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1 최종보고서 보안과제( ), 일반과제( ) 과제번호 과실품질관련유전자를이용한멜론형질전환체개발로 GMO 품종등록 (Development of Transgenic Melon Plant Using Genes Related with Fruit Quality and Registration of GMO Varieties) ( 주) 에프앤피기술연구소 농림수산식품부

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 과실품질관련유전자를이용한멜론형질전환체개발로 GMO 품종등록 과제의 보고서로제출합니다. 2009년 4월 24일 주관연구기관명:( 주) 에프앤피 주관연구책임자: 윤길영 연구원: 김신제 연구원: 김창기 연구원: 김군보 연구원: 조아영 연구원: 김신애 연구원: 김연실 연구원: 전은현 연구원: 남희영

3 요약문 I. II. 1. 제목 과실품질관련유전자를이용한멜론형질전환체개발로 연구개발의목표및필요성 연구개발의최종목표 GMO 품종등록 과실의품질관련유전자를이용한형질전환을통해고품질멜론형질전환체개발 멜론형질전환체의기능분석및형질전환체의분자생물학적분석 과실품질관련유전자를이용한형질전환체의유망계통선발및증식 GMO 품종등록 2. 연구개발의필요성 국내ㆍ외원예산업은주로생산량증대를위한연구가꾸준히진행되어왔으나농산물의시장이개방되고생활수준이향상되면서양적인면보다질적인면이강조되고있음 과실의품질을향상시키기위한유용유전자원의확보가필요 생명공학기술을이용한고품질의과실생산을위한연구개발이필요 III 연구개발내용및범위 과실품질관련유전자를이용한형질전환 과실품질관련유전자로선발된 transcription factor인 Myb1, 2, xyloglucan endoglucantransferase (XET) 그리고 superoxide dismutase (SOD) 등에대한 overexpression (sense, S) 및 knockdown (RNAi, AS) 식물형질전환용벡터를이용하 여 Agrobacterium-mediated transformation 방법으로멜론형질전환을실시하여형질 전환체획득 이들형질전환식물각라인별후대식물체로부터외부유전자삽입여부가확인된것만 을선발하여세대진전 형질전환식물체의후대검정 형질전환체의세대별생육조사를위하여 ( 주) 에프앤피의 GMO 품종재배비닐하우스에서 각각의형질전환체의재배생리적특성구명 특히, 각형질전환체의재배생리적특성중엽록체의함량을측정하여후숙이지연되 는형질전환체라인선발을위한지표로활용 형질전환체의후대검증및생육조사결과를종합하여세대확보와최종선발후보군압 축 3. 각각의형질전환식물체에서원예형질의분석 - 3 -

4 4. 각형질전환체의과실의후숙정도, 과실의무게, 착과의개수등을측정하여고품질및 기능성계통을선발하기위한각형질전환체의재배적 생리적특성비교 고품질및고기능성신품종의등록 과실의품질관련농업형질결과를종합하여최종품종등록후보계통을선발 최종적으로멜론형질전환체의분자생물학적, 생리적및원예형질을분석하여상품성이 있는형질전환체선발및 GMO 품종등록 Ⅳ. 1. 연구개발결과 형질전환및후대식물체의선발 과실품질관련유전자로확보된멜론 transcription factor인 Myb1, 2, xyloglucan endoglucantransferase (XET) 그리고 superoxide dismutase (SOD) 등을이용하여과 발현및 knock-out 식물형질전환용벡터를제작하여멜론형질전환 각각의벡터를이용하여확보한형질전환체는 CmMyb1 24, CmMyb2 26, CmXET 21, CmSOD 22 개체를선발하여총 93개체를확보하였음 발현양상에따른형질전환개체수는 41개의 overexpression (sense, S) 과 52개의 knockdown (RNAi, AS) 형질전환체가선발되었음 2. 형질전환체의분자생물학적특성분석 각각의벡터를이용하여형질전환된식물체는 PCR, southern blot 및 RT-PCR로분석 하여외부유전자의도입여부를확인하였음 외부유전자의도입여부는형질전환체의세대진전과정에서도 segregation 을분석하여확인 PCR과항생제를이용한 또한 CmMyb와상호작용하는유전자를확인하기위해 yeast-two hybridization 분석 을통해 CmMyb2가 chitinase와상호작용하는것을확인하였음 과실품질관련유전자의발현특성은 CmMyb2는과실발달초기에만발현되어과실발 달과관련된 downstream 유전자의조절과관련이있음이확인되었음 CmSOD의 promoter region 분석에서활성화산소에반응하는 as1/ocs motif와 Myb-type motif 가존재함이확인되었음 3. 형질전환체의농업형질분석 후대검정을위한형질전환체는 GMO 품종재배포장에서재배하면서과실의품질관련 농업형질과재배생리적특성을조사하였음 1차로선발된 1,103개의형질전환체중발달단계에따른엽록소함량변화를분석하여 Myb1 (S), Myb1 (AS), Myb2 (S), Myb2 (AS) 련농업형질을분석하였음 그리고 XET (AS) 를선발하여품질관 최종선발된형질전환체의특성은 overexpression 개체는과실의성숙이 wild type에 - 4 -

5 비해빠르게진행되어조기낙과및열과현상이나타났음 반면에 knockout 라인은낙과및후숙이지연되어 wild type에비해 5~10일의발달 단계의차이가확인되었음 CmMyb2 knockout 라인은개체당 4~5까지착과해도과실의크기나생육에영향이 없어 wild type에비해 2배이상의다수확이가능함이확인되었음 CmXET knockout 라인의경우도 wild type에비해 10 일정도의후숙지연 ( 낙과) 이확 인되었음 과실의경도는 overexpression 라인의경우 30DAP~35DAP에서는 wild type과유사 하였으나, 40DAP에서는현저히감소하여낙과및열과현상과관련이있음이확인되었음 Knockout 라인의경우는 30DAP에서는약 29% 높았으며, 40DAP에서는 wild type은 현저히경도가감소하는반면 knockout 개체는다소감소하여과실의후숙이진행지 연과밀접한관계가있음이확인되었음 에틸렌발생은 35DAP에서 Myb2 RNAi 라인이 wild type에비해약 30% 낮게나타났 음. 이와같은결과는과실경도, 당도의변화와일치하는것임 따라서형질전환체 Myb2 RNAi 라인은과실의후숙지연에따른저장성및수송성향 상뿐만아니라다수확에의한생산성향상에도효과가있음이확인되었음 Ⅴ. 1. 연구성과및성과활용계획 작물의과실품질관련유용유전자원의확보및활용체계를확립 기후변화와바이오에너지에대한수요증가로유용유전자원의확보와이들유전자를활 용한산업화를위한첫단계인유용유전자원의확보체계확립 형질전환방법에의한목표형질이도입된새로운품종개발과정의체계확립 2. 과제수행기간에축적된기술과인력인프라의활용 유용유전자를확보및형질전환체개발그리고형질전환체를검정을통한품종개발체 계를이해하는인력및기술인프라를활용한유용목표형질이도입된신품종개발 확보된유용유전자는특허등록을하여지적재산권확보 환경내성작물, 바이오에너지원자재확보를위한바이오매스증대를위한형질전환 작물의개발및세대고정을통한품종개발에활용하고자함 3. 확보된우수한형질이도입된멜론을이용한환경위해성평가 ( 다음단계조치사항) 본연구가기획되고진행되는동안에이루어진 GMO 품종등록을위한환경위해성평 - 5 -

