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1 한국산업위생학회지, 제 권제 호 () 중량당섬유수가다른국내산석면이폐기능과폐조직에미치는영향평가 Effect of Fiber Number Per Mass Concentration in Korean Produced Asbestos on Lung Function and Pathology 정용현 * 한정희 강민구 김종규 양정선 Yong Hyun Chung* Jeong Hee Han Min Gu Kang Jong Kyu Kim Jeong Sun Yang 산업안전보건연구원화학물질센터독성연구팀 Toxicological Research Team, Center for Chemicals Safety and Health, Occupational Safety & Health Research Institute ABSTRACT Objectives: To evaluate the pulmonary toxicity of Korea asbestos(chrysotile, anthophyllite), Sprague-Dawely rats were exposed to mg domestic asbestos by intratracheal instillation(it). Methods: Lung function of rats was analyzed by pressure transducer(max3, Buxco Electronics, USA). The effects of mg asbestos(chrysotile ; 8,8, 6 fibers/mg, average diameter.8 µm, average length.39 µm, anthophyllite ; 5,8 6 fibers/mg, average diameter.95 µm, average length 7.9 µm) on pulmonary function and pathological changes were evaluated at after a single IT. Lung function and histopathological evaluation were assessed in 5 animals from each group at each time point. Results: Due to differences in fiber numbers, chrysotile induce marked lung pathology and lung function change than anthophyllite at the same mass dose. Chrysotile showed notable thickening of interstitial areas surrounding the alveolar ducts and terminal bronchioles. Conclusions: On a mass dose basis, chrysotile that have,7 times numbers of fibers per unit weight than anthophyllite produced a greater persistent lung injury than anthophllite for at least weeks after exposure. Key words : chrysotile, anthophyllite, intratracheal instillation, lung toxicity Ⅰ. 서론 최근우리나라에서도석면피해구제법이시행됨에따라, 석면에노출된사람에대한보상문제가사회적관심사가되고있으나우리나라에서생산된석면에대한유해성평가를위한독성시험자료는부족한상황이다. 석면피해구제법에의하면, 원발성악성중피종과원발성폐암, 석면폐증등석면피해질환은석면노출과발병간의인과관계와조직병리검사와임상적판단및영상의학적판단등으로결정한다. 원발성폐암은건조폐나기관지폐포세정액내석면을계수하여기준 치를초과하면원발성폐암으로인정하기도한다. 석면폐증은컴퓨터단층촬영사진을판독하여석면폐증의정도 ( 의심형, 초기형, 진행형 ) 와폐기능의장해단계 ( 정상, 경도장해, 고도장해 ) 에따라 급, 급, 3급등으로구분하여판정하고있다 ( 한국환경공단, ). 우리나라산업안전보건법의석면함유제품에대한정의는제품에함유된석면중량 % 로규정하고있다. 그러나동일한중량일지라도석면의종류에따라서섬유수는많은차이를보이며, 석면과같은섬유상물질은중량보다는섬유수와섬유의형태가독성학적으로더중요한의미를가진다. *Corresponding author: Yong Hyun Chung, 대전시유성구문지동 -8 번지산업안전보건연구원, Tel: , Fax: , Received:..., Revised:..6., Accepted:..9. 3

