KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 2003;46: 사람코점막과배양된코점막상피세포에서 15-Lipoxygenase 와 Cyclooxygenase-2 의발현 연세대학교의과대학이비인후과학교실, 1 두뇌한국 21 의과학사업단 2 김경

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1 KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 2003;46: 사람코점막과배양된코점막상피세포에서 15-Lipoxygenase 와 Cyclooxygenase-2 의발현 연세대학교의과대학이비인후과학교실, 1 두뇌한국 21 의과학사업단 2 김경수 1,2 윤주헌 1,2 김창훈 1 김선구 1 장정현 1 김지훈 1 Expression of 15-Lipoxygenase and Cyclooxygenase-2 in Human Nasal Mucosa and Cultured Human Nasal Epithelial Cells Kyung-Su Kim, MD 1,2, Joo-Heon Yoon, MD 1,2, Chang-Hoon Kim, MD 1, Sun Goo Kim, MD 1, Jung Hyun Chang, MD 1 and Ji Hoon Kim, MD 1 1 Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University College of Medicine, Seoul; and 2 Brain Korea 21 Project for Medical Science, Seoul, Korea ABSTRACT Background and Objectives:The purpose of our study was to examine the expression of 15-lipoxygenase (15-LO) in human nasal mucosa and to investigate the change of expression of 15-LO and cyclooxygenase-2 (COX-2) as a function of mucociliary and squamous differentiation. Materials and Method:Human inferior turbinates were used and immunohistochemistry with 15-LO and COX-2 antibody was done. Passage-2 normal human nasal epithelial cell culture using air-liquid interface method was performed for 14 days and the cells were divided as retinoic acid (RA)-sufficient and RA-deficient group. Western blot analysis for 15-LO and COX-2 expression was performed on each group on 0, 7, and 14 days. Results:15-LO expression of mucociliated epithelium was noted in ciliated cells and basal cells, but was not found in goblet cells and secretory acini. In squamous epithelium, the expression of 15-LO was weaker than that in the mucociliated epithelium, but the expression of COX-2 showed no difference between them. In Western blot analysis, 15-LO expression was significantly higher in RA-sufficient culture than in RA-deficient culture and this expression was time-dependent. COX-2 expression was almost same level in RA-deficient culture, but its expression was significantly higher in RA-sufficient culture on 7 and 14 days than on zero day. Conclusion:15- LO and COX-2 may be related to differentiation and development of nasal epithelial cells. However, it is unclear whether this relationship is direct or indirect effect of 15-LO and COX-2. This question remains to be solved. (Korean J Otolaryngol 2003;46:649-53) KEY WORDS:Nasal mucosa 15-Lipoxygenase, arachidonate Synthase, prostaglandin Cell differentiation

2 사람코점막에서 15-LO 와 COX-2 의발현 Korean J Otolaryngol 2003;46:649-53

김경수 외 전기영동은 8% SDS-polyacrylamide gel을 이용하였 게 발현되었으나, 배세포에서는 발현되지 않았다(Fig. 1A). 고 전기영동 후 nitrocellulose membrane에 전이시킨 다 분비선의 경우 점액 및 장액선 모두에서 발현되지 않았다 음 이 막을 10% milk in TBST로 4 에서 밤새 반응시킨 (Fig. 1C).

1B), 분비선에서도 발현되지 않았다(Fig. 1C). UK)로 1시간 처치한 다음 세척하였다. 이후 enhanced chemiluminescence(ecl kit, Amersham Pharmacia Biot- 일차 항체를 제외하고 염색한 음성 대조군의 경우 양성 반응이 관찰되지 않았다(Fig. 1D).

위의 membrane 하비갑개의 전단부에서 편평 상피 부위와 중간부에서 점 을 deprobing 후 actin 항체(Santa Cruz Biotechnology 액섬모 상피조직 부위를 선택하였다. 각각에 대해 15-LO Inc.

LO와 COX-2 밴드의 세기를 actin 밴드의 세기에 대한 15-LO의 경우 점액섬모 상피에서 강하게 발현되었으나 비율(15-LO 또는 COX-2/actin)로 표시하여 강도를 비 편평 상피조직의 경우 발현이 매우 적거나 관찰되지 않아 교하였다. 점액섬모 상피조직보다 발현이 감소된 소견을 보였다(Fig. 2A and B).

