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1 Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 4, August 13, Original article 최유성 민경두 윤두수 *, ( 주 ) 럭키산업, * 조선이공대학교생명환경화공과 (13 년 5 월 1 일접수, 13 년 5 월 21 일심사, 13 년 6 월 3 일채택 ) Antibacterial Properties of Silver-alginate/PVP Nanofiber Yoo-Sung Choi, Kyung-Du Min, and Doo-Soo Yoon*, R&D team, Lucky Industry, Gwangju 56-25, Korea *Department of Bioenvironmental & Chemical Engineering, Chosun College of Science & Technology, Gwang-ju , Korea (Received May 1, 13; Revised May 21, 13; Accepted June 3, 13) 알지네이트에은이온을첨가하기위하여, 질산은수용액을이용하여은 - 알지네이트를제조하였다. 본연구에서는은 - 알지네이트를 Poly vinylpyrrolidone (PVP) 수용액과블렌드하였고, 전기방사는블렌드용액을이용하여수행하였다. 은 - 알지네이트 /PVP 혼합용액의항균효과는 colony counting test 로대장균과포도상구균에대해확인하였다. 은 - 알지네이트 /PVP 혼합용액의전기방사조건은조성물의농도를다양하게하여방사거리 22 cm, 방사속도.1 ml/min, 전압 26 kv 조건하에서수행하여나노섬유를제조하였다. 은 - 알지네이트나노섬유의형태와크기는 SEM 과 Image J 를통해확인하였으며, 전기방사된 섬유들의평균직경은 124 nm 를보였으며, 균일하게방사되는것을확인하였다. 의균감소율은 24 시간후 99.9% 를보였다. In order to incorporate silver ions into the alginate, silver-alginate was prepared with aqueous solutions of silver nitrate. In the study, the silver-alginate was prepared by blending with poly vinylpyrrolidone solutions and the electrospinning was performed by using this blend solution. Antibacterial properties of silver-alginate/pvp solutions were estimated for Escherichia coli and Staphylococcus aureus by the colony counting test. Electrospinning conditions of silver-alginate/pvp solution were the tip-to-collector distance of 22 cm, the flow rate of the solution at.1 ml/min, and the voltage at 26 kv. The form and size of silver-alginate/pvp nanofibers were estimated by SEM and Image J. The average diameter of the electrospun fibers was 124 nm and showed a narrow diameter distribution. The reduction of bacteria for exhibited 99.9% after 24 h. Keywords: silver-alginate, low molecular weight sodium alginate, electrospun, poly vinylpyrrolidone 1) 1. 서론 알지네이트는주로갈조류에서탄산수소나트륨수용액을사용하여추출, 생산되고있는기능성다당류이다. 알지네이트는 β-d-mannuronate[m] 와 α-l-guluronate[g] 가 1-4 glycosidic 결합으로이루어지는 hetero polysaccharide의형태로존재한다 [1-4]. 알지네이트는항균성을갖는천연다당류물질로생체적합성이우수하고질량대비 3 배이상의높은함습능력으로창상치유제 (wound dressing) 로널리사용되고있다 [5,6]. 알지네이트의항균성은항균성을갖는대표적인다당류인키토산과비슷한메카니즘으로음이온화된카르복실그룹 (-COO - ) 에의해발생하는 Corresponding Author: Chosun College of Science & Technology Department of Bioenvironmental & Chemical Engineering 39-1, Pilmundaero, Dong-gu, Gwang-ju , Korea Tel: dsyoon@cst.ac.kr pissn: 13 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 것으로알려져있다 [7-9]. 최근들어이러한특성을갖는알지네이트의항균성을지속적이고더욱증가시키기위한방법으로은이온 (Ag - ) 을알지네이트에함유시켜사용하는방법도보고되어지고있다 []. 알지네이트수용액은높은용해점도로인하여단독전기방사가어려워여러가지수용성고분자와혼합하여방사하고있다 [11,12]. 하지만높은점도로인하여계면활성제를사용하지않고는 2% (wt/v) 이상의농도에서는전기방사가어렵다고알려져있다. Poly vinylpyrrolidone (PVP) 는물및여러가지유기용매에뛰어난용해성을가지고있는대표적인기능성고분자로높은생체친화성, 낮은독성과접착력등이우수하여의약품, 화장품, 접착제, 합성세제및생체재료등에폭넓게활용되고있다 [13,14]. 본연구에서는알지네이트의높은용해점도로인하여발생하는여러가지전기방사공정상의문제점을해결하기위해계면활성제를사용하는기존의방법과달리저분자량의알지네이트를사용하였고, 항균성의지속과증진을위한방안으로은-알지네이트를제조하여이를대표적인수용성고분자인 PVP와혼합하여전기방사하였고그항균특성을확인하고자하였다. 416