2 3 정용현, 한정희, 강민구, 김종규, 양정선 본 연구는 동일한 중량이지만 섬유수가,7배 정 도 차이가 나는 국내산 백석면(chrysotile)과 안소필라 이트(anthophyllite)가 호흡기계에 미치는 영향을 비교 평가하기 위하여 랫드의 기도 내로 동일한 중량의 시 험물질을 투여하여 시험동물의 폐 기능과 폐 조직에 미치는 영향을 비교 평가하였다. Ⅱ. 재료 및 방법. 시험물질 시험물질은 국내 석면 광산에서 수집한 백석면 (8,8, 6 fibers/mg,.8 µm.39 µm)과 안소 필라이트(5,8 6 fibers/mg,.95 µm 7.9 µm)를 사용하였다. 안소필라이트가 백석면에 비하여 평균직 경은 배 정도 굵고 평균길이는.8배 정도 긴 섬유상 이었다(Figure ). 백석면의 섬유수는 안소필라이트에 Chrysotile(,) Anthophyllite( 5,) 비하여 mg 당,7배 정도 많았다. 시험물질의 길이는 백석면은 5 µm 이상이 % 였고, 안소필라이트는 5 µm 이상이 6% 였다.. 투여방법 각 시험동물은 Ketamin(염산케타민 농도 5mg/mL, 투 여량 5 mg/kg, 유한양행)으로 마취한 후, 시험동물 당 멸균한 시험물질 mg을 생리식염수.3 ml에 넣어 시 험동물의 기도 내(intratracheal instillation)로 회 투여하 였다. 대조군에는 생리식염수.3 ml를 투여하였다. 3. 시험동물 및 사육환경 본 연구에 사용된 실험동물은 화학물질센터의 실험동 물윤리위원회의 승인을 받아 사용하였다. 시험동물은 특 정병원체 부재동물(Specific Pathogen Free, SPF) Sprague Dawley 수컷 7주령 랫드를 중앙실험동물(주)에서 분양 받아 barrier system 동물실에서 7일간 순화시킨 후 건 강한 동물 마리를 선별하여 사용하였다. 시험동물군 은 체중을 지표로 하여 군별 체중편차가 최소화 되도록 하여, 대조군 마리, 시험물질 투여 후 주군 마리, 투여 후 주군 마리, 투여 후 주군 마리 등 개 군 으로 구성하였다. 각 군중 5마리는 시험물질을 투여한 후 주, 주, 주에 시험동물을 희생시켜서 폐 조직 검사 에 사용하였다. 각 군의 시험동물의 폐 기능 검사는 시 험물질 투여 후 주, 3주, 주에 실시하였다. o 동물사육실은 온도 ± 3 C, 상대습도 5 ± %, 환 기회수 3~8회/hr, 조명시간 시간(오전 9시~오후 9시) 및 조도 5~3 Lux로 설정되었으며, 사료는 멸균된 실험동물용 고형사료(Labdiet 5PMI, USA)를 구입하 여 자유롭게 섭취시켰다. 물은 미세여과기 및 자외선을 이용하여 여과시킨 상수도수를 자유로이 섭취시켰다.. 체중측정 시험동물의 체중측정은 군을 분리할 때와 시험물질 투여 후 주, 주, 3주, 주에 측정하였다. 5. 폐 기능 검사 폐 기능 검사는 pressure transducer(max3, Buxco Figure. Domestic asbestos fibers by scanning electron microscopy. Electronics, Sharon, CT, USA)에 의해 서로 연결되어 있는 기준 챔버와 시험동물 챔버로 구성되어 있고 일 정한 유량(.~.5 lpm)으로 흐르는 whole body plethysmograph(wbp)(sft386, Buxco Electronics, Sharon, CT, USA)에 시험동물을 넣고 분간 순화시킨 후 각

3 중량당섬유수가다른국내산석면이폐기능과폐조직에미치는영향평가 33 시험동물의분당호흡횟수, 회호흡량, 분당호흡량등의폐기능을측정하였다. 일차, 일차, 9일차에서안소필라이트투여군보다유의한체중저하를보였다. 6. 폐조직병리검사및석면관찰시험물질투여후 주, 주, 주에 Isoflurane(Ilsung Pharm, Korea) 을사용하여시험동물을마취시킨후폐조직을절취하여중량을측정하였다. 절취한폐장기는 % 중성포르마린용액에고정하였다. 고정된왼쪽폐장기조직은탈수한후파라핀으로포매하고마이크로톰으로박절한후 Hematoxylin-Eosin(H&E) 염색과 Masson's trichrome 염색을하여광학현미경 (AXIOSKOP plus, Carl Zeiss, Germany) 으로관찰하였다. 7. 