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2 의학박사학위논문 황색포도알균감염에서파지 리신 SAL200 과항생제의 병합치료효과 Effect of phage endolysin SAL200 in combination with antibiotics for Staphylococcus aureus infection 2017 년 2 월 서울대학교대학원 임상의과학과 김낙현 1

3 초 록 서론 : 황색포도알균은다양한침습성감염증을일으키는중요한병원균으로항생제내성이치료에있어서중대한문제가되고있다. 항생제내성의문제가심각해지면서세균감염증의치료에박테리오파지를이용하려는노력이다시이루어지고있고, 다양한균을대상으로파지와리신의항균효과를생체외 (in vitro) 균주실험과동물감염모델을이용하여확인한연구들이발표되고있다. 본연구에서는리신을항생제와병합하였을때황색포도알균에대한항균효과를 in vitro 와 in vivo 에서확인하고자하였다. 특히, 항생제내성균감염에서리신을병합하였을때기존항생제의치료효과를개선시킬수있을지확인하고자하였다. 방법 : 황색포도알균특이적박테리오파지 SAP-1에서분리된리신 SAL200을이용하여대표적인황색포도알균균주에대한리신최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 와최소살균농도 (minimal bactericidal concentration, MBC) 를액체배지미량희석 (broth microdilution) 법으로측정하였다. 각황색포도알균균주에대한리신 MIC와표준항생제인 vancomycin, nafcillin MIC를측정한후 checkerboard method와 time-kill assay를시행하여리신과 i

4 표준항생제의병합투여효과를확인하였다. In vivo에서리신과표준항생제의병합투여효과를확인하기위하여황색포도알균균혈증 mouse 모델을제작하였고, 이에서 1 대조군, 2 표준항생제투여군, 3 리신투여군, 4 리신과표준항생제병합투여군의치료효과를투약후 1시간이경과한시점에균혈증의정도와감염후 72시간이경과한시점에전이성병변의형성정도로평가하였다. 결과 : 각균주의 SAL200과표준항생제 MIC와 MBC는각각단독으로측정되었을때보다 SAL200과표준항생제를병합하여투약하였을때감소하는것이 checkerboard assay에서관찰되었다 : Fractional inhibitory concentration (FIC) index를기준으로 SAL200과 nafcillin을병합하였을때상승효과가관찰된균주들은 ATCC B1707, LAC, Newman 이었다 ( 각각의 FIC index = 0.375, 0.5, 0.5). SAL200과 vancomycin을병합하였을때는 ATCC B1707, Newman, ATCC 균주에서상승효과가관찰되었다 ( 각각의 FIC index = 0.5, 0.5, 0.375). Fractional bactericidal concentration index를기준으로하였을때에는, SAL200과 nafcillin을병합한경우 ATCC 33591, ATCC B1707, LAC, Newman, ATCC 균주들에서상승효과가관찰되었고, SAL200과 vancomycin을병합한경우에는 ATCC B1707, LAC, Newman, ATCC 균주들에서상승효과가관찰되었다. ii

5 각균주를 MIC 또는 MIC보다낮은농도의 SAL200, 표준항생제, SAL200과표준항생제의조합에노출시켜배양한 time-kill assay에서는 MIC보다낮은농도의표준항생제에노출된경우에는황색포도알균성장억제효과가미미하였으나, 동일농도의표준항생제와 SAL200을병합하였을때는 30분정도경과하였을때 bactericidal 한수준의균억제가관찰되었다. LAC, Newman, ATCC 균주들에서는 6시간동안배양하였을때, 배양시작할때보다, 그리고각항생제단독으로노출된경우보다 inoculum이 2-log 10 이상감소함을관찰하여 SAL200과표준항생제가병합되었을때상승작용을볼수있었다. 균혈증 mouse 모델에서는 LAC 균주를감염시킨경우, 투약후 1 시간이경과하였을때, 대조군에비하여 SAL200 단독투여군 (3.385 vs ; P=0.009) 과병합투여군 (3.385 vs ; P=0.016) 에서균혈증정도가유의하게낮았다. Newman 균주를감염시킨경우에는대조군에비하여 SAL200 단독투여군 (3.437 vs ; P=0.025) 과표준항생제투여군 (3.437 vs ; P=0.021), 병합투여군 (3.437 vs ; P=0.012) 에서모두투약후 1시간째에 균혈증이유의하게감소하였다. 감염후 72 시간째에비장내 균농도로평가한전이성감염의정도는 LAC 균주와 Newman 균주를감염시킨경우에서모두병합투여군이가장낮았다. iii

6 결론 : 본연구에서리신 SAL200의항-황색포도알균효과를 in vitro에서관찰하였으며, SAL200을항-황색포도알균표준항생제와함께사용하였을때상승작용이있다는것을 in vitro 와 in vivo에서확인하였다. 특히, SAL200을표준항생제와병합투여하였을때, 균혈증자체뿐만아니라전이성병소형성도억제하는효과를보여, 그동안표준치료에도반응이좋지않았던중증황색포도알균감염환자들에게항생제와함께리신을투여하면, 지금보다치료성적을향상시킬수있을것으로기대한다 주요어 : 황색포도알균, 파지, 리신, 상승작용 학번 : iv

7 목 차 초록... i 목차... v 표목록... vi 그림목록... vii I. 서론 황색포도알균의임상적중요성 황색포도알균의항생제내성문제 박테리오파지를이용한세균감염증의치료 기존연구의제한점 연구의필요성 연구목적... 9 II. 연구방법 황색포도알균에대한리신 MIC 와 MBC 측정 리신과표준항생제의 in vitro synergism assay v

8 3. 황색포도알균균혈증 mouse 모델에서리신과표준항생제의치료효과평가 치료결과의평가 통계분석방법 III. 결과 리신의황색포도알균에대한항생효과 리신의표준항생제의 in vitro synergism 가. Broth microdilution을이용한 checkerboard assay 나. 리신과표준항생제를이용한 time-kill assay 황색포도알균균혈증 mouse 모델에서리신과표준항생제의치료효과 IV. 고찰 V. 결론 참고문헌 초록 ( 영문 ) vi

9 표목록 Table 1. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of SAL200 and Standard-of-Care antibiotics against Staphylococcus aureus strains Table 2. Minimum bactericidal concentrations (MBCs) of SAL200 and Standard-of-Care antibiotics against Staphylococcus aureus strains Table 3. Combination MICs for SAL200 and Nafcillin Table 4. Combination MICs for SAL200 and Vancomycin Table 5. Combination MBCs for SAL200 and Nafcillin Table 6. Combination MBCs for SAL200 and Vancomycin Supplementary Table A. Mortality and Bacterial Density in Blood for Different Doses of Vancomycin Supplementary Table B. Bacterial Density in Blood for Different Doses of SAL vii

10 그림목록 Figure 1. Antimicrobial Dilution Scheme for Checkerboard assay. 13 Figure 2. Experiment Flow Figure 3. a) Combination MICs for SAL200 and Nafcillin Figure 3. b) Combination MICs for SAL200 and Vancomycin Figure 4. a) Combination MBCs for SAL200 and Nafcillin Figure 4. b) Combination MBCs for SAL200 and Vancomycin Figure 5. Time-Kill Curves of MRSA strains, LAC and ATCC 33591, Treated with Buffer, MIC- or submic- Concentrations of either SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 and Vancomycin Figure 6. Time-Kill Curves of MSSA strains, Newman and ATCC 29213, Treated with Buffer, MIC- or submic- Concentrations of either SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin Figure 7. a) Bacterial Density in Blood, 1 hour after Treatment with Buffer, SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 viii

