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병숙 어금
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1 Journal of Bacteriology and Virology Vol. 39, No. 1 p Expression and Antibody Production of Japanese Encephalitis Virus RNA Polymerase (NS5) Protein Jeong-Min Kim, Sang-Im Yun, Byung-Hak Song, Yu-Jeong Choi, Jun-Sun Park and Young-Min Lee * Department of Microbiology, College of Medicine and Medical Research Institute, Chungbuk National University, Cheongju, Korea Japanese encephalitis virus (JEV), a member of mosquito-borne flaviviruses, is the leading cause of viral encephalitis in a large geographic area of Southeast Asia and Australia. JEV contains a single-stranded positive-sense RNA genome, which encodes its own RNA-dependent RNA polymerase (NS5) that is required for genomic RNA replication. In this study, we have described a pair of mouse antisera specific to the N- or C-terminal region of the NS5. Initially, two hydrophilic regions corresponding to the N-terminus and C-terminus of the NS5 protein were individually amplified by reverse transcription-pcr from the genomic RNA of JEV K87P39 strain. The amplified DNA fragments were cloned into a prokaryotic expression vector, pgex-4t-1; the resulting constructs were used for the expression of GST fusion proteins, designated GST/NS5N and GST/NS5C, in E. coli BL-21 strain. Following immunization of three BALB/c mice with each of the purified GST/NS5N and GST/NS5C, we obtained two pools of the antisera, specifically recognizing the ~103-kDa NS5 and several smaller NS5-related proteins in BHK-21 and Vero cells infected with JEV K87P39 strain. Overall, we have successfully expressed the N- and C-terminal regions of JEV NS5 fused to the C-terminus of GST and generated the mouse antisera capable of recognizing the NS5 and its related proteins in JEV-infected cells. This would provide a valuable reagent for the study of JEV NS5 in the viral life cycle. Key Words: Japanese encephalitis virus; Flavivirus; RNA-dependent RNA polymerase; NS5 서론 일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV) 는작은빨간집모기 (Culex tritaeniorhynchus) 에의해전파되며인체감염시급성뇌염을일으킨다. 일본뇌염바이러스는한국, 중국, 일본, 인도, 베트남등을포함한동남아시아의대부분지역에서유행하고있다 (1, 2). 통계학적으로매년약 50,000명정도의발병환자가보고되고있 Received: March 6, 2009/ Revised: March 16, 2009 Accepted: March 17, 2009 * Corresponding author: Young-Min Lee. Department of Microbiology, College of Medicine & Medical Research Institute, Chungbuk National University, 12 Gaeshin-Dong, Heungduk-Ku, Cheongju, Korea. Phone: , Fax: ymlee@chungbuk.ac.kr ** This work was supported by a Korea Research Foundation grant (KRF C00405, which was transferred from R ) funded by the Korean Government (MOEHRD). 으며, 이중에서약 15,000명은사망한다 (3). 특히어린이와유아의경우치료후에도심각한신경성후유증을경험할가능성이높다 (4, 5). 최근지구의기온상승과생활환경의변화로인해서일본뇌염바이러스의감염지역이점차확대되고있다. 특히, 과거에는일본뇌염바이러스가발견되지않았던호주에서최근 2~3년동안지속적으로바이러스가분리되고있어, 전세계적으로주요병원성바이러스의하나로대두되고있다 (6~9). 일본뇌염바이러스는분류학적으로플라비비리데과 (Flaviviridae family) 의플라비바이러스속 (Flavivirus genus) 에속하며, 유전학적으로황열바이러스 (yellow fever virus), 웨스트나일바이러스 (West Nile virus, WNV) 및뎅기바이러스 (dengue virus, DENV) 와매우유사하다 (10, 11). 다른플라비바이러스와마찬가지로, 일본뇌염바이러스는약 11,000 개의염기로구성된단일가닥의양성-극성 RNA를게놈으로가지고있다. 게놈의 5'-말단에는 53