통계처리시험동물의체중, 폐무게, 폐기능검사등의시험결과는평균과표준편차로표시하였으며, 실험군간의유의성은일원배치분산분석 (one-way ANOVA) 을실시하였으며사후분석은 Dunnett 검정을사용하였다. Ⅲ. 연구결과. 체중변화시험물질투여후시간경과별로체중을측정하여대조군과비교한결과를 Figure 에제시하였다. 모든백석면투여군과안소필라이트투여군은대조군에비하여유의한체중저하를보였다. 백석면투여군과안소필라이트투여군을비교한결과에서는백석면투여군이안소필라이트투여군에비하여투여후 8일차, 5. 폐기능검사 ) 분당호흡횟수 (Frequency) 분당호흡횟수를측정한결과를 Figure 3에나타내었다. 백석면투여군의분당호흡횟수는대조군에비하여 주차, 3주차에서유의한증가를보였고 주차에서도통계적유의성은없었으나증가하는경향을보였다. 안소필라이트투여군의분당호흡횟수는대조군에비하여 주차, 3주차에서유의한증가를보였으나, 주차에서는유의한변화를보이지않았다. 백석면투여군에비하여안소필라이트투여군은 주차, 3주차, 주차등모든군에서분당호흡횟수는유의한감소를보였다. ) 회호흡량 (Tidal volume) 회호흡량을측정한결과를 Figure 에나타내었다. 백석면투여군의 회호흡량은대조군에비하여투여후 주차에서는감소하는경향을보였고, 투여후 3주차와 주차에서는유의한감소를보였다. 안소필라이트투여군의 회호흡량은대조군에비하여감소하고백석면투여군에비하여증가하였으나통계적으로유의한변화는없었다. 3) 분당호흡량 (Minute volume) 분당호흡량을측정한결과를 Figure 5에나타내었다. Figure. Body weight changes of SD male rats after asbestos instillation. a : p <., control vs chrysotile and anthophyllite b : p <., chrysotile vs anthophyllite c : p <.5, anthophyllite vs chrysotile Figure 3. Frequency changes of rat treated with asbestos instillation. a : p <., Control vs Chrysotile and anthophyllite b : p <., Chrysotile vs anthophyllite

4 3 정용현, 한정희, 강민구, 김종규, 양정선 Table. Absolute lung weight of SD male rats after asbestos instillation. Control Chrysotile Time point (Weeks) right lung (unit : mg) left lung (unit : mg) body weight (g) 85. ± ± ± ± ± 3..6 ± ± 89.8 ** 7. ± 9.9 ** 35.3 ± 8.8 ** 56. ± 88.7 ** 73. ± 3. ** 36. ±.3 ** Anthop 976. ±. * 5. ± ± 9. hyllite 88. ± ± ± 6. All values are expressed as mean ± SD Significant differences as compared with control : ** p <., * p <.5 Figure. Tidal volume changes of rat treated with asbestos instillation. C : p <.5, control vs chrysotile Table. Relative lung weight of SD male rats after asbestos instillation. Control Chrysotile Anthop hyllite Time point (Weeks) right lung (unit : mg) left lung (unit : mg).33 ±.5.3 ±.8.7 ±.6.3 ±.6.59 ±.93 **. ±.5 **.38 ±.5 **.98 ±.6 **.9 ±.9 **.5 ±. **. ±.. ±.8 All values are expressed as mean ± SD Significant differences as compared with control : ** p <., * p <.5 Relative lung weight (%) = (lung weight / body weight) x Figure 5. Minute volume changes of rat treated with asbestos instillation. a: p <., control vs Chrysotile and anthophyllite 를측정하여체중에대한폐무게 % 를산출한상대장기무게 (Table ) 를비교한결과, 백석면투여군은투여후 주군, 주군등모든군에서대조군에비하여유의한증가를보였으나, 안소필라이트투여군에서는투여후 주군에서만대조군에비하여유의한증가를보였다. 