대한치과보존학회지 : Vol. 34, No. 6, 2009 구강상피세포의냉동보관방법에따른세포생존률비교 백도영 이승종 정한성 김의성 * 연세대학교치과대학치과보존학교실 ABSTRACT COMPARISON OF VIABILITY OF ORAL EPITHELIAL CELLS

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1 구강상피세포의냉동보관방법에따른세포생존률비교 백도영 이승종 정한성 김의성 * 연세대학교치과대학치과보존학교실 ABSTRACT COMPARISON OF VIABILITY OF ORAL EPITHELIAL CELLS STORED BY DIFFERENT FREEZING METHODS Do-Young Baek, Seung-Jong Lee, Han-Sung Jung, EuiSeong Kim* Department of Conservative Dentistry, College of Dentistry, Yonsei University This study examined the influence of the storage methods on the viability of oral epithelial cells using conventional cell freezing storage, slow freezing preservation, rapid freezing preservation, and slow freezing preservation with a pressure of 2 Mpa or 3 Mpa. The cell viability was evaluated by cell counting, WST-1 and the clonogenic capacity after 6 days of freezing storage. After 6 days, the frozen cells were thawed rapidly, and the cell counting, WST-1, and clonogenic capacity values were measured and compared. 1. The results from cell counting demonstrated that conventional cryopreservation, slow freezing under a 2 Mpa pressure and slow freezing under a 3 Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). 2. The results from the optical density by WST-1 demonstrated that slow freezing under a 2 Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). 3. The clonogenic capacity demonstrated that slow freezing under a 2 Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). [J Kor Acad Cons Dent 34(5): , 2009] Key words: WST-1, Cell counting, Clonogenic capacity, Slow freezing under pressure, Slow freezing, Rapid freezing -Received , revised , accepted Ⅰ. 서론 최근의치과임상에서골유착임플란트의도입은높은성공률과예지성으로인해치과임상에획기적인변화를가져 *Corresponding Author: Euiseong Kim Department of Conservative Dentistry, College of Dentistry,Yonsei University 134, Shinchon-dong, Sudaemoon-gu, Seoul, Korea Tel: Fax: andyendo@yuhs.ac 왔으나골유착을성공조건으로보고있는한자연치와같은치근막의감각기능, 이식후의치아이동, 고유감각등을가질수없는단점이있다. 더구나성장기의환자에서골유착임플란트는금기증이지만치근막이살아있는자연치아의이식은성장기환자에서도자연치와같은수준으로기능이회복될수있다 1). 자가치아이식의예후에영향을미치는가장주요한인자로는공여치의치근면에존재하는건전하고생활력있는치주인대세포의유지라고할수있다. 이상적인자가치아이식은발치즉시시행하는것이나세포의적절한보관방법을찾아치주인대세포의손상이최소 * 이논문은 2007 년정부 ( 교육인적자원부 ) 의재원으로한국학술진흥재단의지원을받아수행된연구임. (KRF E00508) 491

