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1 大韓不妊學會誌 : 第 32 卷第 1 號 2005 Kor. J. Fertil. Steril., Vol. 32, No. 1, 2005, 3 동결 - 융해배아이식에서손상된할구의미세수술적제거의임상적효과 포천중문의과대학교차병원여성의학연구소 최원윤 손지온 박은아 이동률 이우식 한세열 박이석조정현 김수희 차광렬 윤태기 Clinical Outcomes of Frozen-thawed Embryo Transfer after Microsurgical Removal of Damaged Blastomere Won Yun Choi, Jie Ohn Sohn, Eun A Park, Dong Ryul Lee, Woo Sik Lee, Se Yul Han, Lee Suk Park, Jung Hyun Cho, Soo Hee Kim, Kwang Yul Cha, Tae Ki Yoon Fertility Center of CHA General Hospital, CHA Research Institute, Pochon CHA University, Seoul, Korea Objective: Human infertility clinics have been faced the demand for improving clinical results. The purpose of this study was to evaluate the effect of microsurgical removal of damaged blastomeres (DB) in frozen-thawed embryos on the clinical outcomes. Methods: From January 2003 to May 2004, out of 258 thawing ET cycles were divided into three groups: Group-1 (n=46): Intact cleavaged embryos after thawing. Remained cycles with embryos containing DB were randomly divided into two groups. Group-2 (n=102): Drilling zona pellucida (ZP) of frozen-thawed embryos by acidified Tyrode's solution. Group-3 (n=110): Drilling ZP and removal of DB. Embryos after microsurgical manipulation were transferred into the uterus of patients. Results: Clinical profiles and the mean number of transferred embryos among three groups were not different. Pregnancy and implantation rates were similar in three groups. It were 30.4% and 9.3% in Group-1, 29.4% and 7.8% in Group-2, and 26.4% and 7.6% in group-3, respectively. Miscarriage rate in Group-3 (37.9%) was slightly higher than those in Group-1 and Group-2 (14.3% and 23.3%), but it was not statistically significant. Conclusion: Intact cleaving embryos after DB removal showed higher potent of pregnancy and implantation. We could not find any improvement of clinical outcome by removal of DB in frozen-thawed embryos. Key Words: Damaged blastomeres (DB), Microsurgical removed, Frozen-Thawed embryo, Pregnancy rate 연락저자 : 최원윤, 우 ) 서울특별시강남구역삼 1 동 606-5, 포천중문의과대학교차병원여성의학연구소 Tel: (02) , Fax: (02) , 주관책임자 : 이동률, 우 ) 서울특별시강남구역삼 1 동 606-5, 포천중문의과대학교차병원여성의학연구소 Tel: (02) , Fax: (02) , * 본연구는교육인적자원부특성화대학지원사업과세로노코리아에의해지원받아수행되었음