2 417 Table 1. Characterization of Silver Alginates Particles Samples Molecular weight of alginate Mole ratio (AgNO 3/SA a ) Particle size b (µm) Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg Ag-Alg a Sodium alginate b The particle size of silver alginates were measured by particle size analyser (ELS8) 2. 실험 2.1. 시약본연구에서사용한저분자화알지네이트는 Choi[15] 의방법으로제조하여사용하였으며, PVP (Mw : 13) 과 AgNO 3 (silver nitrate : %) 는 Aldrich사의제품을정제없이사용하였다 은-알지네이트의합성알지네이트를은-알지네이트로변형시키는방법은 Scherr 그룹 [16] 의방법을수정하여사용하였다. 합성에사용한저분자알지네이트의분자량과질산은 (silver nitrate) 의몰비에따른특성을확인하기위해다양한조건에서합성을실행하였다. Table 1에합성에사용한저분자알지네이트와질산은의몰비를나타내었다. 각각의반응조건에따른질산은일정량을증류수 8 ml에녹인후.45 µm의 syringe filter를사용하여여과시켰다. 여과시킨질산은용액은정량펌프를이용하여저분자알지네이트 1 g과탈이온수 ml에녹인후.45 µm의 syringe filter를사용하여여과시켜제조한용액에떨어뜨리면서 ice bath에서반응시켰다. 반응도중초음파를사용하여알지네이트사슬끼리의엉킴현상 (aggregation) 을방지하였고생성된은-알지네이트입자들의분산을유발하였다. Ice bath에서 1 시간동안반응시킨후원심분리기를사용하여생성물을회수하고에탄올로 3회세척한후진공건조기 4 에서 24 시간동안건조하였다. 건조된은-알지네이트의회수율은 6% 였다 은-알지네이트 /PVP 용액제조및전기방사합성된은-알지네이트와 PVP와의혼합조성은은-알지네이트 5% 에 PVP 5,, 15 그리고 % 를각각잘섞어증류수에용해하였다. 합성된은-알지네이트의경우입자크기가가장균일하고물에완전히용해되는 Ag-Alg-6을사용하였다. 은-알지네이트 /PVP 혼합비율표기는은-알지네이트 5% 와 PVP 5% 를혼합한경우는 SA5P5, 은-알지네이트 5% 와 PVP % 를혼합한경우는 SA5P, 은-알지네이트 5% 와 PVP 15% 를혼합한경우는, 은-알지네이트 5% 와 PVP % 를혼합한경우는 SA5P으로나타내었다. 은-알지네이트와 PVP 혼합용액의전기방사를위해사용된고전압직류발생장치는 5 kv까지발생할수있는장치가부착된장비를사용하였고, 집적판은알루미늄호일을사용하였다. 용액의유출량을일정하게조절하기 위해 syringe pump ( series, Kd Scientific Inc., U.S.A) 를사용하였다. 방사후얻어진나노섬유들은진공보관함에보관하였다 은-알지네이트 /PVP 용액의항균특성은-알지네이트 /PVP 용액의항균성을확인하기위해포도상구균 (Staphylcoccus aureus ATCC 29132) 과대장균 (Escherichia coli ATCC 52922) 의균주에대해진탕플라스크법을이용하여균감소율을측정하였다. 충분한성장이이루어진균주를연속희석법으로 4 배로희석하였고, 희석된균주는각각의대조군과시험군의 25 ml 배양액에 5 µl를접종하여 37, 15 rpm으로 24 시간진탕배양하였다. 24 시간진탕배양된배양액을 3 배로희석하여고체배지에 µl씩각각도말하여 37, 24 시간배양하여잔존생균수를계수하여균감소율을측정하였다. 처리시료의균감소율은아래식에의하여구하였다. 균감소율 A = 24 h 배양후대조군의잔존생균수 (CFU/mL) B = 24 h 배양후시험군의잔존생균수 (CFU/mL) 잔존생균수 = 클로니수 배양액 희석배수 2.5. 은-알지네이트 /PVP의특성분석합성된은-알지네이트의입자크기를확인하기위하여건조된은- 알지네이트.1 g을 3차증류수 ml에녹인후알코올에떨어뜨려 Photal사의 ELS 8을사용하여측정하였다. 총 3회에걸쳐측정하였으며측정도중입자들을분산시키기위해초음파를사용하였다. 은-알지네이트의모폴로지는잘건조된파우더상의샘플을 gold sputtering 시킨후 Shimazu사의 TEM (JEM- FX II) 을사용하여확인하였다. 또한, 전기방사를통하여제조된은-알지네이트 /PVP 나노섬유의모폴로지는 Hitachi사의 SEM (S-47) 으로확인하였고, 형태분석프로그램인 Image J (Nation Institutes of Health, USA) 를이용하여섬유의평균직경을측정하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 은-알지네이트의입자분석 Figure 1과 Table 1에제조한은-알지네이트입자크기결과를나타내었다. 은-알지네이트의입자크기는알지네이트의분자량이 5.1 kda 으로일정한조건하에서알지네이트와질산은의몰비 (mole ratio) 가.75에서입자의크기가.31 µm로가장커졌다가작아짐을확인할수있다. 이는은-알지네이트의경우은이온의농도가높을때증류수에대한용해도가떨어져침전되지만질산은과알지네이트의몰비가.5 이하에서는물에대한용해도및분산도가좋아져은-알지네이트입자가상대적으로작게생성된것으로사료된다. Figure 2(a) (c) 는은-알지네이트 [SiA-1] 의 TEM 사진들이다. (a) 의경우전체적으로구형의모습을유지하고있지만작은입자들이 aggregation된것을확인할수있고, 그크기는.7 µm정도로 Table 1 의입자크기분석결과와일치함을확인할수있었다. (b) 와 (c) 는 (a) 에서보여준입자를고배율로확대한모습인데작은입자들이뭉쳐있음을확인할수있었고입자들의크기는 5 nm 이하부터 nm 정도로분포되어있음을확인하였다. 입자크기분석결과와 TEM을통한모폴로지분석결과실제제조된은-알지네이트입자의크기는 Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 4, 13

