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1 구강상피세포의냉동보관방법에따른 세포생존률비교 연세대학교대학원 치의학과 백도영

2 구강상피세포의냉동보관방법에따른 세포생존률비교 지도김의성교수 이논문을석사학위논문으로제출함 2009 년 6 월일 연세대학교대학원 치의학과 백도영

3 백도영의석사학위논문을인준함 심사위원 심사위원 심사위원 인 인 인 연세대학교대학원 2009 년 6 월일

4 감사의글 과연잘할수있을까걱정도많이했었던실험이었지만정말많은분들의도움으로석사학위논문이나오게되었습니다. 우선전혀갈피를잡지못했던저에게논문의준비단계에서부터끝까지세심한지도를하여주신김의성지도교수님께깊은감사를드립니다. 옆에계신것만으로도큰힘이되어주시는이승종교수님, 실수투성이였던저의논문을정성스럽게고쳐주신정한성교수님께도깊은감사를올립니다. 항상수련의들에게깊은사랑과관심을가져주시며저희를이끌어주시는이찬영교수님, 노병덕교수님, 박성호교수님, 정일영교수님, 박정원교수님, 신수정교수님, 공형규교수님께감사드립니다. 매일같이이것저것물어봐도정성스럽게답해주신이영은선생님과조직학교실곽성욱선생님, 불평불만없이기쁜마음으로제실험을도와준윤태선선생님께도고마운마음을전합니다. 끝으로항상저를믿어주시고사랑으로돌봐주시는부모님, 저에게격려와응원을아끼지않는동생진욱, 힘들때마다웃을수있게해주었던사랑하는차수진에게도감사의마음을전합니다.

5 차 례 그림차례 ii 표차례 iii 국문요약 iv I. 서론 1 II. 재료및방법 5 1. 실험대상및전처치 5 2. 실험방법 Cell counting WST-1 standard curve 및각실험군의 WST-1 측정 Clonogenic capacity 12 III. 결과 Cell counting WST-1 standard curve 및각실험군의 WST-1 측정 Clonogenic capacity 16 IV. 고찰 18 V. 결론 28 VI. 참고문헌 30 VII. 부록 41 영문요약 43 i

6 그림차례 Figure 1. Monolayer epithelial cell that origin of oral, lower gingiva 5 Figure 2. 1 /min freezing container Mr. Frosty 7 Figure 3. Schematic diagram of program freezer with pressure vessel 10 Figure 4. Cell counting by hemacytometer slide and trypan blue 11 Figure 5. Standard curve of WST-1 using monolayer epithelial cell(yd-38) 15 Figure 6. Clonogenic capacity of experimental groups 17 Figure 7. Schematic of physical events in cells during freezing 21 ii

7 표차례 Table 1. The averages and standard deviations of viable cell number 14 Table 2. The Median and IQR of optical density of WST-1 16 Table 3. The Median and IQR of the number of colonies 17 iii

8 국문요약 구강상피세포의냉동보관방법에따른 세포생존률비교 본연구의목적은구강상피세포를배양한후일반적인세포냉동보존법, 저속냉동보존법, 급속냉동보존법, 2Mpa, 3Mpa 의압력을이용한저속 냉동보존법으로 6 일간냉동보존시각냉동보존법에따른세포의 활성도를 Cell counting, WST-1, Clonogenic capacity 의방법을이용하여비교평가하기위함이다. 구강내하악치은에서기원한단층의상피세포를배양하여 6x10 6 ~7x10 6 개의세포가확보되면각각의실험군당 1x10 6 개의세포를다음의방법으로 6 일간냉동보존한다. 세포를 freezing container 에담아 1 /min 의냉동속도로 -70 까지냉동후 -196 에냉동하여보관한일반냉동보존군, 세포를바로 -196 의액화질소에넣어냉동한급속냉동보존군, 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 속도로서서히냉동시킨뒤 -196 에냉동한저속냉동보존군, 2MPa 의압력을가하고 -0.5 /min 속도로 4 에서 -35 까지서서히냉동시킨뒤 -196 에냉동한 2MPa 압력 저속냉동보존군, 3MPa 의압력을가하고 -0.5 /min 속도로 4 에서 -35 까지서서히냉동시킨뒤 -196 에냉동한 3MPa 압력저속냉동 보존군으로나누었다. 보존액은세포를분양받을때와같은 Media (10%FBS +90%RPMI) 를사용하였고동해방지제로 5% DMSO 를사용하였다. 6 일후 iv

9 냉동되었던세포를급속해빙하여각각의 Cell counting, WST-1, Clonogenic capacity 값을측정하여비교하였다. 1. Cell counting 에서일반냉동보존법, 2Mpa 압력저속냉동법, 3Mpa 압력 저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게 높은세포수를나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력 저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은세포수를나타냈으나 통계적인유의차는없었다. 2. WST-1 검색에서는 2Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동 법에비해통계적으로유의차있게높은흡광도를나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에 비해높은흡광도를나타냈으며 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동 보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은흡광도를나타냈으나통계 적인유의차는없었다. 3. Clonogenic capacity 에서는 2Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속 냉동법에비해통계적으로유의차있게높은집락수를나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에 비해높은집락수를나타냈으며 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동 v