2 화된다면부득이하게미리발치하는경우에도발치된치아를추후이식가능하게될것이다. 살아있는세포에냉동생물학적인과정을적용하는주목적은생물학적, 의학적, 수술적목적을위해장기간세포기능을보존하는데있다. 이러한목적에부합하기위해서는냉동시의물에의한조직의손상이최소화되어야한다. 냉동보존과정은복잡한현상으로지난십수년간많은연구 2-5) 가있어왔지만아직완전한기전이밝혀지지않았다. 이러한냉동보존법에서는냉동속도 (cooling rate) 에따라세포의생존율이달라진다. 얼음결정형성과용질농도효과 (solution concentration effect) 는세포의불활성화를유발하며적절한냉동속도 (cooling rate) 는각효과를최소화시킨다 2). 최근일본에서는미소자장을이용한프로그램냉동고 (Cell Alive System) 를이용하여세포와냉동보존액전체를동시에냉동하게하는시도가있었다. 이특수한자장냉동고를사용하여 Kawata 6) 는쥐치아를 15 ma 자기장으로 -0.5 /min 속도로 -30 까지 3 일간냉동보관했을때급속냉동을하는것보다좋은결과를얻었다고보고하였다. 하지만 Ahn 7) 등은쥐치아를 -0.3 /min 속도로 -20 까지 21.7 ma, 60Hz, 1G 의자기장을이용하여프로그램냉동을시도하였으나급속, 저속냉동한군사이에유의한차이는없다고보고하였다. 또다른방법으로고압하에서냉동시킴으로써세포의손상을줄이고자하는방법들도연구되었는데 Pribenszky 8,9) 는쥐를이용한생체내실험과소의낭포를이용한실험에서고압 (High hydrostatic pressure) 전처치가냉동보관을용이하게하며생존률을증가시킨다고보고하였다. 또한이러한전처치를통해냉동시킨수퇘지와황소의정자가해빙된후운동력과번식력이증가됨을보고하였다 9,10). WST-1(4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H- 5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) 검색법은세포증식및생존능력, 약제에대한세포독성을평가할때사용된다 11). 이방법은 MTT 와는다른약한붉은색의 tetrazolium salts(wst-1) 을세포내미토콘드리아탈수소효소가분해하여진한붉은색의 formazan 결정으로환원시키는원리를이용하며 450nm 의파장에서흡광도를측정한다. 이흡광도는살아있는세포에의해 WST-1 이환원된양을나타내며생존세포수와비례한다 12). Clonogenic capacity 측정법은단일세포로부터집락이각각얼마나형성되는가를바탕으로하여세포의생존력을측정하는방법이다. 세포집락은최소 50 개이상의세포로구성되어야한다. 오직소량의뿌려진세포만이집락을형성할수있는능력을간직한다. 처치전후적정한농도로희석된세포를뿌려 1~3 주안에집락형성을확인하게된다. 이에본연구의목적은구강상피세포를배양하여일반적 인세포냉동보존법, 저속냉동보존법, 급속냉동보존법, 2 Mpa, 3 Mpa 의압력을이용한저속냉동보존법으로 6 일간냉동보존시각냉동보존법에따른세포의활성도를비교평가하기위함이다. 1. 실험대상및전처치 Ⅱ. 실험재료및방법 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank) 로부터구강내하악치은기원의단층상피세포 (YD-38) 를분양받아세포배양후 P1, P2, P3, P4 으로계대하여각각의 cell stock 을 5 개씩만들었다. 2. 실험방법 실험에사용한보관용액인 media 는 KCLB media 인 RPMI 1640 with L-glutamine (300mg/L), 25mM HEPES and 25mM NaHCO3, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS) 10% 를이용하였다. 냉동시세포질내동해방지제로는 5% dimethylsulfoxide (DMSO,Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO, USA) 를사용하였다. <Cell culturing> 먼저 stock 으로보관되어있던냉동세포를 37 수욕조에급속해동시켰다. 15ml 원통튜브에 4ml 의 Media (90%RPMI+10%FBS) 를 1ml 의세포부유액과섞어원심분리한후냉동보관시쓰였던 DMSO 용액을제거하였다. 다시 Media(90%RPMI+10%FBS) 를섞은후 15 회 pipetting 하여세포가고루분포하도록하였다. 이후 100mm 2 petridish 에 Media (90%RPMI+10%FBS) 와세포부유액혼합액이 10mm 2 의부피가되도록하여 incubator 에보관하였다. Media(90%RPMI+10%FBS) 는 2~3 일에한번씩교체하였다. 세포를해동하여 incubator 에배양한지약 3 일정도후에 monolayer 가약 70% 정도덮이는데이때세포를계대하였다. 이와같이세포를배양하여약 ~ 개의세포가준비되면각각의실험군의조건에따라냉동보존을시작하였다. 실험시에는항상같은계대의세포를이용하였다. 가. 실험군분류대조군으로는한국세포주은행에서배양때쓰였고세포의 stock 을만들때썼던 Freezing container 를이용한일반적인세포보존법을이용하였다. 1 군 : 대조군 (Freezing container 와 Isopropyl alchol<nalgene 'Mr. Frosty'> 을이용한일반세포보관법 ) 492

3 구강상피세포의냉동보관방법에따른세포생존률비교 /ml 의 cell suspension 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아 Freezing container(figure 1. 'Mr.Frosty', NALGENE Labware) 를이용하여 - 70 까지 1 /min 의냉동속도로냉동후 -196 의 nitrogen liquid 에넣어 6 일간보관하였다. 2 군 : 저속냉동군 /ml 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아속도조절냉동기에넣어 4 냉장온도에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다 3 군 : 급속냉동군 /ml 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아 -196 액화질소냉동고에넣어냉동시켜 6 일간보관하였다. 