발간등록번호 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발

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1 발간등록번호 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발

2 제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 천연물질을이용한한우수태율향상기술개발에관한연구 과제의보고 서로제출합니다 년 3 월 21 일 주관연구기관명 : 명품한우컨설팅 주관연구책임자 : 박정준 세부연구책임자 : 박정준 연 구 원 : 이선구 연 구 원 : 윤필상 연 구 원 : 유한준 연 구 원 : 김기원 협동연구기관명 : 강원대학교 협동연구책임자 : 정배동 연 구 원 : 길용범 연 구 원 : 박소연 협동연구기관명 : 대구대학교 협동연구책임자 : 구덕본 연 구 원 : 김진우 연 구 원 : 박수용 연 구 원 : 채성규 - 1 -

3 요약문 - 2 -

4 μ β β - 3 -

5 - 4 -

6 SUMMARY ( 영문요약문 ) - 5 -

7 - 6 -

8 β - 7 -

9 - 8 -

10 CONTENTS ( 영문목차 ) - 9 -

11 목 차

12 제 1 장 연구개발과제의개요및성과목표 목표 천연물질에의한한우수태율증진

13 - 12 -

14 제 2 장 국내 외연구현황

15 - 14 -

16 제 3 장 연구개발수행내용및결과

17 - 16 -

18 - 17 -

19 - 18 -

20 No. 균주명구분비고 1 Streptococcus infantarius sspcoli 자궁관류액 2 Sphingomonas paucimobilis 자궁관류액저수태우 3 Granulicatella elegans 자궁관류액 4 Enterococcus casseliflavus 자궁관류액 5 Erysopelothrix rhusiopathiae 자궁관류액저수태우 6 Staphylococcus lentus 자궁관류액 7 Bacillus lentus 자궁관류액 8 Bacillus pumilus 자궁관류액 9 Pantoea spp 자궁관류액 10 Brucella melitensis 자궁관류액 11 Serratia plymuthica 자궁관류액 12 Staphylococcus vitulinus 자궁관류액 13 Granulicatella adiacens 자궁관류액 14 Staphylococcus gallinarum 자궁관류액 15 Staphylococcus xylosus 자궁관류액 16 Staphylococcus sciuri 자궁관류액

21 17 Kocuria rosea 자궁관류액 18 Enterobactor aerogenes 자궁관류액저수태우 19 Bacillus licheniformis 자궁관류액 20 Rothia mucilaginosa 자궁관류액 21 Stenotrophomonas maltophilia 자궁관류액 22 Alloiococcus otitis 자궁관류액저수태우 23 Staphylococcus chromogenes 자궁관류액저수태우 24 Streptococcus alactolycus 자궁관류액 25 Pasteurella canis 자궁관류액 26 Paenibacillus polymyxa 자궁관류액 27 Kocuria kristinae 동결정액 28 Streptococcus uberis 동결정액 29 Pseudomonas aeruginosa 동결정액저수태우 30 Streptococcus sanguinis 동결정액 31 Staphylococcus homonis ssp hominis 동결정액 32 Pseudomonas pseudoalcaligenes 동결정액저수태우 33 Serratia marcescens 동결정액저수태우 34 Eschericha coli 동결정액저수태우 35 Bacillus sporothermodurans 동결정액저수태우 36 Oligella ureolytica 동결정액저수태우 37 Kocuria varians 동결정액 No. 균주명 Colony 특색 배양액 ph 1 Streptococcus infantarius sspcoli 특이사항없음 변화없음 2 Sphingomonas paucimobilis 특이사항없음변화없음 3 Granulicatella elegans 특이사항없음변화없음 4 Enterococcus casseliflavus 특이사항없음변화없음 5 Erysopelothrix rhusiopathiae 하얀색, 단단히굳음변화없음 6 Staphylococcus lentus 특이사항없음변화없음 7 Bacillus lentus 갈색변화없음 8 Bacillus pumilus 특이사항없음변화없음 9 Pantoea spp 특이사항없음변화없음 10 Brucella melitensis 특이사항없음변화없음 11 Serratia plymuthica 짙은하얀색변화없음 12 Staphylococcus vitulinus 노란색변화없음 13 Granulicatella adiacens 특이사항없음변화없음