2 54 J-M Kim, et al. 캡-1 구조 (cap-1 structure) 를가지고있으나, 3'-말단에는폴리 A 꼬리 [poly(a) tail] 을가지고있지않다 (12, 13). 게놈은단한개의 open reading frame (ORF) 으로구성되어있으며, 이 ORF의양쪽끝부분에단백질을인코딩하지않는비번역부위 (nontranslated region, NTR) 가위치한다. 바이러스의 ORF는하나의다단백질 (polyprotein) 로합성된후, 최소 2개의단백질분해효소에의해서 3개의구조단백질 (structural protein) 과 7개의비구조단백질 (nonstructural protein, NS) 로분해된다. 3개의구조단백질은 capsid (C), premembrane (prm) 및 envelope (E) 이라고부르며, 7개의비구조단백질은 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5라고명명한다 (13, 14). 일본뇌염바이러스를포함한모든플라비바이러스의 NS5 (~103 kda) 은서로다른분리주들간에염기서열의이질성 (heterogeneity) 이매우낮으며, methyltransferase와 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) 의기능을겸비한다기능단백질로알려져있다. Methyltransferase의기능은바이러스의게놈 5'-말단에캡구조를첨가하는반응에관여하며 (15, 16), RdRp의기능은게놈 RNA의복제를수행하는역할을하는데기여하는것으로보고된바있다 (17~19). 비록이러한 NS5의생물학적특징은정제된단백질을사용하여입증된바는있으나, 이들이어떠한작용기전에의해서바이러스의 RNA 복제에관여하는지에대한자세한사항은거의규명된바없다. 또한알려진기능이외에 NS5 단백질은플라비바이러스의증식에중요한역할을하는것으로추정된다. 뎅기바이러스의경우, NS5가사이토카인 IL-8의전사와분비를증대시킴으로써바이러스의전파를촉진한다고보고된바있다 (20). 그리고진드기에의해서전파되는플라비바이러스 (tick-borne encephalitis virus) 의경우, NS5가인터페론수용체와결합함으로써 IFN-α/β와 IFN-γ의신호전이를방해하고, Jak1과 Tyk2의인산화를감소시켜 STAT1 의활성화를억제한다는사실이보고된바있다 (21). 앞으로 NS5 단백질이플라비바이러스의생활사에서어떠한기능을하는지에대한자세한연구가필요할것으로사료된다. 본연구에서는 E. coli 발현시스템을활용하여일본뇌염바이러스 NS5 단백질의두부위를 glutathione S- transferase (GST) fusion protein 형태로각각다량발현하고, 정제된재조합단백질을면역원으로사용하여마우스항혈청을생산하고자하였다. 이렇게얻어진단백질 과항혈청은앞으로일본뇌염바이러스의기초연구, 특히바이러스생활사에서 NS5의역할과작용기전을규명하는데중요한실험시약으로활용할수있을것으로기대한다. 재료및방법세포및바이러스본연구에서는 BHK-21과 Vero 세포주를바이러스감염실험에사용하였다. 이들세포주는모두 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum), 2 mm L-글루타민, 비타민및페니실린 / 스트렙토마이신을첨가한 alpha minimum essential medium (α-mem) 에서배양하였으며, 37, 5% CO 2 조건에서약 3~4일마다분주하였다. 본실험에사용한일본뇌염바이러스는 1987년모기에서분리된한국분리주 K87P39를사용하였다 (22). 플라스미드일본뇌염바이러스 NS5 단백질의 N-말단부위로부터 275개의아미노산을발현하는 pgex/jevns5n과 C-말단부위에서 463개의아미노산을발현하는 pgex/jevns5c 플라스미드를각각제조하였다. 플라스미드클로닝과관련된모든사항은일반적인재조합 DNA 기술 (recombinant DNA technology) 를사용하였다 (23). 먼저일본뇌염바이러스의국내분리주인 K87P39 (GenBank accession no. AY585242) 의게놈 RNA을주형으로사용하여 RT- PCR를수행함으로써 JevNS5N과 JevNS5C에해당하는 cdna를각각합성하였다. RT-PCR 반응에사용한프라이머는 JevNS5N cdna의경우 B-ns5-F/B-Nns5-R를사용하였으며, JevNS5C cdna의경우 B-Cns5-F/B-ns5-R를사용하였다 (Table 1). 합성된 cdna 단편은 EcoR I과 Xho I 으로처리한후, 같은제한효소로처리된 pgex-4t-1 발현벡터 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 에삽입하였다. 클로닝된 JevNS5N과 JevNS5C cdna는 GST 단백질의 C-말단부위에융합되어 GST fusion protein 형태로발현되도록고안하였다 (Fig. 1). Reverse transcription (RT)-PCR로증폭된부위는최종적으로염기서열분석을통해서삽입된염기서열이기존의 K87P39 분리주와일치함을확인하였다.

