제 6 장 혈청학적 반응

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1 5. 세포용해반응 (cytolytic reaction) 세포성항원 ( 세균, 적혈구 ) 과그대응항체와반응후, 여기에정상혈청중에있는보체가작용하면세포가용해되는것 1) 용혈반응 (Hemolytic reaction) 항원 ( 적혈구 ) 과항체 ( 용혈소 hemolysin: 항혈청 ) 를반응시킨후보체를가하면용혈이일어남 적혈구 + 용혈소 + 보체 -> 용혈

2 2) 용균반응 (Bacteriolytic reaction) 항원 ( 세균 ) 과항체 ( 용균소 bacteriolysin) 을반응시킨후보체를가하면용균이일어남 세균 + 용균소 + 보체 -> 용균 Gram 음성세균 phospholipid 양이풍부 막의부피가얇다 항원 - 항체 - 보체반응의유발시쉽게용균 콜레라균최종적인동정에자주이용 (Pfeiffer 현상 ) Gram 양성균 용균은보기어렵고다만사균현상을볼수있음 항원과결합하는특이항체 (bacteriolysin, hemolysin) 열에안정한성분 56 도에서 30 분간처리하여도영향을받지않는다

3 6. 보체결합반응 (complement fixation reaction) 항원 - 항체반응이발생 항원 - 항체복합체형성 보체가복합체에결합되어소모됨 이러한보체소모여부로항원항체반응이발생하였는지를판단 보체결합유무를판단 육안으로는관찰하기어려움 감작혈구의용혈여부를보고판단 1 기 항원항체복합체에보체를결합시키는반응 2 기 보체가남아있는가여부를감작적혈구를사용하여알아봄 일본뇌염, influenza, virus 감염증진단, 발진티프스, 발진열등의 Rickettsia 감염증, 매독, 말라리아감염증진단등에응용 미리검사할혈청내에들어있는보체의활성을소실시킨다.( 비동화 ) 56 도씨 30 분항온처리

4 보체결합반응의원리

5 7. 흡수반응 (Absorption reaction) 항체 ( 항혈청 ) 에항원을가함 항원에대응하는혈청중의항체를결합시켜제거 살모넬라항혈청 이질균항혈청 전염성단핵구증의감별시험

6 8. 억제 ( 저지 ) 반응 (Inhibition reaction) 항원항체반응물을육안적으로확인할수없는경우에사용 2개의항원과 1개의항체가반응하는경우 임신반응검사 임산부소변과 anti-hcg를반응하면 Anti-hCG가제거됨 hcg가부착된 Latex를첨가시키면반응이일어나지않음 일본뇌염virus항체 influenza virus 항체등에이용

7 9. 표식항원 * 항체를이용한측정 면역분석법 (Immunoassay) 방사면역분석법 (RIA: Radioimmunoassay) 효소면역분석법 (ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay, EIA) 면역형광법 ( 형광항체법 : Immunofluorescence) Immuno-Blot 법

8 1) 방사면역분석법 항원또는항체를 125 I 와같은방사성동위원소를표식 항원 - 항체복합물의방사활성을측정함으로써미량의항원이나항체를측정 화학적분석법으로측정어려운항목 미량의항원이나 hapten 혈청 insulin 미량의 hormone 생리활성물질 약물 원리 항원과표지항원을항체에결합시키면항체에경쟁적으로비례하여결합 결합형 항원, 표지항원이항체와결합한것 유리형 항원, 표지항원이항체와결합하지않은것 고상법 (solid phase method) 극미량의항원을정량 plastic 시험관의벽에항원을흡착 항체를반응시킨후시험관을세척 항원과결합한항체를측정하기위해방사선동위원소로표식한항체를다시작용 시험관세척후방사선을측정하여정량

9 샌드위치법 Bead에항체를흡착 항원을반응시킨후 Bead를세척 항체에부착된항원을측정하기위해표지항체를다시작용시킴 항원항체복합체를만들어항원량을정량

10 효소면역분석법 방사면역측정법 방사선물질을취급 특별한시설 면허증이나자격증소지자 반감기에따른시약의유효기간 실험실및환경오염 1966 년 ELISA 효소 (peroxidase, alkaline phosphatase, β-d-galactosidase 등 ) 효소를항원또는항체에결합시킴 혈청또는각종조직내에서항원항체결합반응을유도 적당한조건하에각효소에해당하는기질을작용 효소가기질에발색성을부여 비색정성, 정량을시행