418 최유성 민경두 윤두수 3 35 25 3 LS Int. Distribution 15 LS Int. Distribution 25 15 5 5 4 6 8 14 5 15 25 3 Diameter( nm) (a) Figure 1. Particle size distribution of silver alginates.

대략 nm 이하의크기였고이들이서로 aggregation 되어있음을확인하였다. 제조되어진은-알지네이트입자의크기를분석한결과입자크기가가장균일하고물에완전히용해되는 Ag-Alg-6가전기방사에가장적합하다고사료되어진다. 3.2.

그결과 PVP의농도가 5% 인경우섬유상으로형성되지못한비드가많이보이는것을확인할수있었다. 비드평균직경은 962.7 nm이다. 이에반해 PVP의농도가 % 그리고 15% 로증가할수록비드상에서섬유상으로바뀌는것을확인할수있었다. 특히, 15% 의경우완전한섬유상을형성함을확인할수있었고, 이섬유의평균직경은 124 nm이었다.

3 418 최유성 민경두 윤두수 LS Int. Distribution 15 LS Int. Distribution Diameter( nm) (a) Figure 1. Particle size distribution of silver alginates. (a) Ag-A-1 and (b) Ag-A-6. Diameter( nm) (b) (a) (b) (c) (d) Figure 2. TEM micrographs of silver alginate particles(ag-a-1), (a) 19, (b) 38, (c) 47, and (d) EDX. 대략 nm 이하의크기였고이들이서로 aggregation 되어있음을확인하였다. 제조되어진은-알지네이트입자의크기를분석한결과입자크기가가장균일하고물에완전히용해되는 Ag-Alg-6가전기방사에가장적합하다고사료되어진다 은-알지네이트 /PVP 나노섬유의특성각조성별로준비된용액들은방사거리 22 cm, 방사전압 26 kv, 방사속도.1 ml/min의방사조건하에서 24 G 규격의 needle을사용하여전기방사하였다. Figure 3은가장안정적인방사조건을확인하기위한방사된섬유의 SEM 사진결과이다. 그결과 PVP의농도가 5% 인경우섬유상으로형성되지못한비드가많이보이는것을확인할수있었다. 비드평균직경은 nm이다. 이에반해 PVP의농도가 % 그리고 15% 로증가할수록비드상에서섬유상으로바뀌는것을확인할수있었다. 특히, 15% 의경우완전한섬유상을형성함을확인할수있었고, 이섬유의평균직경은 124 nm이었다. 섬유의직경은 18 nm에서 118 nm까지분포된전반적으로균일한섬유상을얻을수있었고, 이는일반적으로전기방사시낮은점도에서는비드가형성되어지고점도가증가하면서비드섬유에서완전한섬유상으로형성되는것으로알려져있다 [17]. 그러나 PVP % 의농도에서는평균 nm를갖는비드상의섬유가생성되었고, PVP의농도가 % 에서보여준비드상섬유에비해섬유의직경이상당히증가된것을확인할수있었다. 이는점도가너무높아지면서 needle 끝에서용액이건조되어방사되지못한것으로사료된다 [18]. 공업화학, 제 24 권제 4 호, 13

Alginate Containing PVP Against E. coli.

%) SA5P5 SA5P SA5P ACC a (CFU/mL) 1. 7 1.

Tables 2, 3 은은 - 알지네이트 /PVP 방사용액 (SA5P5,

율을진탕배양법으로측정한결과이다. 대장균에대한균감소율은 Appl. Chem.