11 and Vancomycin in Mice Infected Intraperitoneally with MRSA Strain LAC Figure 7. b) Bacterial Density in Blood, 1 hour after Treatment with Buffer, SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin in Mice Infected Intraperitoneally with MSSA Strain Newman Figure 8. a) Bacterial Density in Spleen, 72 hours after Intraperitoneal Infection with MRSA Strain LAC in Mice Treated with Buffer, SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 and Vancomycin Figure 8. b) Bacterial Density in Spleen, 72 hours after Intraperitoneal Infection with MSSA Strain Newman in Mice Treated with Buffer, SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin. (Splenic bacterial density in the dead mice from the control group was presumed to exceed 7.5 log10 CFU/g.) ix

12 I. 서론 1. 황색포도알균의임상적중요성 황색포도알균은대표적인피부상재균으로피부연조직감염, 골관절염, 균혈증, 폐렴, 식중독등다양한감염증을일으키는중요한병원균이다 (1, 2). 우리나라에서황색포도알균감염증은연간인구 10만명당 43.3건, 즉, 연간약 21,000여건이상발생하며, 500병상이상의병원에서발생하는의료기관관련황색포도알균균혈증은연간 4000여건에이를것으로추정된다 (3). 황색포도알균균혈증의사망률은약 20-30% 정도로알려져있으며, 특히메티실린내성황색포도알균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 균혈증에이환된경우치명률이더높고, 전체적인임상적치료성공률은 50~60% 에불과한것으로보고되어있다 (2, 4, 5). 황색포도알균균혈증에따른합병증으로심장, 신장, 근육, 망막, 중추신경계등의장기에다양한전이감염이발생할수있다. 전이감염이발생한경우에는그렇지않은경우보다더장기간의항생제치료가필요하고, 침범된장기의손상때문에후유증이남기도하여예후가좋지않다 (6). 1

13 2. 황색포도알균의항생제내성문제 MRSA는 1968년에미국에서처음으로분리된이후지속적으로증가하고있다 (1, 5-7). 국내 3차병원에서분리되는황색포도알균의메티실린내성률은 60-70% 를상회하고있으며, 1 2차병원에서도 40% 이상에달하고있어, MRSA는이미우리나라에토착화된상태로알려져있다 (8-10). 메티실린내성뿐만아니라반코마이신내성황색포도알균도 1997년에처음으로국내에서확인된이후꾸준히발견되고있고 (11, 12), 미국과유럽에서는 linezolid 내성황색포도알균도보고되고있어 (13) 황색포도알균의항생제내성문제는매우심각한수준이다. 2

14 3. 박테리오파지를이용한세균감염증의치료 가. 박테리오파지와파지요법 파지 (phage) 는세균에종특이적으로침투하여세균을용균시키는세균성바이러스로 1915년에 Frederick Twort와 1917년에 Felix d Herelle에의해처음발견된이래, 현재까지 5,100가지이상의파지가발견되었다 (14). 파지요법 (phage therapy) 은파지또는파지에서분비되는물질을세균성감염증의치료에이용하는것을말하며, 1917년에 Felix d Herelle에의해처음시작되었다 (14-17). 서구에서는 1940년대이후다양한항생제가개발되어사용되면서사장되다시피하였으나, 러시아, 조지아, 폴란드등동유럽권국가들에서는파지연구및사용이지속되었다 (14, 17-20). 나. 파지요법의장단점 파지는종특이적으로숙주세포인세균에부착하여세균내로침투하고, 그안에서증식후 holin과 lysin을분비하여숙주세균을용균시키면서배출되는생활사를가진다 (14). 이러한파지의생활사를이용한파지요법은기존의항생제치료와비교하여다양한장점을가진다. 종특이적으로세균을용균시켜죽이므로 1 다제내성균이라 3

15 하더라도항균효과를기대할수있고, 2 인체의정상세균총은영향을받지않으며, 3 인체의세포들도영향을받지않아부작용이적다. 또한, 4 즉각적인살균효과를기대할수있다 (14). 이외에도, 온전한파지를이용한항균요법의경우에는파지가숙주세균안에서증식하므로, 적은양으로도치료효과를기대할수있고, 표적세균이전멸되면파지도더이상생존할수없으므로스스로소멸되어잔류하지않는다는장점도있다 (21). 또한, 숙주세균에서파지에대한내성이발생하더라도파지도변이가가능하므로이를극복하는것이용이하며, 환경에도무수한파지들이존재하므로새로운파지를찾는것도보다수월할것으로기대할수있다 (18). 하지만, 스스로번식이가능한바이러스를주입할경우, 치료의정량이어려우며, 온전한바이러스의번식에의한예기치않은부작용을배제하기어렵다는우려도있다 (22). 또한, 치료측면에서는세균에부착하는과정에서내성이비교적잘발생하고, 혈류내파지가비장등망내계에서소멸되어작용시간이매우짧다는단점이있다 (14, 20). 다. 파지리신을이용한치료 파지리신 (phage lysin) 은파지가생성하는 peptidoglycan hydrolase 로숙주인세균에서탈출하는단계에작용하는데, 4

16 이것이실질적으로용균작용을일으켜세균을죽이는역할을한다 (23-25). 리신은직접세균벽의 peptidoglycan을파괴하므로 peptidoglycan의합성을억제하는 penicillin과같은항생제보다작용이직접적이고, 즉각적이며, 분열하는세균외에휴지기에접어든세균에도작용할수있다것이큰장점이다 (20, 25). 또한, 리신역시파지와마찬가지로세균에종특이적으로작용하므로정상세균총및인체의세포들에미치는영향이없어부작용이적고 (20, 22), 항생제내성세균에도작용하여살균효과를보인다 (22, 26). 5

17 4. 기존연구의제한점 최근항생제내성의문제가대두되면서여러세균감염증의치료에서파지를이용하려는연구가다시활성화되고있고 (14, 18, 19, 27), 파지와리신의항균효과를생체외 (in vitro) 균주실험과동물감염모델을이용하여확인한연구들이발표되었다. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae, S. aureus 등다양한세균을이용한동물감염모델에서파지의치료효과가연구되었고 (14, 28-30), 리신을이용한치료도 Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, group B streptococcus, S. aureus 등을이용한 mouse 모델에서그효과가확인되었다 (23, 31-36). 하지만, 이러한연구결과들이다양한파지와리신의항균효과를대변하기는어렵다는한계가있어새로운파지와리신에대한연구는여전히필요하다. 또한, 현재정립되어있는감염증에대한표준치료는항생제치료이기때문에, 파지및리신치료를표준항생제치료와비교하거나, 병합하는것에대한고려가필요하다. 파지나리신을항생제와함께투여하였을때감염치료효과가증대된다는몇몇연구결과가있으나 (37-39) 이는파지의종류나리신의종류, 감염부위, 감염증의중증도등에따라효과가다를것이므로동일하게적용하기에는무리가있고, 6

18 상승작용의기전에대하여명확히밝혀진바가없다는한계가 있다. 7

19 5. 연구의필요성 황색포도알균의항생제내성이증가함에따라황색포도알균감염증의항생제치료가어려워지고있고, 치료기간의장기화, 추가적인시술 / 수술의필요성등으로의료비부담도증가하고있어서, 항생제내성문제를극복할수있는새로운항균치료전략이절실하다 (40-42). 현재진료지침에서는황색포도알균감염증에서표준항생제치료와감염병소를제거하는것을권장하고있으나, 이것으로충분한치료가되지않는황색포도알균감염증환자들은마땅한치료가없어예후가좋지않다 (6). 따라서, 이러한환자들에서리신치료를함께시도해볼수있을것으로생각되며, 파지요법의장점들을고려할때, 위험부담을크게증가시키지않으면서치료효과를증대시킬수있을것으로기대해볼수있겠다. 항생제와리신치료를함께하였을경우, 항생제치료만하는경우보다항균효과가상승할것을기대해볼수있겠으나, 이를뒷받침할만한연구결과들은아직상당히제한적이다. 실제로항생제와리신을함께투여하였을때상승효과가있는지 in vitro 와전임상생체내 (in vivo) model에서확인하는것이필요하며 (23), 항생제와리신을함께투여하였을때상승효과가있다면, 항생제치료만으로치료가잘되지않는황색포도알균감염증환자들의치료에이를적용하여치료효과의개선을가져오는지확인해보는것도필요하다. 8