15-LO는 섬모상피세포와 기저세포의 세포질에서 강하 A B 사람 정상 코점막 상피세포에서 분화 양상 및 정도에 따 른 15-LO와 COX-2의 발현 사람 정상 코점막 상피세포를 섬모 상피세포로 분화시 C D Fig. 1. Expression of 15-lipoxygenase and cyclooxygenase-2 in human nasal mucosa.

3 김경수 외 전기영동은 8% SDS-polyacrylamide gel을 이용하였 게 발현되었으나, 배세포에서는 발현되지 않았다(Fig. 1A). 고 전기영동 후 nitrocellulose membrane에 전이시킨 다 분비선의 경우 점액 및 장액선 모두에서 발현되지 않았다 음 이 막을 10% milk in TBST로 4 에서 밤새 반응시킨 (Fig. 1C). 후 15-LO와 COX-2 항체로 실온에서 각각 4시간 동안 COX-2는 섬모상피세포의 세포질에서 주로 발현되었고 반응시켰다. TBST로 세척 후 horseradish peroxide 중합 일부 기저세포에서 발현되었으나 배세포에서는 발현되지 않 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, 았고(Fig. 1B), 분비선에서도 발현되지 않았다(Fig. 1C). UK)로 1시간 처치한 다음 세척하였다. 이후 enhanced chemiluminescence(ecl kit, Amersham Pharmacia Biot- 일차 항체를 제외하고 염색한 음성 대조군의 경우 양성 반응이 관찰되지 않았다(Fig. 1D). ech)로 발색시킨 다음 autoradiography를 이용하여 15LO와 COX-2의 밴드를 각각 검출한 다음 이에 대해 Scion 점액섬모 상피조직과 편평 상피조직에서 15-LO와 COX- Image(Scion Co., Frederick, MD, USA)를 이용하여 각 2의 발현 비교 밴드의 세기를 반정량적으로 분석하였다. 위의 membrane 하비갑개의 전단부에서 편평 상피 부위와 중간부에서 점 을 deprobing 후 actin 항체(Santa Cruz Biotechnology 액섬모 상피조직 부위를 선택하였다. 각각에 대해 15-LO Inc., Santa Cruz, CA, USA)(1 500 농도)로 Western 와 COX-2 항체로 면역조직화학염색을 하여 분화에 따른 blot analysis하여 actin 밴드에 대한 세기를 구하였다. 15- 각 단백 발현의 차이를 알아보았다. LO와 COX-2 밴드의 세기를 actin 밴드의 세기에 대한 15-LO의 경우 점액섬모 상피에서 강하게 발현되었으나 비율(15-LO 또는 COX-2/actin)로 표시하여 강도를 비 편평 상피조직의 경우 발현이 매우 적거나 관찰되지 않아 교하였다. 점액섬모 상피조직보다 발현이 감소된 소견을 보였다(Fig. 2A and B). 결 과 COX-2의 경우 점액섬모 상피와 편평 상피조직간에 유사 하게 발현되어 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2C and D). 사람 정상 코점막에서 15-LO와 COX-2의 발현 사람 하비갑개 점막을 다클론성 15-LO와 COX-2 항체 로 면역조직화학염색을 하여 각 단백의 발현을 관찰하였다. 15-LO는 섬모상피세포와 기저세포의 세포질에서 강하 A B 사람 정상 코점막 상피세포에서 분화 양상 및 정도에 따 른 15-LO와 COX-2의 발현 사람 정상 코점막 상피세포를 섬모 상피세포로 분화시 C D Fig. 1. Expression of 15-lipoxygenase and cyclooxygenase-2 in human nasal mucosa. A 15-lipoxygenase expresses in the upper portion of cytoplasm of ciliated cells and basal cells, but not in goblet cells. B Cyclooxygenase-2 expresses mostly in upper portion of ciliated cells and partly in basal cells, but not in goblet cells. C In submucous glands, positive reactions to cyclooxygenase-2 and 15-lipoxygenase are not found. D Negative control in which the primary antibody was omitted. A B C D Fig. 2. Expression of 15-lipoxygenase and cyclooxygenase-2 in mucociliary and squamous epithelium. Expession of 15-lipoxygenase is more intense in mucociliated epithelium (A) than in squamous epithelium (B), but expression of cyclooxygenase is almost same level between mucociliated (C) and squamous (D) epithelium. 651