4 (a) (b) (c) (d) Figure 3. SEM Images and distribution of electronspun Ag-alginate/PVP fibers. (a) SA5P5, (b) SA5P, (c), and (d) SA5P. Table 2. Antibacterial Action of PVP and Silver Alginate Containing PVP Against E. coli. Blank PVP (5.%) PVP (.%) PVP (15.%) SA5P5 SA5P SA5P ACC a (CFU/mL) < < < 5. 6 AA b (%) a Viable Cell Count b Antibacterial Activity [, A : Viable cell count of control group, B : Viable cell count of experimental group] Table 3. Antibacterial Action of PVP and Silver Alginate Containing PVP Against S. aureus. Blank PVP (5.%) PVP (.%) PVP (15.%) SA5P5 SA5P SA5P ACC a (CFU/mL) < < < 2. 6 AA b (%) 은 - 알지네이트 /PVP 용액의항균특성 Figures 4, 5 와 Tables 2, 3 은은 - 알지네이트 /PVP 방사용액 (SA5P5, SA5P,, SA5P) 의대장균과포도상구균에대한균감소 율을진탕배양법으로측정한결과이다. 대장균에대한균감소율은 Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 4, 13

9% : < CFU/mL ; 99.9% SA5P : 2. 6 CFU/mL ; 5.% PVP 5. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Figure 5. Photographs of smear test for S. aureus. PVP. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % PVP 15. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Blank.

5 4 최유성 민경두 윤두수 SA5P5 : < CFU/mL ; 99.9% SA5P : < CFU/mL ; 99.9% : < CFU/mL ; 99.9% SA5P : 5. 6 CFU/mL ; 5% PVP 5. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Figure 4. Photographs of smear test for E. coli. PVP. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % PVP 15. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Blank. E. coli. : 1. 7 CFU/mL SA5P5 : < CFU/mL ; 99.9% SA5P : < CFU/mL ; 99.9% : < CFU/mL ; 99.9% SA5P : 2. 6 CFU/mL ; 5.% PVP 5. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Figure 5. Photographs of smear test for S. aureus. PVP. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % PVP 15. wt% : 1. 7 CFU/mL ; % Blank. S. aures. : 1. 7 CFU/mL SA5P5, SA5P 그리고 는모두 99.9% 의억제율을보였지만, SA5P 은 5.% 의억제율을보였다. 또한, 은 - 알지네이트를함유하지 않은 PVP 15% 용액은전혀항균력을보이지않았다. 포도상구균에 대한균감소율을보면대장균과마찬가지로 SA5P5, SA5P 그리고 공업화학, 제 24 권제 4 호, 13

Antibacterial Action of Silver Alginate Containing PVP Against E. coli. Blank (d-2) (d-) (d-) ACC a (CFU/mL) 1. 7 < < 7.5 5 AA b (%) 99.9 99.9 92.

