[ 별지 26 호 ] 최종보고서 - 1 -

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1 [ 별지 26 호 ] 최종보고서 - 1 -

2 ( 뒷면 ) 주 의 (15 포인트고딕계열 ) 6cm 식품용 첨가물 생산 S B Bacteriophage 와 유산균을 이용한 Enterobacter sakazakii 종합 제어법 개발과 안전한 영유아 보안과제 ( ), 일반과제 (O) 과제번호 SB010 ( 앞면 ) ( ) 농림수산식품부

3 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 Bacteriophage 와유산균을이용한 Enterobacter sakazakii 종합제어법 개발과안전한영유아식품용첨가물생산 과제의보고서로제출합니다 년 12 월 19 일 주관연구기관명 : 경원대학교 주관연구책임자 : 박종현 세부연구책임자 : 지근억 연 구 원 : 박명수 연 구 원 : 이영덕 연 구 원 : 박언호 연 구 원 : 김은진 연 구 원 : 류태화 연 구 원 : 김자영 연 구 원 : 이승욱 연 구 원 : 박민수 연 구 원 : 남윤우 - 1 -

4 요약문 Bacteriophage와유산균을이용한 Enterobacter sakazakii 종합제어법개발과안전한영유아식품용첨가물생산하고자본연구를수행하였다. E. sakazakii(cronobacter spp.) 는자연계에존재하는세균으로뇌수막염, 패혈증, 괴사성대장염을유발하는 newly emerging pathogen 으로최근에조제분유, 이유식에오염되어위해성이높은병원성세균이다. 이를제어하여안전한영유아식품을생산하기위하여 C. sakazakii의용균성파지와영유아장내로부터 C. sakazakii에의항균유산균선발하고선발된유산균과용균성파지의복합처리에의한 C. sakazakii의최적의제어법을개발하여안전성이제고된영유아식품을생산하도록한다. 조제분유, 이유식, 선식, 생식, 농수산물, 샐러드등에오염되어있는 C. sakazakii를분리하기위하여일차작인 132개의분리균주중생화학특성, Vitek, PCR등으로최종적으로 112종의 C. sakazkaii를동정하고확보하였다. 분리된 C. sakazakii들은 ampicillin, tetracycline, chlorampenicol에대해서는대체적으로감수성이큰것으로나타났으나, streptomycin의경우에는내성이매우높았다. 건조에대하여는식품에서분리된 90% 이상의 C. sakazkaii 균주는건조에강한저항성을나타내는것으로사료된다. 건조에강한균주는 biofilm의형성능이높은것으로나타났다. 박테리오파지는돼지분변시료로부터 7주, 김치시료로부터 3주, 오수시료로부터 2주를분리하여총 12 용균성파지들을분리하였고다른식중독세균에대해서는 plaque를형성하지 않았다. Host inhibition spectrum 은 112 개의 Cronobacter spp. 분리주들에 19%~58% 숙주 생육저해특성을나타냈다. 분리된용균성파지대부분은 Myoviridae family에속하는것으로확인되었으나, ESSI-3 phage등일부는 Siphoviridae family에속함을알수있었다. EI-I파지등주요한 6개의파지에대한 C. sakazakii에대한생육저해특성을 MOI에따라확인한결과는 0.1일경우 6시간이후에는 C. sakazakii가검출되지않았다. 이들용균성파지 6주를섞어서조제분유에오염된 C. sakazakii에처리한경우대체적으로초기균수들을유지하거나감소효과를나타내는것으로나타났다. 23종의 biofilm 다분비 Cronobacter spp. 의저해효과를분리파지 cocktail을사용하여이균들을 12시간후에현저히사멸시키는효과도확인하였다. Cronobacter spp. 길항성실험결과총 18 분리유산균중 Bifidobacterium animalis BF-8가가장저해력이큰균으로 screening되었으며분리된 4개의용균성파지들을배양배지에혼합하여확인했을경우모두 C. sakazakii가검출되지않았다. 또한우유에 C. sakazakii를접종하여 Bifidobacterium BF-8과용균성파지혼합액에의한생육저해정도를확인했을때도이 - 2 -

5 와유사한결과를확인하였다. 한편열충격에의해 C. sakazakii KYU90으로부터 temperate phage가유도되어나오는것을관찰하였으며, 이러한현상은열처리로 Cronobacter spp. 를제어할수있는흥미로운정보가되겠다. 분리된용균성파지 cocktail을이용해 Phage amplification assay를통한 Cronobacter spp. 의검출을수행하였다. 실험결과적은수의 C. sakazakii가오염되어있을경우용균성파지 cocktail을이용해 Cronobacter spp. 를검출하기위해서는 3시간이상의배양시간이필요할것으로사료되었다. 조제분유, 채소쥬스, 양상추에배양된 C. sakazakii ATCC29544를접종한후파지cocktail을처리한후파지가검출되었다. 분리된용균성파지 cocktail을이용하여 phage amplification assay를수행하여 Cronobacter spp. 의검출할때는초기균수의영향과식품자체가가지고있는성분, ph, inhibitor의존재유무등물성에대한특성을고려하여검출을해야할것으로판단된다. 분리된야생형균주 Cronobacter spp. 를통해용균성파지 cocktail을적용한결과약 2 log CFU/mL 수준까지검출이가능하였으며, 전체적으로실험이수행되는데걸리는시간은약 20 시간미만으로예상되며용균성파지의가장큰장점이자단점인높은숙주특이성때문에매우효과적인검출방법이될것으로사료된다. Cronobacter spp. 에길항성을보이는유산균 16 bifidobacteria를분리하여동정하였고그중에서 B. animalis BF8이가장우수한균으로분리되었다. B. animalis BF8는 bacteriocin-like substance를분비하고있었으며이물질이첨가된조제분유에서의 C.sakazakii의생육저해현상을확인하였다. 이분리균주의산업적활용을위하여 cytotoxicity 를본결과 Hep-2 cell의 MTT 분석의결과특별히독성현상은관찰되지않았다. B.animalis BF8의산업적생산을위한 pilot 생산의경우배양초기의유도기를거쳐약 3시간후부터는대수기에접어들어 13시간만에정체기에도달하였다. 또한이를회수하여동결건조하여생 균수 1.5X10 11 CFU/g 수준의시제품을생산할수있었으며이는상업적생산균주와같은 yield를보이고있어제품화에문제가없는것으로나타났다. 따라서이러한발효생산물을분말화하여시제품을생산할수가있었다. 그러므로본연구를통하여 C. sakazakii collection을완성하였고 C.sakazakii에특이적으로작용하는 bacteriophage를 12주분리하였으며이를이용한 C.sakazakii의 sanitizer로의개발, C.sakazakii의신속검출법으로의활용이가능하겠다. 그리고 C.sakazakii에길항적으로작용하는 B.animalis BF8를분리하였고 bacteriocin-like substance를확인하였으며이를조제분유등의첨가물로활용이가능할것으로사료된다

6 SUMMARY We researched for development of complex control of Enterobacter sakazakii and produce of safety food additives for baby foods such as infant formula. E. sakazakii(cronobacter spp.) is a widespread bacteria newly emerging high hazard pathogen, which causes encephalomeningitis, hematosepsis and necrotic colitis in infant formula and baby food. As a study of method to control and produce of safe infant formula, we selected C. sakazakii virulent bacteriophage and lactic acid bacteria and developed the optimum condition of controlling C. sakazakii and produce safety infant formula using complex handling of lactic acid bacteria and bacteriophage. To identify C. sakazakii from infant formula, baby food, grain powder, raw food, crops and salad, we primary isolated 132 strains from it and final identification of 112 C. sakazakii by checking the biochemical characteristics, Vitek, PCR etc.. General Cronobacter spp. isolates showed high sensitivity at ampicillin, tetracycline, chlorampenicol but it has high resistance at streptomycin. 90% of C. sakazakii isolates had strong resistance at drying and does were also having high biofilm formation ability. We isolated 12 virlulent phages which doesn't formate plaques in other food-borne pathogens, 7 from swine feces sample, 3 from Kimchi, 2 from sewages. Host inhibition spectrum was 19%~58% of 112 Cronobacter spp. isolates and appeared growth impeding characteristic. Most isolated virulent phages belongs to Myovirdae family, but some of these belongs to Siphoviridae family such as ESSI-3 phage. We checked the MOI by effections of EI-I and other major phages about C. sakazakii growth impeding characteristic, when MOI is 0.1, C. sakazakii was not detected after 6hours. We treated 6 mixed major virulent phages in C. sakazakii contaminated infant formula, initial total bacterial count has remained or decreased in principle. When use of phage cocktail at 23 high secretion biofilm C. sakazakii, we checked the markedly decrease after 12hour treatment. Bifidobacterium animalis BF-8 and lactic acid bacteria had the most powerful antimicrobial effects to Cronobacter spp., in 18 lactic acid bacteria isolates and when mixed with 4 virluent phages, C. sakazakii was not detected. Also we checked similar results at application of infant formula. Meanwhile we confirmed the inducement of temperate phage from C. sakazakii KYU90 by heatshock, such being the case we could get interesting information controling Cronobacter spp. using heat treatment

7 We performed detection of Cronobacter spp. by Phage amplification assay using isolated virluent bacteriophage cocktail. We need more than 3hours of incubating time if it has low dose of C. sakazakii in contaminated food. Bacteriophage was shown after treating phage cocktail in infant formula, vegetable juice, cabbage contaminated by C. sakazakii ATCC When detecting Cronobacter spp. using phage amplification assay, we should remind effects of initial bacteria count and food ingredients, ph, inhibitors, food properties. For detection of wild type Cronobacter spp. isolates using phage amplification assay, about 2 log CFU/mL level of C. sakazakii was able to detect and detection time was not more than 20 hours, because of merits and demerits of high host specifics, we think it could be a very effective detection assay. We identified 16 bifidobacteria which has antimicrobial effects at Cronobacter spp. and Bifidobacterium animalis BF-8 lactic acid bacteria was the most outstanding strain of the others. B. animalis BF8 secretes bacteriocin-like substance and we confirmed the growth impeding characteristic of C. sakazakii when added in infant formula. For the use of it in commercial, we checked cytotoxicity by analysing MTT of Hep-2 cell, there was no toxicity phenomenon. For the produce of commercial B. animalis BF8 pilot, it took 3 hours of lag phase, 10 hours of log phase and finally epoch to the stational phase after 13 hours. Also we produce prototype of lyophilization solution which cover CFU/g and this is up proportionately to other commercial lactic acid bacteria, so it has no probs to make it into products. Therefore these micro ferment products could be confricated and produce it to manufactured goods. We have completed Cronobacter spp. collection by this research, and isolated 12 host specific bacteriophages, development uses of it as a sanitizer agent, and use of rapid detection method of C. sakazakii. Also we isolated B. animalis BF8 effects antimicrobial to C. sakazakii and confirmed bacteriocin-like substance, so we could use as an additive in modified milk powder