3 JEV NS5 Antibody 55 RT-PCR 역전사반응 (reverse transcription reaction) 은 100 U의 Superscript II 역전사효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 를사용하여 20 μl 반응액에서수행하였다. 일반적인반응액의조성은 Superscript II 역전사효소와함께 10 μl의추출된바이러스게놈 RNA, 5 pmol reverse 프라이머, 40 U RNaseOUT (Invitrogen), 0.1 mm dithiothreitol (DTT) 및 10 mm deoxynucleoside triphosphate mix를포함하였다. 역전사반응은 37 에서 1시간동안지속되었으며, 70 에서 15분동안가열함으로써효소를불활화시켰다. 그리고 PCR 반응은 5 U의 Pyrobest DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan) 를사용하여 100 μl 반응액에서수행하였다. PCR 반응액은 Pyrobest DNA polymerase를포함하여 10 mm Tris (ph 8.3), 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, 200 μm dntps 및 0.4 μm forward와 reverse 프라이머로구성하였다. PCR 증폭사이클은 denaturation (94, 30초 ), annealing (60, 30 초 ) 및 polymerization (72, 1분 ) 으로구성하였으며, 총 30 사이클을실시하였다. 단백질발현및정제 pgex/jevns5n과 pgex/jevns5c를각각 E. coli BL-21 competent cell에형질전환 (transformation) 한후, 암피실린이첨가된 LB 플레이트에 37 에서 12시간배양하였다. 각각하나의독립된콜로니를암피실린이첨가된 LB 배양액에서 12시간배양한후, 총 250 ml의배양액에 1:50 으로희석한다음 A 600 흡광도가 0.6~1.0의범위에올때까지 1시간 30분간다시배양하였다. 이후 0.2 mm의 isopropyl-β-thiogalactoside (IPTG) 를첨가하여 4시간동안 GST fusion protein의발현을유도하였다. 재조합단백질을정제하기위해서배양된 E. coli를원심분리하여침전물 (pellet) 을수확한후, 23.5 ml의인산완충용액 (phosphate-buffered saline, PBS) 에재부유시켰다. 부유액에 1% Triton X-100를첨가한후 30분간실온에서방치한다음, 12,000 rpm의속도로 4 에서 20분간원심분리하여상층액을수확하였다. 얻어진상층액으로부터 GST fusion protein은 glutathione sepharose 4-fast flow beads (GE Healthcare) 을사용하여제조사가제공하는지침서에따라서단백질을정제하였다. 정제된단백질은 A 280 흡광도를측정한후 Bradford 단백질정량법으로정량하였다. 정제된단백질은 12% SDS-polyacrylamide gel electro- phoresis (SDS-PAGE) 를통해서분리한다음, coommasie staining 방법으로염색하여원하는단백질의수확량을분석하였다 (23). 항혈청생산 pgex/jevns5n과 pgex/jevns5c 벡터로부터정제된단백질 (GST/JevNS5N과 GST/JevNS5C) 을면역원으로사용하여, SPF BALB/c (4주령) 마우스의복강에총 6차례접종하였다. 1차접종은 500 μl의정제된단백질 (100 μg/ ml) 에 500 μl의 complete Freund adjuvant를섞어서주사하였으며, 2~6차접종은 500 μl의정제된단백질 (100 μg/ ml) 에 500 μl의 incomplete Freund adjuvant를섞어서주사하였다. 1~2차접종은 2주간격으로실시하였으며, 2~6 차접종은 1주간격으로실시하였다. 접종스케줄이끝난후, 그룹별로 3 마리의마우스에서얻어진혈청을혼합하였다. 