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1 J Plant Biotechnol (2017) 44: DOI: ISSN (Print) ISSN (Online) Research Article 멸종위기수생식물인매화마름 (Ranunculus kazusensis Makino) 의기내신초증식 박민완 류시현 남수환 배기화 In vitro shoot propagation of Ranunculus kazusensis Makino, an endangered aquatic plant Min Wan Park Shi Hyun Ryu Su Hwan Nam Kee Hwa Bae Received: 21 June 2017 / Revised: 5 July 2017 / Revised: 9 August 2017 / Accepted: 10 August 2017 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract A micropropagation method via callus for Ranunculus kazusensis Makino, an endangered species, was established. When stem segments were cultured on MS media supplemented with 1.0 mg/l IAA, NAA, IBA and 2,4-D, the highest frequency of callus induction was achieved on MS medium supplemented with 1.0 mg/l NAA. Multiple shoot per explant was obtained, the MS medium containing 1.0 mg/l BA and 0.5 mg/l NAA. Additionally, effect of activated charcoal (AC) and sucrose on shoot growth in in vitro culture were examined. The most suitable conditions for shoot growth after 4 weeks of culture were the MS medium with AC and sucrose. This in vitro propagation protocol will be valuable for conservation and mass propagation of this endangered plant. Keywords 서론 Charcoal, Multiple shoot, Sucrose 산업화와관계시설의발달로우리주변에서흔히볼수있었던크고작은습지가점차사라지고있어습지를자생지로하는일부수생식물도절멸의위기에처해있다. 과거에는흔하게 M. W. Park S. H. Ryu K. H. Bae ( ) 국립낙동강생물자원관 (Nakdonggang National Institute of Biological Resources, 137, Donam 2-gil, Sangju-si, Gyeongsangbuk-do, 37242, Republic of Korea) S. H. Nam 천리포수목원 (Chollipo Arboretum, 187, Cheollipo 1-gil, Sowon-myeon, Taean-gun, Chungcheongnam-do, 32121, Republic of Korea) 발견되던구와말 (Limnophila sessiliflora), 남개연 (Nuphar pumila), 참물부추 (Isoetes coreana), 물질경이 (Ottelia alismoides), 가시연꽃 (Euryale ferox Salisb.), 각시수련 (Nymphaea tetragona var. minima), 매화마름 (Ranunculus kazusensis Makino), 물고사리 (Ceratopteris thalictroides), 순채 (Brasenia schreberi), 전주물꼬리풀 (Dysophylla yatabeana), 조름나물 (Menyanthes trifoliata) 등을그예로들수있다 (Lee and Choi 2006; Lee 1984; Lee 1996; 김금호 2006). 환경부가멸종위기야생생물 II 급으로지정해보호하고있는매화마름 (R. kazusensis) 은미나리아재비과 (Ranunculaceae) 에속하는 2 년생침수성수생식물로주로논이나늪, 연못에자생한다. 매화마름은 1960 년대까지만해도영등포에서채집될정도로흔했던식물이지만경작지의감소와도시의팽창으로인해 1980 년대에들어서면서사진조차구하지못할정도로자생지에서사라지는식물이되었다 ( 김금호 2006). 매화마름에대한멸종압력으로는우선특정한서식지에서만자생하는생태적특징을들수있다. 최적의자생지는둠벙이나소류지가인접해있어겨울철에도수분이많은논이다. 바닥이완전히마른채로겨울을나는논에서는매화마름종자가이듬해모내기전까지는발아를할수없다 ( 김금호 2006). 어렵게발아를하여신초가생장하더라도모내기전후로논잡초를없애기위해뿌리는제초제에의해사멸할수있다. 