8 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 9 제 1 절연구개발의필요성 9 1. 연구개발대상기술의경제적 산업적중요성및연구개발의필요성 9 가. Bacteriophage를이용한 E. sakazakii의효율적인제어법개발 9 나. 유산균과 bacteriophage 복합처리를통한 C. sakazakii 제어기술개발 12 제 2 절연구개발목표및범위 연구개발의최종목표및주요범위 과제별 ( 세부 ) 연구개발의목표및내용 연차별연구개발의목표및내용 연구추진일정 19 제 2 장국내외기술개발현황 20 제 1 절국외관련연구현황 20 제 2 절국내관련연구현황 21 제 3 장연구개발수행내용및결과 22 제 1 절 Enterobacter sakazakii(cronobacter spp.) 분리및동정 재료및방법 22 가. 사용균주 22 나. MPN 법에따른정량적검출방법 22 다. VITEK을이용한 C. sakazkaii의동정 24 라. Polymerase chain reaction (PCR) 을이용한 C. sakazkaii 의동정 24 마. 16s rrna sequence를통한 homology 25 바. 건조특성에따른 C. sakazkaii의생리특성 26 사. 건조분말식품내에서의생육특성 26 아. 건조특성에따른 biofilm 형성특성 26 자. 분리된 Cronobacter spp. 의열감수성특성 27 차. Sanitizer를이용한 C. sakazakii 제어농도측정 27 카. 분리된 Cronobacter spp. 의세포독성시험 결과및고찰 31 가. 다양한식품중에일반세균오염도 31 나. VITEK과 PCR에의한 C. sakazkaii의분리, 동정 33 다. 분리된 Cronobacter spp. 의항생제감수성특성 42 라. 건조에따른 C. sakazkaii의특성 44 마. 건조분말식품내에서 C. sakazkaii의생육특성 46 바. C. sakazkaii의 biofilm 특성분석 48 사. 분리된 Cronobacter spp. 의열감수성특성 53 아. Sanitizer를이용한 C. sakazkaii의제어농도측정

9 자. 분리된 Cronobacter spp. 의세포독성시험 58 제 2절 E. sakazakii(conobacter spp.) 용균성파지의분리 재료및방법 60 가. 분리원및용균성파지의분리 60 나. 숙주저해범위분석 60 다. 분리파지의형태학적특성 61 라. 파지 DNA 추출 61 마. 분리된용균성파지에대한 genome sequence 분석 결과및고찰 63 가. C. sakazakii의용균성파지의분리및숙주저해특성 63 나. 분리파지의형태학적특성 70 다. 파지 DNA 추출 73 라. 분리된용균성파지에대한 genome sequence 분석 75 제 3 절. E. sakazakii(cronobacter spp.) 용균성파지를이용한식품적용 재료및방법 81 가. 분리된파지를이용한 C. sakazakii의생육억제 81 나. Bacteriophage를이용한식품중 C. sakazkaii의저감화 81 다. 분리된용균성파지를이용한 biofilm의제어 81 라. Bifidobacterium, 유산균과용균성파지를이용한 C. sakazakii의제어 82 마. C. sakazakii KYU90으로부터 temperae phage의분리및특성분석 결과및고찰 85 가. 분리된파지를이용한 C. sakazakii의생육억제 85 나. Bacteriophage를이용한식품중 C. sakazkaii의저감화 89 다. Bacteriophage를이용한 biofilm의제거효과 94 라. Bifidobacterium spp., 유산균, 용균성파지를이용한 C. sakazakii의제어 101 마. C. sakazakii KYU90으로부터 temperate phage의분리및특성분석 107 제 4 절. Cronobacter spp. 의검출을위한용균성파지의이용 재료및방법 117 가. 분리된용균성파지들의 ferrous ammonium sulfate에의한제거 117 나. Phage amplification assay에의한 C. sakazakii의검출 117 다. 식품에오염된 Cronobacter spp. 의검출 118 라. Cronobacter spp. 분리주를대상으로한식품적용 결과및고찰 119 가. 분리된용균성파지들의 ferrous ammonium sulfate에의한제거 119 나. Phage amplification assay에의한 C. sakazakii의검출 122 다. 식품에오염된 Cronobacter spp. 의검출 125 라. Cronobacter spp. 분리주를대상으로한식품적용 127 제 5 절 C. sakazkaii 길항성유산균및 Bifidobacterium 분리 재료및방법 129 가. 발효식품으로부터유산균의분리 129 나. 발효식품으로부터 Bifidobacterium의분리 129 다. 분리된유산균및 Bifidobacterium에의한 C. sakazkaii의길항작용 130 라. 선발균주의생육특성분석

10 마. Bifidobacterium BF-8의 bacteriocin의정제 134 바. Bifidobacterium BF-8의 cell cytotoxicity 134 사. Pilot 생산 결과및고찰 136 가. 발효식품으로부터유산균의분리 136 나. 발효식품으로부터 Bifidobacterium의분리 139 다. 유산균과 Bifidobacterium의 C. sakazkaii에대한저해효과 149 라. 선발균주의생육특성분석 159 마. Bifidobacterium BF-8의 bacteriocin like substance의분리 174 바. Bifidobacterium BF-8에대한 cell cytotoxicity 176 사. Pilot 생산배양 178 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 181 제 1 절목표달성도 181 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 183 제 1 절실용화 산업화계획 ( 기술실시등 ) 183 제 2 절교육 지도 홍보등기술확산계획등 183 제 3 절. 특허, 품종, 논문등지식재산권확보계획등 183 제 4 절. 추가연구, 타연구에활용계획등 184 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 185 제 1절본연구관련국내외기술수준비교 185 제 2절논문, 특허및시장분석 논문 특허 시장현황 187 가. 국내제품생산및시장현황 : 없음. 187 나. 국외제품생산및시장현황 187 제 7 장참고문헌

11 1. 연구개발대상기술의경제적 산업적중요성및연구개발의필요성 가. Bacteriophage 를이용한 E. sakazakii 의효율적인제어법개발 (1) Enterobacter spp. 가병원에서많이검출되어그중요성이조명받게되었고, Sander등에의해새로운병원성균으로보고되었다. 이세균은원래항균물질에대한저항성이크고새로운이들물질에쉽게저항성을획득하는것으로알려져있다. 이속의세균중에서 Enterobacter aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae, E. sakazakii 가주로병원성을유발하는데, 그중에서도특히 E. sakazakii 는신생아에게치명적인질병을유발시키는균이며, 1980년에새로분류되었다. 최근에는 E. sakazakii를새롭게 Cronobacter spp. 로분류하고 C. sakazakii, C. muytjensii, C. turicensis, C. dublinesis 로나뉘어지고있다. 이세균은치즈, 육류, 야채, 곡물, 허브, 향신료를포함한식품에널리분포되어있으나, 영 유아식품에관련한이세균제어연구는현재국내에서는거의이루어진바없고전세계적으로도매우적은실정이다. (2) 우리나라의모유수유율은직장여성의증가와여성들의몸매관리열풍으로매년큰폭으로감소하여 2002년 6.5% 로, 유럽 75%, 미국 52%, 일본 45% 등선진국모유수유율의절반에도미치지못한다. 90% 가넘는영아 (Infant) 들이오로지영아식품 (Infant formula) 에의존해영양분을섭취하게되므로영아식품에대한주의깊은품질관리및안전성관리가요구되고있다. 최근국내에시판중인조제분유를대상으로 Cronobacter sakazakii의스크리닝및특성을분석한실험결과에따르면조제분유내에 Cronobacter sakazakii 가존재하는것으로밝혀져문제가되고있다. (3) 이세균은자연계에분포하여농축산식품소재에도오염되는데 C. sakazkaii의뇌수막염은뇌수종, 전신마비, 신경계미발달등심한신경학적후유증보이고있으며사망률이 40 80% 라고알려져있다. 괴사성소장결장염을가진신생아들에대한연구에따르면, 환자의 29% 에서공통적으로 C. sakazakii 가발견되었다. 괴사성소장결장염은모유를먹는유아보다조제분유를 - 9 -

12 먹는유아들에게서약 10 배정도높게나타났다. C. sakazakii 감염은성인에서도확인되는데, 발염증환자와요로성패혈증환자등에서발견되었다. (4) 1차생산농축산식품소재에오염된 C. sakazakii는, 특히비열처리되는식품의경우나식품제조과정중교차오염된식품의경우에, 면역력이떨어진영 유아혹은노약자를감염시킬수있다. 따라서이러한식품의미생물안전성에대한세심한노력이기울어져야한다. 조제분유나이유식은비살균공정을거치는대표적인식품으로이세균에의해오염되기쉬우며실제로한국의영 유아식품에의오염도가약20% 에접근하는것으로나타났다. (5) 자연계에많이존재하는 Bacteriophage는 20세기초반에발견된 virus로써특정세균을용균시켜사멸시키는특징을갖고있어관련연구가활발히진행됐었다. 하지만항생제의발견으로인해연구가지지부진해오다가항생제내성세균의출현등의문제로인해항생제대체수단으로다시금활발한연구가진행중에있다. Virus의일종인 bacteriophage는일반적으로용균성생활환 (virulent phage) 과용원성생활환 (temperate phage) 을거치면서증식하게된다. 각각의 bacteriophage 는그특성에따라최근다양한연구분야에응용되어사용되고있다. 대표적으로병원성미생물의치료제로이용되는 phage therapy, 특정 protein또는 antibody를만들어내는 phage display, 병원성미생물의 typing과검출, vaccine 관련연구, bacteriophage 유전자를이용한유용효소의생산등이다. 하지만, bacteriophage의 host immune system과의관계, lysis된병원성미생물의 endotoxin, gene transfer 등에대한문제가남아있으므로안전성에관련된추가적인연구또한진행중에있다. 국외의경우이렇듯다양한분야에적용을위한연구가활발하게진행되고있다. (6) 최근국외에서는 bacteriophage 의특정균주를특이적으로사멸시킬수있는특징을이용하여여러병원성미생물들의예방과치료에적극적으로이용하고있다. 특히미국의경우양계장에서 Salmonella 또는 E. coli O157:H7의 bacteriophage를분무시켜가금류들이섭취하게하여이것들을제거하는효과가나타났으며, 도계장에서도 rinsing 등의처리로저감화를확인하였다 [32~34]. 그리고사람의화상부위에감염된 Pseudomanas aeruginosa를치료하기위해환부에직접 bacteriophage 를처리하여상처가낫게하는보고도있으며, mouse를이용한 in vivo test에서도경구또는복강투여를통한다양한병원성미생물의제거를통한치료효과를나타냈다. 또한미국 FDA에서는 L. monocytogenes 와 E. coli O157:H7의 bacteriophage 를식품첨가물로승인하였다. 이러한연구결과들을볼때국내에서도 bacteriophage를이용해 E. sakazakii의제어에대한연구를수행할필요가있다