4 군 : 2 Mpa 압력저속냉동군 /ml 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아압력통 (Figure 2. Geumsung Science, Seoul, Korea) 안에냉동튜브를넣고스패너로잠근뒤속도조절냉동기 (Low Temp Freezer Drying Chamber KS5045, Geumsung Science, Seoul, Korea) 에넣고압력통에압력을 2 Mpa 로가하고 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다. 5 군 : 3 Mpa 압력저속냉동군 /ml 의 cell suspension 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아압력통 (Geumsung Science, Seoul, Korea) 안에냉동튜브를넣고스패너로잠근뒤속도조절냉동기 (Low Temp Freezer Drying Chamber KS5045, Geumsung Science, Seoul, Korea) 에넣고압력통에압력을 3 Mpa 로가하고 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다. Figure 1. 1 /min freezing container Mr. Frosty Figure 2. Schematic diagram of program freezer with pressure vessel. a. Oxygen container : 2,3 Mpa of pressure b. Program freezer c. Pressure bottle d. 2ml Cryotube: 1ml 65%RPMI+30%FBS+5%DMSO e. Cell suspension f. Pressure valve g. Thermometer 493

4 나. 냉동군의해빙방법각군의냉동한세포를냉동튜브채로 -196 액화질소냉동고에서꺼내어 37 수욕조에넣어급속해빙하였다. 압력냉동군은압력통을액화질소냉동고에서꺼내어압력을해소하고안에든냉동튜브를꺼내 37 수욕조에넣어해빙하였다. 2ml 냉동튜브속의보관용액이완전히액체상태로되었을때수욕조에서꺼내 15ml 원통형튜브 5 개에 Media(90%RPMI +10% FBS) 를 4ml 씩넣고각군의세포부유액 1ml 를넣어 5ml 를만들었다. 냉동보관시쓰였던 DMSO 제거위해원심분리후상층부흡입하였다. 각 tube 에 Media(90%RPMI+10%FBS) 를 1ml 씩넣고 15~20 회정도 pipetting 하여 1ml 의세포부유액전반에균일한밀도의세포가존재할수있도록하였다. Eppendorf tube 에각군의세포부유액 50μl 과 trypan blue 50μl 를 (1:1) 섞은혼합액을만들어 5 분간기다린뒤 Hemocytometer 의 cover glass 를덮고, 혼합액 10μl 를취하여 Figure 3 과같이 hemocytometer 의홈에위치시킨후현미경 100 배율에서세포를관찰하여계산하였다 Cell counting 2-2.WST-1(4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)- 2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) standard curve 및검색먼저 WST-1 standard curve 를완성하기위해실험군 과는별개의배양된세포를이용하였다. 10 3, , ,8 10 3,1 10 4, , , 개의세포를 96-well plate 에각각 3 개의 well 에넣었다. 24 시간뒤 96-well plate 용액 (20μl, Cell Proliferation Reagent WST-1;Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 10μl 를넣고알루미늄호일로 96-well plate 를싸서 4 시간동안 37 incubator 에배양하였다. 4 시간후 Dynatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA) 에넣고 450nm 파장에서흡광도를측정하여각각의세포수와 WST-1 의값을비교하여 standard curve 를완성하였다. 각실험군의처리가끝난뒤에 96-well plate 에 개의 cell 을각실험군당 3 번씩 well 에넣었다. 24 시간뒤 96-well plate 를꺼내 WST-1 용액 (20μl, Cell Proliferation Reagent WST-1;Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 10μl 를넣고알루미늄호일로 96- well plate 를싸서 4 시간동안 37 incubator 에배양하였다. 4 시간후 Dynatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA) 에넣고 450nm 파장에서흡광도를측정하였다 Clonogenic capacity 각각의군당 2 개의 petridish (100mm 20mm) 에 10ml media (10%FBS +90%RPMI) 를넣고 10 3 개의세포를골고루분포하도록하였다. 10 일뒤상층부의 media Figure 3. Cell counting by hemacytometer slide and trypan blue 494