20 6. 연구목적 본연구를통하여새로운항생제후보물질인리신을기존의항생제와같이사용하였을때, 항생제만단독으로사용할때와비교해서 S. aureus 감염증을치료하는데추가적인도움이되는지를확인하고자하였다. 특히, 항생제내성균인경우리신과항생제의병합요법으로기존항생제의치료효과의개선을기대할수있을지확인하고자하였다. 황색포도알균균주들에대한리신의항균효과를평가하고, 리신과표준항생제의 in vitro synergism assay를통하여병합투여가상승효과가있는지확인하고자하였다. 또한, 황색포도알균균혈증동물모델 (mouse 모델 ) 을이용하여리신을기존의항생제와같이사용하였을때항생제단독으로사용한것과비교하여상승효과가있는지확인하고자하였다. 9

21 II. 연구방법 본연구에서는리신의항-황색포도알균효과를확인하기위해황색포도알균을특이적으로감염ᆞ용균시키는박테리오파지 SAP-1에서분리된리신 SAL200 (intron Biotechnology, Inc., 성남시, 대한민국 ) 을이용하여아래의실험을진행하였다. 1. 황색포도알균에대한리신 MIC 와 MBC 측정 황색포도알균에대한리신 SAL200 최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 와최소살균농도 (minimal bactericidal concentration, MBC) 는 Clinical and Laboratory Standard Institute 가이드라인을응용한액체배지미량희석 (broth microdilution) 법을이용하여측정하였다 (43). 황색포도알균균주는 ATCC 29213, Newman, LAC, SA1, ATCC B1707, ATCC 33591를사용하여메티실린감수성황색포도알균 (methicillin susceptible S. aureus, MSSA) 과 MRSA를모두포함하였다. 가. Broth microdilution 을이용한리신 MIC 측정 (1) skim milk 에보관되어있는균을혈액한천배지 (blood agar 10

22 plate) 에접종한후 37 에서 18시간동안배양하여 stock plate를만들어두었다. (2) CAMHB (Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth) (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 에균을풀어 McFarland 0.5 (10 8 CFU/ml) 로균액의농도를맞췄다. (3) CAMHB 10ml + 균액 0.1 ml 로 100배희석하였다. (10 6 CFU/ml) (4) Microplate에 well 당 50 μl의균액을가하였다. (final inoculum dose CFU/ml) (5) Microplate를 37 에서 24시간동안배양한후균이자라지않기시작한최소의농도를 MIC로판정하였다. 나. Broth microdilution 을이용한리신 MBC 측정 (1) 실험균주를 logarithmic growth phase 의균으로키운후, 이를 CAMHB 에희석하여 McFarland 0.5 (10 8 CFU/ml) 로균액의 농도를맞추고, 다시 CAMHB에 100배희석하여각 well내의최종 inoculum dose가 CFU/ml 되도록준비하여 MIC를확인하였다. (2) 육안으로확인하였을때, 균이자라지않은 well의균액을취하여 saline에 10배, 100배, 1000배희석후 Mueller-Hinton agar (MHA) plate ( 한일코메드, 성남시, 대한민국 ) 에각희석단계의균액을접종하고 37 에서 18시간동안 11

23 배양하였다. (3) 각평판배지에서자라고있는균집락의개수를세어 well의균농도를계산하였다. (4) 각 well 중 99.9% 이상이살균된최소의농도가 MBC이므로, well 의균농도가 CFU/ml 미만으로확인되는농도를 MBC 로판정하였다. 2. 리신과표준항생제의 in vitro synergism assay 리신과표준항생제의병합투여효과를확인하기위하여각황색포도알균균주에대한리신 MIC와표준항생제인 vancomycin (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), nafcillin (Sigma- Aldrich) MIC를측정한후 checkerboard method와 time-kill assay를시행하였다 (43, 44). MSSA 균주들에서는리신과 nafcillin의병합투여효과를, MRSA 균주들에서는리신과 vancomycin의병합투여효과를확인하고자하였다. 가. Broth microdilution 을이용한 checkerboard assay (1) Microplate 각열과행의항생제최종농도가 4MIC부터 1/8MIC가될수있도록항생제희석액을제작하여 microplate의각 well에분주하여 microplate를준비하였다. (Figure 1) 12

24 Figure 1. Antimicrobial Dilution Scheme for Checkerboard assay 표준항생제 (Vancomycin 또는 Nafcillin) 최종농도 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 8 MIC 4 MIC 2 MIC 리신 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 0 (2) 실험균주를 logarithmic growth phase 의균으로키운후, 이를 CAMHB 에희석하여 McFarland 0.5(10 8 CFU/ml) 로균액의 농도를맞추고, 다시 CAMHB 에 100 배희석하여각 well 내의 최종 inoculum dose 가 CFU/ml 되도록준비하여각 항생제별로 MIC를확인하였다. (3) 각항생제단독으로측정한 MIC와 2가지항생제가혼합된상태에서측정한 MIC를확인하여다음공식에따라각항생제의 fractional inhibitory concentration (FIC) 를계산하고, 각항생제 FIC를더하여 FIC를구하였다. 항생제 A 의 FIC = 항생제 와 병합하였을때 항생제 단독의 13

25 (4) FIC 0.5 이면 synergism, 0.5< FIC 4 이면 indifference, FIC>4 이면 antagonism 으로해석하였다 (45). (5) 육안으로확인하여균이자라지않은 well의균액을 10배씩희석하여각희석단계별로 MHA plate에접종하고 37 에서 18시간동안배양한후, 배지에서자란집락수를세어각 well의균농도를정량하였다. 99.9% 이상살균된최소농도를 MBC로판정하였다. (6) 각항생제단독으로측정한 MBC와 2가지항생제가혼합된상태에서측정한 MBC를확인하여다음공식에따라각항생제의 fractional bactericidal concentration (FBC) 를계산하고, 각항생제 FBC를더하여 FBC를구하였다. 항생제 A 의 FBC = 항생제 와 병합하였을때 항생제 단독의 (7) FBC 0.5 이면 synergism, 0.5< FBC 4 이면 indifference, FBC>4 이면 antagonism 으로해석하였다 (45). 14

26 나. 리신과표준항생제를이용한 time-kill assay (1) 실험균주를 logarithmic growth phase 의균으로키운후, 이를 CAMHB 에희석하여 McFarland 0.5(10 8 CFU/ml) 로균액의 농도를맞추고, 다시 CAMHB에 100배희석하여 inoculum dose가 10 6 CFU/ml 되도록균액을준비하여시험관에분주하였다. (2) 각시험관의 final inoculum dose가 CFU/ml 되고, 각시험관의항생제최종농도가 2-4 MIC 부터 1/4-1/2 MIC가될수있도록적절히항생제희석액을제작하여각시험관에분주하고, 밀폐하여 shaking하면서 37 에서배양하기시작하였다. (3) 배양시작후 0분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간이경과하였을때, 각시험관에서 100 μl의균액을취하여 saline에 10배, 100배, 1,000배희석후 MHA plate에각희석단계의균액을접종하고 37 에서 18시간동안배양하였다. (4) 각평판배지에서자라고있는균집락의개수를세어각시점마다시험관내균농도를 log 10 CFU/mL로계산하고, 이를바탕으로시간에따른 time-kill curve를그린다. 균농도를알고있는균액을 10배씩순차적으로희석하여고체한천배지에 100 μl의균액을접종, 37 에서 18시간동안배양한 15