또한종자를다량으로생산하지만휴면기간이짧아이듬해발아에실패할경우에는자생지에서의증식이어려운특징도있다 (Lee and Choi 2006; Lee 1984; Lee 1996; Lee 2006). 매화마름에관한연구로는접합자배유래의체세포배생산을통한식물체유도 (Min et al. 2007) 에관한연구결과외에는전무한실정이다. 따라서본연구는매화마름의줄기절편으로부터캘러스를유도하여기내재분화체를생산하고자하였다. 이를통해연중생산이가능한기내식물체의생산방법에대한기초자료를확보하였다. This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2 326 J Plant Biotechnol (2017) 44: 재료및방법 식물재료및배양조건 연구에사용된매화마름 (R. kazusensis) 의전초는천리포수목원에서분양받았다. 표면살균은매화마름의전초를흐르는수돗물에서 30 분, 세척멸균증류수로 1 회세척, 70% ethanol 에 1 분, 1% NaOCl 용액에 20 분, 멸균증류수로 5 회세척, 멸균여과지에서수분을제거하는순으로진행하였다. 표면살균한매화마름의줄기절편을 cm 로세절하여실험에사용하였다. 모든배양물은온도 22 ± 1 C, 광주기 16/8( 명 / 암 ) 시간, 광도 46 µmol m -2 s -1 의배양실에서배양하였다. 실험에사용한모든배지와기구는 121 C, 1.5 기압으로 20 분간멸균하였으며배지의경우페트리디쉬 (12 5 cm, SPL, Korea) 에는 30 ml, 4 각 plastic 배양병 ( cm, SPL, Korea) 에각각 100 ml 씩분주하여사용하였다. 옥신류호르몬종류및농도에따른매화마름줄기유래절편으로부터캘러스유도 옥신류호르몬종류에따른매화마름캘러스유도를위해줄기절편을 1.0 mg/l 의 IAA (Indole acetic acid), NAA (Naphthalene acetic acid), IBA(Indole butiric acid) 와 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) 가첨가된배지에치상하여 4 주간배양한다음캘러스유도율을조사였다. NAA 의농도에따른캘러스유도하기위해 0, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 mg/l 의 NAA 가첨가된배지에치상하여 4 주간배양한후캘러스유도율을조사하였다. 배양배지는 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지 (30 g/l sucrose, 7 g/l agar, ph 5.7) 를기본으로제조하여페트리디쉬에 30 ml 씩분주하였다. 옥신류와사이토키닌류혼합처리에따른다신초유도및기내증식 매화마름캘러스유래의다신초유도조건을조사하기위해호르몬이첨가되지않은 MS 배지에서 2 회에걸쳐계대배양한캘러스를 100 ~ 200 mg 취해 0, 1.0 mg/l 의 BA (Benzylaminopurine) 와 Kinetin 을첨가하고각배지에옥신류호르몬인 NAA, IAA, 2,4-D 를각각 0, 0.1, 0.5, 1.0 mg/l 씩조합처리한 MS 배지 (30 g/l sucrose, 7 g/l agar, ph 5.7) 에 20 개씩 5 반복치상하여 4 주간배양한후처리구당다신초유도개수를조사하였다. 와 sucrose (0, 10, 30, 50, g/l) 가농도별로첨가된 MS 배지 (Gelrite 4.0 g/l, ph 5.8) 에 6 개체씩 3 반복하여치상하였다. 실험은온도 (25 ± 1 C), 광주기 (12/12 시간 ), 광도 (46 µmol m -2 s -1 ) 가일정하게유지되는배양실에서실시되었다. 배양 4 주후신초와뿌리의길이, 생중량과건중량을각각조사하였다. 통계분석 모든데이터는평균 ± 표준편차로표시하였고, 집단간변이차이를알아보기위해서 one-way ANOVA 를실시하여, 유의성이있는경우 Duncan s multiple range test 로사후검증을실시하였다. 통계적유의성은 P < 0.05 로설정하여분석하였다. 결과및고찰 매화마름줄기유래절편으로부터캘러스유도 매화마름의줄기절편에서캘러스유도에미치는옥신류호르몬의종류를알아보기위해 IAA, NAA, IBA 와 2,4-D 가각각 1 mg/l 첨가된 MS 배지에줄기절편을치상한후에캘러스형성율을조사한결과, 1.0 mg/l NAA 를첨가한배지에서 87% 의캘러스유도율을보였으며, 1.0 mg/l IBA 가첨가된배지에서 78%, 1.0 mg/l 2,4-D 가첨가된배지는 42%, 1.0 mg/l IAA 첨가배지는 34% 의순으로조사되었다 (Fig. 1). NAA 처리농도에따른캘러스유도율은 0.5 mg/l 의 NAA 처리구에서 87.5% 로조사가되었으나 1 mg/l 의 NAA 처리구와유의적으로차이를보이지않았다. 동속은아니지만참돌꽃 (Rhodiola rosea L.) 의경우, 줄기절편을치상하여 BA 와 NAA 가복합적으로처리가되었을때부정아및캘러스유도율이가장우수하다는결과를보고하였고 (Bae et al. 2005), 또한난과식물인새우난초 (Calanthe discolor) 의조직배양을통한식물체생산에서도새우난초의배양부위 ( 잎, 구경, 뿌리 ) 에따라부정아유도율과캘러스유도율이다르고식물체재생율에많은영향을주는것으로보고되었다 (Bae et al. 2010). 