10 보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은집락수를나타냈으나통계 적인유의차는없었다. 위의결과를통해구강상피세포에서 2Mpa 혹은 3Mpa의압력을이용한저속냉동법이저속냉동법및급속냉동법보다세포활성도에있어우수한경향을나타냄을알수있다. 자가치아이식을위해서는치주인대세포를통한연구가필요하며적절한압력과냉동속도에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 핵심되는말 : WST-1, Cell counting, Clonogenic capacity, 압력저속냉동, 저속냉동, 급속냉동 vi

11 구강상피세포의냉동보관방법에따른 세포생존률비교 < 지도교수 : 김의성 > 연세대학교대학원치의학과 백도영 I. 서론 자가치아이식은이용가능한공여치 (donor tooth) 가있을때소실된치아를수복하는치료의한방법으로, 같은종의동일개체내에서치아를원래의위치에서다른위치로이식하는것을의미한다 (Guralnick, Shulman 1962). 이러한자가치아이식은생리적인치주인대가재생되어자연치와유사한기능을유지할수있고성장기환자에서도자연치와같은수준으로기능이회복될수있으며비용과시간의감소등의장점으로소실된치아를수복하는방법으로이용되고있다. 자가치아이식의예후에영향을미치는가장주요한인자로는공여치의치근면에존재하는건전하고생활력있는치주인대세포의 1

12 유지라고할수있다. 이상적인자가치아이식은발치즉시시행하는것이나세포의적절한보관방법을찾아치주인대세포의손상이최소화된다면부득이하게미리발치하는경우에도발치된치아를추후이식가능하게될것이다. 살아있는세포에냉동생물학적인과정을적용하는주목적은생물학적, 의학적, 수술적목적을위해장기간세포기능을보존하는데있다. 이러한목적에부합하기위해서는냉동시의물에의한조직의손상이최소화되어야한다. 냉동보존과정은복잡한현상으로지난십수년간많은연구가있어왔지만아직완전한기전이밝혀지지않았다. 이러한냉동보존법에서는냉동속도 (cooling rate) 에따라세포의생존율이달라진다. Mazur 등은얼음결정형성과용질농도효과 (solution concentration effect) 는세포의불활성화를유발한다고하였고적절한냉동속도 (cooling rate) 는각효과를최소화시킬것이라고하였다. 최근일본에서는미소자장을이용한프로그램냉동고 (Cell Alive System) 를이용하여세포와냉동보존액전체를동시에냉동하게하는시도가있었다 (Kawata, 2005, Kaku, 2007). 이특수한자장냉동고를사용하여 Kawata 는 쥐치아를 15mA 자기장으로 -0.5 /min 속도로 -30 까지 3 일간냉동 보관했을때급속냉동을하는것보다좋은결과를얻었다고보고하였다. 하지만 Ahn(2008) 등은쥐치아를 -0.3 /min 속도로 -20 까지 21.7mA, 2

13 60Hz, 1G 의자기장을이용하여프로그램냉동을시도하였으나급속, 저속냉동한군사이에유의한차이는없다고보고하였다. 또다른접근법으로고압하에서냉동시킴으로써세포의손상을줄이고자하는방법이연구되었다. 특히식품공학분야에서고압하에서냉동시킴으로써세포의손상을줄이는방법들이연구되어왔다. Koch 등은 (1996) 감자 입방체의, Fuchigami 는당근의조직학적연구에서식품고압냉동방법 (Pressure Shift Freezing, Pressure Assist Freezing) 을통해보관시일반적인얼림방법에비해세포의손상이적음을보고한바있다. 의학분야에서도고압하에냉동보관을통해세포손상을줄이려는시도들이있었다. Pribenszky (2005) 는쥐를이용한생체내실험 (2005a) 과소의낭포를이용한실험 (2005b) 에서고압 (High hydrostatic pressure) 전처치가냉동보관을용이하게하며생존률을증가시킨다고보고하였다. 또한이러한전처치를통해냉동시킨수퇘지와황소의정자가해빙된후운동력과번식력이증가하였다 (Kuo,2007; Pribenszky 2005). WST-1(4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3- benzene disulfonate) 검색법은세포증식및생존능력, 약제에대한세포독성을평가할때사용된다 (Berridge, 1996). 이방법은 MTT 와는다른약한붉은색의 tetrazolium salts(wst-1) 을세포내미토콘드리아탈수소효소가분해하여진한붉은색의 formazan 결정으로환원시키는원리를이용하며 450nm 의파장에서흡광도를측정한다. 이흡광도는살아있는세포에의해 3

14 WST-1 이환원된양을나타내며생존세포수와비례한다. WST-1 검색법은 동위원소를사용하지않으며시약을녹이기위한유기용매를사용하지않아 안전하며동일계통의기질인 MTT 가비수용성의 formazan 결정으로 환원시키는데반해 WST-1 은수용성 formazan 결정으로환원시켜추가적인단계없이측정할수있으므로고감도의결과를보장하여 MTT 보다민감도가뛰어나다 (Alotto, Ariotti, 2002). Clonogenic capacity 측정법은단일세포로부터집락이각각얼마나형성되는가를바탕으로하여세포의생존력을측정하는방법이다. 세포 집락은최소 50 개이상의세포로구성되어야한다. 오직소량의뿌려진 세포만이집락을형성할수있는능력을간직한다. 처치전후적정한농도로희석된세포를뿌려 1~3 주안에집락형성을확인한다. 이에본연구의목적은구강상피세포를배양하여일반적인세포냉동보존법, 저속냉동보존법, 급속냉동보존법, 2Mpa, 3Mpa 의압력을이용한저속냉동보존법으로 6 일간냉동보존시각냉동보존법에따른세포의활성도를비교평가하기위함이다. 이를위해 cell counting, WST-1, clonogenic capacity 의방법을이용하여각각의실험군에따른세포의 활성도를비교평가한다. 4