4 사람코점막에서 15-LO 와 COX-2 의발현 RA Actin Ratio LO 0 day 7 day 14 day COX-2 0 day 7 day 14 day Fig. 3. Expression of 15-lipoxygenase 15-LO and cyclooxygenase-2 COX-2 according to culture duration in the presence or absence of retinoic acid RA. In Western blot analysis using normal human nasal epithelial cells grown in RA-sufficient RA or RA-deficient RA culture media, the values of 15-LO and COX-2 expression were marked as ratio using their corresponding actin level after the estimation of intensity of hybridization bands by densitometer. 15-LO expression is significantly higher in RA culture than in RA culture and the expression of 15-LO increases with culture duration in RA culture. COX-2 expression is almost same level in RA culture throughout culture duration. However, in RA culture, COX-2 expression increases on 7 and 14 days after confluence compared with that on the day of confluence, but there is no significant difference between 7 and 14 days. - Korean J Otolaryngol 2003;46:649-53

5 김경수외 REFERENCES 1) Herschman HR. Regulation of prostaglandin synthase-1 and prostaglandin synthase-2. Cancer Metastasis Rev 1994;13: ) Hill EM, Bader T, Nettesheim P, Eling TE. Retinoid-induced differentiation regulates prostaglandin H synthase and cpla2 expression in tracheal epithelium. Am J Physiol 1996;270:L ) Ford-Hutchinson AW. Arachidonate 15-lipoxygenase: Characteristics and potential biological significance. Eicosanoid 1991;4: ) Tang DG, Chen YQ, Honn KV. Arachidonate lipoxygenase as essential regulators of cell survival and apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93: ) Nadel JA, Conrad DJ, Ueki IF, Sigal E. Immunocytochemical localization of arachidonate 15-lipoxygenase in erythrocytes, leukocytes, and airway cells. J Clin Invest 1991;87: ) Hunter JA, Finkbeiner WE, Nadel EJ, Goetzl EJ, Holtzman MJ. Predominant generation of 15-lipoxygenase metabolites of arachidonic acid by epithelial cells from human trachea. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: ) Henke D, Danilowicz RM, Curtis JF, Boucher RC, Eling TE. Metabolism of arachidonic acid by human nasal and bronchial epithelial cells. Arch Biochem Biophys 1988;267: ) Kumlin M, Hamberg M, Granstrom E, Bjorck T, Dahlen B, Matsuda H, et al. 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid is the major arachidonic acid metabolite in human bronchi: Association with airway epithelium. Arch Biochem Biophys 1990;282: ) Watkins DN, Peroni DJ, Lenzo JC, Knight DA, Garlepp MJ, Thompson PJ. Expression and localization of COX-2 in human airways and cultured airway epithelial cells. Eur Respir J 1999;13: ) Pinto S, Gallo O, Polli G, Boccuzzi S, Paniccia R, Brunelli T, et al. Cyclooxygenase and lipoxygenase metabolite generation in nasal polyps. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 1997;57: ) Yoon JH, Moon HJ, Seong JK, Kim CH, Lee JJ, Choi JY, et al. Mucociliary differentiation according to time in human nasal epithelial cell culture. Differentiation 2002;70: ) Hill EM, Eling T, Nettesheim P. Changes in expression of 15-lipoxygenase and prostaglandin-h synthase during differentiation of human tracheobronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1998;18: ) Shannon VR, Crouch EC, Takahashi Y, Ueda N, Yamamoto S, Holtzman MJ. Related expression of arachidonate 12- and 15-lipoxygenase in animal and human lung tissue. Am J Physiol 1991;261:L ) Demoly P, Crampette L, Lebel B, Campbell AM, Mondain M, Bousquet J. Expression of cyclooxygenases 1 and 2 proteins in upper respiratory mucosa. Clin Exp Allergy 1998;28:

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Microsoft Word doc KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 2006;49:307-12 사람정상코점막상피세포에서겔형성점소 (Gel-Forming Mucin) 분비에대한 Prostaglandin E 2 의효과 김진국 1 김창훈 2,3 김규보 2 장현종 1 김현직 2 윤주헌 2,3,4 Effect of Prostaglandin E 2 on Gel-forming