6 가조항의신설로신품종등록에필요한위해성평가자료작성및심사신청에개발된 형질전환체활용가능 환경위해성평가를위한원재료 event" 로활용하여환경위해성평가를위한기술개발 에이용가능 위해성평가기술개발과축적된결과는신품종등록을위한심사자료로제출하여신품종등록 축적된형질전환체의품질관련형질의분석결과는품종등록후학술지에게제 - 6 -

7 SUMMARY Title: Development of Transgenic Melon Plant Using Genes Related with Fruit Quality and Registration of GMO Varieties To development of high quality melon using a genes associated with fruit quality, we cloned a genes by differential expression cdna library screening and then the selected genes were transformed into melon (Cucumis melo cv Reticulatus) by Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were evaluated by PCR with inserted gene-specific primer, southern hybridization, RT-PCR and segregation analysis using antibiotics. Among 1,103 primary candidate transgenic plants, we had scleleted five transgenic plants in terms of characters associated with fruit quality such as formation of abscission layer and chlorophyll contents during the developmental stage. We could acquire the suitable transgenic plant that delayed ripening thought the analysis of the agricultural characters which are firmness, soluble solid contents and production of ethylene using the five selected transgenic plants. The transgenic plant which was knockout the CmMyb2 shown 30% higher firmness compare to wild type as well as high-yield of fruit per plant. Many plant TFs are known for their specific regulatory functions as well as cross-regulation under different biotic or abiotic conditions. Downstream targets of TFs are not only related to environmental adaptation but they also function in various aspects of growth and development such as pigmentation, cell wall biogenesis, ethylene biosynthesis and fruit ripening. The results suggested that CmMyb2 RNAi plant can be adequate to reduce the coast by increase the period of storage and to increase farmer's income by high-yield. We have been try to registration of this transgenic melon as new variety. Also this line can use to "event" for the environmental risk assessment

8 CONTENTS I. Title 9 Development of Transgenic Melon Plant Using Genes Related with Fruit Quality and Registration of GMO Varieties II. Trend of Home and Abroad Technology and Research Purpose 11 III. Research Contents and Results 13 IV. Achievements and Contributions to Related Research 39 V. Results and Application 42 VI. Information of Abroad Technology 43 VII. Reference

9 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 9 제 2 장국내외기술개발현황 국내기술개발현황 세계적수준 국내외의연구현황 제 3 장연구개발수행내용및결과 13 제제제제 절형질전환및후대식물체의선발절형질전환체의분자생물학적특성절형질전환체의농업형질분석절고품질신품종후보선발 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 39 제 제 제 절기술개발목표 절연도별주요개발목표달성도 절관련분야에의기여도 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 42 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 43 제 7 장참고문헌

10 제 1 장연구개발과제의개요 1. 연구개발의목적및필요성 가. 연구개발의목적 이차대사산물생합성관련유전자, 세포벽대사에관여하는유전자, 과실의항산화물질생 성에관여하는유전자이용한멜론형질전환을통해고품질의식물품종육성 멜론형질전환체의분자생물학적분석을통한기능분석 과실품질관련유전자를이용한형질전환체의유망계통선발및증식 유망계통의 GMO 품종등록 나. 연구개발의필요성 (1) 연구개발기술의경제적 산업적 필요성 국내외원예산업은주로생산량증대를위한연구가꾸준히진행되어왔으나, 농산물의시 장이개방되고, 사회경제적으로국민의생활수준이향상되면서양적인면보다는질적인 면이강조되고있는오늘날에는생산위주의영농에서탈피하고, 고품질의과실생산을위 한연구개발이필요 일반적으로과실의품질은외관, 무게, 색, 당도, texture등에의해좌우되며이중에서과실 의색은시각적인맛을증대시키며, texture는과실의익은정도와저작감을결정하는매 우중요한인자 박과채소는비타민, 미네랄, 항산화효소, 섬유소를포함하는유용한식물체이기때문에고 품질의박과과실의생산에대한연구는소비자뿐만아니라과실의상업적손실을줄임으 로써생산자에게도중요 특히과실의수확후손실을줄일수있는주요방법은과실의연화시기를조절함으로써 가능. 한편다양한유전자를도입하여항산화활성, 노화억제활성, 콜레스테롤저하활성등 다양한생리활성이우수할뿐만아니라변형된과색을나타내어상품적가치를높이기위 한연구가활발히진행되고있음 박과채소중멜론은전형적인 climateric type의과실로서 ripening에관한연구모델로 활용되었으며, 특히과실호흡의일시적인증가와에틸렌의생성이급증하며전분이분해 되어 sucrose로변하면서과육의당도가단시일만에급증 이시기에과육의경도또한급격히감소하고있어세포벽의구조상의변화가활발히진행

11 되고세포벽의분해에관여하는효소의유전자를식물형질전환을통하여그발현을조절함 으로써과육연화를지연시키거나저장성및수송성의향상을도모할수있음 멜론중 Charentais' 는유럽이원산지로서수확후, 이틀만에 ethylene climacteric 및과 육의연화가진행되면서상품성을잃게되는품종 따라서이품종은토마토나사과와는달리단기간에 ripening에관련된생리의변화및이 에수반되는유전자들의발현기작등을연구할수있는모델로사용되고있음 현재과실성숙시기를조절하기위해다양한화학적및생물적제제(agent) 가사용되고 있다. 이러한과실성숙시기를조절하는제제들은다양한목적으로사용 한가지목적은과실의성숙을촉진하여수확시기를단축하거나또는경작지에서과실의 효과적인수확을돕기위해과실의성숙시기를일치시키는것이고다른목적은낙과를방지하여적합한성숙시기까지과실이식물에남아있게하는것임 과실성숙을조절하기위해이전에사용한몇개의제제들은대부분이합성제제들로이들합성제제들은잠재적독성과발암성의문제로인해사용이금지되거나제품에대한상업적또는소비자저항으로인해그사용이급격히감소 과실성숙을향상시키기위해현재가장많이사용되고있는제제는 Rhone-Poulenc Ag. Co.(Research Triangel, NC, USA) 의에트렐(Ethrel) 이란상표명으로시판되고있는합성 화합물, 에테폰(ethephon) 임 멜론형질전환을통해과실의성숙시기를조절하는것은식물을이용한산업화에장점을 가지고있음 기존에는좋은품질관계형질을지닌멜론을제작하기위해다양한교배를통한육종방법이 실시되었으나이러한육종방법은많은시간과노동을요구 따라서과실의연화및항산화와관련된유전자를식물체에형질전환을통해효과적으로 고품질의상품을얻을수있는기술이요구됨