웨스턴블롯 pgex/jevns5n과 pgex/jevns5c 벡터로부터정제된단백질 (GST/JevNS5N과 GST/JevNS5C) 에존재하는 GST fusion protein을동정하기위해서, 또한본연구에서얻어진 NS5 단백질에대한항혈청을테스트하기위해서웨스턴블롯을실시하였다. GST fusion protein을동정하기위해서는정제된단백질을직접샘플로사용하였으며, 항혈청을분석하기위해서는일본뇌염바이러스에감염된세포 ( 실험군 ) 와감염되지않은세포 ( 대조군 ) 를 sample loading buffer (80mM Tris-HCl [ph 6.8], 2.0% SDS, 10% glycerol, 0.1M DTT, 0.2% bromophenol blue) 로직접용해시켰다. 이렇게얻어진 cell lysate에존재하는단백질은 12% SDS-PAGE로분리한후, 메탄올로전처리된 PVDF membrane (Millipore, Billerica, MA, USA) 에전기영동을통해서이동시켰다. Membrane은 1차항체로써 GST에특이적으로반응하는단클론항체 (AbFrontier, Seoul, Korea) 또는본연구에서얻어진마우스항혈청으로염색한다음, 2차항체로 alkaline phosphatase (AP)-conjugated goat antimouse IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA, USA) 로염색하였다. 1차및 2차항체로염색된 membrane은 AP의기질인 BCIP (5-bromo-4-chloro-3- indolylphosphate)/nbt (nitroblue tetrazolium) 혼합용액으로염색하였다.

4 56 J-M Kim, et al. Table 1. Primers used for PCR amplification in this study Primer Sequence a Polarity Size (mer) B-ns5-F 5'-GATGGATCCGGAAGGCCTGGGGGCAGG-3' Sense 27 B-Nns5-R 5'-ATCCTCGAGCTAGTGGTATGTCCAAGTGCG-3' Antisense 30 B-Cns5-F 5'-GATGGATCCGAGTGTCACACATGTATC-3' Sense 27 B-ns5-R 5'-ATCCTCGAGTTACTAGATGACCCTGTC-3' Antisense 27 a JEV-specific sequences are indicated in boldface types. Restriction recognition sites used for cloning are underlined A bp DNA DNA marker JevNS5N JevNS5C B pgex-4t-1 pgex/jevns5n GST GST JevNS5N Molecular Weights (kda) ~28 ~ pgex/jevns5c GST EcoR I JevNS5C Xho I Figure 1. PCR amplicons of JevNS5N and JevNS5C (A) and schematic presentation of pgex/ JevNS5N and pgex/jevns5c constructs (B). The JEV NS5N and NS5C regions were PCRamplified with an appropriate pair of primers as indicated in the text. The amplicons were separated by 1% agarose gel electrophoresis and stained with ethidium bromide (A). pgex/ JevNS5N and pgex/jevns5c constructs were designed to express the N-terminal region (275 amino acids) and C-terminal region (461 amino acids) of JEV NS5 protein, respectively (B). ~79 결과일본뇌염바이러스 NS5 단백질의 N-말단부위와 C-말단부위를각각발현하는벡터의합성먼저일본뇌염바이러스의 RNA 복제에필수적인 RdRp 인 full-length NS5 단백질을원핵세포발현벡터를사용하여 E. coli에서 GST fusion protein 형태로발현하고자시도하였다. 그러나여러차례의실험결과온전한 NS5 단백질은 E. coli에서발현이거의되지않음을경험하였다 ( 자료미제시 ). 