multiplex PCR and conventional culture method for the detection of S. pneumoniae and H. influenzae in 112 patients Culture Multiplex PCR + - N of concordance Kappa P S. pneumoniae + 34 (30.4%) 0 (0.0%) - 8 (7.1%) 70 (62.5%) 104 (92.9%) 0.84 <0.001 H. influenzae + 21 (18.8%) 0 (0.0%) - 10 (8.9%) 81 (72.3%) 102 (91.1%) 0.75 <0.001 대상군중 98 명에대해시행한 M. pneumoniae 항체검사에서양성인경우는 48명 (49.0%) 이었다. 다중 PCR 결과에서 M. pneumoniae 양성을보인 9명중 6명은회복기혈청과의비교에서항체가가 4배이상증가했거나단일혈청에서 1:640 이상의고항체가를보였으나나머지 3명은항체음성소견을나타냈다. 항체검사에서 1:160 이상의항체가를보였으나 PCR에서음성인경우도 4예가있었다. 6. PCR 양성군의임상적특징 다중 PCR 검사에서양성을보인 81 명의환자들의의무기록을후향적으로조회하였다. 환자군의평균나이는 4.9세, 연령분포 Table 6. Disease entities of positive cases by multiplex PCR Disease Bacterial (single) Bacterial (multiple) Abbreviation: FUO, fever of unknown origin. Bacterial and viral Total Pneumonia Bronchiolitis Asthma exacerbation Acute otitis media FUO Pertussis Acute tonsillitis 1 1 Croup 1 1 Sinusitis 1 1 Total

5 Evaluation of Pneumobacter Detection Kit 311 는생후 18 일부터 16세까지였고, 남자가 46명, 여자가 35명이었다. 임상진단명은폐렴이 46 예 (56.8%), 급성세기관지염이 15예 (18.5%), 급성천식의악화가 11예 (13.6%), 백일해, 급성중이염및불명열이각각 2예 (2.5%), 크룹, 급성편도염및부비동염이각각 1예 (1.2%) 이었다 (Table 6). 고찰본연구에서폐렴환자 46예중 M. pneumoniae가원인으로진단된경우는 8예였으며, 이중 6예는다중 PCR에서양성으로나온경우였다. PCR 양성 5예는 M. pneumoniae 항체검사에서항체가가 4배이상증가했거나단일혈청에서 1:640 이상의고항체가를보였으나, 나머지 1예는항체음성이었다. 항체음성인 1예는다중 PCR에서 M. pneumoniae가단독양성으로나온환자였으며 clarithromycin 치료에도잘반응하여 M. pneumoniae 폐렴으로진단된경우였다. 대상군중 PCR 음성이나항체가가 1:160인경우가 1예, 1:320인경우가 3예가있었는데, 이중항체가 1:320의 2예는임상적으로 M. pneumoniae를원인균으로의심하고치료를시행한경우였다. 실제임상에서는많은경우단일혈청검사에서고항체가를보인경우에 M. pneumoniae 감염으로간주하고치료를시행하고있으나 [11], 연구보고에의하면호흡기증상이없는건강인에서도 1:160 내지는 1:320의항체가가관찰될수있어입자응집법을이용한단일혈청항체가만으로는 M. pneumoniae 현증감염을진단하기에는무리가있음을시사한다 [12, 13]. 