: S V 4 0 T A m p h o t r o p ic R e t r o v ir u s, *, *, 1),,, (dedifferen tiation ) 2). (ex tracellu lar m atrix ) (horm on ally defin ed

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1 : S V 4 0 T A m p h o t r o p ic R e t r o v ir u s, *, *, 1),,, (dedifferen tiation ) 2). (ex tracellu lar m atrix ) (horm on ally defin ed m edia) 3) 4),.. 5), 6).. (tran sform ation ) T GF - 7, 8),. (33 ), (37-39 ). SV40 T 1998, (retrov irus ) 9). S V 40 T 10),., 11). S V 40 T am - ph otropic retrov irus, 12). 1. P s i-2 S V 40 T n eom y cin phos photran s feras e am ph otropic recom bin an t retrov iru s ps i- 2 (, A lb ert E in s tein Roy - Chow dhu ry ). 37, 10% (bov in e s erum ) 1% - M E M 80% (s ub confluen t), m

2 By u n g - H o K im, et a l : C on dition a l im m or t a liza t ion of h u m a n fet a l h epa t oc y t es us in g a n a m ph otr opic r et r ov ir u s en c odin g t em per a t u re - s e n s it iv e S V 40 la r g e T a n t ig e n collag en as e 13) g (phos ph ate bu ffered s alin e, P BS ) g u ag e (3 ), calciu m free Leffert (10 m M H E P E S, 3 m M K Cl, 130 m M N acl, 1 m M N ah P O4.H 2O, 1 m M D- g lu cose, 5 m M E GT A, ph 7.4) 20 m L 4, collag en as e (10 m M H E P E S, 3 m M K Cl, 130 m M N acl, 1 m M N ah P O4.H 2O, 1 m M D- g lu cos e, 1.9 m M CaCl2, 0.5 m g / m l collag en as e- D, Boehrin g er- M an h eim, In dian apolis, U S A ) oC. 70%, (10 m M H E P E S, 3 m M K Cl, 130 m M N acl, 1 m M N ah P O4.H 2O, 1 m M D- g lucos e, 1.9 m M CaCl2) 100 m m esh, 50 g m L, try pan blue. 6 cm (P rim aria plate, F alcon, U S A ) 0.8x % (feta l ca lf s eru m ), 0.1%, 0.2% N a H C O 3, 10-8 M in s u lin 1% D M E M / H A M F 12 37oC, 95% a ir/ 5% C O 2 6. (10-2 lactic acid, 1 m M g lutam in e, 10-8 M in s u lin, 10-6 M dex am eth as on e, 10-8 M T 3, m ix ture of lin oleic acid, albu m in an d selen ic acid). 20 n g / m L h epatocy te g row th factor (H GF, S ig m a Ch em ical Co., U S A ) 24, m L poly b ren e (8 g / m L) 4, H GF 33oC. (lactic acid, 20 m M g lu cos e ), 4% 1% DM E M / H A M F 12, 4 G418 (400 g / m L). 2, (colon y ) clon in g cy lin der. 10 cm (confluen t) 1:2 1: , T. 10 cm 5x oC 1-3 (pop u la tion dou blin g tim e). 39oC. T p53 (W es tern blot) P BS, - 80oC., 20 g S DS - poly acry lam ide g el(t 7.5% ; p53, 10% ), poly v in y liden e difluoride m em b ran e (M illipore Corp., U S A ) (m ous e an ti- S V 40 larg e T an tig en, m ou s e an ti- p53 m onoclonal an tibody, On cog en e Res earch P rodu cts, U S A, 500 ) perox idas e (perox idas e- conjug ated

3 : s heep an ti- m ou s e Ig G an tibody, A m ers ham, E n g lan d, 3000 ), (Lu m iglotm K it, K irkeg aard & P erry Lab., U S A ). T p53 COS 7, A 431 H ep G2, K A T O III. 5. colcem id (10 g / m L) 3, M K Cl 3, (m ethan ol, acetic acid, 3:1). 2-3 Giem sa, (,, ) (alph a- fetoprotein, A F P ), (urea). 