13 (7) C. sakazakii 는자연계에널리오염되어있어다양한유기농원료를이용하는영유아용식품에오염되어있을가능성이높으며, 현재영유아용조제분유등의식품제조공정중에정확한오염원을확인하지못하고있다. 따라서농축산물등의원료에 bacteriophage 의처리또는제조공정중에식품가공기계등에 C. sakazakii 의 bacteriophage 를분무또는도포등을통해이들을효과적으로제어할수있을것이다. (8) C. sakazakii 분리방법으로 FDA, Muytjens, Nazarowec- White등의방법그리고 Iversen등의방법이알려져있다. 이들방법은기본적으로장내세균을선택배지에서증균한후에생화학적인방법으로동정하는재래적인방법이다. 이방법은 C. sakazakii로의심되는 yellow pigment 생산집락을선택하여 API20E kit와 ID32E kit(biomerioe, France) 를이용하여 C. sakazakii로동정하는데이때 α-glucosidase의존재유무와 D-sorbitol의자화능이주요동정인자중의하나이다. 그러나이러한동정방법은시간이적어도 7~10 일간의시간이필요하며, 아울러 API20E 와 ID32E의동정결과가서로일치하지않는것이커다란문제이다. 또한이방법으로도분리가되지않는 C. sakazakii가본연구진에의해확인하였다. (9) Bacteriphage 를이용한병원성미생물의검출은짧은시간 (~4hr) 과특이적검출이가능하기때문에해외에서많은연구가진행중에있다. 현재 bacteriophage를이용하여폐, 혈액, 기타조직 sample에서결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) 을검출하는 kit가상용화되어시판중에있다. 그리고, Salmonella, S. aureus, E. coli O157:H7, P. aeruginosa 등의병원성미생물검출과항생제내성균확인에도이용되고있다 [30, 40~41]. 따라서본연구를수행하였을때 C. sakazakii 의 bacteriophage 를이용하여다양한환경 sample로부터보다저비용으로신속하고정확하게정량검출에응용할수있게될것이며, 더나가서는진단 kit의개발을통한경제적효과도창출할수있을것이다. (10) 2002년국제미생물규격위원회 (ICMSF) 는이세균이한정된사람들에게매우위험하며, 급성혹은장기간까지생명을위협한다고보고하였고많은전문가들의의견을수렴하기위하여 FAO/WHO는영 유아용분말식품에대한위해에대한조사를수행하도록권고하고있다 [13]. C. sakazakii 가식품안전측면에서사회의큰관심대상으로부각된것은 2004년 CODEX 식품안전분과위원회에서의영 유아식품의병원성세균에대한자료수집으로부터시작된것으로보인다. 이러한노력들은, 주로모유대신영 유아에게공급되는조제분유등이보다더위생적으로제조되도록하는데주안점을두고있다. 그러나 FAO/WHO 도이세균에대한심각성은인정하지만

14 아직까지현실적인대안이없기때문에영 유아식품에서의 C. sakazakii의권장기준규격을만들지못하고있는실정이다. 그러나 Nestle등의산업체와미국의 NFPA생산자단체등에서집중적으로 C. sakazakii 의제거연구를하고있으므로우리도영 유아에게완전한식품을공급하고우리농식품산업을지키기위하여이세균에대한연구가시급히이루어져야하겠다. (11) 본연구를통해분리된다양한 C. sakazakii bacteriophage 는국외의연구에발맞추어갈수 있는기초적인학술자료로도이용이가능할것이며, 또한이것들은 sanitizing agent 이외에 C. sakazakii 의검출, phage therapy 등여러분야에응용이가능할것이다. 나. 유산균과 bacteriophage 복합처리를통한 C. sakazakii 제어기술개발 (1) C. sakazakii 에감염되면치사율이아주높아급사가이루어지지만감염이오랫동안유지되는경우는이세균을치료할수있는항생제가제한되어있다. 전통적으로이세균을치료하기위하여 ampicillin, gentamycin, chloramphenicol 의복합적인치료로수행하고있으나많은 C. sakazakii 가이같은항생제에내성이있음이확인되고있다 [22]. 따라서감염된이들세균을치료하기위한새로운항생제와치료법이요구되고있다. 아울러 C. sakazakii 세균의생육을저해시키는유산균을개발하여 C.sakazakii 의생육을저해시킬수가있을것이며, 아주적은숫자가감염되더라도이들세균의증식을저해하므로 infective dose에이루지못하게할수있다. (2) 박테리오신은미생물이생산하는항균성단백질 (antimicrobial polypeptide) 로서단백질이므로인체내의단백가수분해효소에의해분해되어인체내에축적되지않으며또한인체에매우안전하고, 항균범주가다양하여응용목적에따른조합적용 (combinatorial application) 이가능하다. 또한단백질이므로그유전자의조작에의해산업적수요에합당한분자특성및생산특성으로의전환이매우용이할뿐만아니라그생산균이주로젖산균등기존식품의주요발효균으로서균자체도인체에안전한 GRAS(Generally Regarded As Safe) 균으로분류되어인간환경에의적용이용이하다. 그러나이러한박테리오신이 C. sakazakii를제어할수있다는것에대한가능성에대해서는그가능성만논의되었을뿐현재까지구체적인성과가보고된연구결과가없다. (3) Bifidobacterium 의경구투여시병원성미생물에의한감염성질환의강도와기간

15 을줄여주는연구가많이보고되고있다. 인간의장에는 1 kg 의세균이상존하고 있는데 출생직후에는비피더스균이최우세균총을차지하고있지만이유기를지나면서비피더스가 줄고유해균들이증가하게되면서외부감염에대한저항이약해지고질병이발병한다. 비피 더스는로타바이러스와기타장질환을일으키는병원성세균의감염장소인장에서주요균 총을형성하고있으며다양한생리활성을가지는것으로밝혀졌다. (4) 이러한생리활성유산균은인체에자연적으로존재하므로항생제나백신보다안전하고효과적인대안이될수있다. 현재까지밝혀진항균기작은 / 병원균과의장표면에부착에대한경쟁 / 병원균에대한항균물질생산 / 기주의면역능증진 / 기주의장관침투성감소등인것으로알려지고있다. 항균활성이나생리활성은균주개체의특성인것으로알려져있으므로우수한균주의선발이필수적이다. (5) 영유아장내에서 screening 된신균주및박테리오신신물질은우선적으로는영유아식품에첨가물로사용가능하고, 타식품의원료로사용될수도있을것이다. 또한 bacteriophage와복합처리를통해 C. sakazakii의제어를위한최적에방법을개발하여식품제조공정등에적용하여보다안전한식품을만들수있을것이다. (6) 본연구팀은다년간의장내유산균연구를통하여 300여종의인체유래비피더스균주에대한라이브러리를확보하였고이미 년도 [ 보건의료기술연구개발사업 ] 을통하여항로타바이러스활성이우수한균주를선발하여활성단백질을찾아내고이비피더스균을적용한유아용정장제품을성공적으로개발하여상용화하였다. 아울러절대혐기성세균인비피더스의발현시스템에대한기반기술도확보한상태이다 ( 미국특허등록 ). (7) 박테리오신활성이우수한균주와박테리오신생산및제품화를위해서많은연구가수행된다. 본세부과제의최종연구개발목표는박테리오신발효의 fermentor 배양적성규명, 발효액의틴달화공법도입, 박테리오신의농축및분리, 분체화공정의조합에의하여신규기능성정장제품을개발하고대량생산체제를구축하는것에있으며, 이를위해서는광범위한항균영역및강력한항균활성을보유한항균물질을생산하는다양한유산균주의개발, 개발균주의발효공정확보, 발효산물인박테리오신의분리농축및건조분체화공정개발이요구된다

16 (8) 따라서본연구를통해분리된유산균과박테리오신을이용하여 bacteriophage 와의복합처리조건개발을위해서유산균의배양환경, 배지조성, 박테리오신의농도, bacteriophage 의처리량, 시간등을최적화하여 C. sakazakii 의제어하며, 또한식품공장의생산라인에적용하여이세균들의오염을최소화할수있을것으로예상된다. (9) 유산균은다양한유기산과항균물질등을생산하고, 과거부터현재까지식품발효, sanitizing agent 등다양한분야에응용되어사용되고있다. 본연구진이보유하고있는독보적인유산균응용기술을이용하여생산된보다좋은유산균들과항균물질들을최근해외에서활발하게연구중인 bacteriophage와복합처리에따른확실한 synergy 효과가입증될경우여러식품산업에응용될수있을것으로보이며, 보다안전한식품생산에이바지할수있을것으로사료된다

17 제 2 절연구개발목표및범위 1. 연구개발의최종목표및주요범위 Cronobacter sakazakii 는자연계에존재하는세균으로뇌수막염, 패혈증, 괴사성대장염을유발하는 newly emerging pathogen 으로최근에많은관심이집중되고있는관심세균이다. 감염치사율이매우높은이세균은주로영 유아에게일어나며치료가되더라도신경계통의발달이저해되는심각한휴유증을보인다. 주전염원은조제분유, 이유식이기때문에이들의관리가필수적이나이식품으로부터 C, sakazakii 를생물학적, 화학적으로제어할수있는기술과제품은개발되어있지않다. 이를위하여아래와같은세부목적을달성하고자한다. C. sakazakii의 bacteriophage를분리및특성분석 영유아장내유산균으로부터 C. sakazakii에의항균유산균과항균물질선발 선발된유산균, 항균물질과 bacteriophage의복합처리를통한 C. sakazakii의제어 Sanitizing agent와신속편이검출에의 bacteriophage의이용 C. sakazakii의 bacteriophage를이용한고감도신속분석법개발 길항유산균의고농도균체생산과항균물질발효 영유아식품용첨가물생산과식품생산환경등에활용

18 2. 과제별 ( 세부 ) 연구개발의목표및내용 구분연도연구개발의목표연구개발의내용 1 차년도 차년도 2009 C. sakazakii의생리특성과 C. sakazakii에유효한 bacteriophage 분리 / 특성분석 ( 세부 ) Bacteriophage와 항균물질생산영유아유산균균유산균선발 주의선발 ( 협동 ) 분리된 C. sakazakii phage를이용한 선발 Bacteriophage와 C. sakazakii 신속검출법 확립과 유산균의특성분석, sanitizing agent로의효능평가 ( 세부 ) 산업적생산 선발된유산균과항균물질의대량 생산및식품첨가물로의활용 ( 협동 )

19 3. 연차별연구개발의목표및내용 구분 1 차년도 세부과제별 연구개발의목표 연구개발의내용 배양법에의한 C. sakazakii 의분리, 동정 고 - α-glucosidase (+) 균과 sucrose 당자화성을이용하 yellow pigment 특성, 장내세균선택배지와 API kit 를사용하여분리, 동정. 분리균주의 molecular genotyping - C.sakazakii 와의생리적인특성분석을위하여 RAPD-PCR, RFLP 등의기법을이용 C. sakazakii phage 분리 - 동물분변, 장내용물, 폐수, 토양등의다양한환경 샘플이용 C. sakazakii의생리 분리된 bacteriophage 의형태학적, 분자생물학적특성 ( 세부 ) 특성과 bacteriophage 분석분리및특성분석 - TEM, Restriction pattern, sequencing ( 협동 ) 항생물질생산장내 유산균균주의선발 - MOI, EOP, 다양한조건에서의생존능확인 분리된 bacteriophage 의생리적특성분석 - 외부환경조건등에의한특성 분리균주의생리특성분석 - 분리균주와균 Library 로건조내성, 열안정성, 항생 제내성특성등파악 Biofilm 생성특성과환경스트레스의관련성 - 원료전처리, 식품공장작업표면오염환경에서 biofilm 형성에대한영향평가 C. sakazakii 에대한항균활성을가지는장내유산균, 비피 더스균개발 영유아장내로부터유산균분리 - 영유아장내유래의비피더스, 락토바실러스유산 균의분리와균 library 구축 C.sakazakii 에대한길항성과항균 spectrum 분석 - C.sakazakii 에대한길항성을 agar diffusion 법으 로일차선발하고장내세균항균 spectrum 분석 선발균주에대한미생물학적특성분석 - 항균물질분비선발유산균의균동정, 배양학적 분비능분석 항균활성물질 (bacteriocin) 에대한생화학적특성 규명 - 단백질성박테리오신생산확인및특성조사

