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1 13 강. 돌연변이육종 (Mutation Breeding) : 자연적또는인위적으로유발된돌연변이를직접품종에이용하거나또는육종의소재 ( 새로운유전변이 ) 로이용하는방법 1. 돌연변이의유발 2. 돌연변이의특징 3. 돌연변이의발생율 4. 돌연변이선발법 5. 염색체절단의이용 6. 돌연변이육종법의특징 7. 새로운유전자교정기술

2 - 자연돌연변이율 : 10-5~-6 * 아조변이 (bud mutation): 식물체특정부분의생장점에서발생하는돌연변이 영양번식작물 ( 특히과수류 ) 에서다수품종화 - Muller > 초파리 X-ray로돌연변이유기 Stadler > 보리, 옥수수 인위돌연변이육종각광, 1960년대까지 1970년대에위축 ( 일거에우량형질을모두보유하는다수성농작물육성목표 우량유전자형선발에실패 ) * 돌연변이는대부분우성 --> 열성 현재의돌연변이육종은 신유전변이의창성과 소수형질의개량에촛점 ==> 다수의성과벼 Carlose (Tall) > Carlose 76 (short) 내도복성품질돌연변이등

3 1. 돌연변이의유발 (1) 돌연변이원 (Mutagen) * 돌연변이 : mutation, 돌연변이체 : mutant, 인위돌연변이체 : induced mutant 1 Irradiation & radio isotopes - X-rays - γ-rays - Neutrons - Beta/Alpha particles - Protons/deuterons (nucleus of hydrogen) - Ion beam (heavier than proton) (Cyclotron/ion accelerator 이용, 최근사용증가추세 ) 2 Chemicals - Alkylating agents - Base analogues and related compounds - Antibiotics - Azides

4 1 Irradiation & radio isotopes A. 돌연변이유발기작 Damage to DNA - single-strand break - double- " - cross-linking within the helix - " to other DNA 분자 - " to protein Repair of DNA : 방사선에의한 damag 는대부분효소에의해자체적으로 repair 됨. repair 되지못한부위가존재시 mutation Ionization of partles by high energy of irradiation and recombination of free radicles (unstable and reactive) - H 2 O > H 2 O + + e - - O 2 가 free radicle 들과반응해서 peroxide 화합물을생성 (-->toxic) Damage on macromolecules - Protein : side chain 이특히 sensitive property 달라짐 - Enzymes 불활성화

5 B. 처리방법 방사선조사 ( 照射 ) 포장 (Irradiation field) --- Co 60 일본, 방사선육종연구소 ( Co 60

6 실내처리 : gamma greenhouse, gamma room 등 콘크리트벽 + 납 (2 인치두께 ), 밀폐 : Co 60 일본, 방사선육종연구소 한국, 정읍, 첨단방사선연구소 태국, Kasesart 대학교, Gamma Center 침지처리 : 동위원소 (radio isotopes; P 32, S 35 등 )

7 C. 처리부위 a. Whole plant 처리 : γ-field 또는또는 γ-room 더선호됨 ( 안전, 경제적, 소면적, 종자처리용이 ) b. 종자처리 - 처리방법, 장소, 환경등을자유로이조절할수있고 - 종자의수분상태조절이용이해서선호됨. c. 화분처리 : - 종자나식물체처리에비해거의 chimera 현상이없다. 정상 egg cell + 돌연변이된화분 heterozygous zygote, seed 내의세포간유전자형은동일 - but 충분한화분량의확보가어렵고, 화분수명이짧아서처리가어렵다. * 옥수수 : 화분수집또는 tassel 에직접처리후수분시킴 Chimera : 1 개식물체가부위별 ( 세포 ) 로서로다른표현형 ( 유전자형 ) 을보이는현상 * 배수성이혼재시는 (polyploid) cytochimera LI-Epiderm (epidermis) 생장점조직 LII- Sporoderm (sporogenous tissues, reproductive organs) LIII- Ground Tissue (vascular tissues)

8 Chimera 종류 A. Sectoral: usually a wedge-shaped segment of tissue extending from epidermis inw ards toward the center of leaf, stem, root, etc B. Periclinal: characterized by an entire layer of tissue one or more cells deep. C. Mericlinal: characterized by a portion of a tissue layer with a different genotype. Sectoral Chimera Development Periclinal Mericlinal 종자로는이러한 chimera 상태가보통유전되지않는데, 색소 (plastid) 돌연변이의경우는세포질유전을하는것이보통이고 egg cell 형성시 2 개이상 type 의 plastid 가동시에 embryo 로전달되어서, 유전하는경우도있다. * 영앙번식작물 ---> 그대로품종화이용 ( 화훼 )