5 구강상피세포의냉동보관방법에따른세포생존률비교 를제거후 5ml 의 PBS 로 2 회세척하여 4% formalin 5ml 를 dish 에넣고 10 분간고정시켰다. Formalin 을제거후 Giemsa stain 과 PBS 를 1:1 로 mix 한 solution 5ml 를넣고물로 wash 후건조하여푸른색으로염색된 colony 수를측정하였다. 3. 통계처리 대조군과각실험군에서 cell counting 에서얻은값은 One way ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Tukey test 를이용하였다. WST-1 검색및 Clonogenic capacity 검색을통한 colony 수는 Kruskal- Wallis One Way ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Dunn s method 를이용하였다. 2. WST-1 standard curve 및각실험군의 WST-1 측정 WST-1 의 standard curve 는가로축이세포수를나타내며세로축이 WST-1 의 optical density 를나타낸다. Figure 4 의 standard curve 에서보듯이세포가증가함에따라 optical density 가증가하는양상을나타내었다. 6 일동안냉동보관했던각실험군의 WST-1 값을측정하였다. 2 회의실험에서측정된 WST-1 값은총 6 개로이의중앙값 (median) 은 Table 2 와같다. 4 군이 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은값을나타내었다 (p<0.05). 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 또한 1 군과 5 군이 2 군과 3 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. Ⅲ. 결과 1. Cell counting 1 군, 4 군, 5 군은각각 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은값을나타냈으며 (p<0.05) 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타내었으나통계적인유의차는없었다. 냉동보존전세포의수가 이었으므로살아남은세포의비율을계산해보면일반적인냉동보존법은약 24%, 저속냉동은약 9%, 급속냉동은약 5%, 2 Mpa 압력저속냉동은약 37%, 3 Mpa 압력저속냉동은 24% 의세포생존율을나타냈다. Figure 4. Standard curve of WST-1 using monolayer epithelial cell(yd-38) Table 1. The averages and standard deviations of viable cell number (logn) Groups Mean SD Group1(Conventional cryopreservation) a Group2(Slow freezing) b Group3(Rapid freezing) b Group4(Slow freezing under 2 Mpa pressure) a Group5(Slow freezing under 3 Mpa pressure) a a,b: Different letters denote statistically significant (p<0.05) Table 2. The Median and IQR of optical density of WST-1 Groups Median IQR Group1(Conventional cryopreservation) ab Group2(Slow freezing) bc Group3(Rapid freezing) bc Group4(Slow freezing under 2 Mpa pressure) a Group5(Slow freezing under 3 Mpa pressure) ac a,b,c: Different letters denote statistically significant (p<0.05) 495

6 Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5 Figure 5. Clonogenic capacity of experimental groups Table 3. The Median and IQR of the number of colonies (number of cells seeded :1x10 3 ) Groups Median IQR Group1(Conventional cryopreservation) 147 ab Group2(Slow freezing) 0 bc 0 Group3(Rapid freezing) 0 bc 0 Group4(Slow freezing under 2 Mpa pressure) 262 a Group5(Slow freezing under 3 Mpa pressure) 140 ac 116 a,b,c: Different letters denote statistically significant (p<0.05) 3. Clonogenic capacity Figure 5 와같이 colony 가형성된부위는 Giemsa 에염색이되어 counting 이가능하였다. 형성된 colony 수는 4 군이 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은값을나타내었다 (p<0.05). 