11 면역형광법 ( 형광항체법 ) 항체를형광물질로표식 항원에항체를결합시킴 형광현미경또는 filter 를부착 항원량을분석 직접법 항원 ( 조직세포내의항원 ) 에형광항체 (fluorescent antibody) 를결합시킴 형광현미경으로관찰 간접법 항원에항체를결합시킴 다시형광표지항체글로블린 (anti-human γ-globulin) 을결합시킴 주로항체검출시이용 항보체법 항원표면에항체를반응시킴 보체를작용시킴 보체에대한표지항체를반응시킴 민감도가높다

12 Immuno-Blot 법 여러단백혼합물질에서특정항원의확인이나생화학적분석시널리이용 검사과정 단백혼합물질 ( 검체 ) 의전기영동 SDS polyacrylamide 분석용분리겔로전기영동 항원의 Nitrocellulose 막전기영동에의한전사 1차항원-항체반응 각항원의확인을위해특정항체를이용 세척 2차항원-항체반응 동위원소표지항체, 효소표지항체 세척 검출 동위원소표지항체법 (autoradiography), 효소표지항체법 ( 기질, 발색제 )

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14 10. 자동분석기응용법 Turbidimetry Nephelometry 분광광도계 형광광도계 유세포분석기 (Flowcytometry)

15 Turbidimetry, nephelometry 용액중의항원항체복합물의혼탁및비탁정도를광학적으로측정 * Turbidimetry ( 비탁법 ) 항원항체복합물에일정한파장의광을조사 빛의흡수광이나투과광을측정하는방법 원리 일정한양의항체에항원량을증가시킴 면역복합체의양은항원 / 항체비가최적비가될때까지비례적으로증가 일정한파장의빛을조사 면역복합체의양에따라투과광은비례해서감소 Immunoglobulin, CRP, ASO, Complement 등의측정 * Nephelometry ( 혼탁측정법 ) 항원항체복합물은광이닿게되면광이산란 산란광을일정한각도에서측광해서용액중의물질의농도를측정 비탁법보다낮은농도의물질측정에좋음

16 비탁계법, 흡광도계, 형광광도계 기기구성의차이점

17 분광광도계 원리 임상화학에서가장광범위하게사용되고있는분광기기 가시광선과일부자외선영역을이용 Beer 법칙 (Lambert-Bouquer s 법칙 ) 을응용 측정하고자하는물질의농도는빛의흡수된양에비례하고투과량의로그에반비례한다 흡광도허용범위 : 0.2 ~ 1.0 (1.0 이상에대해서는오차가심함 희석필요 ) A=abc=log(100/%T)=2-log%T A(absorbance): 흡수된빛의양 a: 몰흡수도 (molar absorptivity) b: light path 의길이 c: 물질의농도 %T: 퍼센트투과도 적용되는조건 입사광이단색방사일때 (monochromatic radiation) 용질의흡광도에비해용매에의한빛의흡수를무시할수있을때 용질의농도가직선영역내에있을때 광학적간섭물질이없을때 측정하고자하는물질과다른물질사이에화학적작용이일어나지않을때

18 형광광도계 원리 형광성을띠는물질의용액에빛을입사 입사광에대해수직방향의위치에서형광의세기를분석 형광의세기가물질의농도와비례 저농도물질의분석에주로이용 효소, 스테로이드, 비타민, 의약품, 기타유기물질분석

19 유세포분석기 생체표본세포에특이적으로결합한형광표지항체의형광물질을측정 세포의크기, 형태, 혼합된복합체에서소수의아형군세포측정및분리 임상의학적분야 단클론항체들을이용한림프구표지검색 세포의 DNA 함량측정 Reticulocyte 수 종양단백측정

20 What is Flow Cytometer.? Flow ( 흐르다 ) + Cyto ( 세포 ) + Meter ( 기기 ) Flowcytometer [ 유세포분석기 ] 유액 ( 流液 ) 상태의입자 (Particle) 나세포 (Cell) 가일정감지지역 (sensing area) 를통과할때빛 Signal들을측정하여각각의입자나세포가갖는여러특징을동시에측정하는장비.

21 Consist of the FCM 1. Fluidic System (Laser 와만나는부분 )

22 Sorting Mechanism laser FSC detector Fluorescence detector - Charged Plates +

23 Summary Light signal ADC Electronic pulse Channel Number Data stored by comuter

24 Thank you! ^^