이와같이배양부위및배지에첨가하는생장조절물질의종류 기내다신초신장에미치는활성탄과 sucrose 의영향 활성탄 (Activated charcoal, AC, Duchefa, Netherland) 과 sucrose 의농도별처리가매화마름다신초신장에미치는영향을조사하기위해 2 cm 생장한다신초를 AC (0, 100, 200, 400 mg/l) Fig. 1 Callus induction of R. kazusensis. A: Kind of auxins, B: NAA concentrations of stem. Different alphabetical letters are significantly different according to Duncan's multiple range test at P < 0.05

3 J Plant Biotechnol (2017) 44: 와농도에따라캘러스유도및신초분화양상이다르게나타남을알수있다 (Ryu et al. 1992). 신초의분화및생장에는세포의생장과분열을촉진하는생장조절물질 ( 옥신과사이토키닌 ) 의첨가가필수적이며, 배양부위의분열부위존재유무등이초기배양의성패를좌우하는중요한인자로작용하는것으로보여진다 (Murashige and Skoog 1962). 옥신류와사이토키닌류혼합처리에따른다신초유도및기내증식 식물생장조절물질복합처리에따른기내매화마름캘러스유래다신초유도조건을알아보기위해 BA (0, 1.0 mg/l) 와 Kinetin(0, 1.0 mg/l) 과 0, 0.1, 0.5, 1.0 mg/l NAA, IAA, 2,4-D 를각각조합하여제조한 MS 배지위에매화마름캘러스를치상한후 4 주후에다신초유도개수를조사한결과는 Table 1 과같다. 매화마름캘러스유래의다신초유도는 1.0 mg/l 의 BA 와 0.5 mg/l NAA 조합처리구에서절편당평균 47.6 개로가장많이유도되었다 (Table 1). 호르몬이처리되지않는대조구에서는캘러스상태로계속유지됨을확인하였다 (Fig. 1B). 2,4-D 의조합처리는절편당평균 10 개미만의다신초가유도되었다. Min 등 (2007) 의연구에서는체세포배유래의식물체생산기법에관해연구하여캘러스의다신초분화등에관한연구는국내외적으로처음수행하는바이다. 본연구에서 BA 와 NAA 를혼합처리가매화마름다신초유도에효과적이라는결과를보였는데이는 cytokinin 류는지하부 의발육보다는지상부의발육을촉진시키는역할을한다는보고 (Short and Torrey 1972) 가있어다양한사이토키닌류의효과를검증할필요가있다고사료된다. 본연구에서는다신초유도에미치는 Tidiazuron (TDZ) 의효과를확인하지는않았지만, TDZ 는목본식물을포함한대부분의식물체의대량증식에효과적이며 (Lu 1993) 재분화에어려운식물체의체세포배형성에효과적이라고보고되었고, Cho 등 (1999) 과 Seo 등 (2009) 의연구에서도나리류의분화에 NAA 와 BA 를혼합처리한실험구보다 NAA 와 TDZ 를혼합처리시분화에가장효과적이라는연구결과와보고한바있어향후 TDZ 의효과를조사해볼필요가있을것으로사료된다. 기내다신초신장에미치는활성탄 (activated charcoal) 과 sucrose 농도의영향 매화마름캘러스유래의다신초신장에미치는 AC (Activated charcoal) 와 sucrose 의농도를조사한결과, 엽장 (shoot length) 은 200 mg/l AC 처리구에서평균 12.6 cm 로가장긴반면, 대조구는평균 8.3 cm 로짧았다 (Table 2). 근장 (root length) 은 50 g/l 의 sucrose 처리구에서평균 5.8 cm 로가장길었고, 대조구는 1.7 cm 로짧았다 (Table 2). 하지만본연구결과는통계적유의성은높지않다 (Table 2). Sucrose 는식물체내대사활동에필요한에너지원으로, 기내조직배양개체의세포내삼투조절제로이용된다 (Gabriela et al. 2005). 그러나고농도 (50 g/l) 의 sucrose 처리는일본산나리류 (Lilium bulbscales) 의기 Table 1 Effects of cytokinins and auxins concentrations on multiple shoots induction R. kazusensis callus 4 weeks of culture on 1/2MS medium supplemented with 20 g/l sucrose and 4.0 g/l gelrite Cytokinins (mg/l) Auxins (mg/l) BA KT NAA IAA 2,4-D No. of multiple shoot/explant ±0* ±0.4b ±1.0a ±0.8b ±0.9c ±0.4d ±0.6e ±0.7f ±0.2fg ±0.1fg ±0.7a ±0.6a ±1.1a ±0.3b ±0.4b ±0.7b ±0.4c ±0.3c ±0.2c *Data are the means ± SD, of three experiments. Different alphabetical letters are significantly different according to Duncan s multiple range test at P < 0.05.