15 II. 실험 재료 및 방법 1. 실험 대상 및 전 처치 Figure 1. Monolayer epithelial cell that origin of oral, lower gingiva 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)로부터 구강 내 하악 치은 기원의 단층 상피 세포(YD-38) (fig.1)를 분양 받아 세포 배양 후 P1, P2, P3, P4 으로 계대하여 각각의 cell stock 을 5 개씩 만들었다. 2. 실험 방법 실험에 사용한 보관 용액인 media 는 KCLB media 인 RPMI 1640 with L-glutamine (300mg/L), 25mM HEPES and 25mM NaHCO3, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10% 이용하였다. 냉동 시 세포질 내 5

16 동해방지제로는 5% dimethylsulfoxide(dmso, Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO, USA) 를사용하였다. <Cell culturing> 먼저 stock 으로보관되어있던냉동세포를 37 수욕조에급속해동시켰다. 15ml 원통튜브에 4ml 의 Media(90%RPMI+10%FBS) 를 1ml 의세포부유액과섞어원심분리한후냉동보관시쓰였던 DMSO 용액을제거하였다. 다시 Media(90%RPMI+10%FBS) 를섞은후 15 회 pipetting 하여세포가고루분포하도록하였다. 이후 100mm 2 petridish 에 Media (90%RPMI+10%FBS) 와세포부유액혼합액이 10mm 2 의부피가되도록하여 incubator 에보관하였다. Media(90%RPMI+10%FBS) 는 2~3 일에한번씩교체하였다. 세포를해동하여 incubator 에배양한지약 3 일정도후에 monolayer 가약 70% 정도덮이는데이때세포를계대하였다. 세포계대방법은먼저 incubator 에보관되었던 petri dish 를 PBS 5ml 로 2 회세척후 trypsin 2ml 를약 2~3 분처리후 petridish 에부착된세포를떨어뜨려다시 3ml 의 Media (90%RPMI +10%FBS) 와혼합하여원심분리하였다. 원심분리후상층부를흡입하여세포만남겨둔상태에서 3ml 의 Media(90%RPMI +10% FBS) 를혼합하여 pipetting 하였다. Media (90%RPMI+10%FBS) 가 8.5ml 씩담겨진 2 개의 100mm 2 petridish 에세포부유액을 1.5ml 씩나누어담아계대를마쳤다. 이와같이세포를배양하여약 6x10 6 ~7x10 6 개의세포가준비되면각각의 6

17 실험군의조건에따라냉동보존을시작하였다. 실험시에는항상같은계대 의세포를이용하였다. 가. 실험군분류 대조군으로는한국세포주은행에서배양때쓰였고세포의 stock 을만들 때썼던 Freezing container 를이용한일반적인세포보존법을이용하였다. 1 군 : 대조군 (Freezing container 와 Isopropyl alchol(nalgene " Mr. Frosty ) 을이용한일반세포보관법 ) 1x10 6 /ml 의 cell suspension 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아 Freezing container(fig2. Mr.Frosty,NALGENE R Labware) 를이용하여 -70 까지 1 /min 의냉동속도로냉동후 -196 의 nitrogen liquid 에넣어 6 일간보관하였다. Figure.2 1 /min freezing container Mr. Frosty 7

18 2 군 : 저속냉동군 1x10 6 /ml 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아속도조절 냉동기에넣어 4 냉장온도에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히 냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다 3 군 : 급속냉동군 1x10 6 /ml 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아 -196 액화질소 냉동고에넣어냉동시켜 6 일간보관하였다. 4 군 : 2MPa 압력저속냉동군 1x10 6 /m 의세포부유액 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아압력통 (fig3. Geumsung Science, Seoul, Korea) 안에냉동튜브를넣고스패너로잠근뒤속도조절냉동기 (Low Temp Freezer Drying Chamber KS5045, Geumsung Science, Seoul, Korea) 에넣고압력통에압력을 2MPa 로 가하고 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다. 5 군 : 3MPa 압력저속냉동군 1x10 6 /ml 의 cell suspension 1ml 를 2ml 용량의 vial 에담아 압력통 (Geumsung Science, Seoul, Korea) 안에냉동튜브를넣고스패너로 8