27 후균집락의개수를확인하는실험을먼저시행하였고, 균집락의수를비교적정확히산출할수있는최소균농도는 100 CFU/mL로정하였다. (5) 배양시작후 6시간이경과하였을 3-log 10 이상의 inoculum 감소가확인되면항생제가살균작용이있다고정의하며, 2가지항생제를혼합하여배양한시험관의 inoculum이더효과적으로균을억제하는항생제 1가지를혼합하여배양한시험관의 inoculum 보다 2-log 10 이상의감소가확인되면서, 배양시작할때의 inoculum 보다 2-log 10 이상의감소가확인되면 2가지항생제가 synergistic하다고해석하였다. 반대로, 배양시작후 2-log 10 이상의증가가확인되면 antagonism 으로해석하였다 (44). 16

28 3. 황색포도알균균혈증 mouse 모델에서리신과 표준항생제의치료효과평가 가. MRSA 균혈증 mouse 모델실험조건결정 In vivo에서리신과표준항생제의병합투여효과를확인하기위하여 MRSA 균혈증 mouse 모델을제작하였다. 체중이 18 ± 1g 인 5-6주령의 BALB/c mouse 암컷을이용하였고, 실험균주는 MRSA 인 LAC 을이용하였다. logarithmic growth phase의균으로제작한균액 500 μl를복강내주사하여치명적인수준의균혈증을유도하였다 (46, 47). (1) 치명적균혈증을유도하기위한균접종량의결정복강내주사를통하여치명적균혈증유도에필요한균의농도를결정하기위하여각각 10마리의 mouse의복강에 LAC 균주를 1.0 x 10 7 CFU/mouse, 1.0 x 10 8 CFU/mouse, 1.0 x 10 9 CFU/mouse가투여되도록 500μl의균액을주사한후 72시간내사망률을확인하였고 (46-48), 실험개체의 50% 이상이관찰기간동안사망하는용량으로결정하기로하였다. 각각 1.0 x 10 7 CFU/mouse 와 1.0 x 10 8 CFU/mouse 복강내주사한개체들은 72시간경과후에도모두생존하였고, 1.0 x

29 CFU/mouse 주사한개체들은감염후 24시간이경과하였을때, 90% (10마리중 9마리 ) 가사망하였고, 72시간이경과하였을때에도 90% 의사망률이확인되었다. 이에, 치명적균혈증을유도하기위한균접종량은 1.0 x 10 9 CFU/mouse로정하였다. (2) 항생제투여용량의결정효과적인항생제용량을결정하기위하여복강내주사로균감염시킨 mouse를각각 5~10마리씩군으로나누어다양한용량의항생제를투여하였다. Vancomycin을투여한군에서는 48-72시간내사망률과균혈증의정도를확인하였고, SAL200 투여한군에서는시험약의반감기를고려하여 1시간째균혈증의정도를확인하였다. 매실험에는균감염은시켰으나항생제를투여하지않은대조군을 5마리씩포함시켜결과를비교하였다. 1 Vancomycin 투여용량의결정 Vancomycin을피하주사로 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12.5 mg/kg, 6.3 mg/kg, 3.15 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg 투여한군을 3차례의실험을통하여대조군과비교하였고 (47, 49-51), 결과는 Supplementary Table A에제시하였다. 해당결과를바탕으로 vancomycin 투여용량은 25 mg/kg로정하였다. 18

30 2 SAL200 투여용량과용법의결정 SAL200을정맥주사로 12.5 mg/kg, 25 mg/kg, 37.5 mg/kg 투여한군을대조군과비교하였고, 25 mg/kg 복강내주사로투약한군과 25 mg/kg을각각정맥주사와복강내주사한투여군을대조군과비교하였고, 결과는 Supplementary Table B에제시하였다. 해당결과를바탕으로 SAL200은 25 mg/kg를정맥과복강내로함께투약하는것으로정하였다. 19

31 Supplementary Table A. Mortality and Bacterial Density in Blood for Different Doses of Vancomycin Experiment Treatment group by VCM dose Mortality Bacterial density in blood # (CFU/mL) Dose Titration 1 Control 40% 2.26 VCM 50 mg/kg 0% 2.02 VCM 25 mg/kg 0% 1.41 VCM 12.5 mg/kg 0% 2.97 Dose Titration 2 * Control 100% NA VCM 25 mg/kg 0% 1.02 VCM 12.5 mg/kg 0% 2.08 VCM 6.3 mg/kg 0% 1.56 VCM 3.15 mg/kg 0% 1.73 Dose Titration 3 Control 80% 2.02 VCM 2 mg/kg 0% 1.32 VCM 1 mg/kg 0% 3.02 * results at 72h, others: results at 48h. # Median of log transformed CFU/mL. VCM: Vancomycin 20

32 Supplementary Table B. Bacterial Density in Blood for Different Doses of SAL200 Experiment Treatment group by SAL200 dose & route Bacterial density in blood # (CFU/mL) Dose Titration 1 Control 6.05 SAL mg/kg IV 6.66 SAL mg/kg IV 6.43 SAL mg/kg IV 6.79 Dose Titration 2 Control 2.17 SAL mg/kg IP 1.45 Dose Titration 3 Control 2.96 SAL mg/kg IV + IP 2.42 # Median of log transformed CFU/mL. 21

33 나. mouse 모델에서리신과표준항생제의치료 효과평가 체중이 18 ± 1g 인 5-6주령의 BALB/c mouse 암컷의복강내에 logarithmic growth phase의균 1.0 x 10 9 CFU/mouse가투여되도록, 2.0 x 10 9 CFU/mL 의균액 0.5 ml 를주사하여치명적인수준의균혈증을유도하였고, 실험균주는각각 MRSA 인 LAC과 MSSA 인 Newman을이용하였다. 리신의항균효과를확인하기위하여실험군은치료제에따라서 1 대조군, 2 표준항생제 (vancomycin 또는 nafcillin) 투여군, 3 리신투여군, 4 리신과표준항생제 (vancomycin 또는 nafcillin) 병합투여군으로나누어실험을진행하였다. 치료제는충분한균혈증을유도하기위하여균감염 1시간후에투약하였으며 (47, 49), 대조군은 phosphate buffered saline 200 μl를꼬리정맥으로한차례정맥주사하였다. 표준항생제투여군은 LAC strain을감염시킨경우에는 vancomycin 25 mg/kg을한차례피하주사, Newman strain 을감염시킨경우에는 nafcillin 200 mg/kg을한차례근육주사하였다 (47). 리신투여군과병합치료군에서리신은 SAL mg/kg를꼬리정맥과복강내로각각한차례씩주사하였다. 22

34 실험개체들은균주입후 72 시간동안관찰하여사망여부를 확인하였고, 72 시간경과후까지생존한개체들은모두 이산화탄소로마취유도하에심장채혈을통하여안락사시켰다. 각실험군의치료효과는투약후 1 시간이경과한시점에 균혈증의정도와 72 시간이경과한시점에전이성병변의형성정도로평가하였다. 투약후 1 시간이경과한시점에균혈증은꼬리정맥에서 100 μl씩헤파린튜브에채혈하여 serial dilution 한후 TSA plate 에접종하여정량하였다. 전이성감염은 72 시간이경과한시점에심장에서채취한혈액과비장에서균의농도를정량하여확인하였다. (Figure 2.) 모든동물실험과정은서울대학교병원동물실험위원회의규정을준수하였으며, 결과의재현성을확인하기위하여 2-3회반복하여시행하였다. 23