20 2 차년도 ( 세부 ) 분리된여러종류의 bacteriophage의 virucidal agent에의한효과 - ammonium compound 등의화학처리제를이용한 bacteriophage의제거효과확인 C. sakazakii의신속검출을위한 bacteriophage 이용 - 다양한식품에서분리된여러종류의 C. 분리된 C. sakazakii sakazakii의 bacteriophage 특이성확인 phage를이용한 C. 신속검출법이용을위한실제식품에적용 sakazakii 신속검출법 - PCR, 생화학검사등의기존검출방법들과의비교확립및 sanitizing - 주요한오염식품인조제분유등에적용하여검출 agent로의효능평가한계및특이성확인 분리한 bacteriophage 의 sanitizing agent로서의효능평가 - 건조등의내성이큰 C.sakazakii 와 biofilm 형성능이큰 C.sakazakii의 bacteriophage 처리를통한저감화 유산균과항균물질, bacteriophage의복합처리를통한최적의 C. sakazakii의제어법개발 - 유산균의배양조건, 항균물질의농도, bacteriophage 의처리량등의조건확립 항균활성물질을대량으로생산할수있는공정 개발 ( 협동 ) 선발된유산균과항균 물질의대량생산 선발균주의고농도배양조건확립 - 박테리오신생산유산균의발효공정최적화 - 박테리오신생산유산균및박테리오신의회수공정개발 항균물질고생산조건확립 - 균종별동결보호제및회수조건개발 - 박테리오신의분리, 농축공정개발 - 발효액의건조분체화공정개발 - 제품화공정및제품의 formulation 개발 in vitro 안전성평가 - 장내유래의 cell line을통하여개발된유산균과항균물질의독성검사

21 4. 연구추진일정 세부과제및주요내용 연도 2008 년 (1 차년도 ) 2009 년 (2 차년도 ) 년 (3 차년도 ) 비고 C.sakazakii virulent bacteriophage 선발과제품화 -C. sakazakii 의생리특성분석과 bacteriophage 분리 - Bacteriophage 특성분석 - C.sakazakii 의건조내성특성 분석과 biolfilm 형성분석 - Bacteriophage sanitizing agent 개발 - Bacteriophage 에의한신속편이검출법개발 C.sakazakii 길항성유산균분리 및제품화 - 길항성유산균분리및특성분석 - 항균물질생산균분리 - 고농도균체생산기술개발 - 선발균주의 In vitro cell line toxicity 분석 - 유산균첨가물생산식품소재화

22 구분연구항목연구내용 C. sakazakii 역학조사 C.sakazakii 분리 동정방법 C. sakazakii 병원성 1961 년최초로보고된후현재까지전세계적으로약 68 편의논문이보고되어있는데대부분이세균은뇌수막염, 패혈증, 괴사성장염을유발한다는것들임. 특히영 유아에게는치명적인증상으로나타나고있음. 이균의특성을연구하기위한분리 동정은미국 FDA, Muytjens et al.(1988), Nazarowec-White (1997), Carol Iversen et al. (2003) 등의방법이있음. 그러나이들방법은주로선택배양후생화학적방법에의한동정임. 따라서분리 동정하는시간이많이소요되고 false-negative, 혹은 false-positive 동정이이루어지는경우가많음. RAPD 분석에의한분리동정연구가발표되어있으나종간의 differential identification 은아직문제가있음. 매우한정된연구만이있음. 캐나다의 Farber 그룹과영국의 Forsythe 그룹이연구를하고있으나현재까지는 enterotoxin 이관여하며 motility 와 capsule 이중요하다고알려져있음. 선행연구 E. sakazakii 오염현황 영국, 덴마크, 미국, 캐나다등의조제분유와이유식등에대한연구가있으나, 이들식품에사용되는소재농산물에대한연구는아주적은숫자에지나지않음. C. sakazakii 안전성확보연구 균제거연구는현재이루어지고있으며영 유아식품의경우환원시킬때의물의온도에따른연구가거의유일함. 현재세계각국에서이세균을영 유아식품에서저감화시키고자하는연구를집중적으로하고있음. Bcateriopha ge 분리및 특성 현재서구선진국을중심으로많은종류의 bacteriophage 분리와특성에대한연구가진행되어왔고, 진행중에있음. 또한 bacteriophage만을전문적으로연구하는기관이따로있음. 그리고여러유전자의기능과특성에대한연구도활발하게진행중임. Bcateriopha 양계또는도계장에서닭에섭취시키거나, 표면수세, 침지등으로 ge의병원성미생물을저감화시키는효과를확인하였음. 그리고식품생위생처리제로산라인에적용하고자함. 또한미국 FDA에서는 L. monocytogene, 의이용 E. coli O157:H7의 bacteriophage를식품첨가물로승인하였음

23 구분연구항목연구내용 C. sakazakii 역학조사 C.sakazakii 에의한국내에서의감염확인은아직까지보고된 바가없음. C. sakazakii 분리 동정방법 광안리오수처리장에서분리된 Extended-spectrum β -lactamase (ESBL) klebsiella 와 enterobacter 의유형, 색소환원법에의한시유의 2 차오염검출을위한그람음성세균선택성배지, 식수에서분리한대장균군의생화학적성상에의한균종별분포등이보고되어있으나 E.sakazakii 만을대상으로하는분리 동정연구는거의없음. C sakazakii 병원성 한국이유식에서분리한 C. sakazakii 가 complimentmediated cytotoxicity 에생존하고 CaCO2 cell 에부착하였고, 이때 motility 가중요한 virulence factor 임을확인함. 국내연구실적 C. sakazakii 오염현황 C. sakazakii 안전성확보연구 국내의농수식품소재와영 유아식품의 268 개의시료로부터 20 균주의 E.sakazakii 를분리하였음. C sakazakii 를불활성화시키고자하는연구로표준균주의열안 전성분석과분리균주의 D-value 비교분석과환원유아식의안 전성분석등이있음. Bcateriophage 분리및특성 과거에는 Lactic acid bacteria의 bacteriophage, temperate bacteriophage와관련된연구였으며, virulent bacteriophage의분리및특성분석에대한연구가진행중. Bcateriophage 의 위생처리제로의 이용 국내의 bacteriophage 를이용한식품등의위생처리제에 대한연구는없음

24 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절 Enterobacter sakazakii(cronobacter spp.) 분리및동정 1. 재료및방법 가. 사용균주 전국유통중인조제분유, 이유식, 생식, 선식, 샐러드등비가열섭취식품시료를온, 오프라인상에서구입하여일반세균수와 Cronobacter spp. 의오염을분석하였다. 사용된조제분유 102종과이유식 9종생식 86종, 선식 86종샐러드 15종, cereal 50종, 과일 41종, 해조류 24종이다. 생화학적, 생리학적특성을비교하기위해공시균주인 C. muytjensii ATCC 와 C. sakakzakii ATCC 29544를사용하였다. 나. MPN 법에따른정량적검출방법 US FDA에서권고한조제분유에서의 C. sakzakii MPN 정량검출법에준하여실험하였으며각 3개씩의1, 10, 100g의검체에 9, 90, 900mL의 BPW (buffered pepton water, Difco Lab, MI, USA) 를가하여균질화하고 37 24시간배양한후각 10 ml의검액에 90 ml의 EE(Enterobacter sakazakii enrichment broth mossel, Difco Lab, MI, USA) broth를가하여 37 24시간배양한후 5장의 violet red bile glucose agar(vrbga, Oxoid Ltd., Hampshire, England) 에도말하여자주색환을띄는집락을선별하여 tryptic soy agar(tsa) 에서 시간배양했을때황색의집락을띄며 chromogenic Enterobacter sakazakii agar (DFI, Oxoid Ltd., Hampshire, England) 에서 37 24시간배양했을때청록색의환을띄는집락을계수하여 Index2 의 MPN 법으로 C. sakazkaii를정량하였고 API 20E kit(biomerieux SA, Etoile, France), ID32 kit (biomerieux SA, Etoile, France) 를수행하였다. C. sakazkaii ATCC 29544를 positive control organism으로사용하였다

25 3 1 g 3 10 g g <Pre-enrichment> 1:10 dilution in Bufferd Peptone Water <Enrichment> 10 ml into 90 ml EE broth VRBG agar DFI agar Overnight incubation at 37 Direct spreading method: 0.1 ml Direct streaking method: loopful(10 μl) Direct pour plate (1 ml) <Selection> Five characteristic colonies TSA 25, hr Yellow colonies <Identification> API 20E biochemical profile ID 32E biochemical profile Oxidase test PCR & VITEC (our method) 16s rrna sequence Fig. 1. Isolation and Identification of C. sakazkaii (FDA method and Carol Iversen et al., 2003)

26 다. VITEK 을이용한 C. sakazkaii 의동정 최종생화학적확인은자동미생물동정기 (Automatic Microbial Identification system, VITEC) (biomerieux SA, Etoile, France) 를이용하여측정하였다. 분리된야생균주를두개의 C. sakazkaii 표준균주와비교하면서 Murray 등의저서 Manual of Clinical Microbiology. 7 th edition, 에수록되어있는 "Biochemical reaction of the named species, biogroups, and enteric groups of the family Enterobacteriaceae" 와그생리적특성을비교하였다 (49). 생리특성을비교하기위해 VITEC을수행하였는데 37 배양기에서 TSA에배양시킨 C. sakazkaii young cell을멸균생리식염수에 (0.85% NaCl saline) 현탁시켜 MacFaland 2(bioMerieux SA, Etoile, France) 로맞춘후 GNI+ card(biomerieux SA, Etoile, France) 에접종시켜 VITEC 기계에 setting시켜동정이빠른순서대로결과를얻었다. VITEC 수행으로얻을수있는 glucose fermentation in 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenylether, D-glucose in acid, 35% growth, actetate utilization, esculin hydrolysis, β-d-glucoside, urea hydrolysis, citrate, indol production, groth in polymyxin B, lactose fermentation, maltose fermentation, D-mannitol fermentation, D-xylose fermentation, raffinose fermentation, D-sorbitol fermentation, sucrose fermentation, myo-inositol fermentation, adonitol fermentation, glucose fermentation in p-coumaric, hydrogen sulfide, ONPG test, L-ramnose fermentation, L-arabinose fermentation, D-glucose gas formation, arginine dihydrilase, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase,oxidase test 결과로 30가지생화학적특성이외에 TSA상에서 C. sakazka i의 DNA-DNA hybridization의여부를판단하는 yellow pigment 형성여부와 α-glucosidase activity를측정하기위해 5-bromo-4-chloro-3-indolyl pospahte 와 D-glucopyranoside가함유된 DFI 상에서의색형성을확인하였다. 라. Polymerase chain reaction (PCR) 을이용한 C. sakazkaii 의동정 C. sakazkaii의분자생물학적동정을위해세쌍의 primer 이용하여표준균주와동일한위치의 amplicon을형성하는지확인하였다. TSA (Difco, Bercon, Dickinson and Company, Sparks, USA) 에획선도말한 C. sakazkaii를 37 에서 18시간배양하였다. 배양된 C. sakazkaii를일백금이취하여 1 ml의멸균증류수에현탁한후 10,000 rpm에서 5분간원심침 전하고멸균증류수로 2 회세척한다음, Accuprep genomic DNA extraction kit (Bioneer, Daejon, Korea) 로 genomic DNA 를정제하였다. 정제된 DNA 중 2 μl 를취하여 template