12 제 2 장국내외기술개발현황 1. 국내기술개발현황 멜론의품질특성에대한국내연구는과실에축적되는비환원당인 sucrose와환원당인 fructrose, glucose 등과같은가용성당과관련하여유전에관한연구 (Kim et al., 1997), 품질관련형질인과피색, 과육색, ascorbic산에대한유전적기초정보를위한연구 가수행되어왔음 (Kim et al., 1998) 본과제의연구원은 Biogreen21과제에서멜론과육연화에관련되는유전자의형질전환에 관한연구를수행하였으며, 특히 Charentais' 멜론의형질전환을성공시키고형질전환과 실에서과육의연화가지연됨을확인 2. 세계적수준 개념정립단계 기업화단계기술안정화단계 멜론은전형적인 climateric 과실로서 ripening중에수반되는다양한생리적인변화에관하 여는비교적잘알려져있으며특히최근에는과실의 ripening 중과육의연화를초래하는 세포벽의펙틴과헤미셀룰로오즈의구조변화에관한분자생물학적연구가활발히진행되었 음 (Rose et al., 1998; Brummell and Harpster, 2001) 과육의연화를초래하는효소들로는 expansin, polygalacturonases(pgs), xyloglucan endotransglycosylases (XETs) 등많은효소들이관여하는것으로알려져있음 이러한과실의연화와관련된특정유전자를 knock-out시킴으로과실의품질을증대시키고 많은상업적가치를높일수있다는생각으로다양한식물에서연구가진행되고있음 (Hamilton et al., 1990; Oeller et al., 1991) XET (xyloglucan endotransglycosylase) 는식물에존재하는자일로글루칸사슬을절단하 고다시결합시켜식물세포가신장되도록식물세포벽을느슨하게하는효소로서알려져 있고 (Rose et al., 2002), XET 는식물의형태를조절하는데사용된바있음 ( 유럽특허제 EP 호) 이러한 XET 는양배추(cauliflower), 토마토, 오이, 애기장대, 유럽너도밤나무등에서분리 되었으며, 키위과실의성숙동안에활성이증가되는것이보고되었음 (Redgwell and Fry, 1993). 그러나현재까지 XET가멜론과실의성숙을조절한다고보고된바없고 익스펜신

13 (expansin) 은세포벽의신장을위한가장중요한인자로여겨지고있음 (Rose et al., 1997) 익스펜신은셀룰로오스미세섬유 (microfibril) 와매트릭스폴리머사이의수소결합을느슨 하게함으로써세포벽의변형(wall creep) 을야기하는것으로보고 (Keller and Cosgrove 1995; Cosgrove, 1997) 익스펜신유전자는최초로클로닝된이후(Shcherban et al., 1995) 다양한식물종으로부 터많은종류의유전자들이동정되었으며이들은다중유전자족 (multigene family) 을형 성하는것으로알려져있음 (Sampedro and Cosgrove, 2005) 익스펜신유전자의발현패턴은특히, 벼와토마토를대상으로심도있게연구되었으며, 문 헌에는벼에서세포벽신장과빠른성장이시작되기전에엑스펜신유전자 OsEXP4 의전 사체양이증가한다고보고 (Kende et al., 2004) 토마토에서초기의잎원기가발생되는정단분열조직세포에서익스펜신유전자인 LeEXP18 이발현된다고보고 (Reinhardt et al., 1998) 과실의 ripening을유기하는에틸렌생합성에관여하는유전자및이들의발현을유기하는 기작의구명에관하여분자수준의연구가활발히진행되고있음 식물세포내신호전달과정을구명함에있어서에틸렌이세포에결합한신호의전달에관여 하는유전자들에관한연구가진행되고있으나, 이러한기초실험들은대부분모델식물인 애기장대를사용하고있어과실에적용하기위한연구가추가적으로진행되어야할필요가 있음 3. 국내 외의연구현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 원예연구소 MPG와 ME에대한멜론형질전환체개발해당사항없음

14 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절형질전환및후대식물체의선발 1. 형질전환 과실품질관련유전자로멜론 (Cucumus melo) 의 transcription factor인 CmMyb1과 2, xyloglucan endoglucantransferase (CmXET), expansin 그리고 superoxide dismutase (CmSOD) 등을이용하여과발현 (sense) 및 RNAi 식물형질전환용벡터를제작하였음 형질전환용벡터는 Agrobacterium-mediated transformation방법으로멜론형질전환을실 시한후 PCR 및 southern blot 으로확인하여형질전환체를선발 (Fig. 1) 형질전환식물체는외부유전자삽입여부가확인된것만을선발하여 T1 식물체를육성하 고, T2 및 T3 세대를확보하면서과실의품질관련농업형질을분석하였음 Figure 1. Transformation of melon by gene assoiciated with quality of furit (CmSOD). A; explants co-cultivation with Agrobacterium, B; callus induced by transformation, C; regeneration plant, D; transgenic plant after harding. 2. 과실품질관련유전자 CmMyb1, 2의유전자를이용한멜론형질전환체개발 CmMyb1(Cucumis melo Myb1) 과 CmMyb2 유전자를이용한멜론형질전환체의개발을 위하여여러가지 vector (pcambia2300(35s/nos)::cmmyb1(over-expression, S),

15 CmMyb1 (RNAi, AS), pcambia3300 (35S/NOS):: CmMyb1(S), CmMyb1RNAi 그리고 CmMyb2(S), CmMyb2RNAi) 를제작하였음 CmMyb 1 의경우, pcambia2300 (35S/NOS)::CmMyb1(AS), CmMyb1(S) 와 pcambia3300 (35S/NOS): CmMyb1(S), CmMyb1 RNAi로형질전환된식물체를총 24 개를선발하였음 CmMyb2 의경우, pcambia3300 (35S/NOS)::CmMyb2(S) 에서 12 개체, CmMyb2 RNAi에 서 14개체를확보하여후대검정을실시하였음 3. CmXET (Cucumis melo Xyloglucan endoglucantransferase) 유전자를이용한멜론형질 전환체개발 CmXET 유전자를이용하여멜론형질전환을위하여 pcambia3300 (35S/NOS):: CmXETRNAi와 35S promoter 대신에멜론과실에서특이적으로발현이되는 CmCP(C. melo Cucumisin promoter) 를포함하는 pcambia3300 (CmCP/NOS)::CmXETRNAi를제 작 pcambia3300 (35S/NOS)::CmXETRNAi를이용하여 형질전환후후대개체를확보한것 은모두에서 12개체임 Cucumisin promoter를이용한멜론형질전환체는 35S promoter를이용한형질전환체보 다초기형질전환체의유도가다소늦게진행되었으나, 최종 9개체에서외부유전자삽입이 확인되었음 4. CmSOD (Cucumis melo Superoxie dismutase) 유전자를이용한멜론형질전환체개발 식물형질전환용벡터, pcambia3300(35s/nos) 에 CmSOD(S) 와 CmSODRNAi를클로닝하 여 Agrobacterium LBA4404 에형질전환을실시한후, PCR 증폭을통해서증폭된산물을 확인 pcambia3300(35s/nos)::cmsod(s) 와 pcambia3300(35s/nos)::cmsodrnai로형질 전환된 Agrobacterium LBA4404 를이용하여멜론의형질전환을실시한결과, pcambia3300(35s/nos)::cmsod(s) 에서 8 개체, pcambia3300(35s/nos):: CmSOD RNAi는 14개체의형질전환체를확보하였음 형질전환체는과실을수확하여 GMO 품종등록을위한기본요소인균일성, 우수성등을 판단하기위하여온실에서재배하면서과실의품질관련농업형질을조사하였음