따라서, NS5 단백질을 N-말단부위와 C-말단부위로나누어발현을유도하고자하였다. E. coli 에서재조합단백질을 soluble form으로발현시키고자, DNA strider 프로그램을사용하여 full-length NS5 단백질의 hydropathy 분포도를분석하였다. 이분석결과를토대로 NS5 단백질의 N-말단과 C-말단부위가친수성이높을것으로추정되었으며, 이부위를본실험에사용하였다. 일본뇌염바이러스의한국분리주 K87P39로부터분리된 genomic RNA를주형으로사용하고, Table 1에열거된프라이머를이용하여 NS5 단백질의 N-말단부위에해당하는 JevNS5N ( 프라이머 : B-ns5-F/B-Nns5-R) 과 C-말단부위에해당하는 JevNS5C ( 프라이머 : B-Cns5-F/B-ns5-R) cdna 단편을각각증폭하였다. 총 905개의아미노산으로구성된 NS5 단백질로부터 JevNS5N cdna는 N-말단의 275개아미노산에해당하는부위이며, JevNS5C cdna는 C-말단의 461개아미노산에해당하는부위이다. RT-PCR 증폭결과합성된 cdna 단편의크기를알아보기위해서 1% agarose gel을사용하여전기영동을실시하였으며, ethidium bromide로염색하였다. JevNS5N의경우 ~825 base pair (bp) 의 cdna가증폭되었고, JevNS5C의경우 ~1,383 bp 의 cdna가증폭되었다 (Fig. 1A). 이들의크기는예상한것과일치하였다. 이와같이증폭된 cdna 단편은클로닝을원활하게수행하기위해서인위적으로프라이머의 5' 과 3' 말단에각각삽입한 EcoR I과 Xho I 제한효소를사용하여 E. coli 발현벡터인 pgex-4t-1 에삽입하였다. Fig. 1B에나타낸

JEV NS5 Antibody 57 것과같이삽입된 JevNS5N과 JevNS5C는모두 pgex- 4T-1이인코딩하고있는 GST 단백질의 C-말단부위에융합되도록하였으며, 그결과 pgex/jevns5n과 pgex/ JevNS5C이라고명명된플라스미드를합성하였다.

5 JEV NS5 Antibody 57 것과같이삽입된 JevNS5N과 JevNS5C는모두 pgex- 4T-1이인코딩하고있는 GST 단백질의 C-말단부위에융합되도록하였으며, 그결과 pgex/jevns5n과 pgex/ JevNS5C이라고명명된플라스미드를합성하였다. 삽입한 cdna의염기서열은 RT-PCR 을위해주형으로사용한일본뇌염바이러스 K87P39의염기서열과일치함을확인하였다. GST/JevNS5N 과 GST/JevNS5C 단백질의발현및정제 pgex/jevns5n과 pgex/jevns5c 발현벡터를사용하여 E. coli BL-21 세포에서 GST fusion protein (GST/JevNS5N 과 GST/JevNS5C) 을다량으로발현및정제하고자하였다. 이를위해서각각의발현벡터로형질전환된 BL-21 세포에 IPTG를첨가하여 4시간동안원하는 GST fusion protein의발현을유도하였다. 발현된재조합단백질은 GST column을사용하여정제하였으며, 원하는단백질의 발현여부와수확량을알아보기위해서정제된샘플을 12% SDS-PAGE로분리한후 coommasie staining을수행하였다. pgex/jevns5n 발현벡터로형질전환된 BL-21 세포에서는예상했던것과유사한크기의 GST/JevNS5N (~61 kda) 단백질과함께, 이보다작은크기 ( 예 : ~28-kDa와 ~30-kDa) 의단백질들이다수발현되는것을알수있었다 (Fig. 2, pgex/jevns5n). 단백질의크기를기준으로하면, ~28-kDa 단백질밴드는 GST에해당하며, ~30-kDa 단백질은 GST/JevNS5N의 truncated form이거나또는단백질발현시 internal initiation에의해서발현된것으로추정된다. 또한, pgex/jevns5c 발현벡터로형질전환된 BL-21 세포에서도 pgex/jevns5n의경우와유사한실험결과를얻었다. 