9 d. Meristems( 생장점 ) - 영양번식작물에서많이이용 --> bud mutation - 종자처리도일종의 embryo meristem 처리임 ( 이미기관분화가되어있음.) e. 기타 : cell 또는 tissue culture 시 irradiation 처리

10 2 Chemicals A. 종류및특징 a. Alkylating 화합물 : DNA 염기를 alkyl 화시켜서변형시킴. 특히 Guanine 의구조를쉽게변형시킴 (alkyl guanine 으로 -- 99% 이상 ). 매우효율적인 mutagen - G A 변화 ( 다음슬라이드 ) - G 와 ribose 의결합을파괴 ( 대신에 R 기결합 ) ---DNA 분자에서 G 소실됨. - 종류 : EMS (ethyl methane sulfonate) des (diethyl sulfate) ENU (ethyl nitroso urea) MNU (methyl nitroso urea) Nitrogen mustards : (ClCH 2 CH 2 ) 2 NCH 3 등 b. Base analogues and related compounds : 원래의 base 대신에삽입되어 mutation 유발 - 종류 : 5-bromo-uracil(BU) ---> thymine 의 analogue 2-aminopurine(AP) ---> adenine 의 등 Maleic hydrazide(mh) --> uracil 의구조 isomer --> 염색체절단도유발 c. Antibiotics : 주로염색체절단유발 - mitomycin C, streptonigrin d. Azide : 주로 point mutation - sodium azide(nan 3 ) 등

11 정상 pairing EMS 처리시비정상 pairing

12 B. 처리방법 : 처리부위를용액에침지또는용액을주입 - 처리부위 ---> 방사선과동일 * 벼의수정란에 MNU 처리예 ) mm 의 MNU 용액을사용직전조제 ( 광분해 ) - 당일수정된영화들을용액에침지 ( 25 o C, 45 min., dark) - 1 일간수세 - 등숙 ---> 종자수확 (M1 종자 ) 벼 MNU 이삭처리후수세

13 2. 돌연변이의특징 : 작물의종류, 품종, mutagen, 처리방법, 처리농도 ( 강도 ), 처리되는식물의상태등에따라돌연변이의종류, 발생빈도등이크게변화함. (1) 형태적 - 간장단축 ( 矮性 )--- 식물체전체가왜소 * 곡류의반왜성돌연변이는도리어수량증대 --- 다수성초형 * 벼의 Japonica 품종 sd-1 유전자는돌연변이로유도함. - 각기관의크기나모양변화, 화기구조의변화 (2) 생리적 - 엽색변화 (chlorophyll 생성 mutation)- chlorosis( 黃化 ), virescent( 白化, 일시적백화 ), albino 등의주로 chlorophyll deficiency - 저항성의변화 - 저장양분의변화 : 성분함량등 * 단백질조성 mutant( 벼 ): 현미의단백질 albumin, globulin : salt soluble (PB3) 19 % prolamin : pepsin-resistant (PB1) 21 % 낮은 mut. 단백질 효과 glutelin : " digestible (PB2) 60 % (3) 염색체의이상 - 염색체의구조적이상 : 절단, 전좌, 역위, 중복, 결실등 (Irradadiation 시발생많음 ) 불임으로나타남. - 염색체의수적이상

14 벼에서돌연변이에의해육성된품종수및개량된형질 (IAEA) An all-purpose technique Mutations in carrots have produced overt color distinctions. USDA Mutant Trait Earliness Semi-dwarf Yield Quality Disease resistance Cold tolerance Salinity tolerance Agronomy Varieties 국화방사선돌연변이 ( 원품종 : 대평 ( 가운데 ) 일본방사선육종연구소 왼쪽 : 원품종, 오른쪽 : 돌연변이체 ( 원농 8 호 ) 원자력연구소

15 Giant embryo Sugary endosperm Floury endosperm Low amylose, waxy 벼에서의배와배유돌연변이체 태국방사선농업연구소 ( 심비디움 mutant, Dr. Rusli)

16

17 Officially released mutant varieties of seed propagated crops in the FAO/IAEA mutant varieties database (Nov. 2004) 2359 mutant varieties in 169 species industrial 81 vegetables 66 oil crops 59 other 111 legumes 311 cereals 1072

18 3. 돌연변이의발생율 (1) 발생율 선량, 농도 강 < > 약 돌연변이발생율 Desirable high low Undesirable high low 치사율 high low Optimum dose of irradiation or chemical mutagen - 생물의종류, 품종 ( 유전자형 ), mutagen 종류, 처리방법, 처리되는생물의조건별로검토필요 * Lethal dose(ld 50 ): 처리된표본중 50% 를치사시키는방사선량또는 chemical 농도 작물별로다름