22 14 Staphylococcus gallinarum 하얀색 Staphylococcus xylosus 하얀색 Staphylococcus sciuri 하얀색과노란색이뒤섞임 변화없음 17 Kocuria rosea 유백색 변화없음 18 Enterobactor aerogenes 하얀색 변화없음 19 Bacillus licheniformis 특이사항없음 변화없음 20 Rothia mucilaginosa 옅은하얀색 변화없음 21 Stenotrophomonas maltophilia 노란색과갈색이뒤섞임 변화없음 22 Alloiococcus otitis 특이사항없음 변화없음 23 Staphylococcus chromogenes 하얀색 Streptococcus alactolycus 특이사항없음 변화없음 25 Pasteurella canis 노란색과유백색 Paenibacillus polymyxa 특이사항없음 변화없음 27 Kocuria kristinae 특이사항없음 변화없음 28 Streptococcus uberis 옅은하얀색 Pseudomonas aeruginosa 검은색 Streptococcus sanguinis 옅은하얀색 Staphylococcus homonis ssp hominis 하얀색 Pseudomonas pseudoalcaligenes 특이사항없음 변화없음 33 Serratia marcescens 하얀색과노란색이뒤섞임 변화없음 34 Eschericha coli 특이사항없음 Bacillus sporothermodurans 노란색 변화없음 36 Oligella ureolytica 특이사항없음 변화없음 37 Kocuria varians 특이사항없음 변화없음 No. 균주명 생존기간 ( 일 ) 부화율 (%) 비고 1 Streptococcus infantarius sspcoli Sphingomonas paucimobilis Granulicatella elegans Enterococcus casseliflavus Erysopelothrix rhusiopathiae Staphylococcus lentus Bacillus lentus Bacillus pumilus 배양액뿌옇게변함 9 Pantoea spp 배양액뿌옇게변함 10 Brucella melitensis 배양액뿌옇게변함 11 Serratia plymuthica Staphylococcus vitulinus 4 0 배양액뿌옇게변함 13 Granulicatella adiacens Staphylococcus gallinarum Staphylococcus xylosus 배양액뿌옇게변함 16 Staphylococcus sciuri 7 50 배양액뿌옇게변함

23 17 Kocuria rosea Enterobactor aerogenes Bacillus licheniformis Rothia mucilaginosa Stenotrophomonas maltophilia Alloiococcus otitis Staphylococcus chromogenes Streptococcus alactolycus Pasteurella canis Paenibacillus polymyxa Kocuria kristinae Streptococcus uberis Pseudomonas aeruginosa 7 60 배양액뿌옇게변함 30 Streptococcus sanguinis Staphylococcus homonis ssp hominis Pseudomonas pseudoalcaligenes 2 0 배양액뿌옇게변함 33 Serratia marcescens 배양액뿌옇게변함 34 Eschericha coli Bacillus sporothermodurans Oligella ureolytica 배양액젤리화됨 37 Kocuria varians 1 0 두꺼운막형성

24 - 23 -

25 - 24 -

26 - 25 -

27 - 26 -

28 A 농 가 구분 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 Control 황백 1:100 황백 1:1,000 황백 1:10,000 누적누적누적누적암소암소암소암소수태율수태율수태율수태율 ( 두 ) ( 두 ) ( 두 ) ( 두 ) (%) (%) (%) (%) 합계 B 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 합계 C 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 합계 D 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태

29 3 회종부수태 4 회이상시도 합계 E 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 합계 A 농 가 구분 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 Control 환삼덩굴 1:100 환삼덩굴 1:1,000 환삼덩굴 1:10,000 누적누적누적누적암소암소암소암소수태율수태율수태율수태율 ( 두 ) ( 두 ) ( 두 ) ( 두 ) (%) (%) (%) (%) 합계 B 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 C 농 가 합계 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 회이상

30 시도 합계 D 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 합계 E 농 가 1 회종부수태 2 회종부수태 3 회종부수태 4 회이상시도 합계