백석면투여군의분당호흡량은대조군과안소필라이트투여군에비하여투여후 주차에서는유의한증가를보였고, 3주차와 주차에서도대조군과안소필라이트투여군에비하여분당호흡량은증가하였으나통계적으로유의한변화를보이지는않았다. 안소필라이트투여군의분당호흡량은백석면투여군에비하여감소하였으나통계적으로유의한변화는없었으며, 대조군과도유의한변화를보이지않았다. 3. 폐조직병리검사 ) 폐무게측정시험물질을투여한후시간경과별로폐무게 (Table ) ) 폐조직병리검사시험동물의폐조직을관찰한결과 (Table 3, Figure 6~7), 백석면투여군에서는 5마리의시험동물모두에서폐포관 (alveoli duct) 과세기관지주위 (peribronchiolar) 에서섬유증 (fibrosis) 이나타났다. 안소필라이트투여군에서는 5마리중폐포관섬유증은 마리에서나타났고세기관지주위섬유증은 7마리에서나타났다. 폐내섬유증의정도는백석면투여군의폐포관에서는심한섬유증 (severe fibrosis) 3마리와중등도 (mild fibrosis) 섬유증이 마리에서나타났으나안소필라이트투여군의폐포관에서는심한섬유증은나타나지않고중등도의섬유증 마리와약한섬유증 (slight fib

5 중량당 섬유수가 다른 국내산 석면이 폐 기능과 폐 조직에 미치는 영향 평가 35 Table 3. Fibrosis of lungs of SD male rats after asbestos instillation. Time point(weeks) *** ** * *** ** * *** ** * *** Grade sum ** * Total sum Control(n=5) Chrysotile(n=5) Anthophyllite(n=5) alveoli duct peri bronchiole alveoli duct peri bronchiole alveoli duct peri bronchiole /5 /5 5/5 5/5 /5 7/5 *** : severe fibrosis, ** : mild fibrosis, * : slight fibrosis n = number of animals. Time point (Weeks) Chrysotile Anthophyllite rosis)이 마리에서 나타났다. 백석면 투여군의 세기관지 주위에서는 심한 섬유증 이 5마리, 중등도 섬유증이 6마리, 약한 섬유증이 마 리에서 나타났으나 안소필라이트 투여군의 세기관지 주위에서는 심한 섬유증과 중등도의 섬유증은 나타나 지 않았고 7마리에서만 약한 섬유증이 나타났다. 시간 경과별 변화를 살펴보면, 대조군에 비하여 모 든 군에서 유의한 폐 상대장기무게 증가를 보인 백석 면 투여군에서는 폐포관의 심한 섬유증은 시간이 경과 됨에 따른 변화가 적었으나 세기관지 주위의 심한 섬 유증은 시간이 경과됨에 따라 중등도와 약한 섬유증으 로 변화하였다. 시험물질 투여 후 주군에서만 대조군 에 비하여 유의한 상대장기무게 증가를 보인 안소필라 이트 투여군은 시간이 경과되어도 폐 조직 내 폐포관 과 세기관지 주위 섬유증은 변화가 적었으며 심한 섬 유증을 보이는 시험동물도 없었다. 3) 폐 조직 내 석면 Figure 6. Histopathology of the lung of SD male rats instilled asbestos after,, weeks. Chrysotile W; severe peribronchiolar fibrosis and severe alveoli duct fibrosis, W; severe peribronchiolar fibrosis, W; severe alveoli fibrosis, Anthophyllite W; slight peribronchiolar fibrosis and slight alveoli duct fibrosis, W; slight peribronchiolar fibrosis, W; slight alveoli fibrosis. (Masson's trichrome, x, light microscopy). 폐 조직을 H&E 염색한 후 배율의 광학현미경으 로 관찰한 결과, 백석면 투여군에서는 모든 군의 폐 조 직 내에서 석면을 관찰하기 어려웠다. 안소필라이트 투여군에서는 투여 후 주차, 주차, 주차 등 시간경 과별로 관찰한 모든 폐 조직 내에서 석면이 관찰되었 다(Figure 7).