16 제 2 절형질전환체의분자생물학적특성 1. CmMyb1과 2로형질전환된식물체의분자생물학적특성분석 CmMyb1과 2 sense 및 RNAi constructs로형질전환된식물체로부터 RNA를분리하여 유전자발현양상을분석하였고, 그유전자의발현양상이가장높은것과가장낮은것을 각각 1차후보군으로선발하였음 CmMyb1의경우형질전환체를 PCR (Fig. 2) 과 southern blot을통하여확인하였고이들 식물체들은후대검정을위하여포장에재배하여채종하였음 M Nc Pc Figure 2. Confirmation of C. melo plants transformed by CmMyb1RNAi using Myb1-specific primer. Pc: Positive control, Nc: Negative control, Lane1-14: Transgenic plants (T2 generation) Myb1의 localization과과실발달단계에따른발현양상을분석하기위해 CmMyb1 promoter region을분리하여담배에형질전환한후 GUS assay를실시 CmMyb1 upstream region을확보하기위하여 CmMyb1의 5 coding region으로부터 primer를제작하여 genomic DNA (gdna) 를주형으로증폭된산물을 pgemt-easy vector 에클로닝한후, sequencing을통해 CmMyb1의 upstream region을확인 CmMyb1 promoter 부위를 HindIII와 BamHI 제한효소인식부위를포함하는 primer를제 작하여증폭한후, pcambia2300(gus/nos) 에클로닝 CmXET와 CmSOD의 upstream region의확보및클로닝도 CmMyb1 promoter cloning과 같은방법으로수행하여확보하였음 pcambia2300(cmmyb1p/ NOS)::GUS로형질전환된 Agrobacterium LBA4404를이용하 여담배 (Nicotiana tabacum cv. Xanti) 에형질전환하여이들식물체의잎으로부터 histochemical GUS assay 를실시한결과, 잎에서는 CmMyb1 gene이발현되지않음을 확인 (Fig. 3)

17 Figure 3. Histochemical GUS assay from leaf transfomed by pcambia2300(cmmyb1p/ NOS)::GUS, pcambia2300(cmxetp/nos)::gus,and pcambia2300(cmsodp/nos)::gus CmMyb1과 CmMyb2 유전자의기능을이해하기위하여 yeast two-hybrid를통해상호작 용유전자를확인하였음 Yeast two hybrid 방법에사용된라이브러리는 Arabidopsis에서일차선발을위하여실험 을수행한결과 CmMyb1과상호작용하는유전자는밝혀지지않았으나 CmMyb2와상호작 용하는유전자는 chitinase 로밝혀졌음 (Fig. 4) Master plate Bait Prey 1:CmMyb1+CmChi1 2:CmMyb1+CmChi2 3:CmMyb1+CmChi3 4:CmMyb2+CmChi1 5:CmMyb2+CmChi2 6:CmMyb2+CmChi : Negative control + : Positive control SD-LW lacz expression URA3 expression ADE2 expression Filter assay SD-LWU SD-LWA Figure 4. Yeast two-hybridization with CmMyb1 and CmMyb2 using library of Arabidopsis. The Myb2 interat with chtinase

18 과실의발달과정에따른 CmMyb 의발현을조사한결과, Myb1은과실의발달초기에높게발현 된후과실이성숙함에따라점차감소하는경향을나타낸반면 현되었음 (Fig. 5) Myb2는과실발달초기에만발 이러한발현양상은 Myb1과 Myb2 가모두과실의발달에관여하지만, Myb2는과실의성숙 또는후숙에관여하는 downstream 유전자를활성화시킴으로써과실의발달에관여하는것으로판단됨 Figure 5. Expression of the CmMyb1 and the CmMyb2 in male flower (MF), female flower (FM), stem (S) and tendril (T). Both of Myb1 and 2 shows highly expression at the early stage of development of furit but Myb2 was only expressed right after pollination. 2. CmXET (Cucumis melo Xyloglucan EndoglucanTransferase) 형질전환체의 분자생물학 적특성분석 CmXET유전자로형질전환된식물체의후대에서관련유전자의발현양상을분석한결과 PG 의유전자발현이현격히줄어있음을알수있었음. 각각의 construct 를이용한형질전환체를개발하였으며, 이들식물체는 Southern Blot을 통해형질전환여부를확인 (Fig. 6)

19 Figure 6. Southern hybridization of C. melo plants transformed by pcambia3300 (35S/NOS)::CmXETRNAi using CmXET- and GUS-specific probe Southern blot을 통하여 형질전환체임이 확인된 식물체의 과실을 수확하여 후대 식물체를 kanamycin이 들어 있는 배지에서 선발 후대를 확보한 것은 이들 식물체로부터 외부 유전자의 삽입이 homozygote한 식물체를 다 시 선발한 뒤 과실을 수확하여 후대에서 PCR을 통하여 외부 유전자의 삽입 여부를 확인 (Fig. 7) M M Nc Pc Figure 7. PCR amplification of C. melo transformation by pcambia3300 (35S/NOS) ::CmXETRNAi (T2 generation). Pc: Positive control, Nc: Negative control, Lane1-14: transgenic plants 3. CmSOD (Cucumis melo Superoxide Dismutase) 형질전환체의 분자생물학적 특성분석 pcambia3300(35s/nos)::cmsod(s)와 pcambia3300(35s/nos)::cmsod RNAi로 형 질전환된 개체의 후대를 외부 삽입유전자와 CmSOD를 이용하여 PCR을 실시한 결과 외부 유전자의 삽입을 확인 (Fig. 8)

20 Figure 8. PCR amplification of C. melo transformation of pcambia3300 (35S/NOS):: CmSOD(S) 와 CmSODRNAi (T2 generation). Pc: Positive control, Nc: Negative control, 7-1: transgenic plants CmSOD upstream region을분리하기위해메론 genomic DNA를주형으로 genome walking을통해 promoter region을분리하고 CmSOD의 promoter region의 sequence에 분포되어있는 motif 를분석 (Table 1) CmSOD의 promoter region에는 5종류의 transcription factor가분포하고있으며이중활 성화산소에반응하는 as1/ocs motif와 ethylene responsive element 그리고 Myb type transcription factor motif 가확인 특히, as1/ocs motif는활성화산소의 quenching 및 scavenging 유전자발현과관련이있 음을고려할때, CmSOD 형질전환체에서생육저조와미숙종자생산은활성화산소종과밀 접한관련이있을것으로판단 Table 1. The motif analysis of the promoter region of the CmSOD Name of cis-element Type of transcription factor Database Annotation TGAC TTCAA TTTTC as1/ocs bzip, TGA-type GA Myb Hydrogen peroxide responsive elements Tomato ethylene responsive elements Barley pyrimidine-box for GA induction ACCT Myb-like Myb responsive elements AGGAGATC Myb2 Tobacco wound responsive elements

21 제 3 절형질전환체의농업형질분석 1. 후대검정을위한형질전환식물체의재배 본과제의 1차년도부터확보된형질전환체로부터수확한 T2, T3 세대의종자의생육조사 를위하여 ( 주) 에프앤피의 GMO 품종재배비닐하우스 (Fig. 9, 10) 에서재배하여각형질 전환체의재배적특성과생리적특성을조사하였으며후대검정을위한종자를확보를위 해과실을채종하여종자를확보 Figure 9. Greenhouse for cultivation of genetically modified organism at the FnP Co., Ltd. Figure 10. Cultivation of the transgenic melon for the evaluation of the generations 각각의형질전환체에서채종한종자는채종용기에넣어 ( 주) 에프앤피의 LMO 종자대장에등재 하고냉암소의종자보관실에보관하면서후대검정에사용하였음