2 1972년쥐에서동결배아를이용한산자의생산이성공한 1 이후초기배아의동결보존기술은가축을포함한대동물과인간에게도적용이확대되었다. 2,3 그결과로 1984년호주에서최초로인간의동결배아이식후에성공적인분만이보고되었고, 4 그후계속되는연구를통해많은발전이이루어졌다. 한편지난 20년동안괄목할만한과배란유도방법의발전으로채취된난자의수와배아의수가증가하였다. 5 또한, 배양기술의발전과다태아임신의방지책으로소수의배아만이이식되어발생능력을가진잉여배아가증가하였고, 이들의보관을위한배아의동결보존방법은시험관아기시술과정에서가장중요한업무중하나가되었다. 6 그외에도난소과자극증후군 (ovarian hyperstimulation syndrome) 이심할경우, 7 난자채취후체외수정이불가능한경우, 그리고난자공여자와수여자간의착상시기가일치하지않을경우, 암과같은병의치료를위해서방사선치료를받아그이후의생식기능의유지에문제가발생할것으로사료되는환자에서도동결보존이생식능력을유지할수있는대안으로제시되고있다. 배아의동결과융해그리고그배아의이식은시험관아기시술프로그램에서많이연구되고있음에도불구하고동결과융해이후배아의생존율과안전성, 이식이후의착상율과임신율은동결과융해의과정을거치지않은배아의착상율과임신율에비해저조하게나타나고있다. 8 이러한차이를극복하고임상적인착상율과임신율의상승과안정을위하여연구자들은보다안정한동결보호제와동결방법을개발하고자노력하고있다. Trounson과 Mohr 4 는 1983년에완만동결방법으로동결보호제인 1.5 M dimethylsulphoxide (DMSO) 을사용하여인간의 4~8세포기배아를 -80 까지동결시킨뒤액체질소에보관하였고, 융해후이식하여최초의임신성공을보고한바있다. 그후 Zeilmaker 등 9 은 1.45 M DMSO를사용하여 -40 까지완만동결한배아를이용하여일란성쌍생아의탄생을보고하였다. Lassalle 등 10 은배아를 1.5 M 1,2-propanediol (PROH) 와 0.1 M sucrose을사용하여평형을시킨후 -30 까지완만동결을시도하였다. 최근에는 ethylene glycol (EG) 이세포내투과성이높고독성이낮은장 점때문에동물과인간난자와배아의동결에널리이용되고있다. 11 이러한동결보존제의선택외에도동결방법에대한연구가많이진행되고있다. 기존의완만동결법과달리고농도의동결보호제를사용하여초급속으로동결하여세포내에얼음결정 (Ice Crystal) 이생기지않게하는초급속동결법 (vitrification) 이도입되어좋은임상결과를얻고있다. 12~14 이러한동결방법의발전은동결배아의생존율을증진시키고있으나아직도배아의상태에따라동결해동후일부할구에상해가나타나곤한다. Etiene 15 와 El-Toukhy 16 등은일반적으로발생기배아의상해는포배내할구수의감소를유도하고배아에서기인되는성장인자의생산감소에의해저조한부화율과임신율의원인이될수있다고하였다. 또한, 이러한손상할구는주변할구에좋지않은영향을주어배아의발생과착상과정을저해할수있다. 따라서본연구에서는미세조작술을이용하여동결-융해후손상된할구를제거하고이러한과정이착상율과임신율그리고유산율에미치는영향을비교하여임상적효용성을확인하고자하였다. 연구대상및방법 1. 연구대상본연구에서는 2003년 1월부터 2004년 5월까지본원에내원하여동결배아의융해후이식을시행한 258 주기를대상으로하였다. 융해된배아는다음과같은 3개의군으로무작위로나누어졌다. Group-1 (n=46) 은해동시손상된할구가없는군으로산성화된 Tyrode 용액 (ph=2.3) 을사용하여보조부화술을시행하였다. 해동후손상된할구를가진배아는무작위로두개의실험군으로나누었다. Group-2 (n=102) 는산성화된 Tyrode용액을사용하여보조부화술만을시행하였고, Group-3 (n=110) 은산성화된 Tyrode용액을이용하여투명대의일부를녹여내고미세조작술로손상받은할구를제거하였다 (Figure 1)

3 Embryos Thawing Incubation Intact Embryos Partially Damaged Embryos DB Assisted Hatching (AH); Group 1 AH Assisted Hatching (AH); Group 2 AH Biopsy of damaged blastocyst (DB); Group 3 Removing of DB Embryo Transfer Confirm of pregnancy Figure 1. Schematic flow chart for this study. 2. 연구방법 1) 배아의동결-융해및배양동결보존을위한기본용액은 10% Serum Sub- stitute Supplement (SSS, Irvine Scientific) 가첨가된 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, GIBCO BRL) 을사용하였고, 투과성동결보호제로는 1.5 M ethylene glycol (EG, Sigma Chemical Co.), 그리고비

4 A B C D E F Figure 2. Assisted hatching (AH) and microsurgical removal of damaged blastomere (DB) in thawed embryos. AH in a thawed embryo (A, B); Damaged blastomere arrow in thawed embryo (C); Microsurgical removal of DB in a thawed embryos (D, E); Removed DB (F). 투과성동결보호제로는 0. 2 M sucrose (Sigma) 를이용하였다. 시험관아기시술과정에서잉여배아로남겨진 4~8세포기배아를 10% SSS - DPBS, 0.5 M EG, 1.0 M EG, 1.5 M EG, 그리고 1.5 M EG M sucrose에각각 5, 5, 5, 10, 그리고 5분씩처리하여탈수하였다. 이후 0.25 ml plastic-straw 에 loading한뒤 24 로준비된세포동결기 (Kryo 10 serise III, Planer; Cryomagic I& II, Miraebiotec) 를이용하여완만동결하였다. 