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경진 경
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줄무늬 패턴을 이용하여 분해능의 한계를 넘어서다: Illumination Microscopy의 소개 DOI: 10.3938/PhiT.21.

1 줄무늬 패턴을 이용하여 분해능의 한계를 넘어서다: Illumination Microscopy의 소개 DOI: /PhiT 고유빈 정 은석 정 연 수 정 의 헌 Overcoming the Resolution Limit Using Striped 머릿말 Patterns: Illumination Microscopy 광학 현미경은 17세기 레벤후크(von Leeuwenhoek)가 발 Yoobin KOH, Eunseok JUNG, Yeonsu JUNG and Euiheon 명한 이후로 이전에는 불가능했던 미생물이나 세포 소기관 구 CHUNG 조의 관찰이 가능하도록 하였으며, 의생명 과학이 발전함에 있어서 큰 기여를 해왔다. 1873년 에른스트 아베(Ernst Abbe) Optical microscopy has entered a new era of super-res- 의 주장에 따르면 현미경의 분해능은 회절 현상(diffraction) olution imaging. This technology is revealing sub-cel- 으로 인해 사용되는 광의 반파장 정도-가시광선의 경우 수백 lular structures and dynamic functions on a nano- 나노미터-로 보고되었으며, 이후 수백 년 동안 이 한계는 넘 meter scale that were previously impossible. A number 어서기 힘든 것으로 여겨졌다. of ideas have been realized in order to surpass the dif- 에 의하여 결정되는 분해능의 한계는 근래에 들어 초분해능 fraction limit of optical microscopy. Among others struc- (super-resolution) 현미경이 개발되면서 극복되었다. 높은 tured microscopy (SIM) has been widely 분해능을 갖는 현미경의 등장은 미소 수준의 생명 현상에 대 studied due to its wide-field imaging nature and less 한 연구를 가능하게 함으로서 생물학과 기초의학 연구에 새 dependence on the fluorophore choice. SIM uses a fine 로운 장을 열고 있다. [1] 이러한 빛의 파동적인 특성 striped pattern of light to extract minute 살아있는 세포의 복잡한 상호작용을 수십 나노미터 수준에 features from the sample. Various advances have been 서 선택적으로 관찰할 수 있다는 점에서 초분해능 형광 현미 achieved to obtain better resolution, robustness, faster 경의 개발은 녹색형광단백질(green fluorescence protein)의 imaging speed, and 3-dimensional imaging of fixed and 발견과 더불어 앞으로도 넓은 분야에서 응용될 것으로 기대 live specimens based on the principle of SIM. 된다. [2] 이러한 경향을 반영하여 초분해능 형광 현미경은 Nature Methods 학술지에서 2008년 올해의 방법론(Method [3] of the year 2008)으로 선정되기도 하였다. 저자약력 고유빈은 광주과학기술원 학사과정생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있 다.(kyb702@gist.ac.kr) 정은석은 광주과학기술원 대학원생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있 다.(esjung@gist.ac.kr) 정연수는 광주과학기술원 대학원생으로서 초분해능 현미경을 연구하고 있 다.(yeonsu@gist.ac.kr) 정의헌 교수는 미국 Harvard-MIT 의공학 박사(2007)로서, Harvard Medical School 박사 후 연구원( )을 거쳐, 2011년부터 현재까 지 광주과학기술원 의료시스템학과 및 기전공학부 조교수로 재직 중이다 (ogong50@gist.ac.kr) 분해능의 한계를 극복한 기술들 입사된 빛이 관측대상으로부터 원거리로 전파하게 되면 회 절 현상이 두드러지기 때문에 원래의 정보를 획득하는데 제 한이 생긴다. 이러한 이유로 표본에 매우 가까이 근접하여 관 [1] E. Abbe, Archiv fu r mikroskopische Anatomie 9, 413 (1873). [2] R. Y. Tsien, Annu Rev Biochem 67, 509 (1998). [3] Nature Methods 6, 1 (2009). 물리학과 첨단기술 MAY

(a) (b) (c) Fig. 1. Resolution extension through the moiré effect. If an unknown sample pattern (a) is multiplied by a known regular pattern (b), and moiré fringes will appear (c).