즉, GST/JevNS5C (~79-kDa) 의단백질과함께이보다작은크기의여러단백질들이함께발현 Figure 2. Expression of GST/JevNS5N and GST/JevNS5C proteins (coommasie staining). The E. coli. BL-21 cells were transformed with the parental pgex-4t-1 or one of two recombinant plasmids designated pgex/jevns5n and pgex/jevns5c. The expression of the recombinant proteins (GST/JevNS5N and GST/ JevNS5C) was analyzed by 12% SDS-PAGE and coommasie staining. The molecular weight markers in kda were indicated on the left and the sizes of GST, GST/JevNS5N, and GST/JevNS5C were shown on the right. Figure 3. Identification of GST/JevNS5N and GST/JevNS5C proteins (immunoblotting). The parental pgex-4t-1 or one of two recombinants (pgex/jevns5n and pgex/jevns5c) was transformed into E. coli BL-21 cells. Each culture was incubated in the presence of IPTG to induce the GST fusion proteins designated GST/JevNS5N and GST/JevNS5C. Following purification of the recombinant proteins with a glutathione sepharose column, the GST fusion proteins were separated by 12% SDS-PAGE and immunostaining with a GST-specific mouse monoclonal antibody.

6 58 J-M Kim, et al. A Figure 4. Immunoblotting with two mouse antisera raised against GST/JevNS5N and GST/JevNS5C. BHK-21 or Vero cells were mock-infected or infected with JEV K87P39 strain at an MOI of 1. At 20 h post-infection, cells were directly lysed with 1 sample loading buffer and the cell lysates were separated by 12% SDS-PAGE. The NS5 and NS5-related proteins (asterisks) were recognized by two mouse antisera (α-ns5n and α-ns5c) raised against GST/JevNS5N and GST/JevNS5C, respectively. Molecular weight markers (in kda) were shown on the left and the sizes of NS5 and its related proteins were presented on the right. 및정제되는것을알수있었다 (Fig. 2, pgex/jevns5c). 본실험의대조군으로사용한 pgex-4t-1 벡터로형질전환된 BL-21 세포의경우, 대부분 ~28-kDa의 GST 단백질임을알수있었다 (Fig. 2, pgex-4t-1). 다음으로, 이렇게정제된여러개의단백질들이정말로 GST fusion protein인지를알아보기위해서, GST에특이적으로반응하는단클론항체 (anti-gst Mab) 를사용하여웨스턴블롯을수행하였다. Coommasie staining의실험결과와일치하게, pgex/jevns5n과 pgex/jevns5c 발현벡터로형질전환된 BL-21 세포에서각각 ~61 kda의 GST/JevNS5N과 ~79-kDa의 GST/JevNS5C 단백질들이각각탐지되었으며, 두경우모두이보다작은여러개의단백질들이 anti-gst Mab에특이적으로반응하는것을알수있었다 (Fig. 3). 일본뇌염바이러스의 NS5 단백질에특이적으로반응하는항혈청생산 최종적으로, E. coli에서발현된 GST/JevNS5N과 GST/ JevNS5C을면역원으로사용하여, BALB/c 마우스에서항혈청을생산하고자하였다. 