24 에서 -7 까지는 -2 /min의비율로온도를내린뒤, 5분간유지뒤에식빙 (seeding) 을시행하였다. 그리고 -39 까지는 -0.3 /min 의비율로온도를내린뒤액체질소에침지보관하였다. 보관의시기는최소 1개월에서최대약 5년까지다양하였다. 해동을위하여보관된 Straw를액체질소에서꺼내대기중에서 40초동안방치후항온수조내 37 의물에서 40초동안융해했다. 재수화는 4단계의평형 (equilibration) 용액을사용하였다. 즉, 1 M EG M sucrose, 0.5 M EG M sucrose, 0.2 M sucrose, 그리고 10% SSS-DPBS에각각 5, 5, 5, 그리고 5분씩처리하였으며, 2002년이전에동결된배아는투과성동결보호제로 1,2-Propanediol (PROH, Sigma) 를그리고비투과성동결보호제로 sucrose를사용하였으며기본용액으로 20% fetal bovine serum (FBS, Sigma) - DPBS를사용하여해동하였다. 동결과융해과정은실온에서각단계별로해당과정을처리하였다. 융해된배아는 BL배양액 (Irvine Scientific or SAGE) 또는 G2배양액 (Vitrolife) 에침지하여 5% CO 2 와 37 가유지되는배양기내에서배양했다. 2) 융해된배아에서의손상된할구의제거융해된배아의투명대를산성화된 Tyrode 를이용하여부분적으로녹여낸후에미세조작기를이용해서 DB를제거하여배양액으로옮겨놓았다 (Figure 2)

5 Table 1. Patient characteristics according to the groups Group-1 (n=46) Group-2 (n=102) Group-3 (n=110) Infertility duration 4.91± ± ±2.37 Age of female 33.43± ± ±4.16 No. of induction cycles 1.61± ± ±0.91 No. of follicles 14.72± ± ±4.45 No. of retrieved oocytes 20.43± ± ±8.83 No. of frozen embryos 12.24± ± ±6.97 No. of thawed embryos 7.78± ± ±2.76 No. of transferred embryos 4.20±1.05 * 4.68±0.71 * 4.44±0.86 * Mean ± SD., *The values with different superscripts in the row are significantly different (p<0.05) (a, b) 3) 배아의이식해동된배아는각군별로배아이식용 catheter (COOK) 에 loading하여배면초음파혹은질식초음파를이용하여자궁의위치를확인하며이식하였다. 4) 임신과착상의확인이식후약 2주 (14일) 후에혈액내의 β-hcg를측정하여임신의유무를확인하고초음파로태낭의수를관찰하여착상된배아의수를확인하였다. 또한환자를추적관찰하여임신지속여부를확인하였다. 3. 통계분석통계적인분석은 Student's t-test와 Chi-square test 를이용하였고, p 값이 0.05이하인경우를통계적으로유의한차이가있는것으로판정하였다. 결과전체 258주기중 46주기 (18%) 는동결해동과정에서할구가전혀손상받지않아 Group-1로분류되었고, 나머지 212주기 (82%) 는배아중일부혹은전부가손상을받았으며무작위로 Group-2와 Group-3으로나뉘어졌다. Group-1과 Group-2는산성화된 Tyrode 용액을사용하여보조부화술만을시행하였다. Group-3의배아는산성화된 Tyrode 용액을이용하여투명대의일부를녹여내고미세조작술로손상된할구를제거하였다. 세환자군간의기본정보는불임기간, 나이, 난자의평균채취개수, 동결된배아의수는 Table 1 에서와같이유의적인차이는없으나이식된배아의수에서 Group-1과 Group-2군간에는유의한차이 (p<0.006) 를보였다. 임신율은 Group-1,-2,-3에서각각 30.4% (29/110), 29.4% (31/102) 그리고 26.4% (14/46) 로나타났고, 이세군사이에유의적인차이는없었다. 하지만손상된할구를제거한 Group-3에서나머지두군에서보다임신율이약간저조한것을볼수있었다. 또한이들의착상율과유산율을비교해본결과착상율의경우 Group-1,-2,-3에서각각 9.3% (18/193), 7.8% (37/477), 7.6% (37/488) 이었으며, 유산율의경우 14.3% (2/14), 23.3% (7/30), 37.9% (11/29) 로나타났다. 세군사이의유의한차이는없으나 Group-3 의유산율이다른두군에비하여약간높은경향을나타냈다 (Table 2). 연구대상을 ICSI와일반적인체외수정을시도한경우로구분하여그임상결과를비교, 분석하였다. 일반적인체외수정의경우임신율은 Group-1,-2,-3 에서각각 34.8% (8/23), 31.1% (14/45), 23.8% (15/63) 로나타났고, 착상율은 11.1% (11/99), 8.5% (18/211), 5.7% (16/277) 이고, 유산율은 25.0% (2/8), 28.5% (4/ 14), 40.0% (6/15) 로나타났다. 또한 ICSI를시행한경우임신율은각각 26.1% (6/23), 28.1% (16/57), 29.8% (14/47) 였고, 착상율은 7.5% (7/94), 7.1% (19/ 266), 10.0% (21/211) 이고, 유산율은 0.0% (0/6), 18.7%