27 DNA로사용하였다. 2.5 U Tag DNA polymerase, 250 μm의 dntp, 10 mm Tris-HCl (ph 9.0), 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2 에 template DNA를첨가하였으며 total reaction volume 20 μl로하여 Gene cycler (Bio-Rad Laboratories. Hercules. CA, USA) 를이용하여 PCR을수행하였다. 사용한 primer는 ompa gene을 target으로하는 primer ompa-1(5 -GGATTTAACCGTTTCC-3 ), ompa-2 (5 -CGCCAGCGATGT TAGAAGA-3 ) 와 16S rrna gene을 target으로하는 Saka-1 (5 -ACAGGGAGCCAGCTTGCTGC-3 ), Saka-2a(5 -TGCTGCGGTTATT AACCAC-3 ) 와 trna-glu와 23S rrna의 intergenic spacer 를 target으로하는 F S F o r ( 5 - A T C T C A A A A M T G A C T G T A A A G T C A C G T T - 3 ), EsRevB(5 -CCGAARAAGTMTTCGKGCTGC-3 ) 를이용하였다. Primer set의 amplicon size는각각 469, 406, 158 bp 였다. PCR cycle로 ompa gene target은 94, 2분간 predenaturation하고 94 15초 denaturation, 60 15초 annealing, 72 30초 extension을 30회반복한다음마지막으로 72, 5분동안 cooling 시켰다. 16S rrna gene target은 9 5, 4분간 predenaturation하고 95 50초, 52 50초, 72 50초를 30회반복한후 72, 4분동안 cooling 시켰다. trna-glu and 23S rrna의 intergenic spacer target은 95, 10 분간 predenaturation 하고 초, 초, 초를 46 회반복한후 40, 30 초 동안 cooling 시켰다 (Table 2). PCR amplicon은 0.5 μg/ml ethidium bromide를포함하는 1% agarose를 0.5 TAE (Tris-acetate EDTAm, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 완충용액에서 100 V/cm로전기영동한후, UV transilluminator (Seolinbiotech, Suwon, Korea) 에서결과를확인하였다. 마. 16s rrna sequence 를통한 homology C. sakazkaii의 16S rrna를 PCR을수행하여 Amplification 한후 PCR Purification Kit(biobeer, taejon, Korea) 으로정제한후 16S rrna sequencing에사용하였다. Sequencing 은 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Biosystems, CA, USA) 와 ABI 3700 sequencer (Biosystems, CA, USA) 에의해수행하였다. 16S rrna sequence의 homologus의분석은 national Center for Biotechnology Information (ftp://ncbi.nlm.nih.gov) 의 BLAST search program을이용하여 DNA database와비교하였으며 phylogenic tree를이용해각각의유사성을확인하였다

28 바. 건조특성에따른 C. sakazkaii 의생리특성 공시균주인 C. muytjensii ATCC 51329과 C. sakazkaii ATCC 2949를포함하여 119개의건조분말식품유래야생균주를대상시험균주로정하였다. 배양액은각균주를 10 ml의 TSB에서 37 24시간동안전배양시켜각균주를 7 log CFU/mL의수준으로초기균수를조정하였다. 7x7 cm 2 의 stainless steel에 20 μl를떨어뜨린후 25, 상대습도 75% 의항온항습인큐베이터 (Daehan scientific, Korea) 에서건조시킨후 0, 4, 8, 24, 48시간째에 50 μl멸균 D.W 로 20회씩 2회 pippeting 하여건조된 bacteria를회수하여 TSA에도말한후 37 에서 24시간동안회복및배양을하여형성된집락을계수하였다. Stainless steel 상에서 8시간째에 1 log CFU/mL 이하의생균수를보인균주를 dry sensitive group, 3 log CFU/mL 이상의생균수를보인균주를 dry tolerant group, 그사이의균주를 intermediate로정하여대표적 3균주씩선정하였다. 10 ml의 TSB에서 37 24시간동안전배양시킨균주를 7 log CFU/mL로조정하여 12-well culture plate의각 well에 200 μl씩접종하여상온에서방치하면서건조시켰다. 건조시간은 0, 6, 12, 24시간과그후 15일까지건조시켰으며각시간별로각각의 well에 200 μl의멸균 D.W로 pippeting하여회수된 bacteria액에서 100 μl를취해 TSA에도말한후 37 에서 24시간동안회복및배양을하여형성된집락을계수하여각그룹간평균과표준편차를계산하여표기하였다. 사. 건조분말식품내에서의생육특성 C. muytjensii ATCC 51329와 C. sakazkaii ATCC 2949를포함한 112개의야생균주를대상으로 C. sakazkaii가검출되지않은조제분유 10 g에시료에 spiking 하여 30일동안저장하였다. 사용된균주는 10 ml의 TSB에서 37 24시간동안전배양시킨균주를최종생균수가 5-6 log CFU/mL의수준이되도록희석한후 100 μl를조제분유에분주하여뭉치지않게고루섞은후실온에서저장하여초기생균수와 30일후의생균수변화를측정하였다. 아. 건조특성에따른 biofilm 형성특성 대상균주로는건조특성에따른 C. sakazkaii 의분류에서분류된 tolerant group 과 sensitive group 의대표적세균주씩을시험균주로하였다. Biofilm 측정방법으로는 의 crystal violet 의 OD 를측정하는 12-well plastic plate 법을이용하여측정하였고각그룹간평균과

29 표준편차를계산하여표기하였다. 자. 분리된 Cronobacter spp. 의열감수성특성 공시균주인 C. muytjensii ATCC 51329과 C. sakazakii ATCC 29544와 Cronobacter spp. 분리주를대상으로해서, 7 7 cm 2 의스텐인레스스틸에 20 μl를떨어뜨린후 25, 상대습도 75% 의항온항습인큐베이터에서건조시킨후 0, 4, 8, 24, 48시간째에 50 μl D.W. 로 20 회씩 2회 pippeting 하여건조된균체를회수하여 TSA에도말한후 37 에서 24시간동안회복및배양을하여형성된집락을계수하였다. 사멸정도에따라건조민감, 건조내성, 중간그룹으로분류하였다. 공시균주를포함한 112개의 Cronobacter spp. 를건조특성에따라세그룹으로나누어 10 ml의 TSB에서 37 24시간동안전배양시킨균주를최종생균수가 7 log CFU/mL의수준이되도록희석하였다. 각각 1 ml씩 1.5 ml tube에나누어담은후 60 항온수조에서 5분간 incubation시킨후 4 ice bath로냉각시킨후 100 μl를취해 TSA에도말한후 37 에서 24시간동안회복및배양을하여형성된집락을계수하였으며초기균수와의차이를 log로표기하였으며각그룹간평균과표준편차를계산하여표기하였다. 차. Sanitizer 를이용한 C. sakazakii 제어농도측정 건조내성에대한분류에따라시험균주로 dry tolerant, sensitive C. sakzakii 를대표적으로 3 균주씩선별하여 TSB 에서 37, 24 시간동안전배양한후 2 차계대하여사용하였다. 살균소 독력시험에사용된 sanitizer 로 살균소독제유효성분중실제제품수와사용량이가장많은 것으로알려진차아염소산나트륨 (Sodium hypochlorite) 과염화벤잘코늄 (Benzalkonium chloride) 를이용하였다. 살균소독력시험법에대한간략한모식도는 Fig. 2와같다. 사용된희석액은 Trypton, pancreatic digest of casein(sigma-aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 1 g과 8.5 g NaCl을증류수 1 L에녹인후멸균하여사용하였다. 중화제는 polysorbate 80(Fulka chemie, Swizerland) 30 g과 lecithin(sigma-aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 를희석액에가하여 1L로만든용액을사용하였으며경수로 A용액 (MgCl 2, g과 CaCl g을증류수 1 L에용해 ) 3 ml과 B용액 (NaHCO g을증류수 1 L에용해 ) 8 ml 을 989 ml의증류수와혼합한뒤 pore size 0.45 μm membrane filter로여과하여사용하였다. 간섭물질로 albumin(sigma-aldrich Co., St. Louis, Mo, USA) 용액 ( 청정조건 : 3 g/l, 오염조건 30 g/l) 을여과멸균하여사용하였다. 시험중모든시약, 시험균, 시험액은항온수조에

30 서 20±1 로유지하였다. 살균소독력시험은간섭물질 1 ml를멸균시험관에넣고시험균현탁액 1 ml를첨가하여혼합하고 20±1 에서 2 min±10 sec동안방치한후 8 ml의시험용액을첨가하여 20±1 에서 5 min±10 sec 동안반응시켰다. 이액 1 ml를중화제 8 ml 와물 1 ml가들어있는멸균시험관에첨가하고 20±1 에서 5 min±10 sec 동안중화시켰다. 이중화반응혼합액 1 ml씩을 2개의 petridish(spl, Korea) 에각각넣고 TSA를 12~13 ml씩분주하여잘섞은후 36±1 에서 24시간배양하여발생한집락수로부터살균소독력을계산하였다. 시험검증법으로시험조건검증시험, 중화제독성검증시험, 희석중화검증시험은 Fig. 2와같은방법으로수행하였다. 또한살균소독력평가를위한시험균주로 Gram(-) 와 Gram(+) 를대표하는 Escherichia coli O157:H7 NCTC 1949와 Staphylococcus aureus ATCC 12103을사용하였다

31 Fig. 2. Test and validation procedure for bactericidal suspension test

32 카. 분리된 Cronobacter spp. 의세포독성시험 분리된 Cronobacter spp. 에대한세포독성실험을수행하기위해 Hep-2 cell line을사용하여수행하였다. 분리된 Cronobacter spp. 들을 TSB에서 37 에서 18시간배양한후 PBS buffer를이용 3회수세한후다시 PBS buffer에현탁하여약 10 4 Hep-2 cell/well에약 6 log CFU/mL 수준으로접종하였다. 그리고 5% CO 2 incubator에서배양하면서 1시간과 3시간이후에 Hep-2 cell 에대한 viability를 trypan blue 염색을수행한후개수하여비교하였다