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 또한 1 군과 5 군이 2 군과 3 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. Ⅳ. 고찰 미성숙치아의자가치아이식은결손치의치료에있어서다른치료에비해좋은결과를나타낸다 13,14). 그러나자가치아이식을위한이상적인상황이항상존재하는것은아니다. 만약발치한치아의치근면에붙어있는세포들이잘유지된다면발치후치아를보관하여필요한때에맞추어쓸수있을것이다. 이전부터세포의장기간유지및보존에관한여러연구들이있었다 7,17-19,25,26). 오래전부터냉동보존 (cryopreservation) 이세포의장기간유지에이용되었다. -5 까지는세포와보존액이얼지않고과냉각된상태로존재하며 -5 ~-15 사이에서는세포외부보존액에얼음이형성되나세포질내로의얼음결정성장을세포막이방해하여세포내부는여전히과냉각된상태로존재한다 15). 세포내의과냉각된물은세포외부보존액에비해높은화학적전위를가지고있어이러한전위차에의해물이세포외부로흘러나와바깥쪽에서얼게된다. 만일세포가너무빠르게냉동된다면평형을유지할수있을만큼세포내의물이빠른속도 로제거되지않는다. 따라서세포는과냉각상태가증가하게되고결국세포내얼음형성을통해평형을얻게된다 15). 반면세포가느리게냉동될경우세포내물이과냉각을없앨정도로충분히제거된다. 그결과세포는탈수되고세포내부는냉동되지않는다. 그러나너무느리게냉동될경우심한부피수축이일어나고장기간높은용질농도에노출되어세포에손상을주게된다. Mazur 16) 등은이러한용질의농도에따른세포손상을 용질효과 (solution effects) 라고명명하였다. 즉느린냉동속도에서는높은용질효과 (high solution effect) 에의해심한세포탈수가나며너무높은냉동속도에서는치명적인세포내얼음형성 (intracellular ice formation) 에의해세포의손상이나타난다 (Figure 6). 따라서용질효과를최소화시키며세포내 Figure 6. Schematic of physical events in cells during freezing. 496

7 구강상피세포의냉동보관방법에따른세포생존률비교 얼음형성이일어나지않을때적절한냉동속도가결정된다. 적절한냉동속도는세포의타입과종류에따라다르다. Rapatz 와 Luyet 17) 은인간의적혈구세포에서냉동속도가 1000 /min 에서생존율이가장높다고하였고 Thorpe 18) 은인간의림프구에서 10 /min 의냉동속도에서생존율이높다고하였다. Leibo 19) 은쥐의난자세포는 1 /min 의냉동속도에서생존율이가장높다고보고한바있다. 포유류조직세포에서는특별한경우를제외하고일반적으로 1 /min 의냉동속도가추천된다. 본실험에서구강상피세포가저속냉동과급속냉동에서좋지않은결과를보이는것은적절한냉동속도 (optimal cooling rate) 보다너무느리거나너무빠른속도로냉동이일어났기때문이라고생각된다. 고압 (High Hydrostatic Pressure) 이세포막의수동수송과능동수송을포함한세포내생화학적반응과세포의단백질윤곽을변화시키는것이증명되었다 20-22). 여러다양한스트레스자극에반응하여 heat shock protein (HSP) 가형성되는데고압에의해서도이러한 HSP 가발생한다. 다양한종류의세포에서압력에의해 HSPs 의합성이증가한다. HSPs 는일종의 molecular chaperone 으로써접힘, 세포내수송, 다른단백질과의합성및분해등을용이하게함으로써스트레스에저항하는역할을한다. 이 HSPs 은세포질내단백질의형태와구조를완전하게유지하는데중요한기능을가지며 23) 세포질내단백질을세포표면으로이동시켜면역반응을유발하는항원전달체기능도가지고있다 24). 의학분야에서도이러한고압을이용하여냉동시의세포손상을방지하려는연구들이있어왔다. Du 등 25) 은돼지의난모세포에치사량에가까운고압 (20MPa) 을적용시켰을때스트레스저항성이증가함을보고하였다. 또한이런방법에의해쥐와소의배아및돼지의정액에있어서도냉동보존시의생존률이증가하였다 8,10). 또한 Lee 등 26) 이쥐치아의치주인대세포를 3 Mpa 압력하에서저속냉동보관하여저속냉동군과냉장군, 급속냉동군과세포활성도를비교한실험에서저속냉동군과냉장군 (4 ) 보관시보다 3 Mpa 의압력하에서저속냉동한군이 MTT, WST-1 값이통계적으로유의성있게높은값을나타내었다. 이경우에서 HSPs 의발현으로인해냉동보존에따른스트레스저항성이높아진것으로생각된다. 본실험에서도 2 Mpa 의압력저속냉동군이저속냉동군과급속냉동군에비해세포활성도에있어좋은결과를나타내었고 3 Mpa 의압력저속냉동군은유의차는없지만저속냉동군및급속냉동군에비해좋은경향을나타내었다. 이는아마도 6 일간적용한 2 Mpa 및 3 Mpa 의압력이이세포에 HSPs 의발현을유도하였기때문으로생각된다. 세포의장기간보존을위해앞으로냉동보존시적절한냉동속도를찾는것과함께 HSPs 의발현과함께고압에 따른손상이최소화되는적절한압력을찾는것이필요할것으로생각된다. Ⅴ. 결론 본연구는구강상피세포를배양한후일반적인냉동보존법, 저속냉동보존법, 급속냉동보존법, 2 Mpa 압력저속냉동보존법, 3 Mpa 압력저속냉동보존법간의세포활성도를 cell counting, WST-1, Clonogenic capacity 의방법으로비교평가하여다음과같은결론을얻었다. 1. Cell counting 에서일반적인냉동보존법, 2 Mpa 압력저속냉동법, 3 Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게높은세포수를나타내었다 (p<0.05). 