19 잠근뒤속도조절냉동기 (Low Temp Freezer Drying Chamber KS5045, Geumsung Science, Seoul, Korea) 에넣고압력통에압력을 3MPa 로가하고 4 에서 -35 까지 -0.5 /min 로서서히냉동시킨뒤 -196 액화질소냉동고에넣어 6 일간보관하였다. 나. 냉동군의해빙방법각군의냉동한세포를냉동튜브채로 -196 액화질소냉동고에서꺼내어 37 수욕조에넣어급속해빙하였다. 압력냉동군은압력통을액화질소냉동고에서꺼내어압력을해소하고안에든냉동튜브를꺼내 37 수욕조에넣어해빙하였다. 2 ml냉동튜브속의보관용액이완전히액체 상태로되었을때수욕조에서꺼내 15ml 원통형튜브 5 개에 Media(10% FBS+90% RPMI) 4ml 씩넣고각군의세포부유액 1ml 를넣어 5ml 를만들었다. 냉동보관시쓰였던 DMSO 제거위해원심분리후상층부흡입하였다. 각 tube 에 Media(10% FBS+90% RPMI) 1ml 를넣고 15~20 회정도 pipetting 하여 1ml 의세포부유액전반에균일한밀도의세포가존재할수있도록하였다. 9

20 Figure 3. Schematic diagram of program freezer with pressure vessel. a. Oxygen container : 2,3MPa of pressure b. Program freezer c. Pressure bottle d. 2 ml Cryotube: 1 ml 65%RPMI+30%FBS+5%DMSO e. Cell suspension f. Pressure valve g. Thermometer 10

21 2-1. Cell counting Eppendorf tube 에각군의세포부유액 50 μl과 trypan blue 50 μl를 (1:1) 섞은혼합액을만들어 5 분간기다린뒤 hemocytometer 의 cover glass 를덮고, 혼합액 10 μl를취하여 fig4. 과같이 hemocytometer 의홈에위치시킨후현미경 100x 배율에서세포를관찰하여계산하였다. Figure 4. Cell counting by hemacytometer slide and trypan blue 2-2. WST-1 standard curve 및각실험군의 WST-1 측정먼저 WST-1 standard curve 를완성하기위해실험군과는별개의배양된세포를이용하였다. 10 3, 2X10 3,4X10 3,8X10 3,1X10 4, 2X10 4, 3X10 4, 4X10 4 개의세포를 96-well plate 에각각 3 개의 well 에넣는다. 24 시간뒤 96-well plate 11

22 용액 (20 μl, Cell Proliferation Reagent WST-1;Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 10 μl를넣고알루미늄호일로 96-well plate 를싸서 4 시간동안 37 incubator 에배양하였다. 4 시간후 Dynatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA) 에넣고 450nm 파장에서흡광도를측정하여각각의세포수와 WST-1 의값을 비교하여 standard curve 를완성하였다. 각실험군의처리가끝난뒤에 96-well plate 에 5x10 4 개의 cell 을각실험군당 3 번씩 well 에넣었다. 24 시간뒤 96-well plate 를꺼내 WST-1 용액 (20 μl, Cell Proliferation Reagent WST-1;Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 10 μl를넣고알루미늄호일로 96-well plate 를싸서 4 시간동안 37 incubator 에배양하였다. 4 시간후 Dynatech MRX ELISA microplate reader (Dynatech laboratories, Chantilly, VA, USA) 에넣고 450nm 파장에서흡광도를측정하였다 Clonogenic capacity 각각의군당 2 개의 petridish (100mmx20mm) 에 10ml media (10%FBS +90%RPMI) 를넣고 10 3 개의세포를골고루분포하도록하였다. 10 일뒤상층부의 media 를제거후 5ml 의 PBS 로 2 회세척하여 4% formalin 5ml 를 dish 에넣고 10 분간고정시켰다. Formalin 을제거후 Giemsa stain 과 12

23 PBS 를 1:1 로 mix 한 solution 5ml 를넣고물로 wash 후건조하여푸른색으로 염색된 colony 수를측정하였다. 3. 통계처리 대조군과각실험군에서 cell counting 에서얻은값은 One way ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Tukey test 를이용하였다. WST-1 검색및 Clonogenic capacity 검색을통한 colony 수는 Kruskal-Wallis One Way ANOVA 를사용하여분석하였으며사후검정으로는 Dunn s method 를이용하였다. 13

24 II. 결과 1. Cell counting 1 군, 4 군, 5 군은각각 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은 값을나타냈으며 (p<0.05) 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타내었으나 통계적인유의차는없었다. 냉동보존전세포의수가 1.0x10 6 이었으므로 살아남은세포의비율을계산해보면일반적인냉동보존법은약 24%, 저속 냉동은약 9%, 급속냉동은약 5%, 2Mpa 압력저속냉동은약 37%, 3Mpa 압력저속냉동은 24% 의세포생존율을나타냈다. Table 1.The averages and standard deviations of viable cell number (log N) Groups Mean SD Group1(Conventional cryopreservation) a Group2(Slow freezing) b Group3(Rapid freezing) b Group4(Slow freezing under 2MPa pressure) a Group5(Slow freezing under 3MPa pressure) a a,b : Different letters denote statistically significant (p<0.05) 14

25 2. WST-1 standard curve 및각실험군의 WST-1 측정 WST-1 의 standard curve 는가로축이세포수를나타내며세로축이 WST-1 의 optical density 를나타낸다. Fig.5 의 standard curve 에서보듯이 세포가증가함에따라 optical density 가증가하는양상을나타낸다. Figure 5. Standard curve of WST-1 using monolayer epithelial cell (YD-38) 6 일동안냉동보관했던각실험군의 WST-1 값을측정하였다. 2 회의실험에서측정된 WST-1 값은총 6 개로이의중앙값 (median) 은표 2 와같다. 4 군이 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은값을나타내었다 (p<0.05). 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 또한 1 군과 5 군이 2 군과 3 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 15