33 2. 결과및고찰 가. 다양한식품중에일반세균오염도 본연구를위해사용된조제분유, 이유식, 선식, 생식, 농수산물, 샐러드들에오염되어있는일반세균수를수행한결과조제분유의경우는약 3 log CFU/g 미만이었으며, 이유식은약 3 log CFU/g, 선식과생식은약 4 log CFU/g, 과일, 곡류, 해조류, 야채류등은약 5~6 log CFU/g, 샐러드는약 5 log CFU/g 수준으로오염되어있는것으로확인되었다 (Fig. 3). 이는원재료의특성이나특정제품을생산하는데있어서가공공정에차이에따라상이하게나타나는것으로판단된다. 조제분유와이유식의경우 3 log CFU/g 미만으로낮은수준으로오염되어있었으나, 다른원재료들인농산물은오염도가높은것으로나타나원재료에대한보다 GAP 등을통한철저한관리가필요할것으로보인다. 또한생식과선식의미생물을제어할수있는열처리등의가공공정이없거나적기때문에원재료의미생물학적관리를통해최종산물이미생물학적으로보다안전한제품이생산될수있을것으로사료된다

34 Fig. 3. Total aerobic bacteria in various foods

35 나. VITEK 과 PCR 에의한 C. sakazkaii 의분리, 동정 C. sakazakii ATCC 29544, C. muytjensii ATCC 두표준균주를대조군으로다양한식품에서 Cronobacter spp. 를분리하였다. 분리법은 U.S. FDA에서규정한 C. sakazakii isolation법에준하여 C. sakazakii 야생균주를분리하였으며 PCR로 C. sakazakii specific gene을갖고있음을확인하였다. 보유균주를포함한 132개의 C. sakazkaii 확정또는의심 bacteria를최종적으로생화학특성을알아보기위해자동미생물동정기, VITEC을수행하였다. 그결과총 124개의 C. sakazakii중 99% 유사성 70균주 98% 유사성 27균주, 97% 유사성 5균주, 96% 유사성 17균주로나타났다. 유사성 99% 의분리균이약 56% 로가장많이분리되었고유사성 95% 미만의다섯균주와 Klebsiella pneumoniae, 2균주, Shigella dysenteria 2균주, Enterobacter cloacae 4균주가확이되었다. 또한 124개분리균중 C. sakazkaii와유사성 95% 이상의균주 119개임을확인하였다 (Table 1)

36 Table 1. VITEK (Automatic Microbial Identification System) result of C. sakazkaii-like isolates Organism Isolates number C. sakazakii 99% 70 C. sakazakii 98% 27 C. sakazakii 97% 5 C. sakazakii 96% 17 C. sakazakii under 95%(66%, 82%) 5 Klebsiella pneumoniae 2 Others Shigella dysenteria 2 Enterobacter cloacae 4 Total C. sakazkaii over 95% similarity isolates 119 of 132 Compared with 2 type strains, C. sakazakii ATCC 2949 and C. muytjensii ATCC

37 VITEK 결과와 Murray PR 등의저서 Manual of Clinical Microbiology의 "Biochemical reaction of the named species, biogroups, and enteric groups of the family Enterobacteriaceae" 의 C. sakazkaii 항목과공시균주, 야생균주의 biochemical characterist를비교하였다. 비교할수있는항목은총 25가지항목이였으며그중 11가지항목에서다른점을보였다. 상이한항목을보면 urea hydrolysis, malonate utilization, indole production의세가지생화학특성에대해서는음성에가까운결과를나타내었는데그중 malonate utilization 의결과, 97% 에서는 99% 와 96% 의음성판정과는달리 50% 전후의양성결과를나타내어뚜렷한특이추이가없음을나타내었다. 하지만 myo-inositol fermentation의경우유사성이떨어질수록결과가음성에가까운것으로확인되어유사성결정과깊은연관이있음을알수있었다. 나머지 lactose fermentation, arginine dihydrilase, ornithine decarboxylase, citrate는일정한경향없이조금씩상이한결과를보였으며 raffinose fermentation, D-glucose, gas, yellow pigment 는분리균은 100% 양성으로동일한결과를보였으나 biochemical characterist에명기된수치와는조금씩다른결과를보였다. 25항목중 D-glucose-acid, esculin hydrolysis와 maltose fermentation, D-mannitol fermentation, D-xylose fermentation, sucrose fermentation, L-ramnose fermentation, L-arabinose fermentation, ONPG test 의 9 개항목은모두 100% 양성반응을나타내었다. D-sorbitol fermentation, hydrogen sulfide, adonitol fermentation, lysine decarboxylase, oxidase의 5가지항목은모두음성반응을나타내어총 14가지항목에서동일한결과를나타내어국내외분리균의동일한특성이있음을나타내었다. "Biochemical reaction of the named species, biogroups, and enteric groups of the family Enterobacteriaceae" 에표기되지않은 VITEC의 7가지항목중 35 growth, α-glucosidase는 100% 양성으로 actetate utilization, growth in polymyxin B, glucose fermentation in p-coumaric는음성으로 type strain과동일한결과를얻었다. 하지만 glucose fermentation in 2,4,4'-trichloro-2'- hydroxydiphenylether, β-d-glucoside의경우유사성 99% 의분리균주와도상이한경향을나타내어외래분리균주라고할수있는표준균주와 Korea isolates의차이점을확인할수있었다. 또한분자생물학적확인을위한 PCR을수행한결과로 positive control로 C. sakazkaii ATCC 29544를, negative control로 C. sakazkaii와가장유사한 E. cloacae NCTC 1949 를선정하여각분리균과비교하였다. ompa gene을 target으로하는 primer쌍은 469 bp에서 16S rrna gene target primer 쌍은 406 bp 에서, trna-glu 와 23S rrna 의 intergenic spacer 를 target 으로하는 primer 쌍은 158 bp 에서전기영동을수행한후각각의 DNA 증 폭산물을확인하였으며, E. cloacae 를제외한모든 lane 에서 amplicon 이확인되어 C

38 sakazkaii 임을확인하였다. (Fig. 4-6)

39 Fig. 4. Detection of C. sakazkaii by amplification of ompa gene. Lanse; 1,12 : 100 bp ladder, 1: C. sakazkaii ATCC 29544(positive control), 2: E. cloacea KCTC 1949(negative control) 3-11: C. sakazkaii wild strains Fig. 5. Detection of C. sakazkaii by amplification of 16S rrna. Lanse; 1,12 : 100 bp ladder, 1: C. sakazkaii ATCC 29544(positive control), 2: E. cloacea KCTC 1949(negative control) 3-11: C. sakazkaii wild strains Fig. 6. Detection of C. sakazkaii by amplification of trna-glu and 23S rrna의 intergenic space. Lanse; 1,12 : 100 bp ladder, 1: C. sakazkaii ATCC 29544(positive control), 2: E. cloacea KCTC 1949(negative control) 3-11: C. sakazkaii wild strains

40 또한분리된 C. sakazkaii strains을 16s rrna sequence 분석을하여최종적으로 C. sakazkaii로동정하였다. 분리균들을 16s rrna sequence를 NCBI에서 BLAST로확인한결과모두 C. sakazakii와가장높은 homology를나타내는것을확인할수있었다. 그리고 16s rrna sequence 결과를 phylogenic tree를통해유사성을확인한결과는 Fig. 7, 8과 Table 2 와같다. 다양한식품으로부터분리한 Cronobacter spp. 를 phylogenic tree를통해확인한결과, 분리된 Cronobacter spp. 대두분은 C. sakazakii로총 100주로확인되었으며 (87.7%), 2주의 C. muytjensii (1.7%), 12 주의 C. dublinesis (10.6%) 로분류되었다. 식품의종류에따른 Cronobacter spp. 의분리율은선식과생식이가장높은비율을나타내고있었다. 생식과선식은야채, 곡류등의농산물을가급적이면최소한에가공공정만으로생산해서미생물에대한오염위험이매우높을것으로판단되며, 특히생식과선식은섭취하는계층이건강한성인부터노약자등이건강보조식또는아침대용식등으로다양하게섭취하고있기때문에노약자에게서 Cronobacter spp. 에대한위험도는클것으로사료된다. 영유아식인 105개의조제분유와 9개이유식의경우도 8주의 C. sakazakii가분리되었으며, 이는기존에국내외에서보고된분리율과유사한것으로확인되었다. 하지만 Cronobacter spp. 는주로영유아에게감염되어뇌수막염등을유발하여매우치명적인질병을유발하거나사망까지이르게된다. 따라서영유아식인조제분유등에오염되었을경우그위험을매우치명적이기때문에 Cronobacter spp. 의원재료의관리, 가공공정관리등의제어가반드시필요할것이다

41 Fig. 7. Neighbor-joining tree of Cronobacter spp. and related organisms based on partial 16SrDNA sequences(bootstraps=1000)

42 Fig. 8. Neighbor-joining tree of Cronobacter spp. and related organisms based on partial 16SrDNA sequences(bootstraps=1000)

43 Table 2. Type and number of Cronobacter spp. samples analyzed Number of Isolates Type C. sakazakii C.muytjensii C. dublinensis Dry-powdere Dried baby food 1 - a - d food (n=9) IMF (n=105) 7 Sunsik (n=86) Saesik (n=86) 35 6 Agricultural product Cereal (n=50) Fruit (n=41) Vegetable (n=128) Seaweed (n=24) F r e s h - c u t food Salad (n=15) Total (n=353) a : not detected

44 다. 분리된 Cronobacter spp. 의항생제감수성특성 분리된 Cronobacter spp. 의 ampicillin, streptomycin, tetracycline, chlorampenicol의항생제에대한감수성을확인한결과는 Table 3. 과같다. 본연구에사용된항생제는주로 Cronobacter spp. 의치료에많이사용되어지고있는것들이다. 분리된 C. sakazakii 들은 ampicillin, tetracycline, chlorampenicol에대해서는 96% 이상이감수성이있는것으로나타났으나, streptomycin의경우약 17% 가내성이있는것으로나타났고, 중간정도에내성을나타내는것은약 75% 로매우높았다. C. dublinesis와 C. muytjensii의경우도 ampicillin, tetracycline, chloramphenicol에대해서는감수성이높은것으로나타났으며, C. sakazakii와마찬가지로 C. dublinesis는 streptomycin의경우는중간내성을갖는분리주는 11 주로확인 되었다. 이는 streptomycin 에대한항생제에대한내성이있는 Cronobacter spp. 가증가될 수있을것으로보인다. 또한 ampicillin, tetracycline, chloramphenicol 에대한감수성이높은 것으로나타났으나, 계속되는항생제의사용및항생제내성유전자의전이등을통해항생제 에대한내성을획득하게될가능성이높을것으로판단된다

45 Table 3. Antibiotics susceptibility of Cronobacter spp. from various foods by agar disc diffusion method C. sakazakii isolates(n=100) Resistance (%) Intermediate (%) Susceptibility (%) Ampicillin Streptomycin Tetracycline Chloramphenico l C. muytjensii isolates(n=2) Resistance (%) Intermediate (%) Susceptible (%) Ampicillin Streptomycin Tetracycline Chloramphenico l C. dublinensis isolates(n=12) Resistance (%) Intermediate (%) Susceptible (%) Ampicillin Streptomycin Tetracycline Chloramphenico l

