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9 mau A B C Qsepharose051229manual001:1_Conc Qsepharose051229manual001:1_Fractions Qsepharose051229manual001:1_Inject Manual run Manual run 3:1_Fractions Qsepharose051229manual001:1_Logbook Manual run 3:1_Logbook mau %B 400 S-300 SDS cut kda kda Waste kda min con min 17 kda 72 kda 10 kda 34 kda 25 kda 15 kda 10 kda Silver Staining of rllc1 (15% Acrylamide gel)

10 Immunized with rllc1 Spleen Cell Fusion HPRT- Myeloma 43 kda 34 kda 26 kda Hybridoma Cells HAT selection 17 kda 11 kda ELISA screening Sample: Ad-LLC1 H : uninfected + : infected Western blotting

11 A549 A549 LLC1 DAPI Merge vector LLC1 WI26 WI26 LLC1 DAPI Merge vector LLC1

12 Lung Salpinx Skin

13 Ad-LacZ Ad-LLC1 Con (pfu/cell) H1588 PARP-48 hr Beta-Actin PARP, 48 hr Beta actin H1703 Caspase 3 Caspase 9 (47/37 kda)

14 O.D. 0.2 M O I 0.8 M O I 3.2 M O I O.D. G F P L L C 1-G F P 0 G F P L L C - G F P G F P L L C - G F P G F P L L C - G F P MOI c o lo n y n u mb e r ( V e cto r L L C 1 co lo n y n u m b er (n ) mm< = 4mm 3mm 1~2mm 300 H v e c to r L L C 1 H1299 c o lo n y n u m b e r v e c to r L L C 1 H520 4mm 3mm 1~2mm c o lo n y n u m b e r v e c to r LLC 1 A549 4mm 3mm 1~2mm

15 300 c o lo n y n u m b e rb m m 4 m m 3 m m 1 ~ 2 m m 0 v e c to r L L C 1 Vector LLC1 Negative Control

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17 #! + - #1 : yeast transformant of C20orf85 bait + : Positive control of protein-protein interaction - : Negative control of protein-protein interaction Master plate lacz expression SD-L.W. Filter assay ADE2 expression URA3 expression SD-L.W.A SD-L.W.U. The PBN204 yeast strain has lacz, URA3 and ADE2 as reporters. μ

18 lacz expression URA3 expression ADE2 expression Filter assay SD-LWU SD-LWA Master plate With bait With vector With bait + With vector - - : Negative control of protein-protein interaction + : Positive control of protein-protein interaction Prey plasmids were prepared by conventional E. coli transformation with yeast DNAs from 15 Ura + lacz + Ade + colonies. SD-LW Number of Colonies Library A Library B Library C 1 st 2 nd Reporter I (URA3) Reporter II (lacz) Reporter III (ADE2) Real Positives

19 Genomic DNA Targeting vector BamHI/XhoI cut BamHI RI KpnI XhoI RI XhoI RI probe 4.3kb RI RI RI RI RI neo DT Targeted locus BamHI/XhoI cut BamHI RI KpnI RI XhoI RI 8.6kb neo Targeting vector Digested by EcoRI 4.8kb 3.1kb 1.3kb 1kb

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21 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) cdna synthesis Concatamer NlaIII digestion Linker Ligation BsmFI digestion and gap filling Sequencing and counting Tag frequency Ditag formation PCR amplification and Nla III digestion Log(Relative LLC-1 expression) H1703 H358 A549 H1299 Hop92 H226 H2170 H520 H522

22 13 adenocarcinoma, 9 squamous carcinoma: no expression 1 squamous and 1 adeno-carcinoma: weak and diffuse staining GATGAGCAAATGGGCCTAGAGGTGGACAAAGGGCCCAGAC*GTGAGCAAAGGATGGCAGCAAGCCC*GG ACCCAAGC*GAC*GC*GGC*GAAAGCACAGC*GACCCCACCCTC*GCCAGGTGCAGAGCCATTTCC*GCCTC C*GAGTCCTGC*GTTGCCTGGCAACC*GGTCTCCCAGGAGAC*GC*GAGAC*GCTGAGCCCAGGGCCAGAG CTTGC*GGGGCGCACAGAGCCCCCAGGCCTCATGGCGCAGAAACCTCTCAGCACCGCGGCGGCTGAACGC A Promoter GCCCGGACCCAAGCGACGCGGCGAAAGCACAGCGACCCCACCCTCG Unmethyl GTTTGGATTTAAGTGATGTGGTGAAAGTATAGTGATTTTATTTTTG Methylat GTTCGGATTTAAGCGACGCGGCGAAAGTATAGCGATTTTATTTTCG B H358 m CpG CpG H23 H1299 H522 Hop92

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