6 Table 2. Comparison of pregnancy, implantation and abortion rate among Group-1,-2 and -3 Group-1 * Group-2 ** Group-3 *** Pregnancy rate 26.4 (14/46) 29.4 (31/102) 30.4 (29/110) Implantation rate 9.3 (18/193) 7.8 (37/477) 7.6 (37/488) Abortion rate (/pregnancies) 14.3 ( 2/14) 23.3 ( 7/30) 37.9 (11/29) Ongoing/delivery rate 85.7 (12/14) 76.7 (23/30) 62.1 (18/29) *Group-1: Embryos with intact blastomeres after freezing thawing and then undergone AH **Group-2: Embryos with damaged blastomere (DB) after freezing and thawing and then undergone AH ***Group-3: Embryos with damaged blastomere (DB) after freezing and thawing and then undergone AH and DB removal Table 3. Comparison of clinical outcomes between standard IVF (IVF) and ICSI in thawing embryo transfer program Group-1 * Group-2 ** Group-3 *** IVF ICSI IVF ICSI IVF ICSI Implantation rate 11.1 (11/99) 7.5 (7/94) 8.5 (18/211) 7.1 (19/266) 5.7 (16/277) 10 (21/211) Abortion Rate (/pregnancies) 25.0 (2/8) 0.0 (0/6) 28.5 (4/14) 18.7 (3/16) 40.0 (6/15) 35.7 (5/14) Ongoing/ Delivery Rate 75.0 (6/8) (6/6) 71.5 (10/14) 81.3 (13/16) 60.0 (9/15) 64.3 (9/14) *Group-1: Embryos with intact blastomeres after freezing thawing and then undergone AH **Group-2: Embryos with damaged blastomere (DB) after freezing and thawing and then undergone AH ***Group-3: Embryos with damaged blastomere (DB) after freezing and thawing and then undergone AH and DB removal (3/16), 35.7% (5/14) 로나타났다. 각군간의임상결과는유의한차이가나타나지않았다 (Table 3). 고찰배아동결및융해는시험관아기시술프로그램의많은발전으로인해발생되는잉여배아의보존을위하여그필요성이더욱가중되고있으며보조생식술의가장중요한부분중의하나로자리잡고있다. 이에여러가지방법으로동결보존방법이발전하고연구되고있다. 여러가지종류의동결보존제의처리및동결보존제의노출시간정도를조절하는일또한그러한방법들중의하나이다. 그러나물리화학적인여러측면에서지금까지도문제가되고있는것은동결배아의해동시생겨나게되는할구의일부혹은전체적인손상에관한것이다. 전체손상을입은할구를가진배아의경우이식이불가하나부분손상을입은할구를가진배아의경 우이식을하기도한다. Van den Abbeel 15 과 El- Tokukhy 16 등도이와관련되어할구의부분적손상이나손실에관한연구를진행하였다. 하지만이것이배아의발달혹은임신과착상에어떠한영향을미칠지에관해서는아직까지연구가미진하다. 본연구는이점에서착안하여해동시에손상된할구를미세조작술을이용하여서제거한후에그임신율과착상율그리고그와수반되어나타나는유산율등을비교하여보았다. 본연구에서의환자군은총 258주기로서총 3개의군으로나누어서진행되었다. 배아의동결시기는환자의난자채취시기에따라다르며동결보존제 (PROH/EG) 와기본용액 (SSS/FBS + DPBS) 의조성또한시기적인차이가있지만이들동결보존제와기본용액사이의차이는이번연구에서크게작용하지않았다. Group-1은해동후에손상된할구가존재하지않고보조부화술을시행한군으로총 46주기 (18% (46/258)) 에해당하며손상된할구가존재하는나머지총 212주기 (82% (212/258)) 를 1군