46 라. 건조에따른 C. sakazkaii 의특성 25, 상대습도 75% 에서의금속표면에서 C. sakazkaii ATCC 29544, C. muytjensii ATCC 두표준균주를대조군으로하여건조실험을수행하였다. 그결과사용한 120 개균주중 7개균주는 8시간째에 1 log CFU/mL 수준으로사멸하는건조에약한감수성균주그룹 (Dry sensitive group, sensitive group) 으로, 8시간건조후 4 log CFU/mL 정도의생존을보이는 37균주건조내성그룹 (Dry tolerant group, tolerant group) 으로, 그중간의수치를나타내는 76개균주를중간그룹 (Dry intermediate group, intermediate group) 으로구분할수있었다. 각그룹별로공시균주를포함한대표적 3균주를지정하여 12-well microtitteplate에서표면상에서의상온방치시건조시간에따른생균수의변화를측정하였을때. 건조 1시간후부터는세그룹모두감소경향을보이나 sensitive group 은 tolerant group에비해 3 log CFU/mL이상사멸하였으며시간이지날수록감소추세를이어갔다. 하지만 tolerant group과 intermediate group은 2일건조후생균수가증가하는것으로나타났다. 이는건조에민감한 10% 미만의균주에서만균의감소를보였고식품에서분리된 90% 이상의 C. sakazkaii 균주는건조에강한저항성을나타내는것으로사료된다 (Fig. 9)

47 h 4h 8h 24h Isolate Number Fig. 9. Dry pattern of C. sakazkaii at 25, 75% relative humidity

48 마. 건조분말식품내에서 C. sakazkaii 의생육특성 C. sakazkaii가검출되지않은조제분유시료에 5-6 log CFU/mL의수준이되도록 C. muytjensii ATCC 51329와 C. sakazkaii ATCC 29544를포함한 112개의야생균주를 spiking 하여고루섞은후실온에서저장하여 30일후의생균수변화를측정한결과건조특성에따른분류와마찬가지로 C. sakazkaii dry tolerant group과 intermediate group은 30일이후에도 3 log CFU/mL 이상의생균수를나타내었다 (Fig. 10). Barron 과 Forsythe는건조상태의조제분유에 C. sakazkaii 야생균주 10가지를 7 log CFU/mL 수준으로 spiking하여 30개월간저장실험을한결과, 열균주중한균주는 1년안에모두사멸하였으나두균주는 30개월까지 2 log CFU/mL이상의생균을유지하고있었으며나머지일곱균주는 20개월에서 30개월내에사멸하여건조내성이크다고보고하였다. 30개월에서생존을보이는두내성균주의사멸패턴으로는 4개월까지급속한사멸곡선을그리다가 6개월이후에안정적으로 2~3 log CFU/mL 수준을유지한것으로나타났다. 또한 Edelson-Mammel 등은조제분유의높은영양성분으로인해 700일이상 bacterial cell의생존이가능하다고보고였다. 또한 Gurtler와 Beuchat가 C. sakazkaii 건조시 Aw가감소할수록생존률이높다고보고하였으며분유의 Aw 는 0.2로나타나조제분유에오염된 C. sakazkaii가균자체의건조내성특성과분유의낮은수분활성도와고영양적특성이복합적으로작용하여높은생존률을보인것으로사료된다

49 Fig. 10. Death of C. sakazkaii spiked in IMF after a month

50 바. C. sakazkaii 의 biofilm 특성분석 12-well plastic plate 법에따른 biofilm 형성을건조특성에따른분류에서 tolerant group 과 sensitive group의대표적세균주씩측정한결과 tolerant group의경우초기 12시간에급속한증가를보였으며그후일주일까지는시간이지남에따라감소하는경향을보이다가 15일까지는다시증가하는 pattern을보였다. Sensitive group의경우초기 24시간까지는감소하는추세를보이다가그이후로 2일까지는급격한증가추세를, 15일까지는완만한증가추세를보였다 (Fig. 11). Loewen와 Hengg-Aronis에의하면 L. monocytogens, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli O157:H7 등의병원성세균은외부스트레스에적응하여인간에게질병을일으키는특수한작용을가지고있으며스트레스관련 sigma factor σ S 와 σ B 는스트레스로부터세균이살아남는데밀접한관련이있는삼투보호물질 (osmopriotectant) 을생산하는유전자에의한것이 라고보고하였다. 또한스트레스관련 sigma σ S (RpoS) 는특히 E. coli, Salmonella typhimurium. Pseudomonas aeruginosa, Y. enterocolitica 등그람음성세균에서발견되고있으며외부의스트레스에적응하여병원균을생존시키고독성을발현하는데중요한역할을한다. C. sakazkaii 균체의건조에따른생균수측정과비교하여보았을때 tolerant group의경우는초기증식한균에의해 biofilm양이증가한것으로나타났고 sensitive group의경우에는건조영향에따라균체의사멸에의해 biofilm 전체의양이줄어들었고그중건조에살아남은소수의균체가강하게 biofilm을생성한것으로사료된다. 건조 15일에가까워질수록 biofilm 양이같아지는것을볼때에도이와같은결과를유추할수있다

51 Sensitive Tolerant Time(Day) Fig. 11. Comparison biofilm formation capability with dry-sentitive/tolerant strains of C. sakazkaii by microtiter plate method. Average of 3 representative strains each

52 특히조제분유로부터분리된 C. sakazkaii들의 16s rrna sequence 결과를이용한 genogroup과 Farmer 등에의한 biogroup에따른건조에대한특성을확인한결과는 Table 4 와같다. 조제분유로부터분리된 C. sakazkaii의건조특성을확인한결과약 31% 가건조에대한내성을갖는것을확인할수있었다. 그리고, 분리된 C. sakazkaii를기존에 biogroup 구분에따라분석한결과새로운 biogroup 17로확인되었으며, 16s rrna에따른 genotype을수행한결과 Cluster I에속하는것으로나타났다. 또한이들 new biogroup 17과같은 cluster I에속하는 biogroup 1들의건조내성특성과 biofilm 생성능을확인한경과는 Fig. 12 와같다. 새롭게확인된 new biogroup 17은기존의 biogroup 1에비해건조에대한내성이크고, biofilm 생성능이좋은것으로나타났다. 이러한결과는일반적으로미생물이환경스트레스를받게될경우 adaptation, mutation 등다양한방법으로생존또는생육할수있게되는것과유사한결과로보여지며, new biogroup 17인 C. sakazkaii가건조한조건에서생육하기위한생화학적특성변화혹은 adaptation 등을통해건조에대한내성이높아진것으로사료되며, 특히이러한특성은조제분유를섭취하는영유아들에게보다높은위해가능성이있을것으로판단된다

53 Table 4. Dry sensitive and resistance strain by genogroup and biogroup Genotype (total %) Strains Dry Sensitive C. sakazakii Cluster I: 28 strains (59%) KYU1, KYU2, KYU6, KYU17, KYU18, KYU19, KYU21, KYU25, KYU27, KYU39, KYU40, KYU43, KYU44, KYU45, KYU47, KYU48, KYU51, KYU53, KYU58, KYU59, KYU60(including biogroup 1-5, 7-9, 11, 13 and 14) New biogroup 17: KYU56, KYU62, KYU64, KYU65, KYU66, KYU68, KYU76 Cluster IV: 5 strains (10%) KYU8, KYU35, KYU37, KYU38, KYU50 Dry Resistant C. sakazakii Cluster I:15 strains (31%) KYU22, KYU23, KYU24, KYU30, KYU31, KYU34, KYU41, KYU42, KYU46, KYU49, KYU52(including biogroup 1-5, 7-9, 11, 13 and 14) New biogroup 17: KYU57, KYU63, KYU69, KYU70 Cluster IV: not detected

54 (A) (B) Fig. 12(A). Viability of new biogroup 17 and biogroup 1 on dried plastic surfaces. (B) Biofilms formation of new biogroup 17 and biogroup 1 on dried plastic surfaces. : dry sensitive biogroup 1, : dry sensitive new biogroup 17, : dry resistant biogroup 1, : dry resistant new biogroup

55 사. 분리된 Cronobacter spp. 의열감수성특성 국내에서분리한 112개의 Cronobacter spp. 를건조내성에따라건조저항, 중간그룹으로, 세그룹으로나누었다. 이들각각의균을 60 항온수조에서사멸정도를측정하였다. 전배양한초기균주는 7 Log CFU/mL 수준이었으며사멸정도를보았을때건조민감그룹은평균 5 Log scale이사멸되었으며평균 3 Log scale이사멸한건조저항그룹보다높은사멸을보였다. 중간그룹의경우위의건조실험에서건조저항그룹에가까운것으로나타는데평균 2 log scale의낮은사멸을보여주었다. 오차범위가넓었지만저항특성이열저항성그룹과비슷한것으로사료된다 (Fig. 13). 그러므로건조저항을가지고있는 Cronobacter spp. 는열에대해서도저항성이큰것으로보인다. 여러연구자들에의한연구에의하며 Cronobacter spp. 의열저항성은매우다양한것으로보고되어있다. 항생제와 biocide에대한교차저항성 (cross-resistance) 의특성과같이건조저항성도열저항성과관련이있는것으로보인다. 그러나무엇보다도조제분유등의건조식품에서살아있는 Cronobacter spp. 는건조저항성이클것으로보인다. 현재 WHO에서는 70 에서조제분유를환원시키라고권하고있지만조제분유상태에서의 Cronobacter spp. 는열저항성도크기때문에이에대한심도있는연구가더따라야할것으로보인다. 열처리로부터살아남은세균이거나식품중의산, 염, 온도등자연적으로가해진스트레스를견디어낸세균들은다른스트레스를가해도일부균주는교차보호 (cross protection) 특성으로인해식품속에서더독성이강해진다고보고하였다. 따라서조제분유등의건조스트레스에노출되었고살아남은 Cronobacter spp. 는교차보호로인해여러가지스트레스에서도높은내성을보일수있을것으로사료된다

56 Fig. 13. Death profiles of dry-sensitive, dry-intermediate, and dry-tolerant Cronobacter spp. by heat at 60oC from the 7 log scale inoculum

57 아. Sanitizer 를이용한 C. sakazkaii 의제어농도측정 Polyvinyl chloride(pvc), teflon, plexigals, wool, rubber와 stainless steel에서 S. aureus, E. coli, Sal. enteritidis와 L. monocytogens는부착하지않은 cell에비해 quaternary ammonium comound(qac) sanitizer에저항력을가지고있다. Biofilm 형성능력이높은 tolerant group과상대적으로초기 biofilm 형성이적은 sensitive group과의염소계 sanitizer 인차아염소산나트륨용액 (sodium hypochlorite solution) 과 4급암모늄계 (QACs) 인염화벤잘코늄 (benzalkonium chloride) 에대한살균력을측정하였다 (Fig. 14). Sodium hypochlorite와 benzalkonium chloride은살균소독제유효성분중실제제품수와사용량이가장많은것으로알려져있다. 살균농도는 C. sakazkaii가 5 log CFU/mL이나 % 의사멸을보이는최초농도로설정하였다. Sodium hypochlorite는두그룹대부분 15~25ppm의범주에속하였고각그룹간의큰구별성은없었으며청정조건과오염조건에서 5ppm 가량의차이를보이는것을확인하였으나오염정도가살균력에크게반영되지는않는것으로보인다 (Fig. 15). 반면 QACs 인 benzalkonium chloride는살균농도가 5~15 ppm으로 sodium hypochlorite 보다낮은농도에서저해됨을나타냈으며각그룹에따라 5ppm의차이를보이는것으로나타났다 (Fig. 14). 청정조건과오염조건에따라서는 tolerant group 중한균주만차이를보여오염조건과살균력의상관관계는크지않은것으로보인다. 따라서실험결과로볼때 sanitizer를이용한 C. sakazkaii의제어시에는 sodium hypochlorite 보다 benzalkonium chloride가저농도에서효과적으로작용할것으로사료된다