26 Table 2. The Median and IQR of optical density of WST-1 Groups Median IQR Group1(Conventional cryopreservation) ab Group2(Slow freezing) bc Group3(Rapid freezing) bc Group4(Slow freezing under 2MPa pressure) a Group5(Slow freezing under 3MPa pressure) ac a,b,c : Different letters denote statistically significant (p<0.05) 3. Clonogenic capacity Fig 6 와같이 colony 가형성된부위는 Giemsa 에염색이되어 counting 이가능하였다. 형성된 colony 수는 4 군이 2 군과 3 군에비해통계적으로유의차있게높은값을나타내었다 (p<0.05). 4 군은 1 군과 5 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 또한 1 군과 5 군이 2 군과 3 군에비해높은값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 16

27 group 1 group 2 group 3 group 4 group 5 Figure 6. Clonogenic capacity of experimental groups Table 3. The Median and IQR of the number of colonies (number of cells seeded : 1x10 3 ) Groups Median IQR Group1(Conventional cryopreservation) 147 ab Group2(Slow freezing) 0 bc 0 Group3(Rapid freezing) 0 bc 0 Group4(Slow freezing under 2MPa pressure) 262 a Group5(Slow freezing under 3MPa pressure) 140 ac 116 a,b,c : Different letters denote statistically significant (p<0.05) 17

28 IV. 고찰 미성숙치아의자가치아이식은결손치의치료에있어서다른치료에비해좋은결과를나타낸다 (Czochrowska et al. 2002; Jonsson and Sigurdsson 2004). 그러나자가치아이식을위한이상적인상황이항상존재하는것은아니다. 예를들어치근형성이자가치아이식에적당하게이루어졌으나수여부가너무작아공간을얻기위해교정적인치료가필요할때가있다. (Andreasen,1992). 다른예로교정적인목적으로소구치를발치하는경우외상으로인한불확실한예후를지닌전치부에유용하게쓸수있지만외상의시기와교정의시기가일치하지않는경우가대부분이라발치한치아는쓰지못하는경우가많다. 이런경우발치한치아의치근면에붙어있는세포들이잘유지된다면발치후치아를보관하여필요한때에맞추어쓸수있을것이다. 이전부터세포의장기간유지및보존에관한여러연구들이있었다. 오래전부터냉동보존 (cryopreservation) 이세포의장기간유지에이용되었는데이러한냉동보존시세포의냉동으로인한손상 (cryoinjury) 의기전을명확히하는것이중요하다. 여러관점, 특히냉동속도 (cooling velocity) 와동해방지제 (cryoprotectants) 에서이러한문제를접근하는많은연구들이있다 (Mazur, 1976). 18

29 -5 까지는세포와보존액이얼지않고과냉각된상태로존재하며 -5 ~-15 사이에서는세포외부보존액에얼음이형성되나세포질내로의얼음결정성장을세포막이방해하여세포내부는여전히과냉각된상태로존재한다. 세포내의과냉각된물은세포외부보존액에비해높은화학적전위를가지고있어이러한전위차에의해물이세포외부로흘러나와바깥쪽에서얼게된다. 만일세포가너무빠르게냉동된다면평형을유지할수있을만큼세포내의물이빠른속도로제거되지않는다. 따라서세포는과냉각상태가증가하게되고결국세포내얼음형성을통해평형을얻게된다 (Mazur 1990). Muldrew 와 McGann (1994) 은실험모델에서삼투압파괴이론으로이를설명하였다. 즉냉동 / 해빙 (freezing/thawing) 동안세포막을통한물의흐름이세포내얼음형성 (intracellular ice formation) 을유발하여세포에손상을줄수있다고하였다. Diller and Cravalho(1970) 은세포내얼음형성온도와세포내얼음형성의동태를 novel 현미경을통해관찰하였다. 대부분의경우에서세포내얼음형성을거쳤던세포들은사멸했다. (Farrant 1977; Fujikawa 1980; Muldrew and McGann 1994) 반면세포가느리게냉동될경우세포내물이과냉각을없앨정도로충분히제거된다. 그결과세포는탈수되고세포내부는냉동되지않는다. 그러나너무느리게냉동될경우심한부피수축이일어나고장기간높은용질농도에노출되어세포에손상을주게된다. Lovelock(1957) 등은높아진용질의농도와세포수축이세포막의지질-단백질복합체 (lipid 19