35 Figure 2. Experiment Flow 24

36 4. 치료결과의평가 본연구에서는리신과표준항생제의병합치료가표준항생제단독치료보다효과적인지, 각실험군의 1 72시간내사망률과 2 투약후 1시간째균혈증의정량및 3 72시간째전이성감염의정량을통하여평가하고자하였다. 이와더불어리신의 anti-staphylococcal effect를다양한황색포도알균균주들 (ATCC 29213, Newman, LAC, SA1, ATCC B1707, ATCC 33591) 에대한 MIC와 MBC를통하여확인하고, in vitro에서병합요법이상승작용이있는지확인하고자하였다. 5. 통계분석방법 연속형변수에대해서는변수의특징에따라평균과표준편차, 또는중위수와사분위수범위를제시하였으며, 범주형변수는비율을제시하였다. 균혈증 mouse 모델의치료결과는각각 Mann Whitney U-test 또는 Kruskall Wallis test, student t test및 Pearson chi square test 또는 Fisher s exact test를적용하여각군간에의미있는차이가있는지분석하였다. Time-kill assay의결과는 unpaired student t test를이용하여분석하였다. 모든분석은 IBM SPSS statistics (version 22.0 software package; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을이용하였고, P value <0.05이면, 유의한차이가있다고판정하였다. 25

37 III. 결과 1. 리신의황색포도알균에대한항생효과 균주별로리신, nafcillin, vancomycin 의 MIC 와 MBC 를각각 3 회씩 측정하였고결과는 Table 1 과 Table 2 에제시하였다. 26

38 Table 1. Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) of SAL200 and Standard-of-Care Antibiotics against Staphylococcus aureus strains Minimum Inhibitory Concentrations (μg/ml)(mean±s.d.) Strains SAL200 Nafcillin Vancomycin ATCC ±0.37 > ±0.50 ATCC B ± ± ±0.00 LAC 1.56± ± ±0.00 SA1 0.59± ± ±0.19 Newman 1.04± ± ±0.47 ATCC ± ± ±0.00 S.D., standard deviation; ATCC, American Type Culture Collection 27

39 Table 2. Minimum Bactericidal Concentrations (MBCs) of SAL200 and Standard-of-Care Antibiotics against Staphylococcus aureus strains Minimum Bactericidal Concentrations (μg/ml)(mean±s.d.) Strains SAL200 Nafcillin Vancomycin ATCC ±0.00 > ±0.00 ATCC B ± ± ±0.00 LAC 1.56± ± ±0.00 SA1 0.59± ± ±0.00 Newman 2.34± ± ±0.50 ATCC ± ± ±0.00 S.D., standard deviation; ATCC, American Type Culture Collection 28

40 2. 리신과표준항생제의 in vitro synergism 가. Broth microdilution 을이용한 checkerboard assay 각균주의리신, nafcillin, vancomycin MIC와 MBC를참고하여 checkerboard method로병합사용하였을때 MIC와 MBC를확인하였다. 모든균주에서리신이표준항생제와병합되었을때 MIC와 MBC가감소하는것을확인하였다. Checkerboard method에따른항생제병합시, 균주별 MIC, MBC는 Figure 3과 Figure 4, Tables 3-6에제시하였다. Newman 균주에서 SAL200의 1/4 MIC 농도가병합된경우, nafcillin의 MIC가 0.5 μg/ml에서 μg/ml로감소하였고, 이때 FIC index=0.5로 synergistic effect가있었다. LAC 균주에서는 SAL200의 1/2 MIC 농도가병합된경우, vancomycin의 MIC가 1 μg/ml에서 0.5 μg/ml로감소하였고, SAL200의 1/4 MIC 농도가병합된경우에도, vancomycin의 MIC가 1 μg/ml에서 0.5 μg/ml로감소하였으나, 각각의 FIC index=0.625 와 0.563으로 synergism까지는관찰되지않았다. SAL200의 1/2 MIC 농도가병합된경우, vancomycin의 MBC가 2 μg/ml에서 0.5 μg/ml로감소하였고, 이때 FBC index=0.5로 synergistic effect가있었다. 다른균주들에서도 SAL200을 MIC 미만의농도로병합하더라도 vancomycin 과 nafcillin의효과를상승시키는경향을관찰할수있었다. 29

41 Figure 3. a) Combination MICs for SAL200 and Nafcillin 1 Newman SAL200 Concentration ( μg / ml ) Newman Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC SA1 Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 2 SA1 SAL200 Concentration ( μg / ml ) 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC

42 3 ATCC LAC SAL200 Concentration ( μg / ml ) ATCC Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC LAC Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration SAL200 Concentration ( μg / ml ) 8 MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC

43 5 ATCC ATCC B1707 SAL200 Concentration ( μg / ml ) ATCC Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC ATCC B1707 Nafcillin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration SAL200 Concentration ( μg / ml ) 8 MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC MIC: minimal inhibitory concentration; C-MIC: MIC in combination; FIC: fractional inhibitory concentration; numbers in the table: FIC 32

44 b) Combination MICs for SAL200 and Vancomycin 1 Newman 2 SA1 SAL200 Concentration ( μg / ml ) Newman Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC SA1 Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration SAL200 Concentration ( μg / ml ) 8 MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC

45 3 ATCC LAC SAL200 Concentration ( μg / ml ) ATCC Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC LAC Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration SAL200 Concentration ( μg / ml ) 8 MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC

46 5 ATCC SAL200 Concentration ( μg / ml ) ATCC Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC ATCC B1707 SAL200 Concentration ( μg / ml ) ATCC B1707 Vancomycin Concentration ( μg / ml ) C-MIC FIC 32 MIC 16 MIC 8 MIC 4 MIC 2 MIC 1 MIC 1/2 MIC 1/4 MIC 1/8 MIC 1/16 MIC 1/32 MIC 0 Final Concentration MIC MIC MIC MIC /2 MIC /4 MIC /8 MIC C-MIC FIC MIC: minimal inhibitory concentration; C-MIC: MIC in combination; FIC: fractional inhibitory concentration; numbers in the table: FIC 35

47 Figure 4. a) Combination MBCs for SAL200 and Nafcillin 1 Newman 2 SA1 36

48 3 ATCC LAC 37

49 5 ATCC ATCC B1707 MBC: minimal bactericidal concentration; C-MBC: MBC in combination; FBC: fractional bactericidal concentration; numbers in the first row - FBC; numbers in brackets numbers of grown colonies 38

50 b) Combination MBCs for SAL200 and Vancomycin 1 Newman 2 SA1 39

51 3 ATCC LAC 40

52 5 ATCC ATCC B1707 MBC: minimal bactericidal concentration; C-MBC: MBC in combination; FBC: fractional bactericidal concentration; numbers in the first row - FBC; numbers in brackets numbers of grown colonies 41

53 Table 3. Combination MICs for SAL200 and Nafcillin Minimum Inhibitory Concentrations (μg/ml) Strains SAL200 Nafcillin SAL/Nafcillin Interpretation FIC index ATCC /4 Indifferent ATCC B /2 Synergistic LAC /4 Synergistic 0.5 SA /0.063 Indifferent 1 Newman /0.125 Synergistic 0.5 ATCC /0.016 Indifferent ATCC, American Type Culture Collection 42