2 (a) (b) (c) Fig. 1. Resolution extension through the moiré effect. If an unknown sample pattern (a) is multiplied by a known regular pattern (b), and moiré fringes will appear (c). It is enough to observe through the microscope even if the original unknown sample pattern is unresolvable. [10] 찰하는근접장현미경 (Near-field optical microscopy) 이개발되었다. 그중에서도탐침을이용해표면가까이에서형광분자의신호를감지하고탐침을표면을따라이동시키며이미징을하는근접장주사광학현미경 (Near-field scanning optical microscopy) 이대표적이다. [4] 하지만이장치를이용한이미징방법은샘플의표면에서매우가까운영역만을볼수있다는점에서한계를보인다. 한편원거리장초분해능현미경 (far-field super-resolution microscopy) 기술은오랫동안이론적으로만예측되어왔으나, 근래에들어서야실험적인증명사례가등장하기시작했다. 형광물질의비선형성을이용한 STED 현미경, [5] 광활성화가가능한형광단백질 (photo-activatable fluorescent protein) 의위치추정법을이용한 STORM/ (F)PALM, [6-8] 줄무늬패턴모양의입사광을사용하여분해능을높인 SIM( microscopy), [9] SIM의원리를바탕으로형광물질의비선형성을이용해해상도를더욱높인 SSIM(saturated structured microscopy) [10] 등회절한계를극복한기술들이근래에들어서다양하게개발되었다. 이글에서는초분해능형광현미경기술중에서도광대역이미징 (wide-field imaging) 기법인 SIM의원리와최근에이룩한 SIM의기술적진보및 SIM 기술이생명과학연구에응용되는사례들을소개하여초분해능현미경기술개발의중요성과응용가능성에대해다뤄보고자한다. SIM(structured illuminated microscopy) 의원리 SIM에서현미경의분해능은간섭무늬를이용하여증가될수있다. 서로다른무늬 a와 b를겹치면우리눈으로쉽게볼수있는새로운무늬 c가생긴다 (Fig. 1 참조 ). 이간섭무늬를무아레무늬 (moiré pattern, 용어설명참조 ) 라하며, 각각의무늬 a 또는 b가분해능보다작더라도무아레무늬는관찰이가능하다. 만약 b 무늬에대한정보를사전에알고있 Fig. 2. The principle of SIM: Under uniform as in conventional microscopy, two closely adjacent fluorescent molecules are not distinguishable. However using localized could reveal each fluorescent molecule by precisely shifting its phase and taking individual images. 었다면무아레무늬 c를관측함으로써 a 무늬의정보를역으로계산해낼수있다. SIM에서무늬 a는기존의현미경으로는관찰할수없는표본의모양이고 b는우리가이미알고있는무늬 (structured ) 의입사광이며 a와 b가서로겹쳐생긴 c를실제로이미징하게된다. 무늬 b의위상을바꾸어가면서획득한여러장의 c의이미지를역으로추정했을때, 이론적으로는기존의현미경보다두배가량향상된분해능으로표본의이미지를얻을수있다. 위에서설명한 SIM의원리를 Fig. 2에서도식으로나타내었다. 점광원 (point source) 의이미지를점퍼짐함수 (pointspread function, PSF, 용어설명참조 ) 라고한다. 따라서 PSF보다가까운거리의물체들은구분이되지않는다. 즉, 보통의형광현미경에서는입사광을샘플에균일하게비추며 [4] E. Betzig and J. K. Trautman, Science 257, 189 (1992). [5] S. W. Hell and J. Wichmann, Opt. Lett. 19, 780 (1994). [6] M. J. Rust, M. Bates and X. Zhuang, Nat. Methods 3, 793 (2006). [7] S. T. Hess, T. P. Girirajan and M. D. Mason, Biophys. J 91, 4258 (2006). [8] E. Betzig et al., Science 313, 1642 (2006). [9] M. G. Gustafsson, J Microsc 198, 82 (2000). [10] M. G. Gustafsson, Proc Natl Acad Sci U S A 102, (2005). 22 물리학과첨단기술 MAY 2012

Fig. 3. Example of SIM imaging of biological sample: The actin cytoskeleton at the edge of a HeLa cell, as imaged by (a) conventional, and (b) structured microscopy.