31 Control 황백 환삼덩굴 1:100 1:1000 1: :100 1:1000 1: 회종부수태율 58.9±5.0bc 75.4±3.8 a 69.4±4.7 ab 64.5±3.5 ab 60.0±10 b 58.7±4.9 bc 51.5±5.5 c 2 회종부수태율 85.0±2.4c 97.5±1.1 a 91.8±1.7 b 89.1±1.5 b 90.0±5.0 b 82.9±3.1 d 79.9±3.8 d 3 회종부수태율 97.3±0.9ab 100.0±0 a 99.6±0.4 a 98.8±1.3 a 99.0±1.0 a 91.4±1.9 c 96.1±2.1 b

32 이식처리군 A 농가 B 농가 C 농가 1 회이식 2 회이식 1 회이식 2 회이식 1 회이식 2 회이식 1) Control 15.2±3 b 27.3±4 b 31.3±1 b 37.5±3 b 34.3±5 b 54.3±7 b 황백 1: ±7 a 36.4±2 a 20.0±2 c 60.0±3 a 61.5±7 a 73.1±2 a 환삼덩굴 1: ±4 a 33.3±3 a 44.4±1 a 44.4±7 b 40.7±4 b 55.6±8 b

33 농가구분 평균발정재귀일 평균종부회수 평균공태기간 1) Control A 농가 황백추출물 환삼덩굴추출물 Control B 농가 황백추출물 환삼덩굴추출물 Control C 농가 황백추출물 환삼덩굴추출물 Control D 농가 황백추출물 환삼덩굴추출물 Control E 농가 황백추출물 환삼덩굴추출물

34 - 33 -

35 Table 2. Identification of bacteria isolated from normal Hanwoo uterus flushing, repeat breeder cow (RBC) uterus flushing and Hanwoo semen No. Bacteria 1 Staphylococcus lentus Bacillus pumilus

36 3 Serratia plymuthica 1 4 Staphylococcus vitulinus 2 5 Bacillus licheniformis 1 6 Paenibacillus polymyxa 1 7 Enterococcus casseliflavus Kocuria rosea Sphingomonas paucimobilis Staphylococcus sciuri 1 11 Staphylococcus xylosus 1 12 Granulicatella elegans 1 13 Erysipelothrix rhusiopathiae Bacillus lentus 2 15 Streptococcus infantarius subsp. coli 1 16 Pantoea subsp Enterobacter aerogenes 1 18 Rothia mucilaginosa 1 19 Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus alactolyticus 3 21 Granulicatella adiacens 4 22 Alloiococcus otitis 1 23 Staphylococcus chromogenes 1 24 Gardnerella vaginalis 1 25 Pasteurella canis 1 26 Kocuria kristinae 2 27 Pseudomonas aeruginosa 1 28 Streptococcus sanguinis 1 29 Streptococcus uberis 3 30 Staphylococcus homonis subsp. hominis 1 31 Escherichia coli 1 32 Oligella ureolytica 1 33 Pseudomonas pseudoalcaligenes 1 34 Serratia marcescens 1 35 Bacillus sporothermodurans 1 36 Kocuria varians

37 - 36 -

38 - 37 -

39 - 38 -

40 Table 3. Antimicrobial effect of each extracts against difference bacterial strains No. Bacterial strains Diameter of clear zone(mm) Phelledendronamurense( 황백 ) Humulus japonicus( 환삼덩굴 ) Conc.(g/ml) Bacillus lentus Bacillus licheniformis Bacillus pumilus Enterococcuscasseliflavus Erysopelothrix rhusiopathiae Granulicatella elegans Kocuria kristinae Kouria rosea Paenibacillus polymyxa Pantoea spp Pseudomonas aeruginosa Serratia plymuthica Sphingomonas paucimobilis Staphylococcushomonisssphominis Staphylococcus lentus Staphylococcus sciuri Staphylococcus vitulinus Staphylococcus xylosus Streptococcus infantarius ssp coli Streptococcus sanguinis Streptococcus uberis The-, no inhibitory zone; +, <10 mm; ++, <15 mm; +++, <20 mm; ++++, <25 mm; +++++, >25 mm