4 328 J Plant Biotechnol (2017) 44: Table 2 Effects of AC and sucrose concentrations on shoot growth from multiple shoot of R. kazusensis after 4 weeks of culture on MS medium supplemented with 4.0 g/l gelrite AC (mg/l) Sucrose (g/l) Length of shoot (cm) Fresh weight (g) ±0.8*b 4.4±1.2c ±0.5a 6.8±1.7b ±0.2a 6.6±1.1a ±1.1a 6.4±1.6a ±1.3a 6.1±1.4a ±0.9a 6.3±0.8a ±0.8a 6.8±1.3a *Data are the means ± SD, of three experiments. Different alphabetical letters are significantly different according to Duncan s multiple range test at P < Fig. 2 In vitro propagation of R. kazusensis. A: Leaf (scale bar, 0.2 mm), B: Stem (scale bar, 0.2 mm), C: Multiple shoot induction of R. kazusensis stem (scale bar, 0.5 mm), D: Shoot conversion from multiple shoot (scale bar 20 mm), E-F: Shoot elongation (scale bar, 20 mm) 내배양시잎발생을억제하고, 캘러스유도를촉진하여생육이저해된다고하였다 (Takayama and Misawa 1979). 반면, Cocos nucifera L 의경우는저농도 (5 g/l) 의 sucrose 처리는고농도 (70 g/l) 처리에비해광합성능을향상시켜토양순화에적합한독립영양식물로발달을촉진시켰다 (Gabriela et al. 2005). 또한, 터키산마르타곤나리 (Lilium martagon) 에서는 sucrose 저농도처리가고농도처리에비해배지내양분흡수를촉진시키고, 생장억제물질생성을감소시켜구근의형성과발달에효과적이었다 (Magdalena and Anna 2005). 하지만본여구결과에서는통계적유의성이없었다 (Table 2). 배지내 AC 의첨가는고온 고압멸균후교질재료 (gelling agent) 에의해 ph 가낮아지는현상을억제하여배지의 ph 를안정화시켜세포또는기관의생장과발달에긍정적인영향을주고 (Eymar et al. 2000; Pan and van Staden 1998), 신초형성및뿌리유도를촉진하는역할을한다 (Dumas and Monteuuis 1995). 결과적으로, 본연구결과는매화마름의기내무균증식에필요한최적조건을확립하였고, 이러한결과는향후야생에서멸종되어가는식물의유전적다양성을유지하면서서식지외에서보존하거나증식된식물체를서식지에복원하는활동에중요한참고자료로활용될수있을것이다. 적요 본연구는자생멸종위기수생식물인매화마름의기내증식에미치는배양환경 ( 식물생장조절제, AC, sucrose) 을조사하기위해수행되었다. 효율적인캘러스유도조건을알아보고자 IAA, NAA, IBA 와 2,4-D 가각각 1 mg/l 첨가된 MS 배지에줄기절편을치상한후에캘러스형성율을조사한결과, NAA 를첨가한배지에서 87% 의캘러스유도율을보였으며, IBA 가첨가된배지에서 78%, 2,4-D 가첨가된배지는 42%, IAA 첨가배지는 34% 의순으로조사되었다. NAA 처리농도에따른캘러스유도율은 0.5 mg/l 의 NAA 처리구에서 87.5% 로조사가되었으나 1 mg/l 의 NAA 처리구와유의적으로차이를보이지않았다. 매화마름캘러스유래의다신초유도는 1.0 mg/l 의 BA 와 0.5 mg/l NAA 조합처리구에서절편당평균 47.6 개로가장많이유도되었다. 호르몬이처리되지않는대조구에서는캘러스상태로계속유지되었다. 2,4-D 의조합처리는절편당평균 10 개미만의다신초가유도되었다. 매화마름캘러스유래의다신초신장에미치는 AC (Activated charcoal) 와 sucrose 의농도를조사한결과, 엽장 (shoot length) 은 200 mg/l AC 처리구에서평균 12.6 cm 로가장긴반면, 대조구는평균 8.3 cm 로짧았다. 결과적으로본연구는매화마