만약국소적인입사광 (localized ) 을이용하여형광분자들을개별적으로들뜨게하고빛의위상을조금씩바꾸면서여러장의이미지를얻는다면이를토대로 PSF보다가까운거리의물체들의존재도알아낼수있다. 이것이바로 SIM의원리이다. 실제로는국소화된입사광의위상을바꾸어가며이미징을하여한방향으로만높은분해능을얻게된다. 따라서몇가지방향으로이과정을반복하여야만전체적으로골고루분해능을높일수있다.

3 Fig. 3. Example of SIM imaging of biological sample: The actin cytoskeleton at the edge of a HeLa cell, as imaged by (a) conventional, and (b) structured microscopy. Fibers separated by less than the resolution limit of the conventional microscope are well resolved using structured. [9] (uniform ) 결과적인형광이미지 (Fig. 2의 F) 에서는회절한계보다가까이위치한물체들은 PSF가겹치게되어서구분할수없게된다. 만약국소적인입사광 (localized ) 을이용하여형광분자들을개별적으로들뜨게하고빛의위상을조금씩바꾸면서여러장의이미지를얻는다면이를토대로 PSF보다가까운거리의물체들의존재도알아낼수있다. 이것이바로 SIM의원리이다. 실제로는국소화된입사광의위상을바꾸어가며이미징을하여한방향으로만높은분해능을얻게된다. 따라서몇가지방향으로이과정을반복하여야만전체적으로골고루분해능을높일수있다. SIM을이용한예로 Fig. 3에서는세포소기관인 actin cytoskeleton의이미지에대한기존의현미경 (a) 과 SIM(b) 의차이를비교하여보여준다. Fig. 4. SLM patterns at three phases and their corresponding patterns: The black ones in the SLM patterns indicate no phase retardation on the incident beam. [13] light modulator, 용어설명참조 ) 는전자적으로패턴을만들수있기때문에회절격자의단점을극복한장치로서표본에임의의패턴을지닌입사광을생성할수있게한다 (Fig. 4 참조 ). 공간빛변조기표면의무늬를컴퓨터로제어함으로써회절격자를이동하거나회전할때생기는기계적인오차를줄일수있게되었다. [11,12] 2. 정상파원리를이용한패턴생성 한편입사광무늬의간격이좁아질수록 SIM의분해능이높아지므로정상파 (Standing wave 용어설명참조 ) 에서빛의세기 (intensity) 의파장이원래파장의반이되는현상 (Fig. 5 참조 ) 을응용한정상파형광현미경 (standing wave fluorescence microscopy) 이등장했다. [14,15] 이것은회절한계보다작은패턴을만들수있는새로운기술임에동시에분해능을향상시 SIM 기술의구현및진보 1. 공간빛변조기 (Spatial light modulator) 를이용한패턴생성이전까지는패턴을가진입사광을만들기위해회절격자를이용한방법이널리사용되어왔다. 하지만회절격자는격자간격 (fringe period) 이고정되어있고, 기계적으로이동하고회전시키는방법은근본적으로정밀도의한계가있고시간적으로도문제가될수있다. 공간빛변조기 (spatial [11] P. Křížek and G. M. Hagen, Microscopy: Science, Technology, Applications and Education, Edited by A. Méndez-Vilas and J. Díaz (2010), Vol. 3, p [12] R. Fiolka, M. Beck and A. Stemmer, Opt. Lett. 33, 1629 (2008). [13] B. J. Chang, L. J. Chou, Y. C. Chang and S. Y. Chiang, Optics Express 17, (2009). [14] B. Bailey, D. L. Farkas, D. L. Taylor and F. Lanni, Nature 366, 44 (1993). [15] J. T. Frohn, H. F. Knapp and A. Stemmer, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 7232 (2000). 물리학과첨단기술 MAY

Fig. 6. Experimental setup of SW-SPRF (standing wave-surface plasmon resonance fluorescence). [18] Fig. 5. Standing wave: Standing wave is made when two waves encounter and interfere.