41 Table 4. Antimicrobial effect of natral extracts and commercial antibiotics against difference bacterial strains isolated from normal Hanwoo uterus flushing Diameter of clear zone(mm) No. Bacterial strains Natural extracts Commercial antibiotics Phelledendronamurense Humulus japonicus Metricure Uterine Boluses 1 Streptococcus infantarius ssp. coli Sphingomonas paucimobilis Granulicatella elegans Enterococcus casseliflavus Erysopelothrix rhusiopathiae Staphylococcus lentus Bacillus lentus Bacillus pumilus Pantoea spp Paenibacillus polymyxa Serratia plymuthica Staphylococcus vitulinus Staphylococcus xylosus Staphylococcus sciuri Kocuria rosea Bacillus licheniformis Staphylococcus gallinarum The-, no inhibitory zone; +, <10 mm; ++, <15 mm; +++, <20 mm; ++++, <25 mm; +++++, >25 mm. Phelledendronamurense, Humulus japonicus, Uterine Boluses; Conc.= 1g/ml, Metricure= 25mg/ml

42 Table 5. Antimicrobial effect of natral extracts and commercial antibiotics against difference bacterial strains isolated from repeat breeder cow (RBC) uterus flushing Diameter of clear zone(mm) No. Bacterial strains Natural extracts Commercial antibiotics Phelledendronamurense Humulus japonicus Metricure Uterine Boluses 1 Sphingomonas paucimobilis Erysopelothrix rhusiopathiae Granulicatella adiacens Kocuria rosea Enterobactor aerogenes Rothia mucilaginosa Stenotrophomonas maltophilia Alloiococcus otitis Staphylococcus chromogenes Streptococcus alactolycus Pasteurella canis The-, no inhibitory zone; +, <10 mm; ++, <15 mm; +++, <20 mm; ++++, <25 mm; +++++, >25 mm. Phelledendronamurense, Humulus japonicus, Uterine Boluses; Conc.= 1g/ml, Metricure= 25mg/ml

43 Table 6. Antimicrobial effect of natral extracts and commercial antibiotics against difference bacterial strains isolated from Hanwoo semen Diameter of clear zone(mm) No. Bacterial strains Natural extracts Commercial antibiotics Phelledendronamurense Humulus japonicus Metricure Uterine Boluses 1 Sphingomonas paucimobilis Kocuria kristinae Streptococcus uberis Pseudomonas aeruginosa Streptococcus sanguinis Staphylococcus homonis ssp.hominis Pseudomonas pseudoalcaligenes Serratia marcescens Eschericha coli Bacillus sporothermodurans Oligella ureolytica Kocuria varians Stenotrophomonas maltophilia The-, no inhibitory zone; +, <10 mm; ++, <15 mm; +++, <20 mm; ++++, <25 mm; +++++, >25 mm. Phelledendronamurense, Humulus japonicus, Uterine Boluses; Conc.= 1g/ml, Metricure= 25mg/ml

44 Table 7. Sample number of the uterus lavage fluid Phelledendron amurense Humulus japonicas sampling date 1:100 1:1000 1: :100 1:1000 1:

45 Table 8. Colony foming unit(cfu) of the washing fluid of the uterus in Hanwoo Phelledendron amurense Humulus japonicas sampling date 0 CFU/ml CFU/ml 1: :1000 1:100 1: :1000 1: sum sum

46 sum sum

47 Table 9. The chage of the bateria flora from the uterus in Hanwoo when injected extract of the Phelledendron amurense sampling date Phelledendron amurense 1: :1000 1:100 0 Acinetobacter lwoffii, Bacillus licheniformis, Kocuria rosea, Staphylococcus xylosus, Streptococcus pneumoniae, Virgibacillus pantothenticus Bacillus pumilus, Enterococcus feacalis, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus heamolyticus Escherichia coli, Sphingomonas paucimobilis 3 Bacillus licheniformis, Escherichia coli, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus heamolyticus Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Escherichia coli - 6 Escherichia coli, Paenibacillus polymyxa, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus lentus, Virgibacillus pantothenticus Escherichia coli, Sphingomonas paucimobilis - 9 Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus xylosus Staphylococcus gallinarum Staphylococcus xylosus