54 Table 4. Combination MICs for SAL200 and Vancomycin Minimum Inhibitory Concentrations (μg/ml) Strains SAL200 Vancomycin SAL/Vancomycin Interpretation FIC index ATCC /0.031 Indifferent ATCC B /0.5 Synergistic 0.5 LAC /0.063 Indifferent SA /0.063 Indifferent Newman /0.5 Synergistic 0.5 ATCC /0.25 Synergistic ATCC, American Type Culture Collection 43

55 Table 5. Combination MBCs for SAL200 and Nafcillin Minimum Bactericidal Concentrations (μg/ml) Strains SAL200 Nafcillin SAL/Nafcillin Interpretation FBC index ATCC /128 Synergistic 0.5 ATCC B /4 Synergistic 0.25 LAC /8 Synergistic 0.5 SA /0.125 Indifferent 0.75 Newman /0.125 Synergistic 0.5 ATCC /0.125 Synergistic ATCC, American Type Culture Collection 44

56 Table 6. Combination MBCs for SAL200 and Vancomycin Minimum Bactericidal Concentrations (μg/ml) Strains SAL200 Vancomycin SAL/Vancomycin Interpretation FBC index ATCC /1 Indifferent ATCC B /1 Synergistic LAC /0.5 Synergistic 0.5 SA /0.125 Indifferent 0.75 Newman /1 Synergistic ATCC /0.5 Synergistic 0.5 ATCC, American Type Culture Collection 45

57 나. 리신과표준항생제를이용한 time-kill assay 각균주를 MIC와 MIC보다낮은농도의표준항생제, SAL200, 또는표준항생제와 SAL200의조합에노출시켜배양하였을때, SAL200에노출이된경우에는배양시작후 30분정도경과하였을때 bactericidal 한수준으로균의성장이억제되는것을볼수있었다. (Figure 5, 6) MIC보다낮은농도의표준항생제에만노출이된경우에는각균주의성장억제가미미하였으나동일한농도의표준항생제를 SAL200과병합하여투여하였을때에는배양시작후 30분정도경과하였을때 bactericidal 한수준으로균의성장이억제되었다. 또한, 균주마다다소의차이는있었으나, LAC, Newman, ATCC 균주에서는 6시간이지난시점까지배양을지속하였을때, 배양시작할때의 inoculum 보다, 그리고, 각항생제단독으로노출된경우의 inoculum 보다 2-log 10 이상감소되어 SAL200이각표준항생제와병합되었을때상승작용이있음을관찰할수있었다. ATCC 33591에서도유사한경향은확인되었으나시간이지남에따라균의억제가유지되지는않았다. LAC과 ATCC 균주의 SAL200과 vancomycin에대한 time-kill curve와, Newman과 ATCC 균주의 SAL200과 nafcillin에대한 time-kill curve는각각 Figure 5와 Figure 6에제시하였다. 46

58 Figure 5. Time-Kill Curves of MRSA strains, LAC and ATCC 33591, Treated with Buffer, MIC- or submic- Concentrations of either SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 and Vancomycin. a) LAC 47

59 b) ATCC Vanco: Vancomycin, SAL: SAL200 48

60 Figure 6. Time-Kill Curves of MSSA strains, Newman and ATCC 29213, Treated with Buffer, MIC- or submic- Concentrations of either SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin. a) Newman 49

61 b) ATCC NAF: Nafcillin, SAL: SAL200 50

62 3. 황색포도알균균혈증 mouse 모델에서리신과 표준항생제치료효과 5-6 주령의 BALB/c mouse 암컷의복강내에 logarithmic growth phase 의균 1.0 x 10 9 CFU/mouse 를주사하여치명적인수준의 균혈증을유도한후각각 SAL200, 표준항생제, buffer, SAL200과표준항생제, 4개의실험군으로구분하여처치하였다. 실험개체들은균주입후 72시간동안관찰하여사망여부를확인하였는데, MRSA 균주 LAC을감염시킨개체들은모두생존하고, MSSA균주 Newman을감염시킨개체들중 buffer를처치한대조군에서만사망률 85.7% 로사망이발생하여처치군간에사망률의차이는확인할수없었다. MRSA 균주 LAC 을감염시킨개체들에서는투약후 1 시간이경과하였을때, buffer 만투여한대조군보다 SAL200 만투여한군 (3.385 vs ; P=0.009) 과 SAL200 을 vancomycin 과함께투약한군 (3.385 vs ; P=0.016) 에서균혈증의정도가유의하게감소하였다. MSSA 균주 Newman을감염시킨개체들에서는대조군에비하여 SAL200만투여한군 (3.437 vs ; P=0.025) 과 nafcillin만투여한군 (3.437 vs ; P=0.021), SAL200을 nafcillin과함께투약한군 (3.437 vs ; P=0.012) 에서모두투약후 1시간째에균혈증이 51

63 유의하게감소하였지만, 대조군을제외한각처치군간에는유의한차이가없었다. 균감염후 72시간째에비장내균농도로평가한전이성감염의정도는 MRSA 균주 LAC을감염시킨개체들에서대조군에비하여각처치군 (SAL200, vancomycin, SAL200과 vancomycin) 의균농도가유의하게낮았다 (7.853 vs 6.020; P=0.007, vs 4.794; P=0.009, vs 3.771; P=0.003). 또한, vancomycin과 SAL200을병합투여한군에서균혈증의정도가 vancomycin만단독으로투약하거나, SAL200만단독으로투약한군보다유의하게낮았다 (2.360 vs ; P=0.028, vs ; P=0.002). 표준항생제로 nafcillin을사용한 MSSA 균주감염개체들에서는대조군의조기사망률이높고, 사망개체들의전이병소균농도를측정할수없어대조군과각치료군을직접비교할수없었지만, 치료군들간에비장의균농도를비교하였을때에는, MRSA 감염개체들과유사하게표준항생제와 SAL200을병합투여한군에서표준항생제만단독으로투여한군보다비장의균농도가유의하게낮았고 (4.087 vs ; P=0.015), SAL200만단독으로투약한군과비교하였을때에도낮았다 (4.087 vs ; P=0.074). 투약후 1시간이경과하였을때균혈증의정도와감염 72시간경과후전이성감염의정도는 Figure 7과 Figure 8에제시하였다. 52

64 Figure 7. a) Bacterial Density in Blood, 1 hour after Treatment with Buffer, SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 and Vancomycin in Mice Infected Intraperitoneally with MRSA Strain LAC. 53

65 Figure 7. b) Bacterial Density in Blood, 1 hour after Treatment with Buffer, SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin in Mice Infected Intraperitoneally with MSSA Strain Newman. 54

66 Figure 8. a) Bacterial Density in Spleen, 72 hours after Intraperitoneal Infection with MRSA Strain LAC in Mice Treated with Buffer, SAL200, Vancomycin, or Combinations of SAL200 and Vancomycin. 55

67 Figure 8. b) Bacterial Density in Spleen, 72 hours after Intraperitoneal Infection with MSSA Strain Newman in Mice Treated with Buffer, SAL200, Nafcillin, or Combinations of SAL200 and Nafcillin. (Splenic bacterial density in the dead mice from the control group was presumed to exceed 7.5 log 10 CFU/g.) 56