22 후대검정을통해우수한품종을선발하기위해 7개의벡터로부터확보한 34개라인총 1,103 개체의형질전환체를 Table 2 와같이정식하였으며, 제 2차및 3차년도의결과에따라과실의 후숙지연에따른저장성이우수한라인을선별하기위해 발달단계에따라엽록소함량을분 석한후, 최종라인을선별하여과실의품질관련농업형질을조사하여최종품종을선발 형질전환체는 3 월말에가온하우스에파종한후, 5월초에재배하우스에 60Cm 간격으로정식 하여세워키우기로일반멜론재배법에따라재배하였음 개화된식물체는인공교배를실시하여, 농업형질분석용개체는 2~3 개, 착과능력검정용개체 는 4~5개의열매를착과시켰음 재배중인 34개라인의형질전환체중 2차년도결과에서 1차후보로선발된 8개라인의엽록소 함량변화와착과, 생육상태에따라서최종적으로 5개의라인을선발하여과실품질관련농업형질을분석하였음

23 Table 2. The list of planting of the transgenic melon for the evaluation of generation in this project. 온실 Line 식물체정식수 1 차후보/ 최종후보 Myb1 OE 선발/ 선발 Myb1 OE Myb1 OE Myb1 RNAi 동 2 3 Myb1 RNAi Myb1 RNAi 선발/ 선발 Myb2 OE 선발/ 선발 Myb2 OE 선발/ 도태 Myb2 OE Control 17 Myb1 RNAi 선발/ 선발 CmSOD CmSOD CmSOD CmSOD CmSOD Control

24 온실 Line 식물체정식수비고 CmXET L CmXET CmXET CmXET 선발/ 선발 1R CmXET CmXET CmME RNAi L CmME RNAi 동 2R 3L 3R CmME RNAi CmME RNAi CmME RNAi CmME RNAi CmME RNAi Myb2 RNAi 선발/ 선발 Myb2 RNAi 선발/ 도태 Myb2 RNAi 선발/ 도태 CmXET Control 2 Myb2 RNAi Myb2 RNAi Myb2 RNAi Control 5 2. 형질전환식물체에서과실품질관련농업형질분석 가. 형질전환체의엽록소함량분석 형질전환체로부터엽록소함량측정을위한시료는정식후, 20일부터 15일간격으로 3회채취 하였으며, 각회의시료는 0.5mm 2 잎 3장을 3곳에서채취하였음 엽록소함량을분석하기위해각각의잎 disk를 1ml 70% MeOH에 ovenight 후원심분리하여 상등액을취해 UV/Vis-Spectrophotometer에서흡광도를측정하였음 엽록소함량은 Lichtenthaler (1987) 의방법에따라측정된값을잎의단위면적 (Cm 2 ) 으로환

25 산하였음 Chlorophyll a= *A *A *A643 Chlorophyll b= *A *A *A661 형질전환체의엽록소함량변화를측정한결과, 과실의후숙과밀접한연관이있음이 2차년 도결과와같이 3 차년도에서도확인되었음 (Fig. 11) Myb2 RNAi 형질전환체의경우, 엽록소함량이발달단계가진행되어도매우안정화되어 있음이확인되었으며, overexpression 형질전환체와대조구에서는식물체가노화되어감 에따라엽록소함량의감소를보였음 이와같은엽록소파괴의지연은식물체의탄소동화작용기간의증가로과실의발달에영 향을주는것으로판단되며, 과실의품질및발달관련유전자 ( 특히 Myb2) 의 RNAi 형질 전환체에서엽록소함량의안정화와과실의후숙이지연되고영양생장기간을연장시킬수 있음을제시함 Figure 11. The content of chlorophyll according to the stage of development at each transgenic plants. The overexpression plants shown decrease of chlorophyll at late developmental stage, whereas RNAi plants were delayed decomposition of chlorophyll

26 따라서 Myb2 RNAi 라인의농업형질적특성은 과실의저장성개선및수송기간의연장등 품질개선뿐만아니라생물량증가에매우유용하게이용될것으로판단됨 나. 형질전환체의과실성숙과정 각형질전환체의과실의후숙정도, 과실의크기, 착과의수등을측정하여고품질및기능 성계통을선발하기위해각형질전환체의원예형질을분석 CmMyb1(S) 의경우완전히과실이숙성되지않았음에도이층형성이빨리이루어져조기 낙과현상이나타났음 (Fig. 12) Figure 12. C. melo fruit transformed by overexpression of pcambia2300(35s/nos):: CmMyb1(S) and knockdwon of CmMyb1(AS). Myb1 유전자의 overexpression과 RNAi 형질전환체의특징은 overexpression 형질전환 체의경우과실의후숙이대조구에비해빠르게진행되었으며, 수정후 35 일째 (DAP) 부터 낙과가시작되고과실의표면이갈라지는열과현상이나타났음 (Fig. 13B, C). 반면에 RNAi 형질전환체는수정후 40 일째 (DAP40) 까지도낙과나열과나현상이나타나지않아 후숙이진행이지연되고있음이확인 (Fig. 13B, C)

27 A) B) C) Figure 13. The characterization of transgenic plant transforemed by Myb1. A) Trangenic melon growth in the GMO greenhouse, B) and C) ripening difference between the overexpression and the knockdown of Myb1-27 -

28 이와같은조기낙과는 CmMyb1가 abscission zone형성에관여하는유전자의조절기능을 가지고있기때문으로판단됨 Myb1 overexpression 라인의조기낙과는본연구의 1~3차년도에서획득한결과에서모 두동일하게나타났으며, 후숙이진행됨에따라 Myb1의발현이점차감소하는경향으로 볼때 (Fig. 5), Myb1 유전자는과실의후숙을촉진하는 downstream의유전자를활성화 하여과실의후숙을유도하는것임을알수있음 과실의후숙과관련된또다른유전자인 Myb2 유전자형질전환체의후대검정결과는그림 5와같이 Myb2 유전자의 overexpression과 RNAi 형질전환체의원예적특징은 Myb1과 유사하게나타났음 Overexpression 형질전환체의경우과실의후숙이대조구에비해빠르게진행되었으며, 수정후 35 일째 (DAP) 부터낙과가시작되고과실의표면이갈라지는열과현상이나타났음 (Fig. 14B, C) 특히, 낙과및열과현상이 Myb1에비해빠르게진행된반면 knockdown 형질전환체는수 정후 일째 (DAP40) 까지도낙과나열과나현상이나타나지않아후숙이진행이지 연되고있음이확인 (Fig. 14B, C) 이러한결과는 Myb1 유전자의 RNAi 형질전환체와유사하였으나, Myb2 유전자가과실의 후숙과정에보다밀접하게관련되어있음을제시하는결과임 또한 Myb2 knockdown 형질전환체는개체당 4~5개의과실이착과되도과실의크기에는영 향이없었음 (Fig. 15) Myb 유전자형질전환체의과실발달에미치는영향을종합해볼때, 과실의후숙과정에서 Myb1 과 2 유전자는과실의후숙을촉진하는 downstream의유전자의발현을조절하는 upstream 인자로서과실의후숙을조절하는것으로판단 특히, Myb2의발현은과실의초기형성과정에서 transient 하게발현 (Fig. 5) 되는것으로볼 때, 과실의발달과및후숙을조절하는유전자의발현을조절하고있음을알수있으며, Myb 유전자의발현을조절하여과실의발달과후숙을조절함으로써, 고품질과실과저장 성이높은품종을육성할수있을것으로판단됨 CmXETRNAi에대한형질전환체의과실과비형질전환체와과실의생육차이를교배후 15 일이후 5일간격으로사진촬영과함께조사 대조구 (wild type) 의경우교배후 35일이경과하면서후숙이빠르게진행되어 36일에과 실의자연낙과가이루어졌으나 CmXETRNAi로형질전환된식물체의과실은 45일이경과 하여도과색의변화가일어나지않으며, 과실의연화또한지연되는것을확인 (Fig. 16, 17)