30 -protein complexes) 에해로운효과를가져와그러한구조를약화시키며지질과인지질의손실을가져온다고하였다. Mazur (1972) 는이러한용질의농도에따른세포손상을 용질효과 (solution effects) 라고명명하였다. Steponkus and Wiest (1979) 는 최대세포면적이론 (Maximum cell surface area hypothesis) 를제안했다. 세포수축이비가역적인막의융합을일으켜세포막의영역이감소하여등장성상태로되돌아갔을때원래정상부피를회복하기전세포가분해된다고하였다. 즉느린냉동속도에서는높은용질효과 (high solution effect) 에의해심한세포탈수가나며너무높은냉동속도에서는치명적인세포내얼음형성 (intracellular ice formation) 에의해세포의손상이나타난다 (fig.7). 따라서용질효과를최소화시키며세포내얼음형성이일어나지않을때적절한냉동속도가결정된다. 적절한냉동속도는세포의타입과종류에따라다르다. Rapatz and Luyet (1968) 은인간의적혈구세포에서냉동속도가 1000 /min 에서생존율이가장높다고하였고 Thorpe (1976) 은인간의 림프구에서 10 /min 의냉동속도에서생존율이높다고하였다. Leibo(1978) 은쥐의난자세포는 1 /min 의냉동속도에서생존율이가장높다고보고한바있다. 포유류조직세포에서는특별한경우를제외하고일반적으로 1 /min 의냉동속도가추천된다. 본실험에서구강상피세포가저속냉동과급속냉동에서좋지않은결과를보이는것은적절한냉동속도 (optimal cooling rate) 보다너무느리거나너무빠른속도로냉동이일어났기때문이라고생각된다. 20

31 Figure 7. Schematic of physical events in cells during freezing. 냉동보존시충분한냉각을통해모든액체상태의물이결국얼음이나결정으로변환되어야한다. -45 이하가되어야만얼지않은작은파편들이자극없이얼음으로변환될수있다 (P. Mazur1984). 매우낮은온도에서세포가견디는능력은일반적인생각보다높다. 오히려세포가얼리고녹일때두번지나야만하는온도의중간지점 (intermediate zone of temperature) (-15 ~-60 ) 에서가보다치명적이다 이하에서는액체상태의물의존재없이물리적인결정상태로만존재하여확산이일어나지않는다. 또한 -196 에서는열적에너지가없어어떠한화학반응도일어나지않아안정된상태가유지된다. (P. Mazur1984) 21

32 이에본실험에서는 "Mr. Frosty" 라는제품을이용하여 1 /min 의냉동속도를적용후 -75 까지얼린후 -196 의 nitrogen liquid 에보관하여 YD - 38 을분양받을때와동일한조건으로 stock 을형성하였다. 쥐치아를이용하여치주인대세포의활성도를연구한실험들에서프로그램냉동속도조절기를이용한저속냉동은냉동으로인한손상을줄일수있다는연구가있다 (Kawasaki, 2004). Andreasen(1992) 은 -35 까지 -0.5 /min 속도로저속냉동, -100 까지 -6 /min 속도로냉동한뒤 -196 까지급속냉동할것을권하였고, Kawata(2005) 와 Kaku(2007) 는쥐치아를자기장으로 -0.5 /min 속도로 -30 까지 3 일간냉동보관했을때좋은결과를얻었다고하였으므로본실험에서도프로그램냉동속도조절기를사용하여 -35 까지는 -0.5 /min 속도로저속냉동하였다. -35 이하온도에서는세포내부에얼음결정이생기지않고 (Ashwood-smith, 1980) 세포외부의냉동환경에반응해서세포가수축하기때문에 -196 까지빠르게냉동할수있다고 (Ashwood-smith, 1980, Farrant, 1977) 보고되고있으므로 -35 이하부터 -196 까지는액체질소통을사용하여급속냉동을시행하였다. 본실험에서저속냉동군의 cell counting, WST-1, clonogenic capacity 가일반냉동보존군에비해낮은경향을보이는것은냉동속도가쥐치아의치주인대세포와달리 YD-38 세포에적합하지않게느리게작용하여심한부피수축이일어나고장기간높은용질농도에노출되어세포에많은손상을주었을것이라생각된다. 22

33 냉동시세포의생존율은영하에노출된총시간과는무관하고세포를얼리는방법에있어손상정도가차이가난다. 세포를 -196 까지얼릴때빠른얼림과천천히녹이는방법과천천히얼림과빨리녹이는방법은 0 에서 -75 까지비슷한시간이걸리나전자가세포에손상이더많이가게된다. 이는냉동속도가빠르면세포내크기가매우작은얼음결정체가형성되고 (Nei, 1978, Shimada, 1977) 세포내작은결정이응집하여큰결정을형성하는재결정화현상이일어나세포가손상을받게되기때문이다 (Mazur, 1984, 1972). 반면 Gao(2000) 는급속해동을하면재결정화현상을막을수있으므로많은세포를살릴수있다고보고하여본실험에서는급속해동을시행하였다. 몇십년전부터식품공학분야에서고압이식품의수명을줄이는효소뿐아니라미생물을비활성시키는데중요한역할이있다는것이소개되어왔다 (Knorr 1993). 식품을냉동할때기존의냉동과정에서는세포표면에서동결이시작되어내부로갈수록빙결정이대형화하는경향이있고표면얼음이성장함에따라내부의얼지않은물분자가이동해세포의탈수가일어나얼음결정의크기는크고다양한직경을갖게된다. 반면 210Mpa 고압하에서는물의상변이온도가 0 에서 -21 로낮아지므로 (Schluter, 2004) 고압을준상태에서 0 이하의온도로떨어뜨리면과냉각상태로존재하다가빠른속도로압력이해소되면서결정이작고균일하게동시에형성된다 (Zhu 2004, 2005, Schluter 2004). 23