7 과마찬가지로 AH만진행되는 Group-2 (102주기) 와미세조작술에의해서손상된할구를제거하는 Group-3 (110주기) 으로나누었다. 각실험군에서환자의나이, 불임기간그리고동결된배아의개수와같은환자의기본정보는유의적인차이를가지지않았다 (Table 1). 그러나이식된배아의개수에서 1군과 2군간에는유의적인차이가있었으나 (p<0.006) Group-1과 -3 사이와 Group-2과 -3 사이에는차이가없었다. Group-1과 -2 그리고 -3군의임신율을비교해보면각각 30.4% (14/46), 29.4% (30/102), 26.4% (29/ 110) 으로각각의유의한차이는없으나손상된할구를제거한 Group-3군에비해서 Group-1과 -2에서약간높은것으로나타났다. 착상율을비교해보면각각 9.3% (18/193), 7.8% (37/477), 7.6% (37/488) 로 Group-1이나머지군보다약간높은것을볼수있으나통계적으로유의하지는않았다. 또한유산율을비교해보면각각 14.3% (2/14), 23.3% (7/30), 37.9% (11/29) 로 Group-1보다 -2과 -3이높고이중에서 Group-3이가장높은것으로나타났다. 현재임신중이거나출산된경우는각각 85.7% (12/14), 76.7% (23/30), 62.1% (18/29) 로 Group-1에서가장높게나타났다 (Table 2). 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD) 에서유전자진단을위해발생중배아에서하나또는두개의할구제거는배반포의형성및임신율에큰영향을주지않는다고보고된바있다. 19,20 반대로발생중의배아에서할구손상이어떠한요인으로든임신율에영향을미친다고보고된바도있다. 15~17 본연구에서는손상된할구를제거한군에서기대한바와달리임신율이높지않았다. 그원인으로는손상된할구의제거시에발생하는화학적혹은물리적인요인을생각할수있다. 21 실제로본연구에서도동결, 해동중손상을받지않은배아를이식한경우가손상을받은배아를이식하는경우에비해통계적으로유의하지는않지만착상율이약간높은경향을보여준다. 이는손상받은할구와그렇지않은할구사이의 autocrine 또는 paracrine기작에의한영향을 15,17 받기때문으로여겨지며손상받은할구의제거를통해이를극복하고자하였다. 그러나손상된할구를제거한 Group-3 에서그렇지않은 Group-2에비교해착상율의증가는관찰되지않고오히려유산율이통계적유의성은없으나증가하는것으로나타났다. 이것은손상할구의제거를위해사용된미세조작술에의한물리화학적인손상이더욱나쁜영향을미친것으로생각되며, 그원인의분석을위해서는다른미세조작술의적용과이에따른세포고사, 배아발생능력등의비교와같은추가연구가필요하다. 체외수정방법에따른임상결과비교에서도전체적인결과와유사한경향을나타냈다. 이들사이에서도유의적인차이는관찰되지않았으나 ICSI를시행한경우와일반적인체외수정을시행한경우임신율에는큰차이를보이지않았다 (28.3%, 28.2%). 하지만본연구에서무작위로나눈실험군을기준으로분석한결과에서 ICSI를시행한경우에서 Group-3의임신율및착상율이다른두군에비해높아지는결과가나타났다. 또한일반적인체외수정을시행한군에서보다유산율이낮게나타났다. 이것은지금까지나타난결과와다른양상의결과로서그이유에관해서는보다많은추가연구가필요하다고사료되나환자군의불임요인이그원인중하나로여겨진다. 즉 ICSI를시행한환자군의불임요인이주로남성에의한문제이고, 이는 ICSI 를이용하여극복되었고, 여성의자궁내에서불임을유발하는여러요인이나난자의질등의여러여성요인에관한문제가일반적인체외수정방법에비해그비율이높지않기때문으로여겨진다. 다른연구자들의보고와유사하게본연구에서도해동시할구의손상이없는배아군에서의임신율및착상율이통계적인유의차는없으나높은것으로나타났다. 20,21 배아의동결과융해에서손상된할구가생기지않도록하는것이중요하며손상된할구가생겼을경우의대처방안에있어서손상된할구를제거했을경우유의한임신율의상승은관찰되지않았다. 또한할구의제거시보조부화술만을시행한 group에비해유산율이증가되는경향을볼수있었다. 결론적으로본연구에서동결-융해된배아의손상된할구의제거가임상적으로유의한장점을나타내지않았으며, 투명대천공및손상할구제거과정에서배아의상해를최소화하는것뿐만아니라동결-융해과정에서할구손상을최

8 소화할수있는방법의개발이필요한것으로사료된다. 참고문헌 1. Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and Science 1972; 178: Wilmut I, Rowson LEA. Experiments on the low temperature preservation of cow embryos. Vet Rec 1973; 92: Leibo S, Loskutoff NM. Cryobiology of in vitro derived bovine embryos. Theriogenology 1993; 39: Trounson A, Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of and eightcell embryo. Nature 1983; 305: Hong SW, Chung HM, Lim JM, Ko JJ, Yoon TK, Cha KY, et al. Improved human oocyte development after vitrification: a comparison of thawing methods. Fertil Steril 1999; 72(1): Hamberger L, Hazekamp J. Towards singled embryo transfer in IVF. J. Reprod Immunol 2002; 55(1-2): D'Angelo A, Amso NN. Embryo freezing for preventing ovarian hyperstimulation syndrome: a Cocharne review. Hum Reprod 2002; 17(11): Kolibianakis EM, Zikopoulos K, Devroey P. Implantation potential and clinical impact of cryopreservation-a review. Placenta 2003; 24 Suppl B: S Zeilmaker GH, Alberta AT, Van Gent I. Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos. Fertil Steril 1984; 42: Lassalle B, Testart J, Renard JP. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2-propanediol. Feril Steril 1985; 44: Bafrani HH, Salsabil N, Pasbakhsh P, Hassani H, Movahedin M, Al-tarihi T, et al. Comparison of 1,2- propanediol and ethylene glycol for cryopreserva- tion of slow-cooled mouse zygotes and their subsequent development. J Assist Reprod Genet 2003; 20 (6): Kelly SM, Buckett WM, Abdul-Jalil AK, Tan SL. The cryobiology of assisted reproduction. Minerva Ginecol 2003; 55(5): Tharnprisarn W, Suwajanakorn S, Sereepapong W, Pruksananonda K, Boonyakasemsanti W, Virutamasen P, et al. Mouse blastocyst vitrification compared with the conventional slow-freezing method. J Med Assoc Thai 2003; 86(7): Boone WR, Johnson JE, Blackhurst DW, Higdon III HL. Cryopreservation methodologies: freezing location and protocol alter development of mouse embryos. Contemp Top Lab Anim Sci 2004; 43910: Van den Abbeel E, Camus M, Van Waesberghe L, Devoroey P, Van Steirteghem A. Viability of partially damaged human embryos after cryopreservation. Hum Reprod 1997; 12(9): El-Toukhy T, Khalaf Y, Al-Darazi K, Andritsos V, Taylor A, Braude P. Effect of blastomere loss on the outcome of frozen embryo replacement cycles. Feril Steril 2003; 79 (5): Rienzi L, Nagy ZP, Ubaldi F, Lacobelli M, Anniballo R, Tesarik J, et al. Laser-assisted removal of necrotic blastomeres from cryopreserved embryos that were partially damaged. Fertil Steril 2002; 77 (6): Jericho H, Wilton L, A.Gook D, H.Edgar D. A modified cryopreservation method increases the survival of human biopsied cleavage stage embryos. Hum Reprod 2003; 18(3): Ludwig M, Muschalla H, Al-Hasani S, Diedrich K. The effect of multiple cryopreservation procedures and blastomere biopsy on the in-vitro development of mouse embrys. Hum Reprod 1998; 13(11): Joris H, De Vos A, Janssens R, Devroey P, Liebaers I, Van Steirteghem A. Comparison of PGD results of human embryo biopsy and outcome of PGD after

9 zona drilling using acid Tyrode medium or a laser. Hum Reprod 2003; 18(9): Wong BC, Boyd CA, Lanzendorf SE. Randomized controlled study of human zona pellucida dissection using the Zona Infrared Laser optical system: evaluation of blastomere damage, embryo development, and subsequent hatching. Fertil Steril 2003; 80(5):

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