29 A) B) C) Figure 14. The characterization of transgenic plant transformed by Myb2. A) Transgenic melon growth in the GMO greenhouse, B) and C) ripening difference between the overexpression and the knockdown of Myb2. Myb2 knockdown transgenic plant shows delayed ripening compare to that of overexpression plants

30 Figure 15. The melon transformed by Myb2 knockdown shows high-yield. The transgenic melon can bearing 4 or 5 fruits per plant Figure 17. C. melo fruit transformed by pcambia2300(35s/nos):cmxetrnai

31 A) B) C) Figure 17. The characterization of transgenic plant transformed by xyloglucan endoglucantransferase (CmXET). A) Transgenic melon growth in the GMO greenhouse, B) and C) different ripening between the overexpression and the knockdown of CmXET

32 CmSOD(S) 유전자가과발현되는이들형질전환체 (Fig. 18) 에서는대조구에비해형태적 으로큰차이를나타내주지않았으나 제대로이루어지지않았음 CmSODRNAi 형질전환체의경우에는과실성숙이 이러한현상은항산화효소의결핍이되면과실의성숙이제대로이루어지지않는것을유 추해볼수있으며이들미성숙종자로부터후대식물체를확보하기위하여기배배양을 실시 약 200립의미성숙종자를기내에서발아를유도하여약 30개의식물체를확보할수있었 으며이들식물체들중약 5개는외부유전자가삽입되어있지않았고 1개의식물체는순 화과정중에고사 16개는모두정상적으로과실이수확되었으나 5개의과실에서는여전히미성숙종자를생산 하였음 Figure 18. Fruit of melon transformed by pcambia3300(35s/nos): CmSOD(S) and SOD RNAi. 식물체의물질대사과정중에생성되는활성화산소는노화및각종스트레스로작용하여세포의사멸을촉진하기때문에항산화효소계를이용하여이들활성화산소를효과적으로제거한다면, 과실의노화를억제하여품질을개선할수있을것으로판단되어 superoxide dismutase (SOD) 를이용한형질전환체를선발

33 CmSOD 형질전환체는미숙종자를생산하는등종자발달및생육이저조하여고품질과 실품종을개발하는데다른유전자에비해효율적이지못한것으로판단됨 이러한이유는멜론이전형적인 climacteric 과실로과실의후숙에활성화산소에의해생 성이촉진되는 ethylene에영향을받기때문으로판단되며또한 CmSOD RNAi 형질전환 체는활성화산소의과다축적으로유전자발현및물질대사의교란으로종자발달이억제 되기때문으로판단됨 다. 과실의무게 Myb2 RNAi 형질전환체의원예형질중의하나는과실의개수와크기에서대조구와 overexpression 형질전환체에비해차이를보였음 일반적으로멜론생산농가에서상품성을높이기위해개체당 1-2개의과실을수확하고있 으며, 과실의수가증가할수록품질은현저히감소 그러나 Myb2 RNAi 형질전환체의경우, 개체당 4-5개의과실이착과되어있어도과실의 크기에는영향을미치지않았으며, 평군과실의무게도가장높게나타나 overexpression 형질전환체에비해약 64% 이상무겁게나타났음 (Fig. 19). CmXETRNAi에대한형질전환체의과실크기도대조구에비해상당히작은것을확인하 였으며이것은세포벽내헤미셀룰로오즈의변형을유도함으로세포벽의신장과과실의성 숙에관여하는 Xyloglucan endotransglycosylase가 knockout된결과로판단됨 또한 CmXETRNAi에대한형질전환체는개체당 1 개가착과되어있을경우, 과실의크기는 대조구에비해약간증가하였으나과실의표면이대조구에비해굴곡이나타나는특성을 보였음 (Fig. 20). 이러한결과는 CmXET 유전자가세포벽의발달과관련이있으며, 식물 의형태형성을조절한다는보고를감안해볼때, CmXET 유전자형질전환체과실표면의 굴곡과관련이있는것으로판단됨 따라서, CmXET 유전자의발현을조절하여과실의발달과후숙을조절할수있으나, 과실 의품질을결정하는요인중의하나인과피의표면상태가다소고르지못하였음

34 Figure 19. Fruit weight of the melon transformed by each vectors. A; Result from 2007 cultivation, B; Result from 2008 cultivation

35 Figure 20. The characterization of transgenic plant transformed by xyloglucan endoglucantransferase (CmXET). 라. 과실의품질관련형질의분석 경도측정을위해각형질전환체의과실발달단계 (DAP 30±1, DAP35±1 그리고 DAP40±1) 에따라 3 개의과실에서경도측정기 (Mitutoyo, 2046S) 를이용하여과피의강도를각각 2회 씩측정 형질전환체의경도는과실의후숙과정에서나타나는농업형질 ( 낙과및열과현상) 과일치하였 으며 (Fig. 21) overexpression 라인의경우 35DAP의경도가 wild type의 30DAP와유사하 여약 5일정도의차이를나타내었음 35DAP에서품질관련유전자가 overexpression된형질전환체는경도가대조구인 wild type 보다약 10% 정도낮았으나, Myb1과 2 RNAi 형질전환체의경우는대조구보다높았으며, CmXET RNAi 라인은대조구와유의차를나타내지않았으나, overexpression 라인의경우 40DAP 에서는과피가매우연화되어경도가매우낮았음 이와같은결과는 Myb 유전자가과실의후숙과관련된유전자의활성을조절함으로써과실의 성숙및후숙에관여하여과피의경도에영향을주고있음을잘제시하는것으로과실의성숙 과정과일치하는것임

36 Figure 21. Comparison of the firmness in transgenic plants transformed by Myb1 (1i2 and 1OE1), Myb2 (2i6 and 2OE3) and CmXET (Xi5) during fruit ripening. i; RNAi knockout, OE; overexpression, WT; wild type, number (2, 1, 6, 3, 5); serial number of transgenic plants. 당도측정은각형질전환체의과실발달단계 (DAP 30±1, DAP35±1 그리고 DAP40±1) 에서 무작위로 3개를수확하여과실당 3곳에서각각 1g의과육을채취한후과즙을디지탈당도계 (PR-201 α/atago) 에떨어트려측정 형질전환체의당도는대조구인 wild type 에비해모두낮게나타났으며, wild type과 RNAi라 인의경우 30DAP에서 45DAP 까지당도가증가하였으나, overexpression의경우는 30DAP 에서가장높은당도를나타냈음 (Fig. 22) 형질전환체가대조구에비해낮은당도를나타냈으나멜론의당도는 40DAP를기준으로점차 감소한다는보고를감안하면, RNAi 라인의경우 45DAP 이후에도당도가증가할것으로예측 45DAP 이후에최고의당도를나타낼것이라는예측은 RNAi 라인의경우, 과실성숙의지연에 따른생리적발달단계의차이가엽록소함량, 경도와낙과및열과의지연등이이미확인되었 기때문임