34 고압 (High Hydrostatic Pressure) 이세포막의수동수송과능동수송을포함한세포내생화학적반응과세포의단백질윤곽을변화시키는것이증명되었다 (Abe et al 1999, Aldridge and Bruner 1985, Huang 2007). 여러다양한스트레스자극에반응하여 heat shock protein (HSP) 가형성되는데고압에의해서도이러한 HSP 가발생한다. 다양한종류의세포에서압력에의해 HSPs 의합성이증가한다. 압력에의해 Escherichia coli (Welch et al.,1993), 효모 (Domitrovic et al.2006,miura,2006), 포유류세포 (Kaarn -iranta,1998) 등에서 heat shock protein s(hsps) 의합성이증가한다는보고가있다. Kaarniranta(1998) 는고압이후전사활성화를유도해 HSPs 70 의생산을유도한다고하였고, Elo(2003) 는고압이 HSPs 90β의생산을유도한다고하였다. HSPs 는일종의 molecular chaperone 으로써접힘, 세포내수송, 다른단백질과의합성및분해등을용이하게함으로써스트레스에 저항하는역할을한다. 이 HSPs 은세포질내단백질의형태와구조를 완전하게유지하는데중요한기능을 (Parsell, 1993) 가지며세포질내단백질을세포표면으로이동시켜면역반응을유발하는항원전달체기능도가지고있다 (Pelham, 1988). Kaarniranta(1998) 는 HSP 70 mrna 안정되는과정에서후전사조절이다른부가적인 heat shock gene 조절을제공하며이것이아마도 stress 에저항하는데중요한역할을한다고하였다. 사람의혈액종양세포를이용한연구에서 HSPs 70 은세포의분화를촉진시키며세포사멸을억제할뿐만아니라 24

35 유발하는약제에대해서도세포가내성을갖도록한다는보고도있다 (Kwak, 1988). 또한 HSPs 는스트레스상황뿐만아니라정상적인포유류배아의발달에도중요한역할을한다. Esfaniari (2007) 은항원에의해 HSP 기능이방해받았을때 blastocyst 의발달이눈에띄게저해되고세포의사멸이증가한다고하였다. 이번실험에서 2Mpa 와 3Mpa 의압력저속냉동보존법이저속냉동보존법과급속냉동보존법에비해세포의활성도평가에서더좋은결과를나타냈다. 특히저속냉동보존법과같은냉동속도를사용하였음에도세포의활성도가높은수치를나타내었다. 이는고압이적절한냉동속도에비해느린냉동속도에서발생하는세포내수축및이에따른용질효과를감소시킨것으로생각된다. 고압을통해발생된 HSPs 이세포내수송을용이하게하고다른단백질과의합성을통해스트레스에저항하여세포의생존율이증가한것으로생각된다. 의학분야에서도이러한고압을이용하여냉동시의세포손상을방지하려는 연구들이있어왔다. Du 등은돼지의난모세포에치사량에가까운 고압 (20MPa) 을적용시켰을때스트레스저항성이증가함을보고하였다. 또한이런방법에의해쥐와소의배아및돼지의정액에있어서도냉동보존시의생존률이증가하였다 (Pribenszky et al,2005, Kuo 2007). 치사에가까운스트레스에의해유발되는 molecular chaperones(hsps) 은냉동보존치료시에도항상성을유지하게하여세포를보호하는역할을담당한다. (Y Du, 2008, Reproduction) 25

36 반면어느정도의압력을가해야세포의생존도가높게유지되는지에대해서는아직불분명하다. 발현되는 protein 의타입과양, 비율은스트레스를받는세포의종류뿐아니라 sublethal shock 의강도와타입에따라다르게결정된다. 다른종류의스트레스에대해서도비슷한반응을보일수있으며 교차보호 의가능성도있다. 또한생존률을높이는데필요한압력의정도와기간은보관대상의종과생식체, 분화정도에따라다르다. 예를들어쥐와소의배아는 60-80MPa 에서 60 분간의압력에도저항성이있지만돼지의난모세포는 30 분간 60MPa 의압력을받을경우회복할수없는손상을입게된다 년 takahashi 등은쥐의간을고압하에영하의온도에서보관한실험에서 30MPa, 20MPa, 10MPa, 5MPa 에 5 시간보관한경우 30 MPa,20MPa 에서는 24 시간뒤모든간이죽었지만 5MPa 의경우 2 주후까지도살아있음을보고하였다 (takahashi, 2000). 이전 Lee 의실험에서쥐치아의치주인대세포를압력저속냉동보관시 3Mpa 의압력하에시행하였었다. 이실험에서는저속냉동군과냉장군 (4 ) 보관시보다 3Mpa 의압력하에서저속냉동한군이 MTT, WST-1 값이통계적으로유의성있게높았고급속냉동군과는유의차가없었지만조금높은값을나타내었다. 이경우에도 HSPs 가발현으로인한냉동보존에따른스트레스저항성이높아진것으로생각된다. 본실험에서도저속냉동군과급속냉동군에비해 2Mpa 및 3Mpa 의압력저속냉동군이세포활성도에있어좋은경향을나타내었다. 이는아마도 6 일간적용한 2Mpa 및 3Mpa 의압력이이세포에 HSPs 의발현을유도하였기때문으로생각된다. 26