6 36 정용현, 한정희, 강민구, 김종규, 양정선 Ⅳ. 고 찰 Figure 7. A lot of anthophyllite fibers in the lung of SD rats instilled anthophyllite after,, weeks. H&E, x light microscopy. 석면 취급근로자에 대한 조사결과에 의하면 연간 fibers/ml 이상 석면에 노출되면 폐 조직에서 석면폐증 이 나타나며(Green 등, 997), 헬싱키 기준(Helsinki Criteria)에 따르면 미만성 간질 섬유증(diffuse interstitial fib rosis)과 조직 cm 내에 개 이상의 석면소체가 나타 나면 석면폐증으로 인정하고 있다(Tossavainen, 997). 본 연구의 시험물질로 사용된 백석면은 안소필라이 트보다 가벼워서 mg 당 섬유수가 안소필라이트에 비하 여,7배 정도 많았다. 이러한 시험물질의 mg 당 섬 유수 차이와 형태의 차이는 시험물질을 투여한 시험동 물의 폐 기능과 폐 조직에 지속적으로 영향을 미쳤다. 본 연구에서 수행된 폐 기능검사는 석면피해인정 검 사방법 중의 하나이다. 폐 기능이 저하되면 일산화탄 소 방산 능력저하, 저산소증이 나타나게 되어 호흡이 빨 라지게 되어 나타나는 폐 하부의 청진음이나 폐 기능 검사도 석면폐증 진단에 도움이 될 수 있으나, 폐활량 측정은 특이성이나 민감성이 낮아서 참고치의 범위가 넓다(De와 Gevenois, ). 본 연구에서 시험동물의 폐 기능을 측정한 결과, 백석면 투여군의 분당 호흡횟수 는 대조군에 비하여 증가하였으나 투여 후 주차에서는 약.6배, 3주차에서는 약.5배, 주차에서는 약.3배 로 시간이 경과됨에 따라 증가율은 감소하였다. 안소필 라이트 투여군의 분당 호흡횟수는 대조군에 비하여 주차에서는 약.배, 3주차에서는 약.배 증가하였 으나, 백석면 투여군에 비하여 상대적으로 변화가 적었 으며 주차에서는 대조군과 유사한 변화를 보였다. 회 호흡량도 백석면 투여군은 대조군에 비하여 주차에 서 감소하였고, 3주차, 주차에서도 유의한 감소를 보였 으나, 안소필라이트 투여군에서는 유의한 변화가 없었 다. 분당 호흡횟수와 회 호흡량의 변화에 따라 변화하게 되는 분당호흡량은 백석면 투여군은 대조군과 안소필 라이트 투여군에 비하여 증가하였으나 시간이 경과할 수록 증가율은 감소하는 경향을 보였다. 안소필라이트 투여군의 분당 호흡량은 대조군에 비하여 유의한 변화 를 보이지 않았다. 본 연구의 폐 기능 검사결과로 상대적 으로 많은 수의 섬유수가 투여되었던 백석면 투여군의 호흡기계는 초기에는 섬유수의 양적인 영향을 많이 받 았지만 시간이 경과됨에 따라 호흡기계는 회복되고, 상 대적으로 적은 양의 섬유수가 투여되었던 안소필라이 트 투여군의 호흡기계는 투여 초기부터 영향이 적었다 고 판단되었다.