60 m m (P rim aria plate, F alcon, U S A ) 5 x % air/ 5% CO2, 33 ( ), 33oC 39oC., Ch ee (Gib co BRL, US A ), tran s - ferrin (6.25 g / m L), dex am eth as on e (1 M ), (6.25 g / m L), s eleniu m (6.25 n g / m L) 3)., 1.2 x com petitiv e inh ibition E LIS A 14). (0.05 m ol / L carbon ate/ bicarb on ate b uffer, ph 9.6, S ig m a) E LIS A w ell 25 n g 4 P BS - T w een (0.05% T w een 20, 0.2% bov in e s eru m alb um in ). ( ) ( ) (g oat anti- hu m an albu m in an tibody, 2000, ICN ph arm aceutical, U S A ) 4, E LIS A 100 L w ell perox idas e (perox idas e con ju g ated rab bit an ti- g oat Ig G an tibody, 10,000, ICN ph arm aceu ticals ) 100 L 1. o- ph en y - len ediam in e (0.04% in ph osphate carbon ate b uffer, 0.06% H 2O2, S ig m a) 50 L 30 1M H 2S O4, 492 n m, 24. (A F P ) kit (Gen edia A F P E IA, K orea Green Cros s Corp.) E LIS A, A F P. 24. S ig m a U rea K it (N o B). 10 m M am m on iu m chloride 2. am m on iu m ch loride. diacety l m on ox im e, n m (te lo m e ra s e ) (te lo m e re ) T RA P (telom eras e repeat am plification protocol)15) k it (T RA P ezetm, On cor In c., U S A ). s ub s trate olig on ucleotide T S T 4 poly - n ucelotide k inas e 32P - A T P. (CH A P S b uffer, 100 L/ 106 cells ) 2 g T S. T S T T A GGG 6,

4 김병호 외 9인 : S V 40 T 항원의 온도조건부 변이형 유전자가 포함된 A m ph ot r opic R et r ov ir us 에 의한 사람 태아 간세포의 불멸화 (tem p la te)으로 양 말단의 시발체를 이용하여 중합효소 성 성장(a n ch or ag e in d epen d en t g r ow th )을 s oft a g a r 연쇄반응(P C R )을 12.5% 의 a s s a y 로 시행하였다. 먼저 60 m m 페트리 접시에 0.6% poly a cr y la m id e g el에서 전기 영동한 후 건조시킨 다음, 시행하였다. 중폭산물은 s oft a g a r 배양액(4% 우태아 혈청, 1% 항생제, 0.2 μ 자가방사기록을 시행하였다. 이때 사용하는 대조는, 정 m ol/ L d ex a m eth a s on e)을 분주하여 굳힌 후, 그 위에 상 상 태아 간세포, 검체를 가열하여 텔로머라제를 불활성 기 조건의 0.3% s oft a g ar 배양액에 각각 5 x 104의 불멸 화 한 것, 세포내 T a q 중합효소 억제물질의 존재를 확인 화 간세포를 섞어 분주하여 33oC 에서 약 3주 간 배양하 하는 P CR 대조( in t er n al con t rol, 36 b a s e p air s ), K A T O 였다. 세포분주 후 주 2회 0.3% s oft a g ar 배양액을 첨가 III 세포주를 이용한 양성 대조, P C R 유사 산물이나 오 하면서 육안적인 세포군락(지름 100 μm )의 발생을 관 염 여부를 알기 위하여 세포 추출물을 첨가하지 않은 오 찰하였으며, 양성 대조는 간암 세포주인 H ep G2를 사용 염 대조(p r im er - d im er / P C R con t am in a tion con t rol) 등 하기로 하였다. 을 동시에 시행하였다. 9. 통계 텔로미어 길이는 상품화 k it ( T h e T elom er e L en g th A s s a y K it, P h a rm in g en, C A, U S A )를 이용하였다. 방법 모든 수치는 평균±표준편차로 표기하였으며, 통계는 을 요약하면, 세포로부터 D N A 를 추출하여 H in fi 및 S tu d en t s t - tes t를 이용하였고 p 값 0.05 미만을 유의수 R s ai 제한효소로 처리함으로써 텔로미어를 포함한 T R F 준으로 하였다. (ter m in al r es t riction fra g m en t )를 생성시켰다. 이어서 결 과 0.6% 한천겔 전기영동을 시행하여 막 전이를 시행한 후, b iotin 이 표지된 텔로미어 소식자로 S ou th ern b lot을 시 행하였다. 이 막을 1. 불멸화 확률 ( h or s er a d is h 태아 절제간으로부터 분리된 간세포수는 6x 107개였으 per ox id a s e)를 이용하여 화학발광시켜 방사기록하였다. 며, 세포 생존율은 90% 였다. 이중 clon in g cy lin der를 이 대조를 위하여 정상 태아 간세포, H L 60 세포주(3.3 용하여 확대 배양이 가능한 정도의 세포군락은 36개가 발 k ilob a s e, k b ) 및 293 세포주(11.3 k b )를 사용하였다. 생함으로써 불멸화 확률은 6x 10-7이었으나, 25세대 이상 s tr ep ta v id in - H R P 계대 배양이 가능하였던 경우는 2가지로 최종 확률은 8. 암성 변화의 관찰 3.3x 10-8이었다. 본 연구에서는 이 두가지 불멸화 세포주 (C 11, D21)를 대상으로 세포의 성격을 분석하기로 하였 암성변화를 보기위한 간접적인 방법으로 부착 비의존 다. 