37 Figure 22. Comparison of the soluble solid contents in transgenic plants transformed by Myb1 (1i2 and 1OE1), Myb2 (2i6 and 2OE3) and CmXET (Xi5) during fruit ripening. i; RNAi knockout, OE; overexpression, WT; wild type, number (2, 1, 6, 3, 5); serial number of transgenic plants. 에틸렌발생량은 5 개의과실 (35DAP±1) 을진공펙에넣어상온 (26±1 C) 에서 overnight 후, 100ml를주사기로채취하여 10ml를 gas chromatography (Aglient 6896N) 에주사하였음 분석조건은 oven temp 75 C, FID detector (ethylene-8min), TDC detector (CO2-6min) 에 mobil gas는 He을사용하였음 에틸렌발생은 Myb1 RNAi 라인에서가장높게나타냈으며, overexpression 라인에서도 wild type 보다낮게나타났음 (Fig. 23) 에틸렌발생이가장낮은형질전환체는 Myb2 RNAi 라인으로 wild type에비해약 30% 정도 낮아과실품질관련형질분석결과와일치하였음

38 Figure 23. Comparison of the ethylene contents in transgenic plants (35DAP) transformed by Myb1 (1i2 and 1OE1), Myb2 (2i6 and 2OE3) and CmXET (Xi5) during fruit ripening. i; RNAi knockout, OE; overexpression, WT; wild type, number (2, 1, 6, 3, 5); serial number of transgenic plants. DAP; days after pollination. 제 4 절고품질신품종후보선발 1. 고품질후보품종의선발 과실의발달과품질관련유전자형질전환체의후대검정및농업형질분석을통해우수한 형질전환체를선발하고자형질전환체의특성을분석한결과는 Table 3과같음 과실의품질관련유전자의 RNAi 형질전환체는과실의발달및후숙을현저히지연하는효 과를나타내어과실의품질을향상시킬수있는저장성이우수한품종개발이가능하였음 최종적으로선발된품종등록후보는 Myb2 RNAi로형질전환된 2i6 ( 품종등록명칭; 싱그런 멜론) 의재배적특성은엽록소의노화, 과실의후숙이지연되어낙과및열과현상이없음 따라서저장성이우수하기때문에유통기한의연장등의장점이있어농가소득향상에도도움 이될것으로판단됨

39 Table 3. Characterization of transgenic plants transformed by genes associated with development of fruit ripening Transgenic Melon Cultivation Character Physiological Character Myb1 OE#1 Similar to wild type Premature, Early abscission RNAi#2 Similar to wild type Late ripening Myb2 OE#3 RNAi#6 Similar to wild type Similar to wild type Premature, Early abscission, Open fruit Late ripening, High-yield, Bigger fruit CmXET RNAi#5 Delayed development at the early stage Late ripening, Bigger fruit 2. 품종등록신청 과실의품질관련유전자를이용하여과실의후숙이지연되는형질전환체를확보하여, 형질전 환체의후대검증및생육조사결과를종합하고확보된채종된 품종등록후보계통을선발 T5 종자를이용하여최종 최종적으로저장성이우수한멜론형질전환체를국립종자원에품종등록하고자하였으나, 2008년 1 월부터 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 이발효되면서, GMO 품종의등록은환경위해성심사후승인을얻어야가능 그러나환경위해성심사를위한자료를수집하기위해서는최소 2~3년이소요되고년간 5~10 억원의예산이필요한방대한연구가필요함 따라서본과제에서개발된저장성이우수한멜론형질전환체를품종등록하지못하였음

40 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절기술개발목표 이차대사산물생합성관련유전자, 세포벽대사에관여하는유전자, 그리고항산화물질생 성에관여하는유전자를이용한멜론형질전환을통해고품질의식물품종육성 멜론형질전환체의분자생물학적분석을이용한기능분석 과실품질관련유전자를이용한형질전환체의유망계통선발및증식 유망계통의 GMO 품종등록 제 2 절연도별주요개발목표달성도 구분연도연구개발목표주요수행내용달성도 1 차년도 과실품질관련유전자 Myb1, Myb2, CmXET 그리고 CmSOD 에대한유전적발현양상등과특성분석 - CmMyb1 promoter region 을분리해낸후, 담배형 질전환을통해발현되는 localization과열매발달단 O 과실품질관련계별발현양상을분석유전자의특성 - 확보된유전자중에서 Myb와상호작용하는유전자규명를알아보기위하여 yeast two-hybrid를실시 O 과실품질관련 유전자들에 한 Sense 대 및 RNAi vector 를 이용한멜론형 질전환체개발 - CmMyb2의경우 Chitinase와상호연관되어있다는새로 운생리학적연구결과를도출하였으며이결과는세계최 초임 - CmMyb의 1과 2, CmXET, Expansin, CmSOD의 유전자를이용한 Sense, Antisense, RNAi vector를 모두construction하였고이를이용한형질전환을실 시하여유전자별각 construct 당 9~14개의형질전 환체를개발하는데성공하였음 - CmMyb의 1과 2, CmXET, Expansin, Cm SOD의 유전자를이용한형질전환을시도하여얻어진형질 전환체는 1차적으로 PCR 방법을이용하여형질전환 O 멜론형질전체를확인하였으며 2차적으로 Southern blot 방법을환체의당대검이용하여외부유전자삽입을확인증및분자생물 - 형질전환체임이확인된개체들은모두자가수분하여학적기능분석후대를확보하였으며이들개체들은세대진전과선 발단계를거쳐재배하면서과실의품질관련농업형 질의특성을분석하였음

41 구분연도연구개발목표평가의착안점및기준달성도 2 차년도 2007 O 과실품질관련 - 1차년도에이어 CmSOD 벡터를이용한형질전환을유전자를이용한계속실시하여추가적인형질전환체를확보하였으계속적인멜론며, 외부유전자의삽입을확인하였음형질전환실시 - 1차년도에확보한형질전환체중 PCR 방법을이용 O 멜론 형질전 환체의당대검증 및후대검증 O 의 조사 육성된 계통 재배적합성 하여세대진전과정에서형질전환체를확인하였으 며, 항생제저항성검정을통한 segregation을조 사하여 homo 라인을선발하기위한분석 - 이들개체들은세대진전을계속하여대부분 T3 generation에서재배하여개체의확보 - 세대고정정이이루어진개체를이용하여 GMO 재 배하우스에재배하면서품질관련형질을조사 - 조사형질은엽록소함량, 착과능력, 과실의무게, - 조기낙과및열과여부를조사하여 차후보로선정 34개라인을 1 각각의라인으로부터종자를수확하여세대진전및 최종품종선발에활용하고자함 - 후대검정은 2차년도에확보한형질전환체중 PCR O 과실품질관방법을이용하여세대진전과정에서형질전환체를련유전자를이확인하였으며, 항생제저항성검정을통한용한멜론형질 segregation을조사전환체의후대검 - 이들개체들은세대진전을계속하여 T3 또는 T4 증 generation 개체의확보 차년도 차년도에확보된 34라인의후보개체를 GMO 재 배하우스에재배하면서품질관련형질을조사 - 발달단계에따라엽록소함량및생육상태를고려 O 과실품질관련하여 5개의라인을최종적으로선발하여품질관련유전자를이용한농업형질을조사형질전환체의유 - 조사형질은발달단계에따른엽록소함량, 과실의망계통선발및무게그리고후숙과정에따른당도와경도측정증식 - 에틸렌함량을분석 - 각의라인으로부터종자를수확하여최종품종등 록시제출하고자함