본연구에서는대상군중 5예에서만회복기혈청에대한비교검사가가능했던관계로 PCR 결과와혈청학적검사와의상관성을규명하기는어려우며, 다만검체의종류에따라 M. pneumoniae PCR 검사의민감도에차이가있다는연구보고가있어 [14] 추후다양한검체를이용한비교검사의시행도의미가있을것으로사료된다. C. pneumoniae의일차감염은소아에서비교적흔하며원외폐렴의원인중약 10% 를차지하고있어급성호흡기감염이의심되는소아환자에서감별해야할주요균주중하나이다 [15]. L. pneumophila는주로면역기능이저하된환자에서기회감염을유발하는것으로알려져있으나, 최근에는원외폐렴의원인균으로도주목받고있는데특히레지오넬라폐렴의경우사망률이높아조기진단이중요하다 [16]. 이들균주는미생물적동정이용이하지않고혈청학적검사또한시간이소요되며현감염을반영하지못하는등의제한점이있으므로 [5, 15], 기존의검사들에비하여민감도가높고신속하게결과를볼수있는분자유전학적검사가진단에유용할것으로기대되는데본연구에서 C. pneumoniae 양성은 1예만있었고 L. pneumophila의경우는양성예가관찰되지않았다. C. pneumoniae 양성예는생후 1개월된여아로서급성세기관지염의증하에내원하여검사시행후타원으로전원한경우였으며, 호흡기바이러스 PCR 검사는시행하지않았다. 연구보고에의하면비인두검체에서 C. pneumoniae와 L. pneumophila의 PCR 양성률이상대적으로낮은것으로나와 [7, 17] 본연구에서이들균주가낮은양성률을보인원인중하나로생각된다. 대상군중 8명에대하여실시한 NOW TM Legionella 소변항원검사 (Binax, Scarborough, ME, USA) 에서도양성예는관찰되지않았다 ( 자료미제시 ). B. pertussis 감염은백신을접종하지않은유아에서가장흔하나청소년및성인에서도잦은기침을주소로하는호흡기질환을유발하기도한다 [18]. 본연구에서 B. pertussis 양성 3명은모두생후 3개월미만의환아로서백일해예방접종은시행하지않은경우였는데그중 2명은임상적으로백일해로진단받고 azithromycin 치료로호전되었으며, 1명은급성세기관지염의증으로내원하여검사를시행한직후타원으로전원한예였다. 백일해진단을받은환자 2명은모두다중 PCR에서 B. pertussis가단독으로검출된경우였다. 다중 PCR에서검출된 B. pertussis 균주의염기서열분석을시행한결과 GenBank 등록균주와 100% 의일치율을보였다 (GenBank No. EF ). 하부호흡기감염의미생물학적진단을위한검체로는흉막액, 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage, BAL) 내지는기관지경흡인액 (bronchoscopy secretions) 등이가장적합하겠으나이러한침습적인검체를통상적으로채취하기는여의치않으며, 객담의경우특히유소아에서는적절한검체를얻기어려운단점이있다. 소아환자에서는검체의수집이용이한비인두흡인액이미생물검사를위한검체로흔히의뢰되는데이를이용한다중 PCR 검사는호흡기감염이의심되는소아환자의신속한선별검사로서유용할수있으나 S. pneumoniae나 H. influenzae와같은상주균의경우결과해석의제한점이있는것또한사실이다. 실제본연구에서다중 PCR 검사를시행한예는주로비정형감염균에대한선별검사의목적으로의뢰한경우였으며, S. pneumoniae와 H. influenzae의양성결과에대해서는대부분의경우환자의임상증상과관련하여진단적가치를부여하지는않았다. 그러나 S. pneumoniae와 H. influenzae는환자의상태에따라서는상기도감염외에하기도감염을유발하기도하며, 특히원외폐렴의주요원인균으로알려져있어호흡기증상으로내원하는환자에서이들균주의감별진단역시중요할것이므로 [19-21] 향후하기도검체를이용한추가연구가다중 PCR 검사의임상적유용성을평가하는데필요할것으로생각된다.

