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2 이학석사학위논문 효모의새로운유전자 HUD1 에대한기능연구 Funtional characterization of a novle gene, HUD1 in Saccharomyces cerevisiae 2008 년 2 월 인하대학교대학원 생명과학과 최도희

3 이학석사학위논문 효모의새로운유전자 HUD1 에대한기능연구 Funtional characterization of a novle gene, HUD1 in Saccharomyces cerevisiae 2008 년 2 월 지도교수배성호 이논문을석사학위논문으로제출함

4 Funtional characterization of a novle gene, HUD1 in Saccharomyces cerevisiae by Do-Hee Choi A THESIS Submitted to the faculty of INHA UNIVERSITY in partial fulfilment of the requirements for the degree of MASTER OF BIOLOGICAL SCIENCES Department of Biological Sciences February 2008

5 이논문을최도희의석사학위논문으로인정함 년 2 월 주심 부심 위원

6 Abstract The HUD1 (YLP033C) gene was originally identified by screening Saccharomyces cerevisiae genes that play a role in DNA metabolism and/or in genome stability using the SOS system of Escherichia coli. Using a tandem affinity purification method, we identified YPL033C gene product among the yeast proteins that were co-purified with MCM helicase. The hud1 deletion mutant was resistant to a chemical that inhibits the nucleotide metabolism and the dntp pool of the hud1 deletion mutant was not reduced in the presence of hydroxyurea. Yeast mutant cells with a deletion in the hud1 gene showed much faster growth rate at low temperature (16 ) than the wild type cells whereas there was no difference in growth rate at 30. Deletion of the HUD1 gene partially suppressed the defect of pol32δ, rad9δ, rad17δ and rad24δ, and suppressed the lethality of mutation of the essential S phase checkpoint genes, lcd1δ, and rad53δ. These results suggest that HUD1 may be involved in nucleotide metabolism and may genetically interact with the S phase checkpoint system. i

7 국문요약 HUD1 (YPL033C) 은 Sccharomyces cerevisiae의유전자중대장균의 SOS induction assay를통해 DNA대사나염색체안정성에영향을미치는유전자를찾는과정에서발견되었다. 본연구에서는 tandem affinity purification 방법을이용하여 Mcm helicase와함께정제되는단백질을조사하였고, 그결과 Hud1 단백질을동정하였다. HUD1 이삭제된효모는 nucleotide 생합성을방해하는 화학물질에내성을나타내었으며, hydroxyura를처리하였을때 dntp양이감소하지않았다. HUD1 삭제돌연변이는 30 에서는야생형과성장의차이가없었지만, 저온에서는훨씬잘자라는것을관찰하였다. HUD1 삭제돌연변이는 pol32δ, rad9δ, rad17δ, rad24δ 돌연변이의표현형을부분적으로억제하였으며, lcd1δ, rad53δ의치사성을억제하였다. 이러한결과를바탕으로 HUD1은 nucleotide 생합성에관여할것으로추측된다. 또한 POL32와 S기 checkpoint와간접적으로상호작용할것으로추측된다. ii

8 목 차 영문요약 ⅰ 국문요약 ⅱ 목차.. ⅲ Table 목차 ⅵ Figure 목차... ⅵ 서론 DNA복제 1 2. Cdc45-MCM-GINS complex (CMG complex) 2 3. 자연적인단백질복합체정제 4 4. dntp pool과 DNA 복제조절 4 5. S기 checkpoint 6 6. HUD1.7 재료및방법 8 1. 효모균주 8 2. 배지및배양 8 iii

9 3. Primer 효모형질전환 효모염색체 DNA 추출 Silver staining 유전자제거 효모교배및포자분리 세포주기동조화 자연적인단백질복합체정제 TAP tag 융합및확인 배양및세포주기동조화 TAP method를이용한단백질복합체정제 단백질복합체정제확인 펩타이드동정 Deoxynuclotide triphospate(dntp) pool 측정 유전자재조합 Hud1 재조합단백질정제 20 결과 Cdc45복합체, GINS복합체와 Mcm2-7복합체정제 HUD1과 nucleotide 생합성의관련성 HUD1과 DNA대사에관련된유전자의유전적상호작용 hud1δ의비가역성 Hud1 단백질정제 36 iv

10 결론 단백질복합체정제 Cdc45, Mcm4, Psf HUD Nucleotide 생합성과관련성 POL32 와관련성 S 기 checkpoint 와관련성 돌연변이의비가역성 41 참고문헌 42 v

11 TABLE 목차 Table 1. Saccharomyces cerevisiae strain 9 Table 2. Primer 11 FIGURE 목차 Figure 1. Isolation of protein complex using TAP 23 Figure 2. Phenotypes of the hud1δ mutant. 26 Figure 3. The effect of HU on dntp pools in cells. 28 Figure 4. The hud1δ recuses the cold & HU sensitivity of pol32δ 30 Figure 5. HUD1 is involved in the regulation of S phase checkpoint 32 Figure 6. Irreversible phenotype of hud1δ mutant 35 Figure 7. Purification of Hud1 protein 37 vi

12 서론 1. DNA 복제 가장단순한원핵생물부터매우복잡한포유류에이르기까지, 모든생물에게정확한 DNA복제는생명유지와번식에필수적이다. DNA복제는세포주기에따라단계별로이루어지며, 정확한 DNA복제를위해각세포주기마다엄격하게조절된다 (1, 2, 4). S기는실질적으로 DNA가복제되는시기로, 엄격한조절을받아세포내모든 DNA가정확하게모두복제된다 (3). 염색체내에는 DNA 복제가시작되는염기서열인복제원점 (Replication origin) 이존재한다. 복제원점은생물에따라염기서열과수가매우다양하다. 본연구에서는효모를대상으로실험을하였다. 효모에서는다음과같이 DNA 복제가이루어진다. DNA 복제는 M 기후반부터 G1 기에 Origin Recognition Complex(ORC) 가복제원점에결합하는것으로부터시작된다. 복제원점에결합된 ORC 는 DNA 복제에필요한단백질이결합하는기본적인장소를제공하며, 그 위에 Cdc6 와 Cdt1 이결합하고, 그후에 Mcm2-7 복합체가복제원점에결합한다 (1, 2, 4). 이렇게형성된 Pre-replicative complexes(pre-rc) 에 Sld3 매개로 GINS복합체와 Cdc45가복제원점에결합하고 (5-7), 이외 DNA복제개시에필요한여러단백질이결합하여 Pre-Initiation Complexes(Pre-IC) 를형성한다. 여기에 DNA합성효소와다른여러단백질이참여하여, S기에 DNA 복제를시작하게된다 (1, 2, 4). 많은양의 DNA를신속하게복제하기위하여, 여러개의복제원점에서동시다발적으로복제가일어난다. 동시에 checkpoint에의해 DNA가정확하게복제되도록감시, 조절받는다. DNA는반보전적으로복제되므로, 우선이중가닥 DNA가반드시단일가닥 DNA로풀린후, 이를주형으로새로운 DNA가복제되어야한다. 이때 DNA를 풀어주는효소를 helicase 라한다. 매우많은양의 DNA 복제할때, helicase 로 작용하기위해서는강력한효소활성을나타내야한다. 원핵생물은 DnaB 가 - 1 -

13 DNA 복제시 helicase 로작용함이밝혀졌다 (41). 하지만진핵생물의 helicase 는 완전히밝혀지지않은상태이다. 하지만 Cdc45-MCM-GINS 복합체가그유력한 후보로지목되고있다 (8-10). 2. Cdc45-MCM-GINS complex (CMG complex) Cdc45-MCM-GINS complex (CMG complex) 는진핵생물에있어서, DNA복제시작용하는 helicase로유력하게지목되고있다. 이중 Mcm2-7복합체가핵심 helicase로여겨지고있으며 (4, 11), Cdc45와 GINS복합체는 helicase 활성을조절하는조효소로작용할것으로추측되고있다 (8, 9, 12, 22). Mcm2-7복합체의구성원들은출아효모에서 minichromosome 유지 (MiniChromosome Maintenance) 에필요한유전자로처음발견되었으며, Mcm2-7복합체는구조적으로연관이있는 Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6, Mcm7의여섯개단백질로이루어져있다. 이들은구조적으로유사하며, 모든진핵생물에서매우잘보존되어있다. Mcm2-7복합체는고리구조를이루며, Mcm-2,5,7과 Mcm-4,6,7 두개의부복합체로이루어져있다. Mcm2-7복합체는여러가지측면에서 DNA복제시작용하는 helicase로예측되나 in vitro에서강한 helicase 활성를관찰하지못하고있다. 이러한이유를두가지로여기고있다. 첫번째는 DNA가복제되는동안 Mcm2-7복합체가여러가지조절을받아효소활성을나타내기때문에 in vitro에서관찰하지못한다는것이고, 두번째는효소활성에추가적인구성원이필요하기때문일것으로생각하고있다. 전자의경우는실험으로확인하기가어려워, 많은사람들이후자에초점을두고연구를진행하고있다 ( 4, 12-14). 그연구결과, 최근에 Cdc45와 GINS복합체가 Mcm2-7복합체의조효소로밝혀졌으며 (7-10, 18, 19, 21), 실제로 Botchan MR의연구그룹에서초파리의 CMG복합체를정제하여 helicase 활성을관찰하였다 (9). Cdc45는저온민감성을나타내는세포주기진행돌연변이를찾는과정에서발견되었다 (15). DNA복제에필수적인유전자로 G1기에서 S기로전환에 - 2 -

14 필수적인유전자이다 (4, 15). Cdc45는 DNA합성효소와상호작용하여 DNA합성효소를 Pre-RC에참여시키는역할하며, Mcm2-7복합체와 DNA복제에관련된여러단백질들과상호작용하는것일밝혀졌다 (1, 4). 최근에 Cdc45가 Sld3의매개로 Pre-RC에결합한다는것이밝혀졌으나 (6), 아직정확한기능은밝혀지지않은상태이다. GINS는 2003년에밝혀진단백질복합체로, Sld5, Psf1, Psf2, Psf3의 4개의구성원으로이루어진단백질복합체이다. 이복합체는출아효모에서 DNA합성효소 ε를복제원점에결합시키는단백질인 Dpb11의돌연변이인 dpb11-1과함께존재할때치사성을일으키는돌연변이를찾는과정에서발견되었다. 이과정에서 Sld5 (Synthetic lethal with dpb11-1 5) 가처음발견되었고, Sld5와상호작용하는단백질로 Psf1 (Partner of Sld five 1), Psf2, Psf3이발견되었다. GINS복합체는 DNA복제개시와진행에필수적인역할을하는것으로밝혀졌다 (5). 뿐만아니라 GINS복합체가출아효모에서는 DNA합성효소ε과사람에서는 DNA합성효소α와 ε과상호작용하는것이밝혀졌다 (16, 17, 18). 또 Mcm2-7복합체와긴밀하게상호작용하는것도밝혀졌다 (18-20). 최근효모와사람에서 GINS 복합체와 Cdc45, Mcm2-7 복합체가 S기에상호작용하는것이밝혀졌을뿐만아니라 (18-20), Xenopus laevis의 egg extract에서는 plasmid의이중가닥 DNA가풀리는자리에함께위치하는것과 (8). 효모에서 S기에 DDK의작용에의해 CMG 복합체의결합이더욱강해지는것이알려졌다 (19). 또 Pyrococcus furiosus에서 GINS 복합체가 Mcm2-7복합체의 helicase 활성을촉진하는것이밝혀졌다 (21). 초파리에서 Cdc45 항체를이용하여 CMG복합체를정제하였을때, CMG복합체가모두존재하는분획에서약한 helicase 활성을나타낸다. 반면 Xenopus에서 Cdc45에대한항체를처리하였을때, DNA가풀리는것이방해받는다 (22). 위사실들이 Cdc45와 GINS복합체가 Mcm2-7 복합체의조효소라는것을증명하고있다. 하지만 CMG복합체의 helicase 활성은매우약하다 (9). 이러한원인은 CMG복합체의 helicase 활성에필요한또다른구성원이필요하여나타나는현상으로보인다

15 3. 자연적인단백질복합체정제 Tandem Affinity Purification method CMG복합체의새로운구성원을찾기위하여, Cdc45, Mcm4, Psf1을이용하여단백질복합체를정제하였다. 이때새로운단백질이함께정제되는지조사하였다. 단백질복합체정제에사용한방법은 Tandem Affinity Purification method(tap) 이다. 이방법은효모를기반으로만들어진실험방법으로빠르고효율적을단백질복합체를정제할수있는방법이다. TAP method는친화성이매우높은 TAP tag을이용한다. TAP tag은두개의 Staphylococcus Protein A와 Calmodulin Binding Peptide(CBP) 가직렬로연결되어있고, 그사이에 TEV단백질분해효소인식자리가있다. Protein A는 IgG bead와매우강력하게결합하며, CBP는칼슘이온존재하에 calmodulin bead와특이적으로결합을한다. TAP tag을 Cdc45, Mcm4, Psf1에각각융합시킨다음, IgG bead와 calmodulin bead를순차적으로이용하여단백질복합체를정제하였다. IgG bead에서해리시킬때는 TEV단백질분해효소를이용하였으며, calmodulin bead에서해리시킬때는칼슘특이적인 chelating agent인 EGTA를이용하였다 (23, 24). 이실험을통하여 DNA복제에관련된유전자인 HUD1을찾았으며, 이유전자가삭제되면 Hydroxyurea 와저온에내성을가지는것을발견하였다. 4. dntp pool 과 DNA 복제조절 dntp양은 DNA복제동안, 세포주기별로조절이되며그비율또한일정하게유지된다 (25). G1기에 dntp의양이많게되면, pre-ic형성에영향을받아 S기로진행이방해받는다. S기에 dntp양이증가하면 DNA손상에내성을가지나, 과도하게증가하면 checkpoint가활성화되는것을억제하여오히려 DNA손상에민감성을나타내며 (26), DNA복제시잘못된 dntp가끼어들어돌연변이가증가한다 (25). 또 dntp들간의비율이맞지않아도돌연변이를유발한다

16 반대로 S기에 dntp의양이매우적으면 replication fork이원활히진행을할수없게되고, 단일가닥 DNA가길게노출됨에따라 checkpoint가유발된다 (27-29). 최근에는대장균에서 dntp 고갈이 DNA double strand break를유발한다는것이밝혀졌다 (30). Ribonuclotide reductase (RNR) 는 rndp를 dndp로환원시키는효소로서, dntp 생합성을조절하는가장중요한효소이다. 효모에는 deoxynucloside 를인산화시키는효소가없기때문에, dntp 생합성을 RNR에전적으로의존한다. 효모의 RNR은 class Ⅰ효소로, 모든진핵생물과몇몇원핵생물에서발견되며, 두개의큰 α구성원과두개의작은 β구성원으로이루어져있다. α구성원은기질의결합자리를제공하며 allosteric 효과를나타내는역할을하고, β구성원은효소활성자리를가지고있다 (31, 32). RNR은 DNA복제되는시기나 DNA가손상을입었을때, 세포내적당한 dntp를유지하기위해조절되는주된효소로서다양한조절을받는다. 효모에서는 RNR 유전자의전사조절, 단백질과 allosteric 효과에의한억제, RNR의세포내위치조절에의한조절을받는다 (31, 32). RNR의전사조절은 Mec1/Rad53 신호전달에의해 S기 checkpoint에이루어진다. Allosteric 효과를나타내는작용기로는 RNR의산물인 datp, dttp, dgtp와 ATP 가있다 (31, 32). RNR의효소활성을억제하는단백질은 Sml1으로, Mec1/Rad53에의해인산화되어활성화된후, RNR의큰구성원에결합하여 RNR의효소활성을억제한다 (31-33). Sml1은 RNR의억제자로서, Mec1과 Rad53의기능이결실되었을때나타나는치사성을억제하는돌연변이를찾는과정에서발견되었다 (31). Sml1은 S기와 DNA 손상후에양이현저하게감소하여, RNR이효소활성을회복하도록한다 (34). SML1이결손되면세포내 dntp 양이 2배이상증가하여, DNA손상에내성을가지게될뿐만아니라생존에필수적인 checkpoint 유전자인 MEC1, LCD1, RAD53이삭제될때나타나는치사성을억제한다 (31). Sml1처럼 RNR의효소활성을억제하는화학물질로 Hydroxyurea(HU) 가있다

17 HU는강력하게 RNR을억제하는물질로, 가역적으로 RNR의활성자리에영향을주어효소활성을억제하여 DNA복제를방해한다 (29, 35). 세포에 HU를처리하게되면세포내 dntp가고갈되어 S기의 replication fork이진행을멈추거나진행속도가느려져서, 세포가 S기에정체되고단일가닥 DNA가증가하게된다 (29, 36). 이때정제된 replication fork과길게노출된단일가닥 DNA, 고갈된 dntp가 Mec1/Rad53에의해매개되는 S기 checkpoint를활성화시키게된다 (27, 29, 37). 그에따라정체된 replication fork을안정화시키고 (36, 37), RNR 유전자의전사를촉진하며, S기후기에발현하는복제원점의개시는막는등원활한 DNA복제를위한여러가지변화가일어난다 (29, 32). 또 HU에의해 DNA double strand break도발생하므로 DNA수리를위한변화가일어나게된다 (30, 32, 36, 37). 5. S 기 checkpoint S기 checkpoint는 S기에 DNA에손상이생기거나 DNA 복제진행에문제가생겼을때이를해결하기위하여, S기진행을지연시켜문제점을회복할시간을벌어주고, 정체된 replication fork를안정화시키는신호전달경로이다 (37,38). Checkpoint는진핵생물에서매우잘보존되어있으며, Checkpoint는 4종류의단백질이관여하는것으로알려져있다. 첫번째는 PI3K-like checkpoint kinase로, 출아효모에서는 Mec1으로 Ddc2, Lcd1과상호작용하며, Ddc2와함께손상을입은 DNA에결합한다. 두번째는 PCNA-like 단백질복합체로출아효모에서는 Ddc1, Mec3, Rad17단백질이모여 PCNA와비슷한고리구조를이룬다. 이복합체는손상을입은 DNA에결합하며, 이때 Rad24-RFC 복합체가매개하여 Ddc1- Mec3- Rad17복합체를 DNA에결합시킨다. 손상된 DNA에각각독립적으로결합한 Mec1-Ddc2, Ddc1-Mec3-Rad17은신속하게 checkpoint 활성화를촉진시킨다. 세번째종류의 checkpoint 단백질은 adaptor 단백질인 Rad9이다. Rad9은 Mec1에의해인산화되고, 인산화된 Rad9은 Rad53과 Chk1의인산화를촉진시킨다. Rad53과 Chk1는 checkpoint 단백질중 4번째종류에속하는 effector kinase로 - 6 -

18 DNA복제에관련된단백질들을인산화시켜 DNA복제가원활히되기위한일련의현상들을유도한다 (3,38). Rad53은 replication fork 안정화, DNA수리에관련된유전자발현촉진, 복제원점개시방지, DNA 수리및 DNA복제재개를매개한다 (37). 6. HUD1 HUD1은효모의유전자중 DNA대사나유전자의안정성에영향을주는유전자를찾기위하여, 대장균에서 SOS induction assay를통해발견된유전자이다 (39). 이유전자는같은균류인 Ashbya gossypii 에만 homologue를가지고있을뿐, 다른진핵생물에는 homologue가없다 (NCBI, HomoloGene:49111). Hud1 단백질은 shot-chain dehydrogenase motof를가진것으로예측되고있다. 이번연구에서는 HUD1의기능을연구하기위하여, 효모에서 HUD1을삭제한후나타나는표현형을관찰하였다. 이표현형을바탕으로연구를진행하였다

19 재료및방법 1. 효모균주 본연구에서는출아효모인 Saccharomyces cerevisiae 를사용하였으며, YPH499, YPH501, W303 을유전적으로변형하여실험에사용하였다. 본연구에사용된 효모의종류는표로정리하였다.(Table 1) 2. 배지및배양 효모배양을위하여사용한배지는영양배지인 YPD배지 (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 와최소배지인 Synthetic Drop-out(SD) 배지 (0.17% yeast nitrogen base, 0.5% ammonium sulfate, 2% glucose, 0.055% Drop-out mix (Clontech)) 를사용하였다. 최소배지에는각실험마다필요한영양소 (0.2% uracil 또는 0.2% histidine 또는 0.2% tryptophan, 1% leucine) 나화학물질첨가하였다. 고체평판배지는 agar를 1.5% 되게넣어주어만들어사용하였다. 각효모의배양은다음과같이하였다. 고체평판배지는 30 에서는약 2~4일또는 15 에서약 5~6일동안배양하여콜로니가형성될때까지배양하였다. 액체배지는 14ml culture tube에 3ml, 또는삼각플라스크에전체볼륨의 1/5~1/2의배지를넣고 30 에서 250rpm으로흔들어주며배양하였다

20 Table 1.Saccharomyces cerevisiae strains Strain Genotype Method Source YPH499 MATa ura3-52 lys2-801 amber ade2-101 orchre trp1-δ63 his3-δ200 leu2-δ1 YPH500 MATα ura3-52 lys2-801 amber ade2-101 ochre trp1-δ63 his3-δ200 leu2-δ1 YPH501 MATa/MATα ura3-52/ura3-52 lys2-801 amber /lys2-801 amber ade2-101 ochre /ade2-101 ochre trp1-δ63/trp1-δ63 his3-δ200/his3- Δ200 leu2-δ1/leu2-δ1 W303-1α MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 FFT221 YPH499 bar1δ::leu2 CDC45-TAP:TRP1 PCR This study FGT211 YPH499 bar1δ::leu2 PSF1-TAP:TRP1 PCR This study YHD124 MATa MCM4-TAP:HIS3MX6 pep4δ::leu2 bar1δ::hisg his3 leu2 ura3 Yasuo et al (2006) DPD200-1a YPH500 hud1δ:: TRP1 Cross/ This study dissection YHM1 YPH499 sml1δ::ura3 Plasmid This study YHM2 YPH499 sml1δ::ura3 lcd1δ::his3 Plasmid This study DPM300 YPH??? hud1δ:: TRP1 lcd1δ:: HIS3 Cross/ This study dissection ARM531 YPH499 rad53δ ::HIS3 sml1δ::ura3 PCR This study BRM532 YPH500 rad53δ ::HIS3 sml1δ::ura3 PCR This study DPM61 YPH??? rad9δ::his3 hud1δ::trp1 Cross/ This study dissection DPM62 YPH??? rad17δ::his3 hud1δ::trp1 Cross/ This study dissection DPM63 YPH??? rad24δ::his3 hud1δ::trp1 Cross/ This study dissection CPM61 YPH501 rad9δ::his3 hud1δ::trp1 Cross This study DPM32 YPH499 pol32δ::ura3 hud1δ::trp1 PCR This study CPE001 YPH501 hud1δ::trp1 hud1δ::trp1 Cross This study - 9 -

21 3. Primer 야생형효모의유전자나유전자조작에필요한유전자를증폭하기위하여주문제작한 primer를사용하였다.. 유전자조작에사용된 primer와유전자조작여부를확인하기위하여사용한 primer는표로정리하였다. (Table 2) 본실험에사용된 primer는 Bioneer사에의뢰하여주문제작하였다. 4. 효모형질전환 효모의형질전환은 Lithium acetate/single strand Carrier DNA/PEG/DMSO method를이용하였다. 형질전환하고자하는효모를적당한액체배지 200ml에접종하고 600nm에서흡광도가 0.6이될때까지 30 에서배양한다. Plasmid를가진균주는적절한 SD배지에서배양하였으며, 그렇지않은경우는 YPD배지를이용하였다. 효모배양액을 3,000rpm에서 5분간원심분리하여균체를회수하였다. 균체를멸균수 50ml에현탁한후, 다시원심분리하여균체를회수하였다. 이와같은단계를 2회반복하여균체를씻어주었다. 여기에 10Χ TE buffer (100mM Tris 10mM EDTA ph 7.5) 150 μl, 10Χ LiAc buffer (1M Lithium acetate) 150 μl, 멸균수 1200 μl를넣고현탁하여 100 μl씩분주후사용하였다. 이렇게만들어진 competent cell을형질전환에사용하였다. competent cell에 carrier DNA(clontech, 50277) 70 μg, 형질전환을위한 selective marker를가진 plasmid 또는 PCR산물 10 μg을넣고 30 에서 30분간배양하였다. 그리고 40%PEG/1X TE/1X LiAc 혼합물 600 μl를첨가하고, 30 에서 200rpm으로흔들어주면서 30분간배양하였다. 다음에 DMSO(Sigma, D5879) 70 μl을넣고 42 에서 15분간 heatshock을주었다. 이후 13,000rpm에서 1분간원심분리하여균체회수후, 멸균수에균을현탁하여적절한 SD plate배지에도말후 30 에서약 2~4일간콜로니가형성될때까지배양하였다

22 Table 2. Primer Name Sequence RT7 5 GATTGTACTGAGAGTGCACC 3 RT8 5 TGTGCGGTATTTCACACCGC 3 Bar1-del1 5 TGGTTCGTATCGCCTAAAATCATACCAAAATAAAAAGA GTGTCTAGAAGGGTCATGATTGTACTGAGAGTGCACC 3 Bar1-del2 5 GCTATAAAGAAATTGTACTCCAGATTTCTTAATATGTT GGTTTACAGACATTTATTGT GCGGTATTTCACACCGC 3 Bar1-1 5 AGTGAAGAGAAAGCACGTCG 3 Bar1-2 5 CCAATGATATCAGTAAAACT 3 CTAP-U 5 TCCATGGAAAAGAGAAG 3 CTAP-D 5 TACGACTCACTATAGGG 3 Cdc45-CTAP- U 5 ACGTCGTGAAGATCTTTCACCATTCCTGGAGAAGCTGA CCTTGAG TGGATTGTTATCCATGGAAAAGAGAAG 3 Cdc45-CTAP- D 5 ATATGGTATTATTATAGAAAAGTTGGACTTAAAAGCTT GAAAAAGCTTAGATTTTTACGACTCACTATAGGG 3 Cdc TGGCTCATAGAATGCTGTGC 3 Cdc GACGGTAGTTGAAACAAC 3 Psf1- CTAP-U 5 CGTAAGGCAGTCTGATGTAGAGCGTTTGATTCAACAAG GTTATTTGCAGAAGATATCCATGGAAAAGAGAAG 3 Psf1- CTAP-D 5 GGAGTAAATTAGAATGGAGGTATGTATCTTGCTTTAT AAAGGATTATATATCATGTACGACTCACTATAGGG 3 Psf1-1 5 CCTTTCTCATCAAGAGCAGG 3 Psf1-2 5 TCAGAAACAGGATGCTTTAG 3 Hud1-del1 5 GAAAAACTGCGTATGTCCGAAGCACAGGTCCACTAGTA ATAGAGCCCAAAAATCTGATTGTACTGAGAGTGCACC 3 Hud 1-del2 5 TTGAATTATTTATAGAAATATATGTGCTTAGCAATTT TATCACTGTTACTTCGATTGTGCGGTATTTCACACCGC 3 Hud ATAGCACCGTTTTAGCAGTG 3 Hud ATTGGAGCTACCATCAGTAC 3 Hud CGCGGATCCATGAAGAAAACAATTTACAA 3 Hud CCGCTCGAGTTAAGTAAAAGAGCTTTTGA 3 Hud CGCCTCGAGAGTAAAAGAGCTTTTGAAAC 3 Hud CCGCTCGAGTATTGCCTTGGAGGAGAATC 3 Hud CGCGGATCCGTAGAATTGGGTTATCACTG CGGACGCTCGACGCCATTAATAATGTTTTC Oligonucleotide sequence of italic type is used for amplify the TAP tag and TRP1 gene of pbs1479. Underlined oligonucleotide sequence is used for amplify the yeast autotrophic marker of prs vector Dashed lined oligonucleotide sequence is the restriction enzyme site for cloning

23 5. 효모염색체 DNA 추출 효모의 genomic DNA는 TEN-Minute Method를이용하여추출하였다. 효모를액체배지 3ml에서포화상태까지배양하였다. 효모배양액 1.5ml을 1.5ml tube에원심분리하여회수후, 600 micron glass bead(sigma, G8772) 0.15g을넣고, TEN- Minute solution(10mm Tris ph8, Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 1mM EDTA) 100 μl, Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1) solution(usb, 75831) 100 μl을넣어주고 15분간격렬하게흔들어주었다. 그리고 13,000rpm에서 5분간원심분리후두층의액체층중윗층을회수하여실험에사용하였다 6. Silver staining 실험은모두상온에서실시하였으며, 모든단계에서 Rocker를이용하여흔들어주며반응하였다. 각단계마다 3차초순수를이용하여헹궈주었다. 실험의모든단계마다사용한용액의양은젤의크기에따라달리하였으며, 6cm Χ 8cm 젤은 50ml, 13cm Χ 14cm 크기의젤은 150ml씩사용하였다. 단백질시료를 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 한후젤을고정액 (50% methanol, 12% acetic acid, 0.5ml/L 37%formaldehyde) 에넣어 1시간이상고정시켰다. 3차초순수로 1번헹궈준후, 50% 에탄올을 20분간넣고씻어주었다. 다음은 0.2g/L Na 2 S 2 O 3 을넣고 1분간반응후, 3차증류수를이용하여 20초씩 3회씻어주었다. 그리고염색용액 (2g/L AgNO 3, 0.75ml/L 37% formaldehye) 를넣어주고 20분간반응후, 3차증류수로 20초씩 3회씻어주었다. 현상액 (60g/L Na 2 CO 3, 0.5ml/L 37%formaldehyde, 4mg/L Na 2 S 2 O 3 ) 를넣어주고약 10분간현상하였다. 단백질 band가적당히나타났을때현상액을버리고정지용액 (1% acetic acid) 으로바꿔준후보관하거나, 이후실험에사용하였다

24 7. 유전자제거 유전자제거는 Baudin A et al (1993). 의방법을변형하여사용하였다 (42). 특정유전자를제거하기위해서해당유전자의양쪽끝의약 55bp의상동성을가진부분 (5 말단 ) 과 prs vecor (Sikorski and Hieter, 1989) 의 selective marker부분을증폭할수있는부분 (RT7, RT8, 3 말단에위치 ) 을모두가진 primer와 prs vecor를주형으로 PCR하여증폭하였다. 증폭된유전자는양말단과삭제할유전자의말단의서열이같고, 그사이에 selective marker를가지고있다. 이증폭산물을이용하여형질전환을하면, 상동재조합에의하여효모내유전자가제거되고, marker가끼어들어가게된다. 유전자삭제의확인은다음과같은방법을따라하였다. 우선효모형질전환후형성된콜로니를적절한 SD 액체배지에서키운후 genomic DNA를추출하여주형으로사용하고, selective marker에특이적으로결합하는 primer(rt7 또는 RT8) 와효모의 DNA중삭제된유전자의주변에결합하는 primer를이용하여 PCR하여확인하였다. 본실험에서위방법으로삭제된유전자는다음과같다. YPH499의 HUD1 유전자는 TRP1 유전자로치환하였다. RAD53유전자는 SML1유전자나 HUD1 유전자가삭제된효모에서 HIS3유전자로치환되었다. W303-1α의 HUD1 유전자는 LEU2 유전자로치환하였다. YPH499와 YPH501의 BAR1 유전자는 LEU2유전자로치환하였다. 8. 효모교배및포자분리 유전자형이서로다른반수체효모를교배 / 포자분리하여, 두개이상의유전자가제거된효모를만들거나, 두가지이상의특정유전자형을가진효모를만들기위하여사용하였다. 우선유전자형과교배형이다르고서로다른 selective marker를가진반수체효모를 SD 액체배지에서포화상태까지배양후, 두효모배양액을 100 μl씩 1.5ml tube에혼합하였다. 효모의 selective marker가

25 없는 SD plate배지에 20 μl를떨어뜨린후 30 에서약 2~4일간배양하였다. 여기서형성된콜로니는유전자형이다른두반수체효모가배수체효모를형성하면서 selective marker가합쳐져자란효모이다. 이효모를동일한 SD plate에도말하여, selective marker를재확인한후다음실험을진행하였다. 확인이끝난배수체콜로니는액체 YPD배지 3ml에서포화상태까지배양후, 배양액 1ml의균체를회수하고멸균수를이용하여 1회씻어주었다. 그리고포자형성배지 (2% potassium acetate ph7.0) 3ml 옮긴후 25 에서 250rpm으로흔들어주면서약 3~7일배양하였다. 현미경으로포자형성상태를확인후, 효모의포자형성배양액 100 μl를원심분리하여균체를회수하였다. 여기에 0.5mg/ml zymolase(1m sorbitol에녹여짐 ) 10 μl를넣고 30 에서 2분간반응하여효모의외벽을약화시켰다. 그리고멸균수 600 μl를넣어 zymolase의효소활성을중지시키고효모현탁액을만들었다. YPD 평판배지의한쪽끝에서약 2cm 떨어진곳에직선을긋고, 선의한쪽끝에세포현탁액 20 μl을떨군후그선을따라흘려준다음완전히흡수될때까지기다렸다. 그후에효모미세조작기 (Singer MSM manual 100) 을이용하여포자를분리하였다. 분리된포자는 30 에서약 2~3일간배양하여콜로니를얻은후, 각콜로니가어떤 selective marker를가지고있는지확인하여유전자형을확인하였다. 9. 세포주기동조화 교배형이 MATa 인효모에서 BAR1 유전자를삭제하면, 교배시사용하는페로몬인효모 α-인자에민감성을가지게되며, 효모 α-인자에의해세포주기가 G1기에정체된다 (43). BAR1 유전자가결손된효모를 YPD 액체배지에서 600nm에서흡광도가 0.6~0.8이될때까지배양후 10mM 효모 α-인자 (Zymo research, Y1001) 을 50nM되게넣어준후 2~3시간동안배양하였다. G1기동조화여부는현미경으로효모가 shmoos를형성하는것을관찰하여확인하였다. S기의효모는다음과같은방법으로얻었다. G1기에정지된효모를 5,000rpm에서

26 10 분간원심분리하여균체회수후멸균수로 1 회씻어주었다. 그리고효모 α- 인자가없는 YPD 액체배지에현탁하여 30 에서 35 분간배양후, 5,000rpm 에서 10 분간원심분리하여균체회수하여실험하였다. 10. 자연적인단백질복합체정제 (Tandem Affinity Purification Method) TAP tag 융합및확인 Tandem Affinity Purification Method는자연적인단백질복합체를정제하는방법중한가지이다. 이번연구에서는 Gambus A et al.(2006) 과 Puig O et al.(2001) 의방법을변형하여사용하였다 (12, 23). 단백질복합체를정제하기위하여우선목표단백질의 C말단에 TAP tag을융합시켰다. TAP tag을융합은 Baudin A et al (1993). 의원리를 이용하였다 (42). 우선 Puig O et al 의방법을따라목표단백질에 TAP tag 을 융합시켰다. 해당유전자의 ORF의마지막부분중정지코돈을제외한 45bp또는 55bp의염기서열과 pbs1479의 C말단 primer A를연결시켜 CTAP-U primer를만들었다. 그리고 ORF로부터 50~200bp 떨어진곳의서열약 45bp나 55bp의염기서열과 pbs1479 의 C말단 primer B를연결시켜 CTAP-D primer를만들었다. 우선 pbs1479 을주형으로이용하고, CTAP-U 와 CTAP-D 를 primer 로사용하여 PCR하였다. 이렇게얻어진증폭산물은 TAP tag과 TRP1 유전자를가지고있다. 이 PCR 산물을효모에형질전환한후, 효모의염색체DNA 에특이적으로결합하는 primer 와 TAP tag 에특이적으로결합하는 primer 를이용하여 TAP tag이잘융합되었는지확인하였다. 그리고 Protein A를탐지하는항체인 PAP(Sigma, P1291) 을이용하여 western blot을하여, 단백질발현여부를확인하였다. 이번실험을위하여효모균주 FFT221(bar1Δ Cdc45-TAP), FGT221(bar1Δ Psf1-TAP) 를제작하였다. 두균주와 YHD124(bar1Δ Mcm4-TAP, 57) 를이용하여실험을하였다. Psf1은 GINS복합체의구성원이고, Mcm4는 Mcm2-7복합체의구성원이다

27 10-2. 배양및세포주기동조화 각단백질복합체는 3가지경우, G1기와 S기, 세포주기가동조화되지않았을때에각각정제하였다. 세포주기가동조화하지않는경우에는 YPD 액체배지를 2L 삼각플라스크에 1L씩, 7L를 600nm에서흡광도가 1.2가될때까지배양후, 5,000rpm에서 10분간원심분리하여균체를회수하여실험하였다. G1기에동조화시키는경우는효모를 YPD 액체배지 6L를 600nm에서흡광도가 0.8이될때까지배양후, 효모 α-인자를 50nM되게처리하고 2시간동안배양하였다. 원심분리하여균체회수후실험을진행하였다. S기동조화는효모를 YPD 액체배지 6L를배양하여 G1기에동조화시킨후, 균체를회수하고효모 α-인자를제거하기위하여멸균수를이용하여 1회씻어주었다. 회수된균체를 YPD액체배지 1.5L(500ml Χ 3) 에현탁하여 35분간배양한후균체를회수하여실험에사용하였다. 이때효모를새로운배지에현탁할때각플라스크에같은양의효모가들어가도록하였다. 세포주기를동조화할때비동조화시기, G1기, S기에각각효모를 1ml씩추출하였다. 이효모를 FACS분석하여세포주기동조화상태를확인하였다. 모든실험에서최종으로회수된균은 22g ~ 25g이었다 TAP method 를이용한단백질복합체정제 세종류의효모모두동일한방법으로단백질복합체정제를실시하였다. 단 YHD124(Mcm4-TAP) 는 sodium glutamate를염으로사용하였고, FFT221(Cdc45- TAP) 과 FGT221(Psf1-TAP) 은 potassium acetate를염으로사용하였다. 회수한균체부피와동일한양의 cell lysis buffer(100mm Hepes-KOH ph7.9, 300mM salt, 10mM magnesium acetate, 10% Glycerol, 0.02% NP40, 2mM EDTA ph8.0, 1mM DTT, 2mM β- glycerolphosphate, 4mM PMSF, 10μg /ml pepstatin A, 2mM Benzamidine) 를넣어효모를현탁하였다. 현탁한효모와 micron glass bead 15g을 beadbeater(biospec, ) 의 50ml chamber에넣고 chamber가가득차도록 cell lysis

28 buffer를넣었다. 시료가과열되는것을막기위하여 200ml chamber에 -80 에서미리냉각되어있던에탄올을 2/3쯤넣은후, 50ml chamber를그안에넣고, beadbeater와결속시켰다. 가장바깥에드라이아이스를깨어넣어에탄올의온도가올라가는것을방지하였다. 이후 bead-beater 를 1분작동, 1분휴식을 10회반복하였다. 만들어진효모분쇄물을진공펌프와체를이용하여 glass bead를제거하고액체부분만회수했다. 이시료를 70Ti 로터를이용하여 ultra-centrifuge (Backman, L8-70) 에서 45,000rpm으로 1시간 30분동안원심분리하였다. 이때상층액중가장윗부분의지질층과가장아래의찌꺼기층을제외한중간층만을회수하여 2개의 50ml tube에같은부피로담아두었다. 이후모든실험은 4 에서이루어졌으며, 미리냉각된완충용액과장비를사용하였다. 3개의 Poly-Prep column(biorad, , 이후 column) 에 IgG bead(amersham, ) 를 400 μl씩넣은후 column wash buffer (50mM Hepes-KOH ph7.9, 300mM salt, 0.02% NP40, 0.5mM EDTA ph8.0, 1mM DTT) 5ml로씻어주었다. 준비된 IgG bead를효모추출물이들어있는 50ml tube에넣고, 4 에서천천히회전시키면서 2시간에서하룻밤동안두었다. 다음으로반응이끝난시료를 4개의 column에같은부피로나누어담은후, 흘려주었다. 계속이어서각 column을 column wash buffer 10ml씩 3회씻어주고, TEV cleavage buffer(50mm Hepes-KOH ph7.9, 150mM salt, 0.02% NP40, 0.5mM EDTA ph8.0, 1mM DTT) 10ml로 1회씻어주었다. 각 column에 TEV cleavage buffer 1ml씩분주후, TEV protease(invitrogen, 12575) 100U을넣어주었다. 상온에서 1시간 30분동안천천히회전시키면서반응시켰다. 반응이끝난후 4개의 column을하나로합친후, 시료를 50ml tube에회수하고, column에 TEV cleavage buffer 1ml을흘려주어 bead내의시료까지회수하였다. 시료 1ml당 1M calcium acetate 3 μl와, calmodulin binding buffer(50mm Hepes-KOH ph7.9, 150mM salt, 1mM magnesium acetate, 1mM imidazole, 2mM calcium acetate, 10mM β-mercaptoethanol, 0.02% NP40) 2ml씩넣어주었다. 여기에 calmodulin binding buffer 5ml로씻어준 calmodulin bead (GE healthcare, ) 400 μl를넣어주었다. 그리고 4 에서천천히회전시키면서 1시간동안반응하였다. 50ml tube의 bead를 2개의 column에나눠담고, 시료를흘려주었다. 이어서 calmodulin

29 binding buffer 10ml씩 3회씻어주었다. 그리고두 column을하나로합친후, calmodulin elution buffer(50mm Hepes-KOH ph7.9, 150mM salt, 1mM magnesium acetate, 1mM imidazole, 2mM calcium acetate, 10mM β-mercaptoethanol, 0.02% NP40, 20mM EGTA) 를 500 μl씩 6회에걸쳐서단백질복합체를해리하였다 단백질복합체정제확인 정제된단백질복합체는 silver staining 하여확인하였다. 11. 펩타이드동정 단백질복합체는 TCA 침전을통하여농축한후, SDS-PAGE 후각단백질 band를잘라 Genomine사에의뢰하여펩타이드를동정했다. 외뢰된단백질은트립신으로분해후 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight - Mass Spectrometry (MALDI TOF - MS) 방법을통해동정되었다. 12. Deoxynuclotide triphospate(dntp) pool 측정 Chabes A et al(2003) 의방법을변형하여효모내 dntp pool을측정하였다 (32). 효모는액체배지 100ml에서 600nm에서흡광도가 1.0이될때까지배양후실험하였다. 화학물질을처리는다음과같이하였다. YPD(100mM HU) 액체배지와 YPD(300mg/L 6AU) 액체배지를만들고여기에접종하여균을배양하였다. 위방법으로각각배양된효모는 3,000rpm으로 5분간원심분리하여균체를회수하고, 3차증류수 50ml을이용하여 1회씻어주었다. 그리고상층액을제거하고균체를 1.5ml tube로옮긴다음 13,000rpm에서 1분간원심분리하여물을최대한제거하였다. 이후실험은모두 4 에서이루어졌다

30 회수된균체에 TCA 추출용액 (12%TCA, 15mM MgCl 2 ) 700 μl를넣고균을 현탁하였다. 시료를 30 초간격렬히혼합한후 15 분간 4 에반응후, 다시 30초동안격렬하게혼합하였다. 시료를 4, 15,000rpm에서 1분간원심분리하여 상층액을회수하였다. 여기에 Freon-amine 혼합액 (Freon(sigma, ) 10ml + Trioctylamine(Fluka, 92828) 2.8ml) 을 800 μl넣어준후 20 초간격렬히혼합한후, 4, 15,000rpm에서 1분간원심분리하였다. 여기서상층액을회수하고여기에 다시 Freon-amine 혼합액을 800 μl넣어주고, 바로전단계를똑같이반복하고 상층액을회수하였다. 이렇게만들어진 TCA 추출물에 1M NH 4 HCO 3 을 50 mm 되게첨가한후사용하였다. dntp pool 은 DNA 중합효소반응을이용하여측정하였다. 주형은 단일가닥 DNA 인 ΦΧ174 에 730 올리고머를보합시켜만들었고, 효소는 klwnow DNA 중합효소 (Enzynomics, M006S) 를사용하였다. datp 를측정하기위한방법은 다음과같다. Klenow 반응완충액 2.5 μl, 80 fmol/ μl주형 1.25 μl, 1mM dttp 1.25 μl, 1mM dgtp 1.25 μl, 1mM dctp 1.25 μl, α-32p dctp (Amersham, AA0005) 0.05 μl, Klenow DNA 중합효소 0.5U, TCA 추출물 10 μl를넣고전체부피가 25 μl가 되도록 3 차증류수를넣어주고 37 에서 30 분간반응하였다. 위와같이 반응하면 TCA 추출물에있는 datp 양만큼주형에 DNA 합성이되고, 합성되는 DNA 양에비례하여방사능성 dctp 가포함되게된다. 반응이끝난시료에, DNA 합성반응을끝내고 DNA 침전을도와주는 2.5mg/ml salmon sperm DNA(50mM NaPPi, 20mM EDTA) 을 50 μl넣어주었다. 여기에 5% TCA 1ml 을 넣어주어 DNA 를침전시켰다. 시료를 glass filter 에통과시킨후 1% TCA 1ml, 95% 에탄올 1ml 순서로씻어준다. 잘말린 glass filter 의방사능양을 섬광계수기 (Backman, LS-6500) 을이용하여측정하였다. 다른 dntp 도위와같은 원리로실험하였다. 측정하고자하는 dntp 를제외한세가지 dntp 를충분히 넣어주고측정하였다. dctp 는 α-32p datp (Amersham, AT0004) 를이용하여 측정하였다

31 13. 유전자재조합 HUD1을효모내에서발현시키기위하여, promoter지역약 600bp와정지코돈뒤약 200bp를포함하는유전자를증폭하였다. 효모염색체DNA를주형으로삼고, XhoⅠ과 BamHⅠ과제한효소절단자리가각각포함된 primer인 Hud1-8과 Hud1-9를이용하여 PCR하였다. 이 PCR 산물을 prs316과 prs325의 BamHⅠ- XhoⅠ자리에재조합시켜 plasmid phud316과 phud325를만들었다. HUD1 과발현을위해 Galactose promoter를가진 pyes2를사용하였으며, BamHⅠ과 XhoⅠ제한효소절단자리가각각포함된 primer인 Hud1-3, Hud1-4를이용하여 ORF만을증폭하여 pyes2의 BamHⅠ-XhoⅠ자리에재조합시켜 plasmid phud2를만들었다. Hud1 C말단에 hexa-histidine tag을융합시키기위하여다음과같이유전자를재조합하였다. 효모의염색체DNA를추출하여주형으로사용하고 BamHⅠ과 XhoⅠ제한효소절단자리가각각포함된 primer인 Hud1-3, Hud1-5를사용하여 PCR하여정지코돈을제외한전체 ORF를증폭하였다. PCR산물을 BamHⅠ과 XhoⅠ으로절단한후 pet21a(novagen, ) 의 BamHⅠ-XhoⅠ자리에재조합시켜 plasmid phud21a를만들었다 14. Hud1 재조합단백질정제 BL21(DE3) 를 phud21a로형절전환후 ampicilin (50 μg /ml) 을포함한 LB배지 (1% tryptone, 0.5% yeas extract, 1% NaCl) 2L (500ml Χ 4) 에서 600nm에서흡광도가 0.3이될때까지배양후 16 로옮겨 600nm에서흡광도가 0.5가될때까지배양하였다. 여기에 IPTG를 1mM되게넣어주고 16시간배양하였다. 배양액을 5000rpm에서 15분간원심분리하여균체를회수한후, 미리냉각된 T 500 완충액 (25mM Tris-HCl ph7.5, 10% glycerol, 0.02% NP40, 5mM imidazole, 1mM PMSF, 5μg /ml pepstatin A, 1mM Benzamidine, 500mM NaCl, 아랫첨자로표시된

32 숫자는염의농도를나타냄 ) 50ml 에현탁하였다. 이후실험은모두 4 에서 이루어졌으며, 미리냉각된장비와시약을사용하였다. 대장균현탄액을초음파분쇄기를이용하여 1분분쇄, 1분냉각를 10회반복하여대장균을분쇄한후 12,000rpm, 4 에서 30분동안원심분리하여상층액을회수하였다. Ni-NTA agarose(invitrogen) 5ml를 column에충전후, 여기에세포추출물을 0.33ml/min 속도로흘려주었다. 그리고 T 500 (5mM imidazole) 30ml, T 500 (20mM imidazole) 30ml, T 500 (50mM imidazole) 30ml, T 100 (200mM imidazole) 30ml을 0.33ml/min의속도로차례로흘려주면서 1.5ml tube에 1.5ml씩나누어담았다. 각 tube의시료를 SDS- PAGE분석과 anti-his antibody(invitrogen) 를이용한 Western blot를하여재조합hud1이포함된 tube를찾아하나로모았다. 모아진시료의염농도가 100mM이하가되게희석한후 EDTA와 DTT가 1mM 되게넣어주고, T 100 (1mM EDTA, 1mM DTT) 로충전된 heparin sepharose column (Amersham) 2ml에 0.13 ml/min 속도로흘려주었다. 모든단계에서 0.13 ml/min으로용액을흘려주었으며, column을통과해나오는시료를 1ml씩나누어담았다. T 100 (1mM EDTA, 1mM DTT) 10ml을흘려주어 column을씻어주고, T완충용액을 20ml흘려주는동안 T 100 (1mM EDTA, 1mM DTT) 에서 T500(1mM EDTA, 1mM DTT) 서서히염농도를증가시켜준후, T 500 (1mM EDTA, 1mM DTT) 10ml을흘려주었다. SDS-PAGE 분석하여, 순도가높은재조합Hud1이있는분획를찾아실험에사용하였으며, - 80 에보관하였다

33 결과 1. Cdc45 복합체, GINS 복합체와 Mcm2-7 복합체정제 CGM복합체의 helicase활성에영향을주는새로운구성원을찾기위하여, 이복합체의구성원인 Cdc45, Mcm4와 Psf1에각각 TAP tag을융합시켜단백질복합체를정제하였다. DNA복제관련된단백질들은세포주기에따라많은변화가있으므로, 특정세포주기에정체되지않은세포를포함하여각세포주기에서정제하였으며, 지수기의세포를취하여실험하였다. G1기의세포는효모 α-인자를처리하여얻었으며, S기의세포는 G1기에정체된세포균체를효모 α-인자가없는배양액으로옮긴후일정시간배양하여획득하였다. TAP method을통하여단백질복합체를정제하는동안 GINS복합체와 Cdc45를포함하는복합체정제시에는염으로 potassium acetate를사용하였으며, Mcm2-7 복합체는 sodium glutamate사용하였다. GINS복합체의구성원인 Psf1를이용하여단백질복합체를정제하였을때, GINS복합체의구성원인 Sld5, Psf1, Psf2, Psf3가함께일정하게정제되었다 (Fig1. C). GINS복합체의구성원이모두비슷한비율로정제되었을뿐만아니라각세포주기에서단백질의양이비슷한것을보아 GINS복합체는매우안정하고, 대부분의세포주기에서 GINS복합체가발현되는것을확인하였다 (Fig1. A, C). 이실험에서 GINS 복합체와함께 Bul1, Brr1, Ygl057c, Act1과 Ctf4가정제되었다 (Fig1. A, C). 효모의단백질에대한정보는 Saccharomyces Genome Database ( 를참고하였다. Bul1은단백질분해에관여하는 Rsp5 E3- ubiquitin ligase복합체의구성원이며, Brr1은 pre-mrna splicing에관여하는 snrnp의한종류이다. Ygl057c는기능은알려지지않았으나 mitochondria와관련될것으로예측되는단백질이고, Act1은 actin 단백질중한종류이다. 이단백질들은세포질에존재하는단백질로비특이적으로함께정제된것으로보인다

34 Figure 1. Isolation of protein complex using tandem affinity purification method(tap) at each cell cycle. The purified proteins were analyzed by SDS-PAGE followed by silver staing. A. TAP product of Psf1 and Mcm4 complexes B. TAP method product of Cdc45. C. TAP product of Psf

35 Ctf4는특정세포주기에정체하지않았을때 Psf1과함께정제되었다 (Fig1. A,C). Ctf4는 DNA합성효소α와상호작용하는것으로알려져있으며 (44), 딸염색분체결합에관여하는것으로알려져있다 (45). 그리고이전연구에서 Ctf4는 Sld5을이용하여 TAP method로정제하였을때 GINS복합체와함께정제되는것이알려져있다 (12). Cdc45이용하여단백질복합체를정제한결과 Cdc45와강하게결합하여존재하는단백질은없었으나, S기에 Cdc45와함께 Mcm5, Trm1, Ctf4, Ycr087w가정제되었다 (Fig1. B). Trm1은 trna 메틸기전달효소로 trna변형에관여하는단백질이고, Ycr087w은전혀알려지지않은단백질로두단백질모두 DNA복제와관계없는단백질로, 세포내양이많아서비특이적으로 Cdc45와함께정제된것으로생각된다. Mcm5는 Mcm2-7복합체의구성원이다. Mcm2-7복합체와 Cdc45와상호작용하는것은이미알려져있다 (12, 19). Ctf4는원래분자량인 104.4kDa 보다작은 50kDa 부근에서나타났다 (Fig1. B). 이는오동정이되었거나이유는알수없지만단백질이깨져작게나타난것으로보인다. 단백질이동정되지는않았지만, S기에서 116kDa 부근에단백질 band의양상이 Mcm2-7복합체와동일하며그마지막단백질이 Mcm5로동정되었다 (Fig1. B). 또 S기에 Cdc45와 Mcm2-7복합체의결합이강해진다는것이알려져 있다 (19). 위사실로미루어볼때, 116kDa 부근에단백질 band 들은 Mcm2-7복합체로판단된다. Cdc45를이용하여단백질복합체를정제했을때, 각세포주기마다 Cdc45의양변화가많았으며특히 G1기의양이다른세포주기에비해두배이상많은것을관찰하였다. 그리고 S기에정제한결과를보면 Cdc45의양은 G1기에비해 2배이상적으나, 더많은 Mcm2-7복합체가함께정제되었다. 이로보아 Cdc45는 G1기에는대부분독립적으로존재하나, S기에는대부분 Mcm2-7복합체와함께복합체로존재한다는것을알수있었다. Mcm4에 TAP tag을융합시켜단백질복합체를정제한결과 Mcm2-7복합체도여러세포주기에서일정하게유지되는것을관찰하였다 (Fig1. A). G1기에는 Ypl033c 가 S기에는 Tef2, Sld5, Sts1, Dnl4가함께정제되었다 (Fig1. A). Tef2는

36 번역에관계된단백질이고, Sts1은 ubiquitin매개단백질분해에관련된단백질로, 세포내양이많아비특이적으로함께정제된것으로보인다. Dnl4는 nonhomologous end-joining에필요한 DNA ligase로 DNA가손상을입었을때수리하는데관여할뿐, DNA 복제에는관여하지않는것으로알려져있다. 마지막으로 Sld5는 GINS복합체의구성원으로, GINS복합체가 Mcm2-7복합체와상호작용하는것이밝혀져있다 (7-10,12,18,19,21). G1기에 Mcm2-7복합체와함께정제된 Ypl033c 는 DNA 대사에관여할것으로여겨지나, 알려진기능이전혀없으며생존에필수적이지않은단백질이다. 이단백질은대장균에서 SOS induction assay를통하여처음발견되었으나 (39), 그이후에자세히연구되지않았다. Ypl033c 가 CMG복합체의새로운구성원으로생각되어이단백질에자세한연구를진행하였다. 이번실험에서목표단백질과함께정제된단백질들중, DNA복제와직접적으로관련이없는단백질은연구대상에서제외하였다. 목표단백질과함께정제된단백질중양이많고 DNA복제와관련이있을것으로예측되나, 기능이잘알려지지않은단백질을연구하였다. Ypl033c 와 Mcm2-7복합체가실제로단백질간상호작용하는지알아보기위한추가실험이필요하다. 2. HUD1 과 nucleotide 생합성의관련성 기능이밝혀지지않은유전자의기능을연구할때, 해당유전자가과발현될때나타나는현상이나, 유전자가의기능이억제되었을때나타나는현상을관찰하면그유전자의기능을유추할수있다. 따라서 Ypl033c 는생존에필수적인유전자가아니므로, 유전자를효모에서결손시킨후, DNA 대사에영향을주는여러가지화학물질에대한표현형을관찰하였다

37 Figure 2. Phenotypes of the hud1δ mutant. YPH499 and DPD200-1a cells are cultured in liquid YPD to log phase. The cultured yeast cell are spotted on appreciate media and culture for 2~3 days. A. Effect of chemicals that inhibit DNA metabolism and translation on hud1δ mutant. B. Effect of chemicals that inhibit dntp synthesis

38 Methyl methanesulfonate(mms) 와 4-nitroquinoline 1-oxide(4-NQO), UV는 DNA 손상을일으키고 (45,46), 3-amino-1,2,4-triazole(3-AT) 은번역을방해하는물질이고 (48), nocodazole은미세소관합성을방해하여 G2-M기에세포를정체시키는물질이다 (49). hydroxyurea(hu) 는세포내 dntp양을고갈시키는물질이다 (35). 이러한물질들을포함한배지에서 YPL033C가삭제된효모와야생형효모의성장을관찰하였다. 그결과 YPL033C가삭제되었을때, DNA 손상이나번역, 세포분열을방해하는물질에대해서는유의한차이가없었다. 하지만 HU를포함한배지에서야생형에비해 100배이상잘자라는것을관찰하였다 (Fig2. A). 이러한표현형을바탕으로 YPL033C를 HUD1 (HydroxyUrea resistance when Deleted 1) 이라명명하였다. HUD1 결손돌연변이 (hud1δ) 가 HU를제외한 dntp를고갈시키는다른물질에대해서도내성을나타내는지확인하였다. 그결과 dgtp를고갈시키는물질인 mycophenolic acid(mpa) 와 6-azauracil(6AU) (50,51), URA3유전자존재하에 dttp합성을방해하는물질인 5-fluoroorotic acid(foa) 를처리하였을때 (52), 내성을나타내는것을관찰하였다. hud1δ은야생형에비해 MPA에서는 1000배이상, 6-AU에서는약 5배, FOA에서는약 10배잘자라는것을관찰하였다 (Fig2. B). HU는 deoxyribonucletide(dntp) 생합성만을방해하는물질이지만, MPA, 6-AU, FOA는 HU보다상위단계의효소의활성을억제하여 dntp뿐만아니라전반적인 nucleotide 생합성과정을방해하는물질이다 (50,51). hud1δ가 dntp생합성을방해하는여러가지화학물질에대해내성을가지는 것을보아, HUD1 은 nucleotide 생합성과정에관여할것으로보인다. 각물질에 대해다른정도의내성을나타내는이유는각물질이서로다른방법으로 nucleotide 생합성을방해하고, 서로다른부수적인영향을나타내기때문에나타나는현상으로보인다. HUD1이 nucleotide 생합성에관여할것으로여겨지고, hud1δ가 HU에대해내성을나타내는것으로보아, HU를처리하였을때 hud1δ과야생형의세포내 dntp양차이가있을것으로예상되어이를확인하여보았다. 이실험에서대조군으로야생형효모와 SML1결손돌연변이 (sml1δ) 를사용하였다

39 Figure 3. The effect of HU on dntp pools in cells. YPH499, YHM1 and DPD200-1a are cultured in YPD in the presence or absence of HU. Small molecules of cells are TCA extracted and dntp pool was quantified using the DNA polymerase reaction. Experiments was performed three times, independently

40 Sml1은단백질간상호작용으로 RNR의효소활성을억제하며 (31-33), SML1이결손될경우세포내 dntp가약 2배증가하는것이알려져있다 (33). 각효모를 100mM HU를처리하지않은배지와처리한배지에 600nm에서흡광도가 1.0이될때까지배양후, 세포내작은분자를추출하여, 실험에사용하였다. 세포내 dntp는 DNA중합효소반응을이용하여측정하였으며, 모두 3회씩반복하였다. 이번실험에서 HU를처리하지않았을때 sml1δ의 dntp양이조금증가하였으나, 이전연구처럼 2배가량증가하지는않았다. 이는이번연구에사용한효모균주와 dntp를측정한방법이이전연구와달라나타난현상으로보인다. HU를처리한경우, 야생형과 sml1δ는현저하게 dntp이감소한반면, hud1δ는 HU를처리하지않았을때와거의비슷한수준으로 dntp양이유지되었다 (Fig3). hu1δ가 HU에대해내성을가진이유는, HU를처리하여도 dntp가감소하지않아나타나는현상으로판단된다. 그리고 HU처리유무에따라 sml1δ와 hud1δ의 dntp양이변하는양상이다르므로, HUD1은 SML1과는다른방식으로 dntp 대사과정에관여할것으로예측된다. HUD1이결손되었을때, nucleotide 생합성을방해하는화학물질 HU, MPA, 6- AU, FOA-에대해내성을가지고, HU를처리하여도세포내 dntp가고갈되지않은것으로보아 HUD1은 nucleotide 생합성에관여할것으로여겨진다. 또한 HU를처리하였을때, sml1δ와 dntp양이변하는양상이다른것으로보아 SML1과는다른방식으로 nucleotide 생합성에관여할것으로예측된다. 3. HUD1 과 DNA 대사에관련된유전자의유전적상호작용 hud1δ의표현형을더조사하기위하여여러온도에서성장을비교하여보았다. 그결과저온에서내성을가지는것을관찰하였다 (Fig4. A). POL32는 DNA합성효소δ의구성원으로, 생존에필수적이지않으나유전자가결손되면저온과 HU에대해서민감성을나타낸다. 이러한현상은 HUD1과반대현상이다

41 Figure 4. The hud1δ recuses the cold & HU sensitivity of pol32δ. A. Phenotype of pol32δ hud1δ. B. dntp pool of yeast cultured at 16. The amounts of datp and dttp is measured four times, dgtp is measured three times, dctp is measured once

42 POL32가 HUD1의작용과연관이있다면, POL32와함께 HUD1을결손시켰을때 pol32δ의저온과 HU에대한민감성에영향을줄것으로예상되어실험을하였다. 그결과 pol32δ의저온민감성과 HU민감성을모두억제하였으나, hud1δ 수준까지도달하지못하였으며야생형보다도느린성장을보였다 (Fig4. A). hud1δ가저온에서내성을가지는원인도 dntp증가에따른현상인지알아보기위하여, 저온에서배양한경우 dntp양을측정해보았다. 이실험에서는야생형과 hud1δ를사용하였으며, datp 와 dttp는 4회, dgtp는 3회, dctp는 1회반복실험하였다. 야생형과 hud1δ 모두 30 에서배양한경우보다 dntp양이감소한것을관찰하였다 (Fig3, Fig4. B). 하지만 16 에서배양한경우만비교하면, 야생형은모든 dntp가현저하게감소했지만, hud1δ은 dttp와 dctp만 30 의 1/2수준으로감소했을뿐 datp 와 dgtp는 30 와비슷한수준으로유지됨을알수있었다 (Fig3, Fig4. B). 이결과로미루어보아, hud1δ는 HU 뿐만아니라, 저온스트레스에의해 dntp가감소되는현상을억제하는것을알수있다. HUD1과비슷하게 SML1도유전자가결손되면, HU에내성을가지는것이알려져있다. SML1이결손되면생존에필수적인 S기 checkpoint 유전자인 LCD1, RAD53, MEC1이결손되었었을때나타나는치사성을억제한다 (33, 53). HUD1도이러한현상을나타내는지알아보기위하여실험하였다. 그결과 HUD1을결손시켰을때, LCD1과 RAD53이결손되었을때나타나는치사성을억제하였다 (Fig5. A). 이로보아 HUD1은 S기 checkpoint 유전자들과상호작용하는것으로여겨진다. HUD1과 checkpoint 유전자의관계를더자세히조사하기위하여, hud1δ가 checkpoint 유전자결손에따른 DNA손상에대한민감성도억제하는지, hud1δ의저온에대한내성이유지되는지조사하였다. DNA손상을유발하기위하여, UV와유사한 DNA손상을유발하는 4-NQO를사용하였다 (47). 실험결과 checkpoint 유전자가 HUD1과함께결손된경우, DNA손상에민감성을나타냈으며, 저온에대해내성을나타내었지만약간감소하였다 (Fig5. A). 자료는제시하지는않았지만낮은농도의 HU에대해서도민감성을나타내었다. 또 checkpoint 유전자가결손되어도 hud1δ의저온에대한내성에는영향이없었다

43 Figure 5. HUD1 is involved in the regulation of S phase checkpoint. A. Suppression of the lethality of lcd1δ and rad53δ by hud1δ. B. Effect of hud1δ on non-essential check point gene

44 hud1δ가 lcd1δ와 rad53δ의 DNA손상에민감성을억제하지못하는것으로보아, 서로간접적으로상호작용하는것으로보인다. HU에민감성을나타내는이유는, LCD1과 RAD53이결손되면 dntp 감소에매우민감해지거나, HU가 dntp 고갈과함께 DNA double strand break등 DNA손상을일으키기때문에나타나는현상으로보인다. HUD1과 S기 checkpoint간의상호작용을자세히알아보기위하여, 생존에필수적이지않은 S기 checkpoint 유전자와 HUD1이함께결손된돌연변이를만들어표현형을조사하여보았다. 이번실험에사용한 S기 checkpoint 유전자는 RAD9, RAD17, RAD24로 DNA 손상을감지한후 RAD53으로신호를전달하는역할을하는유전자이다. 생존에필수적이지않은유전자들은결손되어도효모가계속해서생존할수있다. 생존에필수적이지않지만기능적으로연관이있는두유전자가함께결손되었을때, 치사성을유발할수있다. 이러한경우는대부분두유전자가비슷한역할을하는경우발생하며, 그이유는한유전자가결손되었을때는남아있는다른유전자에의한우회경로가존재하여생존이가능하지만두유전자가함께결손되었을때는기능손실을보완할수없어생존을유지하지못하기때문이다 (54). RAD9, RAD17, RAD24과 HUD1이함께결손되었을때, 치사성을유발하지않았다 (Fig5. B). 그러므로 HUD1은 S기 checkpoint의기능에직접적으로참여하지않는것으로보인다. hud1δ은 rad9δ, rad17δ, rad24δ의 UV민감성을억제하지못하였지만, 높은농도의 HU에대한민감성을억제하였다 (Fig5. B). hud1δ은 lcd1δ와 rad53δ의 HU민감성은억제하지못하였다. 이러한현상은 HU에의해 Rad53이인산화되는것은 RAD9, RAD17, RAD24의경로를거치지않기때문에나타나는현상으로보인다 (55). HUD1은 POL32와 S기 checkpoint와유전적으로상호작용하는것으로보인다. 이중 hud1δ가 pol32δ의저온과 HU에대한민감성을억제하는것은 hud1δ의 dntp 양이높게유지되어나타나는현상으로판단된다. hud1δ이 LCD1이나 RAD53이결손되었을때나타나는치사성과 rad9δ, rad17δ, rad24δ의 HU 민감성을억제하는것으로보아 HUD1은 S기 checkpoint와관련이있을것으로

45 보인다. 그리고 HUD1이 RAD9, RAD17, RAD24와함께결손되었을때, 치사성을나타내지않는것과 lcd1δ, rad53δ, rad9δ, rad17δ, rad24δ의 DNA 손상에대한민감성을억제하지못하는것으로보아, HUD1이간접적으로상호작용할것으로예측된다. 4. hud1δ 표현형의비가역성 HUD1의기능에대해더조사하기위하여 HUD1을효모내에서과발현시켰을때어떤현상이나타나는지연구하였다. 우선 hud1δ이 plasmid 상태의 HUD1에의해표현형이회복되는지확인하기위하여야생형과 hud1δ에 phud316을형질전환시킨후표현형을관찰하였다. hud1δ는야생형의표현형으로돌아가고, 야생형은 HU와저온에민감성을나타낼것으로예상하였다. 하지만야생형과 hud1δ 모두 phud316을형질전환하여도아무런변화가나타나지않았다 (Fig6. A). 이러한현상은 multi-copy plasmid인 prs325나 pyes2를이용하였을때도동일한결과를나타내었다. 이는 HUD1이 plasmid 형태로는효모내에서발현되지않기때문에나타나는현상으로보인다. plasmid 형태로 HUD1이발현되지않는문제점을보완하기위하여, HUD1을가진반수체효모와 HUD1이결손된효모를교배하여배수체효모를만들었을때, 표현형이회복되는지관찰하였다. 이때효모내에 HUD1이존재하기때문에야생형의표현형을나타내야한다. 그러나이실험에서도표현형이회복되지않음을확인하였다 (Fig6. B). 그러므로 HUD1 결손시발생하는돌연변이는비가역적인것으로판단된다. HUD1은효모내에서 plasmid형태로발현되지않을뿐만아니라, HUD1결손으로나타나는돌연변이는비가역적인것으로보인다

46 Figure 6. Irreversible phenotype of hud1δ mutant. A. To test the recovery of hud1δ by HUD1 in plasmid, prs316 (vector) and phud316 (HUD1) are transformed to YPH499 and DPD200-1a. B. To test the phenotype of CPM61(hud1Δ/HUD1)

47 5. Hud1 단백질정제 HUD1에대한유전학적연구와더불어분자생물학적인연구를하기위하여 Hud1 단백질을정제하였다. 효율적인정제를위하여, hexa-histidin tag을융합하여재조합단백질을만들었다. Hud1 단백질은대장균에서용해성이매우낮아대부분불용성상태로존재하였다. 용해성을높이기위하여 tag의위치, 단백질발현온도를바꾸어가며예비실험해본결과, C말단에 tag을융합시켜 16 에서 8시간이상발현시켰을때가장높은효율을나타내었다. 단백질을정제하기위하여 hexa-histidin tag과 Ni-NTA agarose 간의친화성을이용하여 1차정제하였다. 정제후에는 SDS-PAGE 와 anti-his antibody를 이용하여 Western blot 을하여확인하였다. 그결과 200mM imidazloe 을이용하여 해리한부분에서 Hud1 단백질이검출되었다 (Fig7. A,B). 더순수한단백질을얻기위해, Hud1 단백질이많은 67번분획부근을모아 heparin sepharose column을이용하여정제하였다 (Fig7. C). 그결과 86kDa 부근의필요없는단백질을제외한순수한 Hud1 단백질을얻을수있었다. Hud1이 helicase인 Mcm2-7복합체와함께정제되었으므로, helicase 효소활성에필요한효소활성을지니는지조사하여보았다. 그래서 DNA와결합하는지, ATP 분해효소활성이있는지조사하였지만긍정적인결과를얻지못하였다. 또한 TAP method 산물을이용하여 CMG복합체혹은 Mcm2-7복합체와함께반응하였을때, helicase 효소활성이나 ATP 분해효소활성이있는지조사하였지만효소활성을발견할수없었다

48 Figure 7. Purification of Hud1 protein. Recombinant Hud1 is purified using Ni-NTA sepharorose and Heparin sepharose chromatography. Arrows indicates the Hud1 protein The numbers indicate the fraction number. A. Coomassie brilliant blue staining of fraction from Ni-NTA column purification. B. Coomassie brilliant blue staining of fraction from heparin sepharose chromatography. C. Recombinant Hud1 was detected by western blot analysis using anti-his antibody. The sample is same with A

49 결론 1. 단백질복합체정제 Cdc45, Mcm4, Psf1 이번연구의목적은진핵생물의가장유력한 helicase 후보인 CMG복합체의새로운구성원을찾고, 그기능을연구하는것이었다. 새로운구성원을찾기위하여 CMG복합체의각구성원에 TAP tag을융합시켜단백질복합체를정제하였다. 이번연구에서는주된실험방법으로 TAP method를사용하였다. 이방법은목표단백질과비교적강한결합을하는단백질을찾을때는효율적일것으로보이나, 실험과정상단계가많고, bead에결합후강하게씻어주는과정이있어약한결합을하거나일시적인결합을하는단백질을찾는데에는부적합한것으로보인다. 실제로약하게결합하는단백질들은반복실험에서일정하게나타나지않았다. 하지만 TAP method로찾은단백질은목표단백질과단백질- 단백질상호작용을하는것으로여겨진다. TAP method로새로운상호작용하는단백질을찾는것은 two hybrid screen또는 library screen처럼유전학적인방법과다른성격의상호작용하는대상을찾을수있다.. 이실험방법을통하여 CMG복합체의새로운구성원을찾는과정에서새로운사실을발견했다. 우선 Ctf4가 Pfs1과함께정제되었는데, 특정세포주기에정체시키지않은세포에서만함께정제되었다 (Fig1. A, C). G1기와 S기에함께정제되지않았으므로, G2-M기에상호작용할것으로보인다. 분열효모에서염색체운반단백질인 Bir1의온도감수성돌연변이의억제자를찾는중에 GINS복합체의구성원인 Psf2가발견되었으며, Psf2가염색체분리에간접적으로관여할것으로예측되고있다 (56). 그러므로 G2-M기에염색체결합 / 분리될때, GINS복합체와 Ctf4와상호작용할것으로예측된다. Cdc45를이용한정제에서는기존연구내용을다시확인할수있었다. 초파리에서 CMG복합체를정제하였을때, 대부분의 Cdc45가단독으로존재했었다. 본연구에서 Cdc45를 TAP method를이용하여정제하였을때, Cdc

50 band가주되게나타났을뿐안정적으로 Cdc45와함께정제되는단백질은발견하지못했다. 또 S기에 Mcm4가 Cdc7에의해인산화되면서 CMG복합체의결합이더욱단단해진다는연구가있었다. 이사실역시 G1기보다 Cdc45의양이적음에도불구하고 S기정제결과에서 Mcm2-7복합체가 G1기보다많은양이함께정제된것으로확인할수있었다 (Fig1. B). Mcm4와함께 Hud1이정제되었으며, 이에대한세부적인연구를진행하였다. 2. HUD1 Mcm2-7 복합체와함께정제된단백질중 Ypl033c 에대해연구를진행한결과 유전자가결손되었을때 HU 에내성을나타내는것을바탕으로 HUD1 (HydroxyUrea resistance when Deleted) 이라명명하였다. 2.1 Nucleotide 생합성과관련성 hud1δ은 nucleotide 생합성을방해하는화학물질에대해서내성을가지는것은물론 HU를처리했을때야생형이나 sml1δ와달리 dntp가고갈되지않았다. 이로보아 HUD1은 SML1과다른방식으로 nucleotide 생합성에관여할것으로추측된다. 세포에 HU를처리하면 dntp가고갈되면, 세포는 dntp양을회복하기위하여 RNR 유전자의전사를증가시키고, RNR의억제자인 Sml1을제거한다. 하지만 HU가 RNR의효소활성을직접억제하기때문에효과를얻지못한다 (29). 이때문에 sml1δ역시 HU를처리하였을때 dntp가고갈된다. 그러므로 hud1δ는 sml1δ와다른방식으로 dntp 생합성과정에관여할것으로생각된다. 최근 threonine 생합성이세포내 dntp양을유지하는데중요한역할을하는것이밝혀졌다 (40). 이연구에따르면, HU에의해 dntp가감소하면, purine의전구체인 threonine 생합성을촉진시켜, RNR의기질이되는 dntp 전구체를증가시켜 dntp 양을유지한다고한다. HUD1이 nucleotide 생합성에관여한다면

51 이와유사한방법으로관여할수있을것으로예측된다. 또한저온에서배양한경우나 HU처리하였을때, hud1δ의 dntp 중 purine인 datp 와 dgtp감소가 pyrimidine의감소폭보다적었다. 이로보아 HUD1이 threonine 생합성으로인한 dntp양을조절하는과정에관여할수도있을것으로생각된다 POL32 와관련성 hud1δ는 pol32δ의저온과 HU 민감성을억제하였다 (Fig4. A). HU가세포내 dntp를고갈시키는물질이라는것과 16 에서배양한효모의 dntp양이매우적었다는것을 (Fig4. B) 볼때, pol32δ의민감성은 DNA합성효소δ의진행성이감소된상태에서 dntp양감소하여 HU와저온에민감성을나타내는것으로보인다. 이때 hud1δ이함께삭제되면, HU가존재하거나저온에서도 dntp양이감소하지않아, pol32δ의민감성이억제되는것으로보인다. 그러므로 HUD1은 POL32와간접적으로상호작용하는것으로보인다 S 기 checkpoint 와관련성 hud1δ는 sml1δ와같이 lcd1δ와 rad53δ의치사성을억제한다. smlδ가이런현상을일으키는이유는세포내 dntp가증가하여나타나는현상이다 (Fig3, 53). 하지만 hud1δ는 dntp양이야생형과동일하게유지되고있다 (Fig3). sml1δ는생존에필수적인 S기 checkpoint 유전자인 mec1δ의치사성을억제하나, hud1δ 은그렇지못하였다 (data not shown). 위결과로미루어보아 HUD1 은 S 기 checkpoint 와도 SML1 과는다른방식으로관계되어있을것으로생각된다

52 2.4 돌연변이의비가역성 hud1δ의표현형은회복되지않는다. 효모에서표현형이회복되지않는경우는 mitochondria에문제가있는경우드물게발생한다. 하지만 hud1δ는발효되지않는탄소원에서도성장에문제가없었다 (data not shown). 즉 mitochondria에문제가없음에도불구하고, 회복이되지않는표현형을나타내는것이다. 실험결과만으로 HUD1의기능을정확히예측하기는어렵다. HUD1이 POL32나 checkpoint와상호작용하는것은간접적이가능성이크고, nucleotide 생합성은비교적밀접하게연관되어있을것으로보인다. HUD1의기능을알기위해가장우선시되는일은, 기능적으로가장밀접한유전자를찾는것이다. 또는민감성을나타내는표현형을찾아야할것으로예상된다

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60 Functional characterization of novel gene HUD1 in Saccharomyces cerevisiae In this work, HUD1 (YPL033C) gene product was co-purified with MCM helicase using a tandem affinity purification method. The results of this study suggest that HUD1 may be involved in nucleotide metabolism and may interact with the S phase checkpoint system. The outcome of this study will contribute to a better understanding of DNA replication and S phase checkpoint control. It would be interesting to extend this work to understand the function of a mammalian homologue of HUD1 gene. Reviewer Byeongwoon Song, Ph.D. Division of Pediatric Infectious Diseases Emory University School of Medicine 2015 Uppergate Drive Atlanta, GA Tel: bsong4@emory.edu