먼저정제된단백질의량을 B Bradford 정량법에의해서측정한후, 재료및방법에기술한것과같이한단백질당 3마리의마우스에접종하였다. 6차례의접종스케줄이끝난다음, 마우스의혈액을채취하여각그룹의혈청을풀링함으로써 anti-ns5n antiserum (α-ns5n) 과 anti-ns5c antiserum (α-ns5c) 을확보하였다. 본실험에서얻어진항혈청이일본뇌염바이러스의 NS5 단백질을특이적으로인지하는지를알아보기위해서, 일본뇌염바이러스 K87P39로감염된 BHK-21세포의 cell lysate을사용하여웨스턴블롯을수행하였다. 1 MOI (multiplicity of infection) 의일본뇌염바이러스에감염된 BHK-21 ( 실험군 ) 과감염되지않은 BHK-21 세포 ( 대조군 ) 를바이러스감염후 20시간이경과한다음 sample loading buffer로직접용해함으로써 total cell lysate을확보하였다. 이렇게얻어진샘플을본연구에서확보한 2개의항혈청 (α-ns5n과 α-ns5c) 을사용하여웨스턴블롯을수행하였다. 두항혈청모두일본뇌염바이러스에감염된 BHK-21 세포에서 ~103-kDa 크기의 NS5 단백질이인지되었으며, 이단백질밴드는바이러스가감염되지않은세포에서는탐지되지않았다 (Fig. 4A). 또한, 예상하지않았던여러개의단백질들 (Fig. 4A, 별표 ) 이일본뇌염바이러스가감염된세포에서특이적으로인지되는것을알수있었다. 다음으로, ~103-kDa 크기의 NS5 단백질보다작은크기의여러단백질들이 BHK-21 세포에서만비정상적으로나타나는것인지, 아니면다른감염된세포주에서도관찰되는지를알아보고자일본뇌염바이러스에감수성을나타내는또다른세포주인 Vero 세포를사용하여웨스턴블롯을수행하였다. Fig. 4B에나타낸것과같이, Vero 세포에서도 BHK-21 세포에서관찰된것과같은여러개의단백질들이 α-ns5n과 α-ns5c 항혈청에의해서인지되는것을알수있었다. 그러나, 이들이 BHK-21 세포에서인지된것과동일한단백질인지는알수없다. 그러므로, 본실험을통해서일본뇌염바이러스의 NS5 단백질에특이적으로반응하는마우스항혈청을확보하였으며, 또한일본뇌염바이러스에감염된 2 세포주에서 ~103-kDa 의 NS5 단백질이외에 NS5 단백질과연관된크기가작은다수의바이러스단백질이존재하는것을발견하였다. 앞으로이들에대한추가연구를통해서 NS5 단백질뿐만아니라, 이와연관된단백질들이바이러스의증식에어떠한역할을규명할필요가있다.

7 JEV NS5 Antibody 59 고찰본연구에서일본뇌염바이러스 NS5 단백질의 N-말단부위 (275개아미노산 ) 와 C-말단부위 (461개아미노산 ) 을 GST의 C-말단에결합하여 GST fusion protein 형태로 E. coli에서발현및정제를하였으며, 이들에대한마우스항혈청을각각생산하였다. 이렇게얻어진항혈청은일본뇌염바이러스가감염된세포 (BHK-21과 Vero) 에서 ~103-kDa 크기의 NS5 단백질뿐아니라, 기존에알려지지않았던여러개의 NS5와연관된바이러스단백질들을인지하는것을알수있었다. 본연구결과합성된재조합단백질과항혈청은앞으로일본뇌염바이러스의 NS5 단백질이게놈 RNA 복제뿐아니라, 세포와어떠한상호작용을하는지에대한연구에기여할것으로생각된다. 지금까지보고된연구결과에의하면일본뇌염바이러스를포함한플라비바이러스의 NS5 단백질은 methyltransferase와 RdRp 기능을함께가진다기능단백질이다 (13). 최근에밝혀진 methyltransferase 기능의경우, NS5의 N- 말단부위에위치하고있으며게놈 RNA의 5'-말단에캡구조를첨가하는반응에작용하는것으로알려져있다 (15, 24). Methylation 반응에작용하는주요아미노산을다른잔기로치환시키면바이러스의증식이억제된다는사실이보고된바있으며, 이것은 methyltransferase의기능이바이러스의복제사이클에매우중요한역할을한다는것을의미한다 (24, 25). 특히흥미로운사실은 WNV NS5 단백질에의한 guanine cap의 N-7 methylation 은 WNV의염기서열에특이적으로일어난다는사실이다 (24, 26). 이것은 WNV NS5가바이러스의 5'-말단또는다른부위에있는특정염기서열이나 2차구조를인식하여, 바이러스에특이적으로 methylation 반응에작용한다는것을의미한다. 