4 Fig. 6. Experimental setup of SW-SPRF (standing wave-surface plasmon resonance fluorescence). [18] Fig. 5. Standing wave: Standing wave is made when two waves encounter and interfere. SIM based on SW utilizes the fact that the wavelength of standing wave intensity is a half of the original. Thus the resultant narrow pattern can lead to higher resolution. 킬수있는획기적인방법이었다. 이원리로부터나아가보다미세한패턴을구현하여분해능을높인 SW-TIRF와같은진보된기술이등장하였다. [16,17] 입사된빛이굴절률이다른매질의경계면에서전반사될때, 한쪽매질에서에바네센트파 (evanescent wave 용어설명참조 ) 가형성되는데이파동을이용해서표본에서가까운 ( 약 100 nm 이내 ) 형광분자만을선택적으로여기시킬수있다. 에바네센트파를정상파로만들면보다미세한패턴을구현할수있기때문에분해능을더높일수있다는장점이있다. [16,17] 나아가서전반사구조에표면플라즈몬공명 (surface plasmon resonance 용어설명참조 ) 현상을적용함으로써형광신호를몇배로증폭시키고동시에배경노이즈 (background noise) 를줄일수있게되었다 (Fig. 6 참조 ). [18] 3. 형광의비선형성을이용하여무제한으로작은패턴을생성하는 Saturated SIM (SSIM) 입사광의세기가특정값이상으로증가하여형광신호가비선형적인반응을보이는포화상태가되면이론적으로무제한적으로작은패턴을만들수있게된다. 이렇게형성된입사광의패턴을 SIM에적용시킨방법을 SSIM(saturated SIM) 이라고한다. SSIM 방법을통하여 50 nm 이내의분해능이실험적으로입증되었다. [10] 하지만강한입사광으로인하여형광분자의광표백 (photobleaching) 이심해지는등의단점도있다. 이를보완하기위해몇시간동안강한빛을조 사해도쉽게광표백되지않는다이아몬드나노결정 (diamond nanocrystals) 을사용한바가있다. 또한실제살아있는세포를이미징하는경우상을얻는도중에물체가수십나노미터씩움직일수있으므로실시간이미징을위해서는천천히움직이는표본만을관찰할수있다는제한점이있다. [20] Table 1에서는 SIM 및연관된기술들을구조화된입사광이만들어진원리에따라분류하고이미징방법, 장단점그리고여러가지명칭들로나누어보여주었다. 4. 이미징속도를향상시킨 SIM 초기의 SIM은회절격자나샘플을직접손으로움직여미세하게위치를조정하여야하였으므로이미징을위한시간이많이들었다. 하지만컴퓨터를이용하여입사광을빠르고정밀하게제어할수있게되었다. 예를들어입사광의세기를조절하는 AOTF(acousto-optical tunable filter) 를통해공간주파수를유동적으로변화시켜사인파형무늬를얻는장치와 [21] 위상제어기 (phase controller) 와같이실시간으로정상파의위상을피드백하여보정해주는알고리즘을이용해열적표류 [16] E. Chung, D. Kim, Y. Cui, Y. H. Kim and P. T. So, Biophys J 93, 1747 (2007). [17] E. Chung, D. Kim and P. T. So, Opt. Lett. 31, 945 (2006). [18] E. Chung, Y. H. Kim, W. T. Tang, C. J. Sheppard and P. T. So, Opt. Lett. 34, 2366 (2009). [19] B. Huang, M. Bates and X. Zhuang, Annu Rev Biochem 78, 993 (2009). [20] A. Gur, Z. Zalevsky, V. Mico, J. Garcia and D. Fixler, J Fluoresc 21, 1075 (2011). [21] P. J. Keller et al., Nat Methods 7, 637 (2010). 24 물리학과첨단기술 MAY 2012