6 421 (Dilution : 2 times) : < CFU/mL ; 99.9% (Dilution : times) : < CFU/mL ; 99.9% (Dilution : 2 times) : < CFU/mL ; 99.9% (Dilution : times) : < CFU/mL ; 99.9% Blank. E. coli. : 1. 7 CFU/mL Figure 6. Photographs of smear test for E. coli. (Dilution : times) : CFU/mL ; 92.5% Blank. S. aures. : 1. 7 CFU/mL Figure 7. Photographs of smear test for S. aureus. (Dilution : times) : CFU/mL ; 92.5% Table 4. Antibacterial Action of Silver Alginate Containing PVP Against E. coli. Blank (d-2) (d-) (d-) ACC a (CFU/mL) 1. 7 < < AA b (%) a Viable Cell Count b Antibacterial Activity [, A : Viable cell count of control group B : Viable cell count of experimental group] 는모두 99.9% 의억제율을보였지만, SA5P 는 5.% 의억 제율을보였다. 은 - 알지네이트를함유하지않은 PVP 15% 용액역시 전혀항균력을보이지않았다. Figures 6, 7 과 Tables 4, 5 는최적의방사조건을보인 용액 의 2 배, 배그리고 배희석시대장균과포도상구균에대한균 감소율결과이다. 대장균에대해서는 2 배희석시 99.9%, 배희석 시 95.% 그리고 배희석시 92.5% 의균감소율을보였다. 포도상 구균에대해서는 2 배희석시 99.9%, 배희석시 99.9% 그리고 배 희석시 92.5% 의균감소율을보였다. 4. 결론 생체적합성이뛰어나고항균성을갖는저분자화알지네이트를질 산은을사용하여은함유알지네이트로합성한후, 대장균과포도상 구균에대해항균성을확인하였으며, 은 - 알지네이트 5 wt% 의수용액 에 PVP 수용액을 5, 그리고 15% 의농도로혼합하여전기방사를 Table 5. Antibacterial Action of Silver Alginate Containing PVP Against S. aureus. Blank (d-2) (d-) (d-) ACC a (CFU/mL) 1. 7 < < AA b (%) 통한나노섬유를제조하였다. 전기방사한결과 % 에서는섬유의 굵기가일정하지못하고비드형태가존재하는섬유상을얻을수있었고, % 에서는너무높은농도로인하여섬유상이아닌비드섬유상으로제조되었다. 이에반해 15% 의 PVP 농도에서는평균직경이 124 nm인균일섬유상을얻을수있었다. 최적방사조건용액인 는대장균및포도상구균에대해각각 99.9% 의억제율을보였으며, 이를희석한용액에서도 92.5% 이상의억제율을보임으로써, 실제나노섬유제조시높은항균성을지닐것으로사료된다. 참고문헌 1. E. Nishide, Y. Kinoshita, H. Anzai, and N. Uchida, Nippon Suisan Gakkaishi, 54, 1619 (1988). 2. E. Nishide, A. Hiroshi, and U. Naoyuki, Nippon Suisan Gakkaishi, 53, 1215 (1987). 3. M. Fujihara and T. Nagumo, J. Chromatogr., A, 465, 386 (1989). 4. K. Noda and K. Takada, Bull. J. Soc. Sci. Fish., 49, 1591 (1983). 5. S. M. Han, C. W. Nam, and S. W. Ko, J. Kor. Fiber Soc., 37, 365 (). 6. Y. Qin, J. Appl. Polym. Sci., 91, 1641 (4). Appl. Chem. Eng., Vol. 24, No. 4, 13

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