48 Table 10. The chage of the bateria flora from the uterus in Hanwoo when injected extract of the Humulus japonicas sampling date Humulus japonicas 1: :1000 1:100 0 Bacillus pumilus, Sphingobacterium thalpophilum, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus xylosus Acinetobacter lwoffii, Bacillus pumilus, Brucella melitensis, Pseudomonas stutzeri, Sphingobacterium thalpophilum, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus lentus Granulicatellaadiacens, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus xylosus 3 Bacillus clausii, Bacillus licheniformis, Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus lentus, Streptococcus infantarius subsp. Coli Escherichia coli, Staphylococcus chromogenes Granulicatellaadiacens 6 Sphingomonas paucimobilis Escherichia coli, Staphylococcus chromogenes Acinetobacter lwoffii 9 Sphingobacterium thalpophilum, Sphingomonas paucimobilis Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus sciuri Sphingomonas paucimobilis, Staphylococcus equorum, Staphylococcus vitulinus

49 - 48 -

50 μ

51 β α β α 얇은유리관을돌칼로 2~3cm간격으로자른뒤알콜램프에절단한유리관끝부분을가열하여부드럽게만들어준다. 가열이유 : 마우스질내유리관삽입시질내막부분손상을막기위함

52 β α β α

53 β β α

54 Clinical Ruffled fur Movement signs Eye condition Responsiveness Score Normal Mild; ruffled fur Moderate; ruffled Severe; ruffled <30% of the body fur <60% of the fur >60% of the body body Normal Mild; reduced movement and Moderate; reduced movement Severe; reduced movement and activity <30% and activity <60% activity >60% Normal Mild; eye closed Moderate; eye Severe; eye and discharge closed and closed and <30% discharge <60% discharge >60% Normal Mild; reduced Moderate; Severe; reduced responsiveness reduced responsiveness <30% responsiveness <60% >60%

55 Histopathology Inflammation Necrosis/ Degeneration Congestion/ Hemorrhage Score No sign of Low leukocyte infiltration (<30% Moderate leukocyte infiltration Severe leukocyte infiltration(>60% of inflammation of the field) (<60% of the field) the field) Normal Mild necrosis or Moderate necrosis Severe necrosis degeneration (<30% of the or degeneration or degeneration (<60% of the field) (>60% of the field) field) Normal Mild congestion or hemorrhage (<30% of the field) Moderate congestion or hemorrhage (<60% of the field) Severe congestion or hemorrhage (>60% of the field)

56 - 55 -

57 a b c d e f

58 β β

59 - 58 -

60 μ μ μ μ μ

61 μ

62 μ μ μ μ μ μ

63 μ μ μ μ μ μ

64 μ

65 μ μ μ

66 - 65 -

67 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도

68 - 67 -

69 β β

70 - 69 -

71 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획

72

73 제 6 장 연구실안전관리이행실적

74 - 73 -

75 - 74 -

76 제 7 장 참고문헌

77 주 의 이보고서는농림축산식품부에서시행한생명산업기술개발사업의연구보고서입니다 이보고서내용을발표할때에는반드시농림축산식품부에서시행한생명산업기술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니다

농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 : ~ ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 (

농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 : ~ ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 ( 농림축산식품부장관귀하 본보고서를 미생물을활용한친환경작물보호제및비료의제형화와현장적용매뉴 얼개발 ( 개발기간 :2014. 7. 29 ~ 2016. 7. 28.) 과제의최종보고서로제출합니다. 2016. 7. 28. 주관연구기관명 : 고려바이오주식회사 ( 대표자 ) 김영권 ( 인 ) 협동연구기관명 : 목원대학교산학협력단 ( 대표자 ) 고대식 ( 인 ) 협동연구기관명

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발간등록번호 발간등록번호 3. 보고서요약서 보고서요약서 - 2 - - 3 - 4. 국문요약문 - 4 - 5. 영문요약문 < SUMMARY > - 5 - 6. 영문목차 < CONTENTS > - 6 - - 7 - 7. 본문목차 목차 - 8 - - 9 - 제 1 장. 연구개발과제의개요 - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 -

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