2 Mpa 압력저속냉동법은 3 Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은세포수를나타냈으나통계적인유의차는없었다. 2. WST-1 검색에서는 2 Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게높은흡광도값을나타내었다 (p<0.05). 2 Mpa 압력저속냉동법은 3 Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은흡광도값을나타냈으며 3 Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은흡광도값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 3. Clonogenic capacity 에서는 2 Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게높은집락수를나타내었다 (p<0.05). 2 Mpa 압력저속냉동법은 3 Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은집락수를나타냈으며 3 Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은집락수를나타냈으나통계적인유의차는없었다. 위의결과를통해구강상피세포에서 2 Mpa 혹은 3 Mpa 의압력을이용한저속냉동법이저속냉동법및급속냉동법보다세포활성도에있어우수한경향을나타냄을알수있다. 자가치아이식을위해서는치주인대세포를통한연구가필요하며적절한압력과냉동속도에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 참고문헌 1. 김재욱, 김의성, 김진, 이승종. 급속냉동된쥐치아의 in vivo MTT 검색법을이용한치주인대세포활성도평가. 대한치과보존학회지 31: , Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 247:125-42,

8 3. Farrant J. Water transport and cell survival in cryobiological procedures. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 278 (959): , Fujikawa S. "Freeze-fracture and etching studies on membrane damage on human erythrocytes caused by formation of intracellular ice." Cryobiology 17(4):351-62, Diller KR, Cravalho EG. A cryomicroscope for the study of freezing and thawing processes in biological cells. Cryobiology 7 (4):191-9, Kawata T. Tooth transplantation by teeth bankapproach to human-hiroshima. Department of Orthodontics, Hiroshima University School of Dentistry, 안현정, 김의성, 김진, 김덕원, 김기열, 이찬영, 이승종. 자기장저속냉동보관법을이용한쥐치아치주인대세포의활성도검사. 대한치과보존학회지 33: , Pribenszky C, Molnar M, Cseh S, Solti L. Improving post-thaw survival of cryopreserved mouse blastocysts by hydrostatic pressure challenge. Anim Reprod Sci 87(2):143-50, Pribenszky C, Molnar M, Ulrich P, et al. Pressure assisted cryopreser vation. Reprod Dom Anim 40: , Kuo YH, Pribenszky Cs, Huang SY. Higher litter size is achieved by the insemination of high hydrostatic pressure-treated frozen-thawed boar semen. Theriogenology 70: , Berridge MV, Tan AS, McCoy KD, Wang R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica 4:15-20, Alotto D, Ariotti S, Graziano S, Verrua R, Stella M, Magliacani G, Castagnoli C. The role of quality control in a skin bank: tissue viability determination. Cell and Tissue banking 3(1):3-10, Czochrowska EM, Stenvik A, et al."outcome of tooth transplantation: survival and success rates years posttreatment." Am J Orthod Dentofacial Orthop 121 (2):110-9;quiz 193, Jonsson T, Sigurdsson TJ. "Autotransplantation