일부 분석에서는 C11은 60회(C 11-60) 및 80회(C11F ig. 1. T h e m or ph olog y of t w o fet a l im m or t a lize d h e pa t oc y t es lin e s (C 11 a n d D 21). T h e ce lls s h ow t h e p oly g on a l s h a pe w ith c en t ra l loc a t ion of a n u cle u s a n d a b u n d a n t cy t opla s m, w h ic h s u g g es t th at th ey orig ina ted from ep it h e lia l c ells. P ic t u r e a a n d b a r e th e ce lls of C 11 w h ich d iv id ed a r ou n d 60 ( a, C 11-60) a n d 80 t im e s (b, C 11-80) r es p ec tiv e ly. H ow e v er, t h e m or p h olog y of D 21 w a s c h a n g ed w it h p a s s a g e, t h a t is, D ( c) w h ic h d iv id ed a r ou n d 30 tim es a n d w a s in com p let ely im m or t a liz ed, look lik e fib r ob la s t. A ft er m or e th a n 60 t im es of div is ion a nd com plet e im m or t a liz a t ion, D ( d ) g a in e d t h e m or p h olog y of ep ithelial cells ( p h a s e c o n t r a s t m ic r o s c o p y, 100)

5 K ore a n J ou rn a l of M e dic in e : V ol. 57, N o. 1, ) 분열한 세포와 D21은 30회(D21-30) 및 60회(D21-80) 분열한 세포 등 4가지를 사용하였는데, D21-30은 증식이 매우 느리고 상당수의 세포가 증식과정 중 사망하여 완전 히 불멸화에 도달하지 못한 것으로 생각하였다. 2. 세포 형태 및 증식 양상 불멸화 간세포의 핵은 세포 중앙에 위치하였고 세포 질은 풍부하였으며 다각형 형태를 취하고 있어 상피 유 래 세포로 추정할 수 있었다( F ig. 1). 그러나 완전 불멸 화에 도달하지 못한 것으로 추정되는 D 세포는 전 술한 형태를 보이기는 하였으나 상당수가 섬유아세포와 같은 방추형 형태를 나타내어 D 21-60과 동일 세포 유래 임에도 불구하고 형태학적 차이를 보였다. 세포 증식은 C11-80과 D 21-60의 두가지 세포주 모두 허용온도에서는 증가하였고 비허용온도에서는 세포 사 망이 일어나면서 감소하는 양상을 보여 온도조건부 기 능이 유지됨을 알 수 있었다. 그러나 집단 배가 시간은 F ig. 3. T h e ex pr es s ion of S V 40 T a n tig en a n d p 53. T a n t ig e n d is a pp ea r ed a t 39 in b oth c ell lin e s, b u t t h e le v el of ex pr e s s ion in cr ea s ed a cc ord in g t h e c ell' s d iv is ion n u m b er. It is th e h ig h t es t in C 11-80, m od e ra t e in C a n d D 21-60, a n d t h e low e s t in D ( u p pe r pa n e l). T h e pa t te r n of p 53 ex p r es s ion look s s im ila r to th a t of T a n t ig e n (low er p a n el). L a n e 1, p os it iv e c on t r ol, C O S for T a n tig en a n d A 431 for p 53; 2, n eg a t iv e con tr ol, H ep G 2 for T a n t ig en a n d K A T O III for p53; 3 a n d 4, C 11-60; 5 a n d 6, C 11-80; 7 a n d 8, D 21-30; 9 a n d 10, D 21-60; la n e 3, 5, 7 a n d 9, c u lt u r e d a t 33 ; la n e 4, 6, 8 a n d 10, c u lt u r ed a t 39. C11이 35시간이었고 D 21은 40시간으로 약간의 차이를 다 1.8배 정도 증가되어 있었으며, D 21-60은 불멸화에 보였다( F ig. 2). 도달하지 못하였다고 생각되는 D 21-30보다 3.3배 정도 증가되어 있었다(F ig. 3, 윗쪽). p53도 T 항원 발현과 유사한 양상을 보였는데, 이러한 결과는 허용온도에서 발현된 T 항원이 p53과 결합하기 때문에 웨스턴 블롯에서 나타나지만 세포 내에서는 p53 작용이 억제된 상태이며, 비허용온도에서는 T 항원이 불 활성됨으로써 유리된 p 53이 짧은 반감기를 갖는 정상 상 태로 존재하기 때문에 검출되지 않은 것처럼 보인 결과 로 생각된다(F ig. 3, 아랫쪽). 4. 염색체 변화 염색체 수는 두 세포주 모두에서 30개 이하부터 100 F ig. 2. T h e g r ow t h r a t e of th e ce ll lin es. T h e c ells of C a n d D pr olifer a t e d r a p id ly a t 33oC, b u t s t op pe d g r ow in g a t 39oC w h ic h s u g g es t t h a t t h e y m a in ta in th e t em p er a tu re - s e n s itiv it y. P op u la tion d ou b lin g tim e w a s 35 a n d 40 h ou rs r es p ec tiv e ly. 개 이상까지 다양한 분포를 보이고 있었으며 정상 염색 체 수를 유지하는 경우는 드물어 불멸화 과정에서 상당 한 손상을 받은 것으로 생각되었다(F ig. 4). 또한 형태에 있어서도 정상이라고 할만한 염색체는 거의 찾아볼 수 없었고 대부분의 염색체가 중심절( cen tr om ere) 주위로 3. T항원 나뉘어져 염색체 수가 증가하는 동시에 전위( tr an s lot 항원은 두가지 세포주 모두 허용온도에서만 발현되 ca tion )등의 변화가 추가되는 양상을 보였다. 또한 쥐 염 고 비허용온도에서 불활성되어 온도조건부 기능이 유지 색체 모양과 같은 단부착사형(a cr ocen tr ic)으로의 변화 됨을 알 수 있었고, 발현 정도는 세포의 분열 횟수에 비 가 많이 일어났으며 염색체의 일부가 작게 분절되는 경 례하여 증가하는 양상을 보였다. 즉 C 11-80은 C 11-60보 우도 많아서(d ou b le m in u t e ch a n g e) 염색체 손상의 정

6 By u n g - H o K im, et a l : C on dition a l im m or t a liza t ion of h u m a n fet a l h epa t oc y t es us in g a n a m ph otr opic r et r ov ir u s en c odin g t em per a t u re - s e n s it iv e S V 40 la r g e T a n t ig e n F ig. 4. T h e d is tr ib u t ion of c h r om os om e n u m b er. T h e cou n t of ch r om os om es a r e dis t rib u t ed r a n d om ly fr om low t o h ig h n u m b er in b ot h ce ll lin es, C a n d D S om e of t h em h a v e m ore th a n 100 ch r om os om es. F ig. 5. T h e c h r om os om a l a b e r ra t ion s of t h e c ell lin es, C a n d D N or m a l look in g ch rom os om es a r e ra r e a n d t h e ch rom os om e n u m b er in c r ea s e d p os s ib ly d u e t o d ele t ion s a r ou n d t h e c en tr om er e, to w h ich v a r iou s t ra n s loc a t ion s w e r e a d d ed. M a n y c h r om os om e s s h ow a cr oce n t r ic a n d d ou b le m in u te c h a n g e s (G ie m s a s t a in, x 300). 도를 심함을 알 수 있었다(F ig. 5). 그러나 완전 불멸화 는 검출되지 않았다. 불멸화 간세포에서 C 11-60은 비허 에 도달하지 못하였던 D 21-30은 일부 변화를 제외하고 용온도에서 배양하였을 때 1.1±0.4 μg / 24h / 106cells 로 는 수 및 모양이 대부분 정상이었다. 정상 간세포의 1/ 10 수준이었으며 C11-80은 0.9±0.2 μ g / 24h / 106cells 로 약간 더 감소되었다. D 21-30은 2.2± 5. 간세포 분화능 (Ta b le 1 ) 0.5 μg / 24h / 106cells 로 정상 간세포의 1/ 5 수준이었으며 정상 태아 간세포의 알부민 분비는 배양 2일째 및 4 D 21-60은 1.0±0.3 μg / 24h / 106cells 로 계대 배양에 따라 일째에 각각 10.3±1.1 μg / 24h / 106cells, 5.9±1.5 μ 알부민 분비가 감소되는 양상을 보였다. g / 24h / 106cells 였으며, 이후 급격히 감소하여 배양 7일째 A F P 은 불멸화 간세포주에서는 분비되지 않았으며, 에 1.1±1.5 μg / 24h / 106cells 정도 검출되었으나 2주째에 대조로 사용하였던 정상 태아 간세포에서 배양 2일째

7 대한내과학회지 : 제 57 권 제 1 호 통권 제 467 호 1999 T a b le 1. A lb u m in a n d A F P s e c re t io n, u re a s y n th e s is f ro m a m m o n iu m c h lo rid e in im m o rt a liz e d h e pa to c y t e s A lb u m in AFP* U r ea ( μ g / 24h / 106 c e lls ) ( μ g / 2 4h / 10 6 c e lls ) ( μ g / h / 106 c e lls ) 10.3± ± ± 4.8 P r im a r y fe t a l h e p a t o c y t e s 2n d d a y c u lt u r e Im m o r t a liz e d h e p a t o c y t e s C ± 0.4 UD 0.5± 4.8 C ± 0.2 UD 1.1± 0.3 D ± 0.5 UD 1.8± 0.3 D ± 0.3 UD 1.6± 0.2 P r im a r y h e p a t o c y t e s w e r e c u lt u r e d a t 37 oc a n d im m o r t a liz e d h e p a t o c y t e s w e r e c u lt u r e d a t 39oC fo r 2 d a y s. C m e a n s a fe t a l im m or t a liz e d h e p a t o c y t e lin e C 11 w h ic h d iv id e d a o u r n d 60 t im e s, a n d s o o n. *A F P, a lp h a - fe t o p r ot e in ; U D, u n d e t e c t a b le. 2.9±0.2 μg / 24h / 106cells 였으나 4일째 0.7±0.2 μg / 24h 텔로미어 길이는 정상 태아 간세포가 6-23 k b 의 분포 / 106cells 로 급격히 감소하였으며 배양 14일째는 거의 분 를 보이면서 평균 15 k b 정도의 길이를 나타내었다. 그 비가 중단되었다. 러나 C 및 C11-80은 대부분 10 k b 이상이었고 평 요소 생산은 정상 간세포가 배양 2일 째 15.9±4.8 μ 균도 20 k b 를 상회하였다. 또한 D 21-60은 C 11과 유사한 g / h / 106cells 였으나 배양 4일째부터는 거의 검출되지 않 길이로 나타났으나, 불멸화에 도달하지 못하였다고 생각 을 정도로 감소하였다. 불멸화 간세포는 모두 μ 한 D 21-30은 4-10 k b 의 분포를 보이면서 평균 7 k b 내 g / h / 106cells 의 범위에서 검출되었으나 본 검사의 측정 외로 짧아져 있었다(F ig. 7). 하한치 이하에서 검출된 양으로 매우 낮은 상태였다. 7. 암성 변화 6. 텔로머라제 활성도 및 텔로미어 길이의 변화 S oft ag a r as s a y 에서 양성 대조를 위하여 사용한 H ep 텔로머라제는 C 세포 및 D 세포 모두 발 G 2 세포는, 0.72±0.07% 의 육안적 세포군락이 발생하였 현되었는데, 전자가 후자보다 5배 정도 강하게 발현되어 으나, 불멸화 간세포주에서는 모두 발생하지 않았다. 있었다. 그러나 불멸화에 도달하지 못한 것으로 생각하 고 였던 D 세포는 거의 텔로머라제가 발현되지 않았 안 다. 본 연구에서 대조로 사용하였던 정상 태아 간세포는 일반적으로 생쥐 세포의 자연 불멸화는 1x 10-5 빈도 텔로머라제가 강하게 발현되었는데, 이는 상당수의 조혈 로 나타나지만 사람은 1x 10-9 정도로 거의 나타나지 않 모세포가 포함되었기 때문으로 생각되었다( F ig. 6). 는 것으로 알려져 있다16). D N A 바이러스 암유전자를 이 F ig. 6. T e lom er a s e a ct iv ity of th e c e ll lin e s. C a n d D s h ow t elom e ra s e a c t iv ity, b u t th e lev e l of it s a c tiv it y is h ig h er in C th a n in D H ow ev er, t h er e is n o a ct iv it y in D w h ic h w a s t h ou g h t t o b e in com p ele te ly im m or t a liz ed. La n e 1 t o 5 re pr e s e n t p r im er - d im er / P C R con ta m in a t ion con t rol, T S R 8 con t r ol for t h e m e a s u r em en t of th e a m tou n t of t elom e r a s e, h ea te d a n d n on - h ea te d b iolog ic pos itiv e con tr ols ( K A T O III ce lls ), a n d p rim a r y fet a l h e pa toc y te s ; 6 t o 8, C 11-80; 9 t o 11, D 21-60; 12 t o 14, D 21-30; 15, p r im er - d im er c on t r ol; la n e 6, 9 a n d 12, n o d ilt u t ion of p r ot ein ; la n e 7, 10 a n d 13, 5 t im e s dilu tion ; la n e 8, 11 a n d 14, 25 tim es d ilu t ion

8 김병호 외 9인 : S V 40 T 항원의 온도조건부 변이형 유전자가 포함된 A m ph ot r opic R et r ov ir us 에 의한 사람 태아 간세포의 불멸화 부 변이형을 사용함으로써 가능할 수 있다9). 이론적으로 변이형 유전자에서 생산된 형질전환 단백은 에 서 불활성되기 때문에 암성 변화의 가능성이 적으며, 실 제로 본 연구자 등은 쥐의 온도조건부 불멸화 간세포를 200회 이상 분열시킨 후에도 부착 비의존성 성장이 발생 하지 않았음을 보고한 바 있다18). 본 연구에서 확립한 사 람 태아 불멸화 간세포주도 최소한 50회 이상 분열시킨 상태였는데, 부착 비의존성 성장 양상을 보이지 않아 암 성 변화의 가능성이 적을 것으로 생각되었다. 아울러 본 연구에서 확립된 세포주는 허용온도에서 T 항원이 발현 되면서 세포증식이 활발하고 비허용온도에서는 T 항원 F ig. 7. T elom e re le n g th of th e c ell lin es. It is a r ou n d 15 k b in p rim a r y fe ta l h ep a toc y te s, b u t a r ou n d 20 k b in im m or ta lized ce ll lin es. H ow e v er, it d ec r ea s ed a lot d ow n to a r ou n d 7 k b in D w h ic h w a s th ou g h t t o b e in c om ple te ly im m or ta lized. L a n e 1 a n d 2, D N A m a r k e rs ; 3 a n d 4, h ig h (19.3 k b ) a n d low ( 11.3 k b ) h u m a n te lom er e c on t r ols ; 5, h u m a n fe ta l h ep a t ocy t es ( 6 t o 23 k b ); 6 a n d 7, C a n d C ( 10 t o 23 k b ); 8, D (4 t o 15 k b ); 9, D (10 to 23 k b ). 발현 및 증식이 멈추어 온도조건부 기능이 유지되었다. 이와같은 온도조건부 변이형 S V 40 T 항원에 의한 사람 간세포의 불멸화는 국내외적으로 첫 번째 보고인 것으 로 생각된다. 본 온도조건부 불멸화 세포주는 T 항원 발현을 외부 에서 임의로 조절할 수 있으므로 T 항원의 작용을 배제 입하면 그 확률은 100배 정도 증가하는데, 사람 간세포 하여 연구에 이용할 수 있다는 장점이 있다. 즉 허용온 의 불멸화에 대한 보고는 매우 드물다7, 17). 본 연구에서 도에서 세포를 증식시키고, 생체외 실험은 비허용온도인 의 불멸화 확률은 3.3x 10-8으로 다소 낮았다. 그러나 이 37 에서 T 항원을 불활성시켜 보다 생체계와 유사한 조 전의 보고는 주로 섬유아세포와 같이 배양에서 분열이 건에서 시행할 수 있다. 또한 간부전 치료 방법으로서 가능한세포를 이용한 결과이며, 간세포와 같이 배양에서 최근 활발히 연구되고 있는 인공간에 사용하는 정상 간 분열되지 않는 세포를 이용한 결과는 아니었다. 본 연구 세포의 대용으로도 이용될 가능성이 있는데, 이를 위하 에서는 20주령의 태아 간을 사용하였는데, 태아 간은 임 여는 간세포 분화능이 잘 유지되어야 한다. 본 불멸화 신 12주가 지나면서 간기능이 발현되기 시작하며 분열 간세포주의 알부민 분비는 정상 태아 간세포의 1/ 5-1/ 10 잠재력이 높아 레트로바이러스의 염색체 내 결합이 가 수준이었으며, 요소 생산은 약간 검출되기는 하였으나 능하고, 배양시 H G F 를 사용하여 결합 능률을 더욱 향상 측정 한계치 이하로 매우 낮은 상태였다. 