5 J Plant Biotechnol (2017) 44: 름의기내증식에미치는몇가지요인에관한구체적인결과를제시하였고, 이러한결과는향후매화마름의증식및보전전략개발에중요한기초자료로제공될것이다. 사사 본논문은환경부국립낙동강생물자원관 2017 년 담수생물다양성보전 관리기반구축 사업의지원을받아수행되었습니다. References Bae KH., Yoon ES, Yun PY, Choi YE (2010) Soil acclimatization of Calanthe discolor throught multiple shoot formation from tissue culture, Kor. J. Plant Res. 23(1):7-13 Bae KH, Yoo JA, Yoon ES (2005) Effect of growth regulators of plant regeneration from Rhodiola sachalinensis leaf segments, Kor. J. Plant Res. 18: Cho WJ, Park HB, Choi EG (1999) Effects of growth regulators and sucrose on plant differentiation and bulblet formation of Lilium cernum Komarov. Bulletin of the Agricultural College, Chonbuk National University. 30:22-32 Dumas E, Monteuuis O (1995) In vitro rooting of micropropagated shoots from juvenile and mature Pinus pinaster explants influence of activated charcoal. Plant Cell Tiss Org Cult 40: Eymar E, Alegre J, Toribio M, Lopez-vela D (2000) Effect of activated charcoal and 6-benzyladenine on in vitro nitrogen uptake by Lagerstroemia indica. Plant Cell Tiss Org Cult 63:57-65 Gabriela F, Carlos T, Carlos O, Yves D, Jorge MS (2005) Exogenous sucrose can decrease in vitro photosynthesis but improve field survival and growth of coconut (Cocos nucifera L.) in vitro plantlets. In Vitro Cell Devel Biol 41:69-76 Lee JS, Choi BH (2006) Distribution and red data of wild orchids in the Korean Peninsula. Kor. J. Plant Taxon 36: Lee, TB (1984) Outline of Korean endemic plants and their distribution. Kor. J. Plant Taxon 14:21-32 Lee, WT (1996) Lineamenta Florae Koreae. Academy Press, Seoul Lee, YN (2006) Flora of Korea. Gyohaksa, Seoul Magdalena, K, Anna B (2005) Morphogenesis of Lilium martagon L. explants in callus culture. Acta Biol Craco Series Bot 47:65-73 Min, SR, Liu JR, Kim SW (2007) Plant regeneration from zygotic embryo-derived embryogenic cell suspension cultures of Ranunculus kazusensis. Plant Biotechnol Rep. 1:57-60 Murashige, T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: Lu, CY (1993) The use of thidiazuron in tissue culture. In Vitro Cellular and Developmental Biology. 29:92-96 Ryu, J. H., Doo, H.S., and Kwon, T. H Induction of haploid plants by anther culture in sesame (Sesaum indicum L.). Kor. J. Plant Biotech. 19: Seo, JN, Kim HY, Lee SG, Kang HD (2009) Effects of plant growth regulators on bulbets regeneration of Liliem cernum K. Journal of Agriculture and Life Science. 43:29-33 Short, KC, Torrey JG (1972) Cytokinins in seedling roots of pea. Plant Physiology. 49: Takayama S, Misawa M (1979) Differentiation in Lilium bulbscales grown in vitro: Effect of various cultural conditions. Physi Planta 46: