ExiProgen His-tagged Protein Purification Kit 사용설명서 Version No.: 1.0 ( ) Please read all the information in booklet before using the kit 바이오니아 대

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펑운 즙
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1 사용설명서 Version No.: 1.0 ( ) Please read all the information in booklet before using the kit 바이오니아 대전광역시대덕구문평서로 8-11 Tel: Fax:

2 Safety warning and Precaution ExiProgen TM His-tagged Protein Purification Kit is developed and supplied for research purposes only. Certain applications possible with this kit may require special approval by appropriate local and/or national regulatory authorities in the country of use. Wear appropriate protection when handling any irritant or harmful reagents. The use of a laboratory coat, protective gloves and safety goggles are highly recommended. For more information please consult the appropriate Material Safety Data Sheet (MSDS). Warranty and Liability All BIONEER products undergo extensive Quality Control testing and validation. BIONEER guarantees quality during the warranty period as specified, when following the appropriate protocol as supplied with the product. It is the responsibility of the purchaser to determine the suitability of the product for its particular use. Liability is conditional upon the customer providing full details of the problem to BIONEER within 30 days. Patent ExiProgen TM and its kits are protected by the patents KR , PCT/KR2012/ Trademark ExiProgen TM is trademark of Bioneer Corporation. Copyright 2012 by Bioneer Corporation, All rights reserved.

3 Contents 1. Overview Kit contents and storage Information on cartridges Experimental procedure Preparation of sample Protein purification with ExiProgen Analysis of sample Maintenance Troubleshooting guide References Related products

1. Overview 는 ExiProgen 을이용하여세포파쇄액또는무세포단백질발현시료로부터 His-tag 을가지고있는목적단백질 을고순도로정제할수있는키트입니다. 6x His-tag 을가지고있는목적단백질이포함된시료를키트에넣은후 ExiProgen 을가동시키면, 전자동으로목적단백질을정제할수있으며, 그원리는아래의그림과같습니다.

4 1. Overview 는 ExiProgen 을이용하여세포파쇄액또는무세포단백질발현시료로부터 His-tag 을가지고있는목적단백질 을고순도로정제할수있는키트입니다. 6x His-tag 을가지고있는목적단백질이포함된시료를키트에넣은후 ExiProgen 을가동시키면, 전자동으로목적단백질을정제할수있으며, 그원리는아래의그림과같습니다. Equilibrium buffer 로평형화된 magnetic bead* 표면에목적단백질이결합하고, 그후, washing buffer 를이용하여세척하고, imidazole 이포함된 elution buffer 를처 리하여, magnetic bead 로부터목적단백질을분리하게됩니다. * 키트내에포함된 magnetic particle 은당사의독자적인기술력으로개발된 Ni- NTA silica magnetic bead 로, 이 bead 표면에 Ni-NTA 가코팅되어있어 His-tag 을가지고있는단백질과결합할수있습니다. 18

5 2. Kit contents and storage Component Catalog No. K-7220 (16 reactions) K-7221 (32 reactions) Cartridge 1 96 well x 1ea 96 well x 2ea Cartridge 2 96 well x 1ea 96 well x 2ea Disposable filter tip Elution tube/cap 2 packs (8 ea/pack) 8-tube strip x 2 ea 1 pack (33 ea/pack) 8-tube strip x 4 ea ExiProgen TM His-tagged Protein Purification Kit 는냉장 (4~8 ) 보관하면되며, 구성품으로는단백질정제에사용되는 Ni magnetic bead 와 buffer 류를포함하는 Cartridge 1, Cartridge 2 와 Disposable filter tip, 그리고 Elution tube/cap 이포함되어있습니다. 본키트의 Cartridges 는교차오염, 증발, 용액누출을막기위해 Sealing film 으로밀봉포장되어있고, 키트의모든플라스틱제품은 DNase-free, RNase-free 상태로제공되므로보관및사용중 Nuclease 또는 Protease 에의해서오염되지않도록주의하시기바랍니다. 19

Binding/Washing buffer ; Ni-NTA magnetic bead

6 3. Information on cartridges Ni-NTA magnetic bead Elution buffer ; 목적단백질정제용 buffer (1M imidazole 을포함하고있음 ) Binding/Washing buffer ; Ni-NTA magnetic bead 에단백질발현물이결합할수있게평형화해주며, 목적단백질결합후, 세척과정 ( 불순물제거 ) 에사용 Sample loading well 20

7 4. Experimental Procedure 4.1. Preparation of samples A. Cell lysate (ex. E. coli) 아래의순서에따라서 E. coli cell lysate 를준비하시기바랍니다. 1 목적단백질을과발현시킨 cell 을회수합니다. (ex. 3,000 rpm, 10min) 2 Cell pellet 에적정량의 resuspension buffer 를넣고, pellet 을완전히풀어준다. (ex. Resuspension buffer ; 20mM Tris-Cl(pH 7.6),1mM 2-Mercaptoehanol) 3 시료를 ice 에담근채, sonicator 를이용하여 cell 을 lysis 한다. (ex. Microtip,On/10sec, Off/20sec, Total/5min) 4 Cell lysate 를 1.5mL tube 에옮겨담은후, 13,000rpm 으로 1 분동안 centrifuge 하여상등액과 pellet 을분리한다. 5 SDS-PAGE gel running 을통해서상등액에목적단백질이있는지여부를확인합니다. B. (In vitro) Cell-free protein expressed sample AccuRapid Protein Expression Kit 이용 1 1.5mL tube 에목적단백질발현용 750uL 부피의발현용액을제조합니다. 2 준비한단백질발현용액을 30 항온조에넣고, 3 시간동안 incubation 을합니다. 3 SDS-PAGE gel running 을통해서발현용액에목적단백질이있는지여부를확인합니다. 21

4.2. Protein purification with ExiProgen 1

예 1) 1 개의시료인경우 예 2) 16 개의시료인경우 2 아래그림과같이미리준비한

각시료 700~750uL 를 Cartridge 2 의 G 열에첨가하시기바랍니다.

8 4.2. Protein purification with ExiProgen 1 ExiProgen 장비에장착하기에앞서, 6 Hole-punch ( 장비악세 사리 ) 를이용하여, 아래그림과같이 cartridge 1, 2 의실링필름에 구멍을뚫어주시기바랍니다. 예 1) 1 개의시료인경우 예 2) 16 개의시료인경우 2 아래그림과같이미리준비한 Cell lysate ( 상등액 ) 또는단백질발현시료를첨가하시기바랍니다. 각시료 700~750uL 를 Cartridge 2 의 G 열에첨가하시기바랍니다. 시료로딩 3 이후, 아래의순서로 ExiProgen 장비에장착하시기바랍니다. 1. ExiProgen TM 장비의문을열고 Setup tray 를앞으로완전히잡아당깁니다. 22

주의 ) Cartridge 1 장착위치에는 Cartridge 고정을위한실리콘링이양쪽에있습니다.

9 2. 숫자 2 가쓰여진위치에 Cartridge 2 를장착하시기바랍니다. 주의 ) Cartridge 2 의 L 행을 Heating block 위의 guard 에끼워넣어장착하신후, Cartridge 가흔들리지않는지확인하시기바랍니다. 3. 숫자 1 이쓰여진위치에 Cartridge 1 을장착하시기바랍니다. 주의 ) Cartridge 1 장착위치에는 Cartridge 고정을위한실리콘링이양쪽에있습니다. 따라서 Cartridge 의왼쪽면부터맞춘후, 오른쪽면을눌러서끼우고, Cartridge 가흔들리지않는지확인하시기바랍니다. 4. Cartridge 2 와 1 을모두장착한후, 사이에 Waste tray 를장착하시기바랍니다. 주의 ) Cartridge 2 Cartridge 1 Waste tray 순서를지켜서장착하신후, 흔들리지않고제대로고정이되었는지, 확인하시기바랍니다. 5. Elution tube rack 의영문열에 Elution tube 를꽂은후, 장비내 base plate 에장착하시기바랍니다. 23

주의 ) 단, Cartridge 의뚫린 열 과같은 열 에 tip 을꽂으셔야합니다.

10 주의사항!!! Elution tube rack 에 Elution tube 를장착할시에는좌측의그림을참고하여정확한위치에맞게꽂아주시기바랍니다. Elution tube 6. Disposable Tip Rack 에 Sample 의개수에맞는 Tip 을꽂으시기바랍니다. 주의 ) 단, Cartridge 의뚫린 열 과같은 열 에 tip 을꽂으셔야합니다. 또한, Cartridge 의뚫지않은열에상응하는위치에는 tip 을꽂지마시기바랍니다. 7. Setup tray 를밀어넣고문을닫습니다. 단, 이때에 Set up tray 는소리가날때까지밀어넣으시기바랍니다. 24

3 셋팅이완료된후, 아래의순서로 ExiProgen 장비를가동하시기 바랍니다. 1.

start 버튼을누르면, 좌측과같이 ExiProgen 화면이뜨고, 스크롤바가움직인후,

만약정상적으로다음화면으로넘어가지않는경우에는장비의전원을끄고, A/S 센터로연락하시기바랍니다. ) 2.

좌측화면과같이 PREP SETUP 화면이나타나고, 각키트에해당하는프로토콜번호를선택할수있는화면이나타납니다.

11 3 셋팅이완료된후, 아래의순서로 ExiProgen 장비를가동하시기 바랍니다. 1. ExiProgen TM 장비를전원을켜고, Press to start 버튼을눌러주시기바랍니다. start 버튼을누르면, 좌측과같이 ExiProgen 화면이뜨고, 스크롤바가움직인후, 다음화면으로넘어갑니다. ( 이과정은장비의 X, Y, Z 축값을초기화하는과정입니다. 만약정상적으로다음화면으로넘어가지않는경우에는장비의전원을끄고, A/S 센터로연락하시기바랍니다. ) 2. MENU 화면에서 Start 버튼을누르면, 프로토콜을선택할수있는다음화면으로넘어갑니다. 3. 좌측화면과같이 PREP SETUP 화면이나타나고, 각키트에해당하는프로토콜번호를선택할수있는화면이나타납니다. 여기에서 901 을눌러화면에서 Prep type: Protein Sample SRC; Protein_Purification 가나타나는지확인해주시기바랍니다. 그후, Enter 버튼을눌러주시기바랍니다. 25

7. 좌측과같이 Running Mode 화면이뜨면, 최종적으로 Prep type:

12 4. ( 좌측화면은핵산추출시사용되는것으로 ) 본키트사용시에는곧바로 ok 버튼을눌러다음단계로이동하시기바랍니다. 5. ( 좌측화면은단백질합성시사용되는것으로 ) 본키트사용시에는곧바로 ok 버튼을눌러다음단계로이동하시기바랍니다. 6. CHECK LIST 화면이뜨면, Cartridge 와를비롯한부속품이각위치에맞게셋팅되어있는지확인하신후 ok 버튼을눌러주시기바랍니다. 7. 좌측과같이 Running Mode 화면이뜨면, 최종적으로 Prep type: Protein 과 Sample SRC; Protein_Purification 이맞는지확인하신후, RUN 버튼을누르면, 장비가동이시작됩니다. 프로토콜실행이완료되면좌측하단의그림처럼 Work Completion 화면이나타납니다. 실험에사용한모든부속품을제거하신후, 원하시는버튼을눌러주시기바랍니다. ( 단, 종료를원하시어 ok 버튼을누르시면, UV lamp 가가동됩니다.) 26

5. Analysis of sample ExiProgen TM 장비를이용한단백질정제가끝난후, 최종목적단백질은 Elution tube에서회수하실수있으며, 단백질용액은약 250 ul 정도가회수됩니다. ( 단, 최종단백질용액에는 Ni-magnetic magnetic bead가포함되어있을수있으나, 이는 centrifuge를통해제거하신후사용하시면됩니다.

13 5. Analysis of sample ExiProgen TM 장비를이용한단백질정제가끝난후, 최종목적단백질은 Elution tube에서회수하실수있으며, 단백질용액은약 250 ul 정도가회수됩니다. ( 단, 최종단백질용액에는 Ni-magnetic magnetic bead가포함되어있을수있으나, 이는 centrifuge를통해제거하신후사용하시면됩니다.) 또한단백질정제과정중의일부시료는그림 1 와같이 Cartridge 2 에서회수하실수있습니다. 그림 1. Cartridge 2 의각행별시료 Unbound sample 1 st washing sample Sample loading * Unbound sample ; 발현시료를 Ni-NTA bead 에결합시킨후의상등액 (bead 에결합하지않은단백질을포함하는용액 ) * 1 st washing sample ; 단백질정제시, 1 차 washing 후상등액 27

14 각시료는 SDS-PAGE 를통해원하는단백질의정제가제대로이루어졌는지확인할수있습니다. a. Loading mixture를아래와같이제조하시기바랍니다. 최종단백질시료 Unbound/ 1 st washing samples sample 15 ul 5 ul 4x loading dye 5 ul 5 ul 멸균증류수 - 10 ul Total 20 ul 20 ul b. 95 에서 5~10min 분간열처리를하시기바랍니다. c. SDS-PAGE gel(10x8 (cm), 10 well) 에각시료를하기와같은양을 loading 하신후, running 하시기바랍니다. 최종단백질시료 ; 10 ul, Unbound/1 st washing sample ; 5 ul d. Coomassie blue 용액으로염색및탈색하시면그림 2, 3 과같이목적단백질의밴드를확인하실수있습니다. 28

ExiProgen 을이용한목적단백질의정제 M : AccuLadder Protein Size Marker (Low), CL ; Recombinant cell lysate P ; Purification sample Figure 3.

15 그림 2. (in vivo 시료 ) E. coli cell lysate 로부터목적단백질정제 A. DUSP3 가과발현된 E. coli cell 준비 M : AccuLadder Protein Size Marker (Low), BI ; Pre-induction sample, I ; Post-Induction sample B. ExiProgen 을이용한목적단백질의정제 M : AccuLadder Protein Size Marker (Low), CL ; Recombinant cell lysate P ; Purification sample Figure 3. (in vitro 시료 ) 무세포단백질발현법으로발현된목적단백질정제 A. 발현시료 B. ExiProgen 을이용한정제 M; AccuLadder Protein Size Marker (Broad), 1: DUSP3 (22 kda), 2 : CAT (24 kda), 3 : AcGFP (28 kda), 4 : ERFP (31kDa), 5 : EF-Ts (34 kda), 6 : VF (45 kda) 29

16 6. Maintenance 단백질정제가끝난후, cartridges 및기타장비액세서리는다음과같이보관 하시면됩니다. A. Waste tray 및 Disposable tip rack Waste tray는 tray 안의용액을버리고흐르는물에씻은후 20% ethanol을뿌려서닦은후, 보관하면됩니다. 또한 Disposable tip rack은불순물이묻어있지않은경우에는그대로보관하시고, 만약불순물이묻은경우에는 20% Ethanol을뿌려서닦은후, 보관하면됩니다. B. Cartridge 1, 2 반응이끝나고, 남은 Cartridge 는뚜껑을덮은상태로, 냉장보관하시기 바랍니다. 30

17 7. Troubleshooting guide 단백질정제에문제가있는경우, 아래의내용을참조하여해결하시기바랍니다. 1. 목적단백질의정제량이적거나, 정제되지않는경우 A 원인목적단백질의발현양이적은경우 해결방안각실험에서제시하는방법에따라서, 목적단백질의 expression level을최적화하기바랍니다. B Loading 시료의양이적은경우 (Cell lysate 의경우에해당함 ) Resuspension buffer 의양을줄여서, cell lysis 하시기바랍니다. C His-tag의위치 목적단백질의 3차구조형성시 His-tag이외부로노출되지않아, 정제가되지않을수있으며, 이경우에는 tag의위치를변경하시기를권장합니다. D 목적단백질이분해되는경우 Cell lysis 하는동안 protease inhibitor 를첨가하시기바랍니다. 2. 목적단백질이 Unbound 또는 1 st washing 시료에서확인되는경우 A B 원인 Overloading 되는경우 단백질이침전되는경우 해결방안 Ni-NTA magnetic bead의 binding capacity를넘어선양의시료가로딩된경우에해당하며, 시료를희석하여사용하시기바랍니다. Solubilization reagent (ex. 0.1% Triton X-100 또는 Tween 20) 등을 buffer에첨가하여사용하실수있습니다. 3. 목적단백질이외의잡밴드가검출되는경우 A 원인 Binding 할수있는목적단백질의양이적은경우 해결방안 1-A와 1-B를참조하시기바랍니다. 31

18 8. References Porath, J., et al. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258: Hochuli, E. (1989) Genetically Designed Affinity Chromatography Using a Novel Metal Chelate Absorbent. Biologically Active Molecules: Hochuli, E. (1990) Purification of recombinant proteins with metal chelate adsorbent. Genet Eng(N Y) 12: Frenzel A., et al. (2003) Novel purification system for 6xHis-tagged proteins by magnetic affinity separation. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 793(2): Kim JS., et al. (2007) Highly-efficient purification of native polyhistidine-tagged proteins by multivalent NTA-modified magnetic nanoparticles. Bioconjug Chem 18(2): Block H. (2009) Immobilized-metal affinity chromatography (IMAV): a review. Methods Enzymol 463:

19 9. Related products Cat. No. Product Size K-7250 AccuRapid Cell-Free Protein Expression Kit K-7260 AccuRapid Midi Protein Expression Kit K-7270 AccuRapid Maxi Protein Expression Kit K ul x 24 reactions 1mL x 5 reactions 10mL x 1 reaction 16 reactions K-7301 ExiProgen TM EC Protein Synthesis Kit 32 reactions K reactions K-7320 ExiProgen TM EC-Tagfree Protein Synthesis Kit 8 reactions K-7330 ExiProgen TM EC-Disulfide Protein Synthesis Kit 8 reactions K-7350 pbivt vector set Each 5ug K reactions ExiProgen TM ProXpress PCR Template Kit K reactions D-2010 AccuLadder Protein Size Marker (Broad) 500 ul D-2020 AccuLadder Protein Size Marker (Low) 500 ul S-2041 Gene Synthesis Service - S-2500 Protein Synthesis Service - A-5041 ExiProgen TM - 33

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