of premolars to premolar sites. A long-term follow-up study of 40 consecutive patients." Am J Orthod Dentofacial Orthop 125(6):668-75, Mazur P. "Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos." Cell Biophys 17(1):53-92, Mazur P, Leibo SP, Chu EH. A two-factor hypothesis of freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells. Exp Cell Res 71(2):345-55, Rapatz G, Sullivan JJ, et al. "Preservation of erythrocytes in blood containing various cryoprotective agents, frozen at various rates and brought to a given final temperature." Cryobiology 5(1):18-25, Thorpe PE, Knight SC, et al. "Optimal conditions for the preservation of mouse lymph node cells in liquid nitrogen using cooling rate techniques." Cryobiology 13(2):126-33, Leibo SP, McGrath JJ, et al. "Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate." Cryobiology 15(3):257-71, Abe F, Kato C, Horikoshi K. Pressure regulated metabolism in microorganisms. Trends Microbiol 7 (11): , Aldridge BE, Bruner LJ. Pressure effects on mechanisms of charge transport across bilayer membranes. Biochem Biophys Acta 817 (2): , Huang SY, Pribenszky C, Kuo YH, et al. The effect of hydrostatic pressure treatment on the protein profile of boar spermatozoa before and after freezing. Theriogenology 70:1391, Parsell DA, Lindquist S. The function of heat shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Ann Rev Genet 27:437-96, Pelham HR. Heat shock proteins: coming in from cold. Nature 332:776-7, Du Y, Lin L, Schmidt M, Bogh IB, Kragh PM, Sorensen CB, Li J, Purup S, Pribenszky C, Molnar M, Kuwayama M, Zhang X, Yang H, Bolund L, Vajta G. High hydrostatic pressure treatment of porcine oocytes before handmade cloning improves developmental competence and cryosurvival. Cloning and stem cells 10(3):325-30, 이영은, 김의성, 김진, 한승훈, 이승종. 압력저속냉동방법의쥐치아치주인대세포보존효율평가. 대한치과보존학회지 34: ,

9 국문초록 구강상피세포의냉동보관방법에따른 세포생존률비교 백도영 이승종 정한성 김의성 * 연세대학교치과대학치과보존학교실 본연구의목적은구강상피세포를배양한후각기다른조건의냉동보존법으로 6 일간보존시각각의세포의활성도를 Cell counting, WST-1, Clonogenic capacity 의방법을이용하여비교평가하기위함이다. 각실험군당 개의세포를다음의방법으로 6 일간냉동보존한다. Freezing container 에담아 1 /min 의냉동속도로 -70 까지냉동후 -196 에냉동하여보관한일반냉동보존군, 세포를바로 -196 의액화질소에넣어냉동한급속냉동보존군, 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 속도로서서히냉동시킨뒤 -196 에냉동한저속냉동보존군, 2 Mpa,3 Mpa 의압력을가하고 -0.5 /min 속도로 4 에서 -35 까지서서히냉동시킨뒤 -196 에냉동한 2 Mpa, 3 Mpa 압력저속냉동보존군으로나누었다. 6 일후냉동되었던세포를급속해빙하여각각의 Cell counting, WST-1, Clonogenic capacity 값을측정하여비교하였다. 실험결과 2 Mpa 혹은 3 Mpa 의압력을이용한저속냉동법이저속냉동법및급속냉동법보다세포활성도에있어우수한경향을나타내었다. 주요단어 : WST-1, Cell counting, Clonogenic capacity, 압력저속냉동, 저속냉동, 급속냉동 499

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