앞으로일본뇌염바이러스 NS5의 methyltransferase 기능에대한특성을분석 비교함으로써, 이바이러스에대한치료제개발에중요한기초자료를제공할수있을것으로기대한다. NS5 단백질의또다른주요기능은 RdRp이며, 이효소의활성은새롭게합성되는게놈 RNA의중합 (polymerization) 에직접작용한다. 최근 in vitro assay를통해서 DENV NS5의 RdRp가게놈 RNA의어떠한부위를처음으로인지하는지, 어떠한작용기전에의해서 RNA 합성이시작되는지에대한연구결과가보고된바있다 (27~ 29). 이연구결과에따르면, NS5 단백질은게놈 RNA의 5'-말단에있는특정 stem-loop structure를최초로인식하여이부위에결합하는것으로알려져있다. 이후 NS5 단백질은게놈 RNA의 3'-말단에있는또다른 stem-loop structure (3'SL) 로이동한후 RNA 합성을시작하는것으로추정된다. 다른플라비바이러스와는달리, 일본뇌염바이러스의경우지금까지적절한항체와다른실험재료들의결핍으로인해서 NS5 단백질에대한연구가활발하게이루어지지못했다. 본연구에서얻어진일본뇌염바이러스 NS5 단백질에대한항혈청은앞으로바이러스복제시이단백질의역할, 특히 proteolytic processing과관련된기능에대한특성분석에활용될수있을것으로기대한다. 또한앞으로 NS5 단백질의특정부위에대한단클론항체를생산함으로써일본뇌염바이러스와유사한다른플라비바이러스의감별진단등에활용될수있을것으로생각한다. 참고문헌 1) Burke DS, Leake CJ Japanese encephalitis, In Monath TP (ed.), The Arboviruses: Epidemiology and Ecology, vol III, pp.63-92, CRC Press, Florida. 2) Vaughn DW, Hoke CH Jr. The epidemiology of Japanese encephalitis: prospects for prevention. Epidemiol Rev 1992; 14: ) Tsai TF. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: Minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, October Vaccine 2000;18: ) Hashimoto H, Nomoto A, Watanabe K, Mori T, Takezawa T, Arizawa C, Takegami T, Hiramatsu K. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the genome of Japanese encephalitis virus Beijing-1 strain. Virus Genes 1988;1: ) World Health Organization Japanese encephalitis vaccines. Wkly Epidemiol Rec 1998;73: ) Hanna JN, Ritchie SA, Phillips DA, Lee JM, Hills SL, van den Hurk AF, Pyke AT, Johansen CA, Mackenzie JS. Japanese encephalitis in north Queensland, Australia Med J Aust 1999;170: ) Mackenzie JS, Poidinger M, Phillips DA, Johansen CA, Hall RA, Hanna JN, Ritchie SA, Shield J, Graham R Emergence of Japanese encephalitis virus in the Australian region, In Saluzzo J, Dodet B (eds.), Factors in the Emergence

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Cloning Takara 와함께하는 Cloning 2014-11-13 다카라코리아바이오메디칼 목차 Cloning 이란? Cloning Flow Chart Cloning DNA / RNA 추출 High Fidelity PCR 제한효소 /ligation/e.coli 형질전환 Clone 확인 이것만은꼭!!! 2 Cloning 이란? Clone 세포나개체의증식에의해서생긴유전적으로동일한세포군