7 중량당섬유수가다른국내산석면이폐기능과폐조직에미치는영향평가 37 석면폐증은폐하부가장자리에서주로발생되며, 초기석면폐증은세기관지주위폐포벽에서제한적으로섬유화가시작되고섬유화가계속적으로진행되면근처의세기관지까지연결된다 (Roggli 등, ). 세기관지주위섬유증 (peribronchiolar fibrosis) 과석면폐증은구분되어진단되어야하지만, 폐포격벽섬유증이없는세기관지주위섬유증을초기석면폐증으로진단하기도한다 (Churg와 Wright, 983). 조직학적으로석면폐증의등급은 등급 ~등급으로나눌수있다 (Craighead 등, 98). 등급은섬유증이세기관지벽과인접한첫번째폐포층에서확인할수있는상태이고, 등급은섬유증이폐포관까지연장되어있거나두번째폐포층이상에서섬유증이나타나지만인접한세기관지와는약간의공간이남아있는상태이다. 3등급은인접한 개이상의세기관지사이의모든폐포벽이섬유증으로두꺼워진상태이다. 등급은벌집폐가나타나는상태이다 (Craighead 등, 98). 본연구에서동일한중량이지만섬유수가많았던백석면투여군의폐포관섬유증은안소필라이트투여군보다심하게나타났다. 본연구에서사용된기도내투여법은시험물질을기도내로투여할때시험물질의양과형태의특성에따라세기관지에시험물질이저류될수있다. 본연구에서폐포관의섬유증은백석면투여군이나안소필라이트투여군모두시간경과에따른변화가적었지만, 세기관지주위의섬유증은시간경과에따른변화가많았다. 백석면투여군에서는세기관지주위에심한섬유증을보인동물수는 주차 3 마리, 주차 마리, 3주차 마리등시간경과됨에따라감소되는경향을보였으나, 안소필라이트투여군에서는세기관지주위에는섬유증이지속적으로유지되었다. 백석면투여군의섬유증이감소되는경향은시험물질투여초기에는백석면투여군의세기관지주위에는저류되는섬유수가많아서섬유증이많이생기지만호흡기계내에서백석면은용해되는속도가빨라서시간이경과됨에따라섬유증이감소되어나타난결과로판단되었다. 일반적으로백석면은폐내의산 (acid) 에안정적이지않고직경이.5 µm 보다작아서광학현미경으로관찰이어렵다 (Hume과 Rimstidt, 99). 본연구에서도광학현미경으로폐조직내석면을관찰한결과, 백석면투여후 주차이후에서는석면을관찰할수없었으나, 안소필라이트투여군에서는안소필라이트투여후 주가경과하여도광학현미경으로폐조직내의석면을관찰할수있었다. Ⅴ. 결론 국내석면광산에서수집한백석면과안소필라이트를 Sprague Dawley 랫드의기도내로 mg 씩 회투여한후시간경과별로시험동물의폐기능과폐장기중량측정및폐조직병리검사를한결과, 섬유수가,7배정도많은백석면은안소필리아트보다폐기능과폐조직에많은영향을주었지만시간이경과될수록호흡기계는회복되는경향을보였다. 안소필라이트는시험기간중백석면에비하여호흡기계에미치는영향은적었으나백석면보다는생체내구성이강하여폐조직내에서섬유상물질은지속적으로남아있었다. 이러한결과로섬유상물질의독성을평가할때는섬유상물질의중량보다섬유상물질의섬유수를충분히고려하여야한다고판단되었다. 참고문헌 한국환경공단. 석면피해구제제도업무매뉴얼,. Churg A, Wright JL. Small airway lesions in patients exposed to nonasbestos mineral dusts. Hum Pathol. 983; (8): Craighead JE, Abraham JL, Churg A, et al; for Pneumoconiosis Committee of the College of American Pathologists and the National Institute for Occupational Safety and Health. The pathology of asbestos associated disease of the lungs and pleural cavities: diagnostic criteria and proposed grading schema. Arch Pathol Lab Med. 98;6(): De Vuyst P, Gevenois PA. Asbestosis. In: Hendrick DJ, Burge PS, Beckett WS, Churg A, eds. Occupational Disorders of the Lung: Recognition, Management, and Prevention. London, England: Saunders; :3-6. Green FH, Harley R, Vallyathan V, et al. Exposure and mineralogical correlates of pulmonary fibrosis in chrysotile asbestos workers. Occup Environ Med. 997; 5(8): Hume LA, Rimstidt JD. The biodurability of chrysotile. Am Mineral. 99; 77(9-):5-8. Roggli VL, Gibbs AR, Attanoos R, Churg A, Popper H, Cagle P, Corrin B, Franks TJ, Galateau-Salle F, Galvin J, Hasleton PS, Henderson DW, Honma K. Pathology of asbestosis- An update of the diagnostic criteria: Report of the asbestosis committee of the college of american pathologists and pulmonary pathology society. Arch Pathol Lab Med. Mar;3(3): 6-8.

8 38 정용현, 한정희, 강민구, 김종규, 양정선 Tossavainen A, reporter. Asbestos, asbestosis, and cancer: the Helsinki criteria for diagnosis and attribution [Record of discussion]. Scand J Work Environ Health. 997; 3():3-36.

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