이러한 결과는 시킴으로써 불멸화 가능성이 높을 것으로 기대되었기 본 세포주가 간세포에서 불멸되었음을 시사하지만, 분화 때문이다. 능 정도는 정상에 비하여 매우 낮은 것으로 생각되었다. 영장류, 특히 사람 세포에서 불멸화가 잘 일어나지 않 한편 A F P 은 태아 혈장의 정상 단백으로서 임신 6주 는 기전에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다. 추정되는 이후에 나타나서 12-16주에 최고치에 이르며 태생 후 기전으로는 생쥐나 쥐에 존재하는 텔로머라제가 사람의 수주 내에 사라지게 된다. 본 연구에서는 임신 20주의 정상 조직 내에는 거의 발견되지 않으며, 설치류에 없는 태아 간을 사용하였는데, 배양 2일째 3 μg / 24h / 106cells 암발생 억제유전자( tu m or s u pp res s or g en e)가 존재한다 정도로 분비되었으며 이후 급격히 감소하여 2주째에는 는 점이 불멸화에 대한 저항성을 나타낼 수 있다는 것이 분비가 중단되었다. 알부민 분비가 배양시간에 따라 감 다11). 소하는 것은 탈분화의 결과로 생각된다2). 그러나 태아 현재까지 보고된 사람 간세포의 불멸화는 야생형 간세포가 불멸된 후 A F P 이 생산되지 않는 기전은 탈분 S V 40 T 항원을 이용한 것들이었다7, 17). 야생형 T 항원을 화와는 다를 것으로 추정되는데, 이는 알부민이 낮기는 이용하여 확립된 동물의 불멸화 간세포주들은 계대 배 하지만 지속적으로 분비되고 있기 때문이다. 따라서 불 양이 증가함에 따라 암세포로의 형질전환이 일어났다고 멸화 후의 태아 간세포는 정상 성인 간세포로 분화되어 한다5). 암성 변화를 피할 수 있는 방법으로는 온도조건 A F P 분비는 중단되는 반면에 알부민 생산은 유지되는

9 K ore a n Jou rn a l of M e dic in e : V ol. 57, N o. 1, 1999., ,, ). S V 40 T 20-30, T p53 prb 20). 2 16),. T, 21).,. 18). T 6x ,.,,. (D21-30),,.,. ( ) (s tem cell) 22). ( ),. S V 40 T.. 80,.... :,.,. : 20 S V 40 T, 25., (33 ) (37-39 ), T p53.,,,. s oft

10 By u n g - H o K im, et a l : C on dition a l im m or t a liza t ion of h u m a n fet a l h epa t oc y t es us in g a n a m ph otr opic r et r ov ir u s en c odin g t em per a t u re - s e n s it iv e S V 40 la r g e T a n t ig e n ag ar as say. : 6 2 (C11, D21) 3.3x C11 60 (C11-60) 80 (C11-80), D21 30 (D21-30) 60 (D21-60), D21-30,. C11. D21-30, D ( ; C11-80, 35 ; D21-60, 40 ), T., D / 10. D / 5.., D D21-30,. S oft ag ar as s ay. : S V 40 T., T..,, am photropic retrov irus A lbert E in s tein (, ) Roy - Ch ow dh ury. = A b s t r a c t = C o n d i t io n a l im m o rt a l i z a t io n o f h u m a n f e t a l h e p a t o c y t e s u s in g a n a m p h o t ro p i c re t ro v i ru s e n c o di n g t e m p e ra t u re - s e n s i t iv e S V 4 0 la rg e T a n t ig e n B y u n g - H o K im, M.D., S e - R a S e on g J a e - K y u n g P a r k, M.S., S e u n g - B o K im, M.D.* S a n g - M o k L e e, M.D., S e ok - H o D on g, M.D. H y o- J on g K im, M.D. Y o u n g - W oon C h a n g, M.D. J e on g - Il L e e, M.D. an d R in C h a n g, M.D. D e p artm e nts of I nte rnal M e d icine, O bste trics and Gy ne colog y * and G e ne ral S urg e ry, K y ung H e e U niv e rsity Colle g e of M e d icine, S e oul, K ore a B a ckg ro und : H u m a n cells are alm os t nev er spontan eous ly im m orta lized in v itro. W e tried to im m ortalize hu m an feta l h epatocy tes (h- F H ) a n d ev alua te th e differentia tion al s tatus a nd its ch an g e. M ethods : H epa tocy tes w ere is olated from a liv er fra g m en t of 20 w eek old fetu s a nd infected w ith a m - photropic recombinant retrovirus containing a tem peratures en sitiv e m utan t of S V 40 la rg e T an tig en an d neom y cin phosphotra ns fera se g en e. G418 res ista nt colonies w ere clon ed an d ex pan ded. T he cells w h ich w ere a ble to div ide m ore th an 30 tim es w ere us ed to a n aly ze v a riou s function s. Re s ults : T he im m