6 312 박주원 김재경 임인수외 1 인 세균 PCR 양성인검체에서호흡기바이러스가양성이었던경우는 47예 (36.7%) 로소아의비인두흡인액검체를대상으로한이전연구결과와유사한양성률을보였는데 [22], 그중세균 PCR 검사에서 M. pneumoniae가검출된 4예및 B. pertussis 가검출된 1예는임상적으로세균성원인으로진단된경우였다. 많은예에서감염의주원인을감별하기는용이하지않았으나바이러스의선행감염이폐렴의발생기전에관여하는것으로알려져있고 [23], 바이러스의경우대개는특정유행시기가있으므로호흡기감염환자의선별검사로호흡기세균과바이러스의 PCR 검사를함께시행하는것은임상에서치료지침을결정내지는변경할경우고려할수있는일차적인정보를제공한다는점에서도움이될것으로생각된다. 다중 PCR 검사에서이용된 DPO 기법은 polydeoxyinosine linker가연결하는길이가서로다른두부위로이루어진시발체를사용하는것이특징인데 bp의 5 부위는검출하고자하는균주의목표염기서열과의결합을촉진시키고, 6-12 bp 의 3 부위는나머지목표부위와의결합을통해증폭반응을진행시킴으로써민감도와특이도를향상시킨것으로보고된바있다 [24]. 본연구에서다중 PCR법은배양결과와의높은일치율을나타내었고, 다양한종류의바이러스와세균균주에대한교차반응성평가에서도만족할만한분석특이도를보였다. 결론적으로 Seeplex TM Pneumobacter Detection 키트를이용한다중 PCR 검사는호흡기감염균의신속한검출을위한선별검사로서유용하리라생각되며, 호흡기환자의치료지침의결정에도움을줄수있을것으로사료된다. 요약배경 : 급성호흡기감염에서원인균의신속한진단은환자의적절한치료를위하여중요하다. 저자들은최근소개된 Seeplex TM Pneumobacter Detection 키트 (Seegene Inc., Korea) 를이용한다중 (multiplex) PCR 검사의진단적유용성을평가하고자하였다. 방법 : 소아호흡기환자 181명의비인두흡인액검체를이용하여 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Bordetella pertussis 및 Legionella pneumophila 등의 6가지호흡기감염균에대한다중 PCR 검사를실시하였다. 대상군중 112검체에대해서는 S. pneumoniae와 H. influenzae 배양검사를시행하여 PCR 결과와비교하였고, 다중 PCR 검사의분석특이도검증을위하여교차반응성을평가하였다. 결과 : 총대상군 181명중 81 명 (44.8%) 에서다중 PCR 결과가양성이었다. 중복감염을포함한양성예는 S. pneumoniae 가 52 명 (28.7%), H. influenzae가 47 명 (26.0%), M. pneumoniae가 9명 (5.0%), B. pertussis가 3명 (1.7%), 그리고 C. pneumoniae가 1명 (0.6%) 이었다. 배양검사와의일치율은 S. pneumoniae와 H. influenzae에서각각 92.9% (kappa index=0.84, P<0.001) 및 91.1% (kappa index=0.75, P<0.001) 이었다. 호흡기감염의흔한원인바이러스와세균에대한다중 PCR법의교차반응은관찰되지않았다. 결론 : Seeplex TM Pneumobacter Detection 키트는호흡기감염균의신속한검출을위한선별검사로서유용할것으로생각된다. 이후 S. pneumoniae와 H. influenzae 양성결과의임상적해석을위한하기도검체를이용하는추가연구가필요할것으로사료된다. 참고문헌 1. Leowski J. Mortality from acute respiratory infections in children under 5 years of age: global estimates. World Health Stat Q 1986;39: McCracken GH Jr. Diagnosis and management of pneumonia in children. Pediatr Infect Dis J 2000;19: Fine MJ, Smith MA, Carson CA, Mutha SS, Sankey SS, Weissfeld LA, et al. Prognosis and outcomes of patients with community-acquired pneumonia. A meta-analysis. JAMA 1996;275: Ostapchuk M, Roberts DM, Haddy R. Community-acquired pneumonia in infants and children. Am Fam Physician 2004;70: Fedorko DP, Emery DD, Franklin SM, Congdon DD. Evaluation of a rapid enzyme immunoassay system for serologic diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. Diagn Microbiol Infect Dis 1995; 23: Wang Y, Kong F, Yang Y, Gilbert GL. A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mpcr/rlb) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia. Pediatr Pulmonol 2008;43: Miyashita N, Saito A, Kohno S, Yamaguchi K, Watanabe A, Oda H, et al. Multiplex PCR for the simultaneous detection of Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae and Legionella pneumophilia in community-acquired pneumonia. Respir Med 2004;98: Stra*lin K, Ba_ckman A, Holmberg H, Fredlund H, Olce@n P. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influen-

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