5 Table 1. Comparison of super-resolution microscopy techniques based on structured. Classification Methods Resolution Advantages Disadvantages Alternative names microscopy (SIM) Grating [9] Spatial light modulator (SLM) [13] Standing wave (SW) [15] nm Relatively simple. Extension to 3D possible. Limited resolution enhancement (upto twice than conventional microscopy). Harmonic excitation light microscopy (HELM) [15] Laterally modulated excitation microscopy (LMEM) [24] microscopy based on total internal reflection geometry (SIM-TIR) under TIR geometry (TIR achievable with a prism or a high NA objective lens) About 100 nm Higher signal-tobackground ratio. Further resolution enhancement than SIM. More complicated alignment due to TIR geometry. Still linear resolution enhancement. Standing wave-total internal reflection fluorescence (SW-TIRF) [16,17] Harmonic excitation light microscopy-total internal reflection fluorescence (HELM-TIRF) [12] TIRF SIM [25] Nonlinear microscopy Deliberate saturation of fluorophores excited state < 50 nm Even further resolution enhancement. (theoretically unlimited). Fast photobleaching may limit the use of biological sample. Saturated Patterned excitation microscopy (SPEM) [24] Saturated structured microscopy (SSIM) [10] Fig. 7. The principle of SSIM: A diffractive grating in the excitation path splits the light into two beams. Their interference after emerging from the objective and reaching the sample creates a sinusoidal pattern. Strong excitation light saturates the fluorescence emission at the peaks leading to sharp dark regions in the effective pattern. [19] (thermal drift) 와미세한진동으로인해생기는영향을줄이는장치는선명한이미지를신속히얻는데도움을주었다. [16] 컴퓨터제어를이용한것과는다르게수직의선형편광된두빛을한번에두방향으로입사시켜위상을회전하는데드는시간을단축시키는방법도등장하였다. [22] 5. 삼차원이미징기술 한편지금까지소개된 SIM은대부분 2차원에서의분해능을향상시킨방법인데반하여, 축방향으로도분해능을증가시킬수있는 3차원 SIM 기반기술들도개발되어왔다. 3차 원의이미지는초점을 z축방향으로이동시키면서얻을수있다. SIM은 XY와 Z 방향모두각각 100 nm, 300 nm 수준으로기존대비두배이상분해능을증가시킬수있다 (Fig. 8 참조 ). SSIM에서와같이형광분자의비선형적인발광특성을이용한다면이를더욱향상시킬수있다. 3차원 SIM 은이전에서잘보여주지못하던세포핵, 바이러스, 시냅스및액틴등의구조를더자세하게보여주게되었다. 맺는말 지금까지 SIM의원리와최근진전되고있는연구결과를소개했다. SIM은기존의널리사용되고있는형광분자를그대로사용할수있어서다양한형광표지를통해다색삼차원이미징이용이하다. 최근에는 Carl Zeiss사와 Nikon사에서 [22]M. Ahn, T. Kim, Y. Kim, D. Gweon and J. H. Lee, Measurement Science & Technology 22, (2011). [23]L. Schermelleh, R. Heintzmann and H. Leonhardt, The Journal of Cell Biology 190, 165 (2010). [24] R. Heintzmann, T. M. Jovin and C. Cremer, J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis 19, 1599 (2002). [25] P. Kner, B. B. Chhun, E. R. Griffis, L. Winoto and M. G. Gustafsson, Nat Methods 6, 339 (2009). 물리학과첨단기술 MAY

감사의글 본연구는광주과학기술원바이오광학영상센터 (K0267C), 의료시스템공학연구소 (imse), 그리고교과부한국연구재단바이오 의료기술개발사업 (No. 2011-0019619, 2011-0019632) 의지원하에이루어졌으며, 이에감사드립니다. Fig. 8.

tubulin, and secondary antibodies conjugated to Alexa 488 (green) and Alexa 594 (red), respectively. Nuclear chromatin was stained with DAPI (blue). [23] 분해능이 100 nm 수준인 SIM 제품을출시하였다.