orta liza tion ra te w a s 3.3 x 10-8 a n d tw o cell lin es (C11, D 21) w ere es tablis hed. C11-60, C11-80, D21-30 an d D21-60 (su ffix n um ber m ea ns th e cell div is ion counts ) w ere ev alu ated. D w a s thoug t to be im com pletely im m orta lized becau se a cons idera ble portion of cells died during cu ltu re. T he m orph olog y w a s s im ilar to tha t of epithelia l cells ex cept for D21-30 w hich looked like fib robla st. T he cells g rew ra pidly a t 33oC bu t s topped g row ing at 39oC. T a ntig en a nd p53 w a s ex press ed at 33oC but dis a ppea red a t 39oC, w hich sug g est tha t T a ntig en bin ds to p53. Ch rom os om a l cha ng es w ere s o m arked tha t it w as im pos sib le to dis crim in ate ex a ct nu m ber. A lbum in w a s s ecreted as a bout 1/ 10 a s th at of h- F H, but alpha - fetoprotein s ecretion s topped a fter

11 : im m orta liza tion. T elom era se w a s a ctiv a ted in both cell lines ex cept for th e incom pletely im m orta lized cells D T elom ere w a s elon g a ted in com petely im m o- rta lized cell lines, but it w a s rather s hortened in D21-30 com pa red to tha t of h- F H. M a croscopic colon ies did n ot dev elop in soft ag ar a s sa y. Con clus ion s : W e su ccess fu lly im m orta lized hum an feta l hepa tocy tes. A lthoug h th e cells a re not likely to ha v e oncog en icity, the fun ctions a re not s o g ood, poss ibly due to m arked chrom osom a l ch an g es w hich are thou g ht to occu r before telom era s e is a ctiv a ted during im m orta liza tion s tep. Key Words : Fetal hepatocytes, Condtional im m orta lization, S V 40 la rg e T a ntig en, A m ph o- tropic retrov irus, T elom era s e, T elom ere R E F E R E N C E S 1) Bis s ell DM, H am m ak er LE, M ey er U A : P are nchy m al ce lls from ad u lt liv e r in nonp rolife rating m onolay e r culture. J C e ll B iol 59:722, ) Clay ton DF, Darn ell JE Jr: C hang e s in liv e r- sp e cific com p are d to com m on g e ne transcription du ring p rim ary cu lture of m ouse he p atocy te s. M ol Ce ll B iol 3:1552, ) W ax m an DJ, M orris sey JJ, N aik S, Jau reg u i H O: P he nobarbital ind uction of cy tochrom e s P B ioche m J 271:113, ) Gug uen - Guillouzo C, Clem ent B, Baffet G, Bea um ont C, M orel- Chan y E, Glais e D, Guillouzo A : M ainte nance and re v e rsibility of activ e album in se cre tion by ad ult rat he p atocyte s co- cultu re d w ith anothe r liv e r e p ithe lial ce ll ty p e. E xp C e ll R e s 143:47, ) W oodw orth CD, K reider JW, M en g el L, M iller T, M en g Y, Isom H C: T um orig e nicity of sim ian v irus 40- he p atocy te ce ll line s: e ffe ct of in v itro and in v iv o p assag e on e x pre ssion of liv e r- sp e cific g e ne s and oncog e ne s. M ol C e ll B iol 8:4492, ) Clay ton DF, W eis s M, Darn ell JE Jr: L iv e r- s pe cific R N A m e tabolism in he p atom a ce lls: v ariations in transcrip tion rate s and m R N A le v e ls. C e ll B iol 5:2633, ),,,, : S V 40 larg e T. 46:450, ) W u JC, M erlin o G, F au sto N : E stablishm e nt and characte riz ation of d iffe re ntiate d, nontransform e d he patocy te ce ll ine s de riv e d from m ice transg e nic for transform ing g row th factor-. P roc N atl A cad S ci U S A 91:674, ) Ja t P S, S ha rp P A : Ce ll line s e stablishe d by a te m p e rature - se nsitiv e sim ian v irus 40 larg e T antig e n g e ne are g rowth re stricte d at the nonp e rm issiv e te m p e rature. M ol C e ll B iol 9:1672, ),,,,,,,, :. 