68 IV. 고찰 황색포도알균의항생제내성이증가함에따라황색포도알균감염증의항생제치료가어려워지고있고, 항생제내성의문제를극복하고자최근파지를이용한치료가다시주목받고있다 (14, 18, 23, 26). 본연구는새로운항생제후보물질인리신 SAL200을황색포도알균감염증의치료에이용할수있을지평가하기위하여진행하였다. 대표적인황색포도알균균주들을이용하여 MIC, MBC를측정하였고, SAL200이황색포도알균을효과적으로억제할수있는것을확인하였다. 항-황색포도알균표준항생제들과 SAL200의병합치료효과를대표적인황색포도알균균주들을대상으로 in vitro assay와균혈증 mouse 모델을이용하여평가하였고, 균주에따라결과가다소상이하기는하나, 병합치료에서상승효과를기대할수있음을확인할수있었다 : ATCC 33591, LAC, Newman 균주에서는 nafcillin과 SAL200을사용한 checkerboard assay에서 FIC 0.5 로확인되어상승효과를확인하였고, ATCC B1707, SA1, ATCC 균주에서는상승효과를증명하지는못하였으나, 0.5< FIC 1 로 57

69 확인되어단독으로사용하는것보다는함께사용하였을때치료효과가더해질것으로생각된다. Vancomycin과 SAL200을사용한 checkerboard assay에서도유사한결과가확인되었으며, 상승효과가증명되지않은 ATCC 33591, LAC, SA1 균주에서는 FIC가각각 0.515, 0.563, 로확인되어상승효과의정의에부합하는결과를보이지는않았어도병합치료로추가적인효과를기대해볼수있다고생각된다. Time-kill assay를시행한모든균주에서최소억제농도의표준항생제에노출된경우에는 6시간정도경과하였을때배양시작균농도보다감소하는경향이확인되는반면, SAL200에노출된경우에는최소억제농도에미치지못하더라도 30분이내에균농도가 3-log 10 CFU 이상감소하는것을확인할수있어서리신의작용기전에부합하는즉각적인살균효과를볼수있었다. SAL200에만노출이되는경우에는살균효과가지속되지않고, 배양시간이지남에따라균농도가다시증가하는것을볼수있었고, SAL200의농도가낮을수록균농도가다시증가하는속도가빠른경향을보였다. SAL200과표준항생제에함께노출된경우에는, 균주에따라정도의차이는있으나, SAL200에만노출이되는경우보다균억제효과가시간이지나도보다오래유지되었다. Checkerboard assay의결과와 time-kill assay의결과가완전히 58

70 일치하지는않았는데, 이는 SAL200의반감기와작용시간때문으로생각해볼수있다. Time-kill assay에서 SAL 1 MIC에노출된경우보다 SAL 1/2 MIC에노출된경우, 일시적인살균효과이후에균농도의상승이더빠르고급격한것을확인하였는데, 이러한농도의존적살균효과도이를뒷받침한다. SAL200에균이노출되면즉각적으로용균으로인한살균작용이일어나서균의농도가빠르게줄어들지만, 반감기도매우짧기때문에균억제효과가지속되지는않는다. 즉, 초기균농도가 SAL200의농도에비하여높아서충분한살균작용을하지못한경우에는시간이지남에따라 SAL200에의해살균되지못한균들이다시증식하여균농도가상승하는것으로생각해볼수있다. 따라서, 24시간경과한시점에한번결과를판독하는 checkerboard assay에서는살균되지못한균이다시증식할만한충분한시간이경과하였을때의결과를판독하게되므로, 상대적으로 SAL200의효과가축소되는반면, 6시간동안진행한 time-kill assay는이른시점에서부터살균작용의정도를정량하므로작용시간과농도에따른 SAL200의효과를반영해준다. Mouse 균혈증모델에서는처치군에따른사망률의차이는확인할수없었으나, in vitro assay에서확인된것과같이 SAL200은정맥주사한후빠르게균혈증을감소시켰으며, 이효과는시간이경과한후에도유지되어, 전이병소의형성도 59

71 억제시켰다. SAL200을 vancomycin과병합투약한경우에는 vancomycin을단독으로투여한경우보다투약후 1시간째균혈증이유의하게감소하였으나, SAL200을단독으로투여한경우에비하여는유의한차이를보이지않았다. 이는 SAL200과 vancomycin의반감기와작용시간의차이때문으로생각해볼수있다. 즉, 투여후 1시간이경과한시점에아직 vancomycin은살균효과를충분히하지못한반면, SAL200은빠르게살균효과를보여, SAL200 투여여부에따라균혈증의농도차이가저명했다고볼수있겠다. SAL200과 nafcillin을사용한실험의결과도이가정을뒷받침해주는데, nafcillin은비교적작용시간이빨라, 투여후 1시간째에모든치료군에서대조군에비하여는유의한균혈증감소가확인되는반면, 치료군간에통계적으로유의한균혈증농도차이는확인되지않았다고생각해볼수있다. 표준항생제로 nafcillin을사용한 MSSA 균주감염모델에서는대조군의사망률이높아대조군에서의전이병소균농도를측정할수없었지만, 사망개체들은균농도가사망으로이어질만큼높다 (7.5 log 10 CFU/g) 고가정하여비교하면, 대조군에비하여각처치군 (SAL200, nafcillin, SAL200과 nafcillin) 의균농도가유의하게낮았다 (7.500 vs 5.956; P=0.009, vs 5.426; P=0.020, vs 4.087; P=0.003) (Figure 7. b)). 60

72 본연구에서와같이리신을항생제와병합사용하거나, 서로다른리신을병합투여하였을때살균효과의상승작용을보고한연구들이몇몇있다 (15, 22, 26). 서로다른리신의병합투여로인한상승효과는리신마다 peptidoglycan 내에서작용하는부위가달라, 병합사용으로용균효과가배가되었을것으로추정하고있으나 (39), 아직까지리신과항생제병합투여에서보이는상승효과의기전은잘밝혀져있지않고 (23), 항생제들과다른리신의작용기전이기여할것으로추측하고있다. Daniel A 등은리신 ClyS을 oxacillin 또는 vancomycin과함께투여하였을때쥐콧구멍안에집락화된 MRSA를더효과적으로감소시키는것을확인하였고, in vitro assay와 MRSA 균혈증 mouse 모델에서도리신 ClyS와 oxacillin 또는 vancomycin을병합투여하였을때상승작용이유도된다는것을확인하였다 (38). 이들은세포벽합성을억제하는항생제들 (cell wall active antibiotics) 이세균내부의 peptidoglycan hydrolases와 autolysins의발현을증가시키고, 결과적으로세포벽 peptidoglycan을약화시키는데, 이런상태에리신까지투여되면세균의 cell wall 파괴가더촉진되어용균으로진행된다는가설을제시하였다 (38). Schuch 등도유사한연구방법으로다른항-황색포도알균리신인 CF- 301을항-황색포도알균표준항생제들과병합투약하였을때상승작용이있는것을확인하였다 (47). 이들은황색포도알균 61

73 균주를 MIC미만의저농도리신에노출시킨상태에서표준항생제를투약하면세균벽에항생제부착이촉진되는것을형광표지자를부착한항생제를이용하여확인하였고, 이를바탕으로리신투약이 MIC에미치지못하는낮은농도에서도 peptidoglycan내의결합을충분히분열시켜세균내로항생제의침투가용이해지는효과를가져올것이라고가정하였다 (47). 이와같이구체적인기전은다소다르더라도, 리신이세포벽에작용하여 cell-wall active antibiotics의활성이증가할수있도록도움을줄것으로상승효과를설명하고있으나, cell-wall active antibiotic이아닌항생제와파지의병합요법이상승효과가있다는연구도있어다양한기전이항균효과상승작용에관여할가능성도있어보인다. Chhibber 등은쥐당뇨발감염모델에서파지를 linezolid와함께투여하였을때각각단독으로투여하였을때보다치료효과가좋은것을창상의균감염정도뿐만아니라조직병리소견, 치료속도를통하여확인하였다 (37). 해당연구의연구자들은정균작용이있는 linezolid가균의증식을억제하고, 파지가억제된균을정화시켜, 감염증이자리잡는것을막아서병합치료가더효과적일가능성이있다고추측하였다 (37). 이외에도파지또는리신의항균효과가종특이적용균작용에서비롯된다는점을고려하였을때, 파지또는리신이빠르게세균감염증에서 inoculum dose를줄여 62