19 4. 돌연변이육종과정 (1) 종자식물 1 과정 Aa Pollens Fertilized egg cells M 1 Aa Selfing Seeds M 1 Plant, tissues M 0 : Original, unmutagenized material Mutagen treatment 개체별재배 / 종자 (M 2 ) 수확, Selfing, Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa M 2 Seeds M 2 M 3 Seeds Plants M 3 Plants 계통육종법과동일하게진행 계통재배 / 집단재배, 개체선발 선발개체의계통재배, 계통 / 개체선발영양번식식물의경우는영양계증식

20 2 고려사항 - 염색체의수적, 구조적변이, 우성돌연변이는 M1 식물체당대에선발이가능하나 hetero 상태임. - 열성돌연변이는 M2세대에서개체분리되어고정. 우성돌연변이는 M3에서고정계통확보가능 - 종자나식물체처리시에는 chimera현상이발생하므로선발시주의. M2에서분리비이상. - 항상원품종과대비하여형질비교. - 목표하는특정형질만 mutation되는것이아니라여러형질이동시에다발적으로 mutation되므로 ( 우량 + 불량 mutation 혼재 ) 돌연변이개체를원품종과교잡후목표형질만원품종으로이전시켜품종화 --- 일반적. - 화학제에의한돌연변이유기시다음대에도약제의잔류로인해새로운돌연변이생성가능

21 (2) 영양번식작물 --- 대부분 hetero 상태 Aa ---> 당대에서구별가능 (bud mutation) 식별및선발용이그러나 chimera(aa, 의혼재 ) 가보통이므로 원래의가지와경합하여도태될우려큼. 변이부분을잘라내어번식시킴. * 또는 mutagen 처리이외의가지를잘라내어처리부위의 budding 을촉진시키기도함. (3) 기내돌연변이 (mutation in vitro; 세포 / 조직배양을이용한돌연변이 ) * somaclonal variation : in vivo 보다는 in vitro 에서대량집단취급가능 내염성, 내냉성, 특정아미노산함량등 ( 돌연변이원처리 ) 생존 callus 선발 식물체검정및선발 조직배양 callus 선발배지에서 callus 계대배양 ( 선발환경조성 ) * 특수배지 : 내염성 -- NaCl 배지첨가고 lysine -- lysine analogue (S-aminoethyl-L-cysteine) 내냉성 -- 저온배양 재분화배지에서선발 callus 재분화

22 5. 염색체절단의이용 --- 주로방사선 - 불량유전자와우량유전자가극도로가깝게연관되어있어서교잡육종으로재조환형을얻기가어려울때 ---> 방사선처리로 ---> 절단, 전좌, 역위등 - 종속간교잡시異種 genome 의유용유전자보유염색체부분만을원하는종에도입시킬때 ---> 절단, 전좌 6. 돌연변이육종법의특징 : (1) 품종내에서특성의조화를파괴하지않고 1 개의특성만을용이하게치환할수있다. (2) heterozygous 인영양번식식물에서변이를작성하기가용이하다 (3) 염색체단편을치환시킬수있다. (4) 인위배수체의임성을향상시킬수있다. --- pairing 방해요소의제거를통해서동질배수체의준상동염색체 --> 비상동염색체에분할 --> 감수분열정상화 (5) 자가불화합, 교잡불화합을극복할수있어육종범위의확대가가능하다. (6) 새로운유전변이를창출할수있다. FAO/IAEA Joint Division Homepage : Welcome to the Mutant Variety Database (MVD):

23 7. 새로운유전자교정 ( 편집 ) 기술 SDN-3 SDN-2 SDN-1 (SDN-: site-directed nuclease) 목표하는유전자의파괴, 교정, allele 교체가능 기존의형질전환방법과다르기때문에 GM 논의불필요?? ( Vector, 선발마커등사용하지않음 )

24 개발된 3 가지유전자교정 ( 편집 ) 기술 Fichtner et al. (2014) Planta 239:

25 induced mutation (conventional) 과 SDN-1/SDN-2 와비교 구분기술원리결과산물효율비고 induced mutation (conventional) Treatment of chemical or physical mutagens Random mutation of unknown genes Mutants ( 대부분 recessive) - 상대적낮음 - 돌연변이한계 기술용이 SDN-1/SDN-2 Targeted engineering of genome/ genes Targeted mutation of known genes Mutants (recessive/ dominant) - 상대적높음 - 돌연변이무한대가능성 고도기술 + 유전자정보 Silencing of polyphenol oxidase (SDN-1) Non-browning mushroom Original Non-browning 정밀육종 (targeted breeding, precision breeding) 25