3:142, ) S ag er R, T a na ka K, La u C, Ebin a Y, A nis ow icz A : R e sistance of hu m an ce lls to tum orig e ne sis ind u ce d by clone d transform ing g e ne s. P roc N atl A cad S ci U S A 80:7601, ) P a g es JC, A ndreoletti M, Ben noun M, V on s C, E lch eroth J, Leh n P, H ous s in D, Cha pm an J, Bria nd P, Bena rou s R, F ran co D, W eber A : E fficie nt re trov iral- m e d iate d g e ne transfe r into p rim ary cu lture of m urine and hum an he patocy te s: e xp re s sion of the L D L re ce ptor. H u m G e ne T he r 6:21, ) S trom S C, Jirtle RL, Jon es RS, N ov icki DL, Rosenberg M R, N ov otny A, Irons G, M cla in JR, M ichalopoulos G: Isolation, culture, and transp lantation of hum an he p atocy te s. J N CI 68;772, ) K ow a lsk i- S au nders P W J, W inw ood P J, A rth ur M JP, W rig ht R: R e v e rs ible inhibition of albu m in p rod uction by rat he p atocy te s m aintaine d on a lam ininrich g e l (E ng e lbre th- H olm - S warm ) in re sp onse to se cre tory p rodu cts of K up ffe r ce lls and cy tok ine s. H e p atolog y 16:733, ) K im N W, P ia ty szek M A, P row s e K R, H a rley CB, W es t M D, H O P LC, Cov iello GM, W rig ht W E, W ein rich S L, S ha y JW : S pe cific association of hu m an te lom e rase activ ity with im m ortal ce lls and cance r. S cie nce 266:2011, ) S ta m ps A C, Gu sters on BA, O' H a re M J: A re tum ours im m ortal? E ur J C ance r 28A :1495, ) U eno T, M iy a m ura T, S aito I, M izu no K : Im m ortaliz ation of d iffe re ntiate d hum an he patocy te s by a com bination of a v iral v e ctor and collag e n g e l cu lture. H u m Ce ll 6;126, ),,,,,,, : S V 40 T ( ) 19) A lls opp RC, V aziri H, P atters on C, Goldstein S, Y oun g la i EV, F u tcher A B, Greider CW, H a rley CB: T e lom e re le ng th p re d icts re p licativ e cap acity of hum an fibroblasts. P roc N atl A cad S ci U S A 89:10114, ) Ludlow JW, D eca prio JA, H ua ng CM, Lee W H, P a ucha E, Liv ing ston DM : S V 40 larg e T antig e n binds preferentially to an underphophorylated m e m be r of the re tinoblastom a susce p tibility g e ne p rod uct

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334 退 溪 學 과 儒 敎 文 化 第 55 號 角 說 에서는 뿔이 난 말과 고양이라는 기형의 동물을 소재로 하여 당대 정치 상 황을 비판하였고, 白 黑 難 에서는 선과 악을 상징하는 색깔인 白 과 黑 이 서로 벌이 는 문답을 통하여 옳고 그름의 가치관이 전도된 현실세

334 退 溪 學 과 儒 敎 文 化 第 55 號 角 說 에서는 뿔이 난 말과 고양이라는 기형의 동물을 소재로 하여 당대 정치 상 황을 비판하였고, 白 黑 難 에서는 선과 악을 상징하는 색깔인 白 과 黑 이 서로 벌이 는 문답을 통하여 옳고 그름의 가치관이 전도된 현실세 南 坡 洪 宇 遠 의 논설류 산문 연구 禹 芝 英 *1) 차 례. 서론. 친근한 소재를 통한 공감의 확대. 문답의 서술방식을 통한 논리성의 강화. 우언의 서술방식을 통한 현실 비판. 결론 국문초록 南 坡 洪 宇 遠 은 仁 祖 에서 肅 宗 연간에 활동한 문인 관료이다. 홍우원의 문집인 南 坡 集 은 시와 상소문이 대부분의 비중을 차지하고, 記 說 序 등의 산문

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