74 항생제가더효과적으로작용할수있도록촉진하는효과가있을것으로도추정해볼수있겠다. 리신은다른대사과정이필요하지않고, 직접세균에부착하여용균을유도하는원리로살균작용을하므로, 세균의세포주기와무관하게빠른살균효과를갖는것이장점으로꼽힌다 (22, 23, 26). 하지만, 용균과정에서 peptidoglycan과각종 toxin을비롯한세균유래물들이다량방출되면, 이들이숙주의 cytokine 생성과염증반응을촉진시킬수있다는우려가있고, 실제로심내막염 rat 모델에서리신을지속적으로정주한후혈중 cytokine 수준을측정하였을때, 고용량의리신을투약한경우에는 cytokine 수준이저용량으로투약한경우보다높은것이확인되었다 (31). 본연구에서도 SAL200을 mouse에게투약한후관찰해보았을때, 30여분이경과하면, SAL200을투여받은개체들이 buffer 또는항생제만투여받은개체들보다전신적인상태가더나빠보이는것을확인할수있었다. SAL200을투여받은실험개체들의상태악화원인에대한객관적인평가를하지는못하였으나, 리신투약후용균작용이대량으로진행되면서 cytokine storm이발생한것일가능성이있겠다. 파지나리신을황색포도알균감염증에이용하면, 항생제부작용의우려없이항생제내성의문제를극복할수있을것으로기대하고있고 (20, 22), 인공물관련감염증에서와같이 63

75 생체막을형성하고있는경우나 (52, 53), 허혈성변화를동반한창상감염에서도충분한치료효과를기대할수있다는자료들이있어 (17, 28, 52, 53) 현재항생제치료의여러제한점을극복할수있을것으로기대되는바가크다. Pincus 등이최근에발표한연구에서는숙주의면역상태에따라파지요법의효과가달라질수있다는것을피부감염 mouse 모델을통하여확인하였고, 배지를이용한 in vitro 실험과동물모델에서는항균효과를보이던파지가사람의전혈에서실험을하였을때에는항균효과가재현되지않는결과를보여주었다 (54). 이는치료효과가파지나리신자체의항균작용뿐만아니라숙주내환경의영향을받는다고해석해볼수있겠으며, 감염병소에따라파지치료효과가상이할수있다는것을보여준다고할수있겠다. 다양한리신과파지의항균작용을 in vitro assay와동물모델에서확인한연구는상당수있으나, 이를실제로사람에서사용한자료는여전히매우제한적이다. 하지만, 사람의체내는 in vitro 환경과달리매우복잡하며, 사람의면역체계는실험동물들과도상당한차이가있어전임상연구에서항균효과를보인파지나리신을사람에게투약하였을때에도동일한효과를거둘수있을지확신을갖기는어렵다. 이때문에, 유력한항생물질후보인리신을실제로감염증환자들에서투약하여항생효과가 64

76 재현되는지확인하는것이필요하겠다. 본연구에서는높은 inoculum dose로균혈증 mouse 모델을제작하여리신과항생제의항균효과를균혈증과전이병변을정량하여평가하였고, 리신과항생제를병합투여하였을때유의하게균혈증과전이병변이감소하는것을확인하였다. 균혈증은그자체로위험한감염증이며, 전이병변이형성되는경우에는항생제치료만으로충분한효과를보기어려운경우가많으므로, 본연구결과를바탕으로, 균혈증이지속되거나전이병변이형성되어항생제치료만으로충분한치료효과를기대하기어려운환자들이리신병합투여를시도해볼수있을것으로생각한다. 65

77 V. 결론 결론적으로, 본연구에서는황색포도알균특이적파지 SAP- 1에서분리된리신 SAL200이황색포도알균에대하여억제및살균작용을한다는것을 in vitro 와 in vivo에서확인하였다. 특히, SAL200을황색포도알균감염증의표준치료제와함께사용하였을때상승작용을한다는것을확인하였고, 이는균혈증자체뿐만아니라전이성병소형성도억제하는효과를보여, 그동안표준치료에도반응이좋지않았던중증황색포도알균감염환자들에게항생제와함께리신치료를적용하면, 지금보다치료성적을향상시킬수있을것으로기대한다. 66

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88 Abstract Effect of phage endolysin SAL200 in combination with antibiotics for Staphylococcus aureus infection Nak-Hyun Kim, M.D. Department of Clinical Medical Sciences The Graduate School Seoul National University College of Medicine Introduction: Staphylococcus aureus is a major human pathogen capable of a wide spectrum of diseases. As clinical S. aureus strains are evolving resistance to anti-staphylococcal antibiotics, phage and phage-derived endolysins are growing back into focus for antistaphylococcal treatment. Many phage and endolysins have shown promising results in in vitro and in vivo studies. This study was designed to assess the anti-staphylococcal effect of the endolysin SAL200, isolated from the bacteriophage SAP-1, in combination 77

89 with standard-of-care (SOC) anti-staphylococcal antibiotics. Methods: Well characterized S. aureus strains were tested for SAL200 minimal inhibitory concentrations (MICs) and minimal bactericidal concentrations (MBCs) by broth microdilution (BMD) methods. MICs and MBCs for SAL200 and SOC anti-staphylococcal agents in combination were assessed by a BMD checkerboard assay. The rate of antimicrobial activities of SAL200 and SOC antistaphylococcal agents in vitro were assessed by time-kill assays. A murine bacteremia model was used to assess the antimicrobial activities of SAL200 with SOC anti-staphylococcal agents in vivo, by measuring bacterial density in the blood 1 hour after treatment and by measuring the bacterial load in metastatic foci 72 hours after infection. Results: In all S. aureus strains tested, the MICs and MBCs of SOC antibiotics decreased in the presence of SAL200: Synergistic effects by means of fractional inhibitory concentration (FIC) indices, in the combination of SAL200 and nafcillin, could be observed in the strains ATCC B1707, LAC, Newman (FIC indices were 0.375, 0.5, and 0.5, respectively). The combination SAL200 and vancomycin resulted in synergism in the strains ATCC B1707, Newman, ATCC 78

90 29213 (FIC indices were 0.5, 0.5, and 0.375, respectively). Synergistic effect by means of fractional bactericidal concentration indices could be observed in the strains ATCC 33591, ATCC B1707, LAC, Newman, ATCC in the combination of SAL200 and nafcillin, and in the strains ATCC B1707, LAC, Newman, ATCC in SAL200 combined with vancomycin. Sub-MIC doses of SAL200 and SOC antibiotics were found to have minimal killing activity against S. aureus strains tested individually. However, when the same doses were used in combination, killing activity increased substantially reaching bactericidal level within 30 minutes of action. In the strains LAC, Newman, ATCC 29213, a sustained decrease >2-log10 in CFU/mL was observed between the combination and each antibiotic after 6 hours of culture. In a bacteremia mouse model using the LAC strain as infective agent, compared to the control group, the groups treated with SAL200 or the combination of SAL200 and SOC antibiotics showed a statistically significant reduction of bacterial CFU in blood within 1 hour of treatment ((3.385 vs ; P=0.009) and (3.385 vs ; P=0.016)). In mice infected with the Newman strain, compared to the control group, mice treated with SAL200(3.437 vs ; P=0.025), mice treated with SOC antibiotics (3.437 vs ; P=0.021), and mice treated with the combination of SAL200 and SOC antibiotics 79