상대적으로짧은역사에도불구하고초분해능현미경은불변으로믿어져왔던회절한계를극복하며발전하게되었고, 세포생물학, 미생물학, 신경생물학등에서새로운통찰력을제시하게될것이다. 용어설명 무아레무늬 (Moiré pattern) 2개의격자무늬가겹쳐지게되면간섭현상이일어나게되는데, 이에따라생겨나는무늬를무아레무늬라한다.

6 감사의글 본연구는광주과학기술원바이오광학영상센터 (K0267C), 의료시스템공학연구소 (imse), 그리고교과부한국연구재단바이오 의료기술개발사업 (No , ) 의지원하에이루어졌으며, 이에감사드립니다. Fig. 8. Super-resolution microscopy of biological samples: Conventional wide-field image (left) and 3D-SIM image (right) of a mouse C2C12 prometaphase cell stained with primary antibodies against lamin B and tubulin, and secondary antibodies conjugated to Alexa 488 (green) and Alexa 594 (red), respectively. Nuclear chromatin was stained with DAPI (blue). [23] 분해능이 100 nm 수준인 SIM 제품을출시하였다. 이에따라더욱많은생물학연구자들이이기술을사용할수있을것으로기대된다. 초분해능형광현미경이등장한이래로짧은시간에도불구하고다양한방법들이개발되어상용화에성공할정도로많은진전이이루어졌다. 이전까지는관찰할수없었던것들을볼수있게됨으로써복잡한생명현상의이해를한층깊게해줄것이다. 상대적으로짧은역사에도불구하고초분해능현미경은불변으로믿어져왔던회절한계를극복하며발전하게되었고, 세포생물학, 미생물학, 신경생물학등에서새로운통찰력을제시하게될것이다. 용어설명 무아레무늬 (Moiré pattern) 2개의격자무늬가겹쳐지게되면간섭현상이일어나게되는데, 이에따라생겨나는무늬를무아레무늬라한다. 점퍼짐함수 (Point-spread function) 현미경에서점광원물체의이미지를점퍼짐함수라고하며회절현상등으로인하여유한한크기를가지게된다. 분해능을가늠하는척도가된다. 정상파 (Standing wave) 진폭과진동수가같은파동이서로반대방향으로이동할때파동의합성에의해생성된다. 이때, 생겨난정상파의파장은원파동의파장의절반과같다. 에바네센트파 (Evanescent wave) 전반사가일어날때매질의경계면에서 ( 입사면반대쪽에 ) 형성되는국소전자기장. 경계면으로부터약 100 nm 정도의매우제한된영역에서만형성되므로형광분자의국소활성화를가능하게한다. 공간빛변조기 (Spatial light modulator) 형성된빛의세기혹은위상의공간적분포를변조하는장치. 표면플라즈몬공명 (Surface plasmon resonance) 금속과유전체의두물질경계면에입사광이 (p-polarization) 특정각도로입사할때에바네센트파의세기가크게증가하는현상. 26 물리학과첨단기술 MAY 2012

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<313331313334C6AFC1FD28C0CCC1F8BFEC292E687770> 단일형광분자 관측을 기반으로 하는 초고해상도 형광 현미경 DOI: 10.3938/PhiT.22.053 이 진 우 홍 성 철 Super-resolution Fluorescence Microscopy Based 수 있어 처음 개발된 이후로 무수히 많은 연구가 현미경을 통 on Single-molecule Localization 해 이루어졌고, 특히 연구 대상이