37 세포의장기간보존을위해앞으로냉동보존시적절한냉동속도를찾는 것과함께 HSPs 의발현과함께고압에따른손상이최소화되는적절한 압력을찾는것이필요할것으로생각된다. 27

38 V. 결론 본연구는구강상피세포를배양한후일반적인냉동보존법, 저속냉동보존법, 급속냉동보존법, 2Mpa 압력저속냉동보존법, 3Mpa 압력저속냉동보존법간의세포활성도를 cell counting, WST-1, Clonogenic capacity의방법으로비교평가하여다음과같은결론을얻었다. 1. Cell counting 에서일반적인냉동보존법, 2Mpa 압력저속냉동법, 3Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게높은세포수를나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은세포수를나타냈으나통계적인유의차는없었다. 2. WST-1 검색에서는 2Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속냉동법에비해통계적으로유의차있게높은흡광도값을나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에비해높은흡광도값을나타냈으며 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은흡광도값을나타냈으나통계적인유의차는없었다. 28

39 3. Clonogenic capacity 에서는 2Mpa 압력저속냉동법이저속냉동법과급속 냉동법에비해통계적으로유의차있게높은집락수를나타내었다 (p<0.05). 2Mpa 압력저속냉동법은 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동보존법에 비해높은집락수를나타냈으며 3Mpa 압력저속냉동법, 일반적인냉동 보존법이저속냉동법과급속냉동법에비해높은집락수를나타냈으나 통계적인유의차는없었다. 위의결과를통해구강상피세포에서 2Mpa 혹은 3Mpa의압력을이용한저속냉동법이저속냉동법및급속냉동법보다세포활성도에있어우수한경향을나타냄을알수있다. 자가치아이식을위해서는치주인대세포를통한연구가필요하며적절한압력과냉동속도에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 29

40 VI. 참고문헌 이영은, 이승종. 압력저속냉동이쥐치아치주인대세포에미치는영향. 연세대학교 ; Abe F, Kato C, Horikoshi K. Pressure regulated metabolism in microorganisms. Trends Microbiol 1999;7 Suppl 11: Ahn HJ, Kim ES, Kim J, Kim DW, Kim KY, Lee CY, Lee SJ. Evaluation of viability of periodontal ligament cell in rat teeth using slow cryopreserv -ation method with magnetic field. J of Korean Academy of Conservative Dentistry 2008;33 Suppl 4: Aldridge BE, Bruner LJ. Pressure effects on mechanisms of charge transport across bilayer membranes. Biochem Biophys Acta 1985;817 Suppl 2: Alotto D, Ariotti S, Graziano S, Verrua R, Stella M, Magliacani G, Castagnoli C. The role of quality control in a skin bank: tissue viability determination. Cell and Tissue banking 2002;3 Suppl 1:

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50 Zhu SM, Le Bail A. Ramaswamy HS, Chapleau N. Characterization of ice crystals in pork muscle formed by pressure shift freezing as compared with classical freezing methods. Journal of Food Science 2004;69 Suppl 4: Zhu SM, Ramaswamy HS, Le Bail A. Ice crystal formation in gelatin gel during pressure shift versus conventional freezing. Journal of Food Engineering 2005;66 Suppl 1:

51 부록 <Raw data> 1. Cell counting Conven -tional cryopre -servation Slow freezing Rapid freezing Slow freezing under 2MPa pressure Slow freezing under 3MPa pressure Mean SD Optical density of WST-1 Conven -tional cryopre -servation Slow freezing Rapid freezing Slow freezing under 2MPa pressure Slow freezing under 3MPa pressure Median IQR

52 3. Number of colonies (number of cells seeded :1x10 3 ) Conven -tional cryopre -servation Slow freezing Rapid freezing Slow freezing under 2MPa pressure Slow freezing under 3MPa pressure Median IQR Comparison temperature of inside the Program freezer and inside the Pressure bottle Inside the Program freezer Inside the Pressure bottle Before pressing After pressing min min min min min min min min

53 Abstract Comparison of viability of oral epithelial cells stored by different freezing method Do-young Baek, D.D.S. Department of Dentistry, the Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor EuiSeong Kim, D.D.S., M.S.D., Ph.D.) This study examined the influence of the storage method on the viability of oral epithelial cells using conventional cell freezing storage, slow freezing preservation, rapid freezing preservation, and slow freezing preservation with a pressure of 2Mpa or 3Mpa. The cell viability was evaluated by cell counting, WST-1 and the clonogenic capacity after 6 days of freezing storage. After 6 days, the frozen cells were thawed rapidly, and the cell counting, WST-1, and clonogenic capacity values were measured and compared. 1. The results from cell counting demonstrated that conventional cryopreservation, slow freezing under a 2Mpa pressure and slow freezing 43

54 under a 3Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). 2. The results from the optical density by WST-1 demonstrated that slow freezing under a 2Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). 3. The clonogenic capacity demonstrated that slow freezing under a 2Mpa pressure showed significantly higher values than slow freezing preservation and rapid freezing preservation (p<0.05). Keywords : WST-1, Cell counting, Clonogenic capacity, Slow freezing under pressure, Slow freezing, Rapid freezing 44