42 구분연도연구개발목표평가의착안점및기준달성도 3 차년도 2008 O GMO 록가능성 및품종등록 품종등 조사 - 1~3 년차의잽배적특성과생리적특성를종합하여 과실의성숙과정에서조기낙과및열과가 wild type에비해 10~15일정도지연되는라인을최종 적으로선발 ( 품종등록명칭; 싱그런멜론) 년 1 월에발효된 LMO 법 에따라 GMO 품종 - 등록시환경위해성심사결과를추가해야하기때문 에품종등록이진행되지못함 본과제에서개발된저장성이우수한신품종의등 록위한위해성심사자료작성을위한지원이필요 50 제 3 절관련분야에의기여도 박과에서과실의품질관련유전자의클로닝및이들유전자를이용하기위한벡터제작및형질 전환체개발체계확립 생명공학기법을이용한신품종개발에필요한형질전환세대의검정및후대검정방법과우 수한목표형질을고정하기위한일련의과정에대한체게확립 과실의품질과관련된농업형질분석에의한고품질품종선발체계 유용유전자 cloning 및활용을위한체계확립으로유사연구에활용가능 형질전환체의환경위해성평가를위한 event 로활용가능

43 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 1. 작물의과실품질관련유용유전자원의확보및활용체계를확립 기후변화와바이오에너지에대한수요증가로유용유전자원의확보와이들유전자를활용 한산업화를위한첫단계인유용유전자원의확보체계확립 형질전환방법에의한목표형질이도입된새로운품종개발과정의체계확립 2. 과제수행기간에축적된기술과인력인프라의활용 유용유전자를확보및형질전환체개발그리고형질전환체를검정을통한품종개발체계를 이해하는인력및기술인프라를활용한유용목표형질이도입된신품종개발 확보된유용유전자는특허등록을하여지적재산권확보 환경내성작물, 바이오에너지원자재확보를위한바이오매스증대를위한형질전환작물 의개발및세대고정을통한품종개발에활용하고자함 3. 확보된우수한형질이도입된멜론을이용한환경위해성평가 ( 다음단계조치사항) 본연구가기획되고진행되는동안에이루어진 GMO 품종등록을위한환경위해성평가 조항의신설로신품종등록에필요한위해성평가자료작성및심사신청에개발된형질전 환체활용가능 환경위해성평가를위한원재료 이용가능 event 로활용하여환경위해성평가를위한기술개발에 위해성평가기술개발과동시에축적된결과는신품종등록을위한심사자료로제출하여 신품종등록 축적된형질전환체의품질관련형질의분석결과는품종등록후학술지에게제

44 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 Melon Genomic Resources - Melon의 physical map 작성 - PI X PD DHL92 집단으로부터 BAC library를제작하여 23,000 clones 획득 - 평균 insert size는 139 kb 이며, 6X coverage - 최근에 Physical map과 genetic map을 integration 시키는작업을시작 Cucuribit Genomic Database ( - Melon의 EST cellection - Melon의 Maps 작성 - Microarray를통한 functional genomic 지원 - Melon EST Collection version 2.0 (Oct 2007) Sequences used for assembly Total number of high quality ESTs (after cleaning) 34,313 Total number of published genes from GenBank (10/02/07) 138 Total number of sequences used for assembly 34,451 Unigene information Total number of contigs (MU3270-MU9721) 6,452 Total number of singletons (MU9722-MU19397) 9,676 Total number of unigenes (MU3270-MU19397) 16,128 - Melon cdna array (ver 1.0) The melon cdna microarray (ver 1.0) was designed based on the melon unigene build version 1.0. The array contains 9,216 spots among which 12 consist of only printing buffer and serve as negative controls, while the remaining 9,204 spots represent 3068 unique genes with each gene printed in triplicate on the array

45 제 7 장참고문헌 Alan B. (1998) Temporal Sequence of Cell Wall disassembly in rapidly ripening Melon fruit. Plant Physiol. 117: Brummell DH, MH Harpster (2001) Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants. Plant Molecular Biology 47 (1-2): Cho HT, Kende H. (1998) Tissue localization of expansins in deepwater rice. Plant J. 15(6): Cosgrove DJ. (1996) Plant cell enlargement and the action of expansins. Bioessays. ;18(7): Hamilton AJ, Fray RG, Grierson D. (1995)Sense and antisense inactivation of fruit ripening genes in tomato. Curr Top Microbiol Immunol. 197:77-89 Keller Elvira and Cosgrove Daniel J. (1995) Expansins in growing tomato leaves. The plant Journal 8(6), Kende H, Bradford K, Brummell D, Cho HT, Cosgrove D, Fleming A, Gehring C, Lee Y, McQueen-Mason S, Rose J, Voesenek LA. (2004) Nomenclature for members of the expansin superfamily of genes and proteins. Plant Mol Biol. 55(3):311-4 Kim HJ. (1989) Determination of total vitamin C by ion exclusion chromatography with electrochemical detection. J Assoc Off Anal Chem. 72(4):681-6 Kim MS, Chung HD and Kim YK (1997) Inheritance of fruit color, sugar and ascorbic acid content in Melon (Cucumis melo L.). Korean J. Breed. 29(1): Oeller PW, Lu MW, Taylor LP, Pike DA, Theologis A. (1991) Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA. Science. 18;254(5030):437-9 Redgwell RJ, Fry SC. (1993) Xyloglucan Endotransglycosylase Activity Increases during Kiwifruit (Actinidia deliciosa) Ripening (Implications for Fruit Softening). Plant Physiol. 103(4): Reinhardt D, Wittwer F, Mandel T, Kuhlemeier C. (1998) Localized upregulation of a new expansin gene predicts the site of leaf formation in the tomato meristem. Plant Cell. 10(9): Rose Jocelyn K.C, Lee Howard H and Bennett Alan B. (1997) Expression of a divergent expansin gene is fruit-specific and ripening-regulated. Plant biology. 94, Rose Jocelyn K.C., Braam Janet, Fry Stephen C., and Nishitani Kazuhiko (2002) The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis: current perspectives and a new unifying nomenclature. Plant Cell

46 Physiol. 43(12): Sampedro J, Cosgrove DJ. (2005) The expansin superfamily. Genome Biol. 6(12):242 Shcherban TY, Shi J, Durachko DM, Guiltinan MJ, McQueen-Mason SJ, Shieh M, Cosgrove DJ. (1995) Molecular cloning and sequence analysis of expansins-a highly conserved, multigene family of proteins that mediate cell wall extension in plants. Proc Natl Acad Sci. 92(20):

47 주 의 1. 이보고서는농림수산식품부에서시행한농림기술개발사업의연구보고서 입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시농림수산식품부에서시행한농림 기술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여 서는아니됩니다.