58 30 Clean condition Dirty contition S1 S2 S3 R1 R2 R3 Dry Senstitive Dry Tolerant Fig. 14. Concentrate of sodium hypochlorite solution for reduce C. sakazkaii

59 30 Clean condition Dirty condition S1 S2 S3 R1 R2 R3 Dry Senstitive Dry Tolerant Fig. 15. Concentrate of benzalkonium chloride for reduce C. sakazkaii

60 자. 분리된 Cronobacter spp. 의세포독성시험 분리된 Cronobacter spp. 에대한 Hep-2 cell에서의세포독성을확인한결과는 Fig. 16로 KYU6, KYU36, KYU10, KYU52, KYU106, KYU38의경우 1시간이후부터 Hel-2 cell 모두사멸되었으나, KYU37, KYU12, KYU2, KYU9, KYU89, KYU35, KYU8은 3시간이후에도 Hel-2 cell이약 3~4 log Hep-2 cell이생존하고있었으며, KYU88, KYU87, KYU50은 3시간이후에는모두사멸되는것을확인하였다. 분리된 C. sakazakii와 C. dublinesis 사이에세포독성의차이를명확히규명할수없었으며, 단지분리된 Cronobacter spp. 분리주간에생리특성또는독성등에기인하는것으로판단된다

61 Fig. 16. Viability of Hep-2 cell by C.dublinesis and C.sakazakii isolates C. sakazakii: KYU2, KYU5, KYU6, KYU10, KYU12, 2949 C. dublinesis: KYU8, KYU9, KYU35, KYU36, KYU37, KYU38, KYU50, KYU52, KYU87, KYU88, KYU89, KYU106 C. muytjensii:

62 제 2 절 E. sakazakii(conobacter spp.) 용균성파지의분리 1. 재료및방법 가. 분리원및용균성파지의분리 C. sakazkaii의용균성파지분리를위해사용된분리원으로는돼지분변 sample, 김치, 오수등을이용하였다. C. sakazkaii ATCC 29544를 Tryptic Soy Agar(TSA) 상에 37 에서 24시간배양한후단일집락을선택하여 Tryptic Soy Broth(TSB) 에서재배양하였다. 그리고 10mM CaCl 2 가첨가된 Luria-Bertani(LBC) broth에접종하여 37, 200rpm으로 early stationary phase까지배양후배양액에 sample을첨가하고동일한조건으로 18시간배양하였다. Sample이첨가된배양액을 8,000rpm으로원심분리하고상등액을 0.2um filter를이용하여제균하여이것을 bacteriophage 분리에사용하였다. 제균액을 C. sakazkaii 배양액과혼합하고이를 LBC soft agar에접종하여 vortex 한후 LBC agar에 lawn으로분주하고 37 에서 24~48시간동안배양하면서 plaque 형성을확인하였다. 형성된 plaque의형태, size, 혼탁정도등을비교하여서로다른 plaque morphology를분리하였다. Plaque를 tooth-picking 하고 SM buffer에현탁한후현탁액을 SM buffer를이용하여 10진희석하여 plaque assay를수행하고 single plaque를분리하였다. 순수분리된용균성파지의증식과농축은 Sambrook 등에의한방법에준하여수행하였다. 나. 숙주저해범위분석 순수분리된 C. sakazakii의용균성파지를대상으로하여 B. cereus, E. colio157:h7, S. aureus, L. monocytogenes, E. cloacae 등의식중독세균과본연구팀에서분리, 동정하여보유하고있는 C. sakazakii들을대상으로 host spectrum을 spot assay를수행하여확인하였다. 다양한식중독세균들은 Tryptic soy broth에서 3회이상계대배양한후 LBC broth에접종한후 0.1mL을취해 LBC soft agar에분주하고 LBC agar 위에중층하였다. 그리고용균성파지용액 10uL를분주한후 37 에서 24시간배양한후 plaque의형성여부를확인하였다

63 다. 분리파지의형태학적특성 분리된 C. sakazakii의용균성파지의형태학적특성을분석하기위해투과전자현미경을사용하여검경하였다. 약 10~11 log PFU/mL 수준으로농축된분리된파지를 2% uranyl acetate 를이용하여 negative stain을수행한후 80kV 하에서투과전자현미경을통해형태학적특성을확인하였다. 라. 파지 DNA 추출 농축된파지용액을 20ug/mL의 DNase와 RNase(Sigma Aldrich, St. Louis, USA) 를처리한후약 15분동안 37 에서배양하고 10mg/mL proteinase K(Sigma) 와 150ul Lysis buffer[0.5m EDTA, 10% SDS, 1M Tris(pH8.0)] 을첨가하였다. 그후 65 에서 30분동안반응하고 700ul phenol:chloroform:isoamy alcohol(sigma) 을첨가한후 10분동안 17,000g에서원심분리를수행하였다. 그리고상등액을취해 chloroform:isoamyl alcohol을첨가하고동일하게원심분리를수행한후상등액을취해 ethanol로침전하고수세한후증류수로현탁하고 -80 에서보관하며실험에사용하였다. 제한효소의절단패턴은제한효소에특성에맞게실험을수행하였으며, 실험후절단된 DNA의패턴은 agarose gel electrophoresis를통해확인하였다. 마. 분리된용균성파지에대한 genome sequence 분석 분리된용균성파지를대상으로하여파지 DNA를추출한후 GS-FLX sequencing을통해수행하였다. 파지 DNA를추출한후 NanoDrop을통해 OD 260/280 의비율이약 1.9, 샘플의양은 GS FLX Rapid library 제작에필요한양 (0.5ug) 임을확인하고, 각 tube에서 Library제작에필요한양을취하여 ice-cold Nebulization Buffer를첨가한후혼합하였다. 준비된 DNA 샘플을 Nitrogen Gas와 Aeromist Nebulizer (Roche, Mannheim, GE) 를이용해물리적인방법으로무작위로절단하였다. 절단된 DNA는 Min-elute PCR purification column (Qiagen, Valencia, CA) 을이용하여정제하였다. Nebulization에의해서형성된 DNA의 End repair를 T4 DNA polymerase, E.coli DNA polymerase_(klenow fragment) 그리고 T4 polynucleotide kinase를이용하여 Phosphorylation 되어진 Blunt End로만들었다. 반응이완료된 DNA는다시 Min-elute PCR purification column(qiagen, Valencia, CA) 를이용하여정제하였다. Blunt

64 End로 repair된 DNA에다음공정에필요한어댑터 (Adaptor A, Adaptor B) 를 Ligation 시켰다. 반응에사용되지않은 Adaptor dimmer 및 small fragment 를제거하기위해 AMPure Bead를이용하여정제한다. 실재로 adaptor A, B가붙은 fragment만을 detection하기위해 GS FLX Rapid Library kit에포함된 standard 시약을이용하여 Quantitation curve를그린후 정량하여총양이 10 9 molecules 이상이되는지확인하고, 1ul 의라이브러리를 BioAnalyzer High Sensitivity chip을이용하여라이브러이의 average size 가 600~900bp 인지, 350bp이하의 fragment가 10% 미만인지를확인한다. 구축된 sstdna Library 동량의 molecule을섞어 DNA Capture Bead에 1:1로 annealing 시킨후Amplification Mix와혼합하여 Clonally Amplification 을수행하였다. DNA-carrying Bead와 PCR mixture를 Water-in-oil microreactor에 Emulsify 한다음 PCR을수행하여 Template을 Expansion 시켰다. PCR이완료된 Bead는 Iso-propanol 및 Wash buffer로 Washing하여 Emulsion 상태를깨주었고, Centrifuge를통하여 DNA beads만을수거한다음 Enrichment Bead를이용하여 DNA-carrying Beads만을골라내었다. 회수된 DNA beads는 Particle Count and Size Analyzer (Beckman Coulter, Florida, USA) 에의해정량하였으며, 한 Region 당약 2000,000개 Beads를 DNA polymerase와함께 incubation 시켰다. 그리고 PicoTiterPlate의 well 에희석된 Enzyme Beads로 1 st layer를 loading하고 incubation된 DNA bead와 Packing Beads를함께혼합하여 2 nd layerloading을진행한다. 이후 Enzyme Bead를한번더 loading하여 3 rd layer를형성시키고마지막으로 PPiase bead를 loading하여 4 th layer를만들어주어 bead loading을완료한다. DNA Beads가 Loading 된 PicoTiterPlate를 GS FLX에장착시켜수십만개의 Picoliter-size Wells에서전체 Genome에대한연속적인 sequencing을수행하였다. 확인된 phage genome sequence의분석을위해 nucleotide sequence는 ( 분석은 ( pi/mw 는 ( rho-independent terminators 는 ( trna 는 ( 를통해분 석하였다

65 2. 결과및고찰 가. C. sakazakii 의용균성파지의분리및숙주저해특성 본연구를통해오수, 김치, 돼지분변시료로부터 C. sakazakii의용균성파지를분리한결과총 12개의용균성파지를분리하였으며, 분리원에따른용균성파지의 plaque morphology는 Table. 5와같다. Plaque의형태로는크게두가지의형태로지름이약 5mm 정도크기의 clear한형태를나타내는용균성파지와지름이약 2mm 정도의작은크기에형태를갖는파지로나뉘어질수있었으며, 돼지분변시료로부터 7주, 김치시료로부터 3주, 오수시료로부터 2주를분리할수있었다. 또한분리한용균성파지 12 주들에대한숙주저해범위를다양한 E. coli, Salmonell enterica, S. aureus, B. cereus, E. cloacae 등의식중독세균들과 Cronobacter spp. 분리주들을대상으로하여수행한결과는 Table 6과같다. 그결과분리된용균성파지들은다른식중독세균에대해서는 plaque를형성하지않았으며, 분리된 Cronobacter spp. 들에대한다양한숙주저해특성을나타내고있었으며, 특히 C. sakazakii와유사한 phenotype과 genotype을갖는 E. cloacae에서는감염이되지않았다. EI-I phage는약 50.4%, ES-I phage는약 40.3%, ES-II phage는약 40.3%, ES-III phage는 33.3%, ES2 phage는약 57.3%, ESSI-2 phage는약 44.9%, ESSI-3 phage는약 39.5%, KCES-2 phage 는 26.3%, KCES-3 phage는 21.7%, KCES-4 phage는 20.1%, ESP phage는 18.6%, ESP phage는 19.3% 에 Cronobacter spp. 분리주들에대한숙주저해특성을나타냈다. 또한분리된용균성파지들은서로다른 Cronobacter spp. 분리주들에대해 lysis를유발하는것으로확인되었으며, 이러한특성을이용하여용균성파지들을 cocktail 형식으로혼합하여사용하면 Cronobacter spp. 분리주들대부분이감염이가능할것이며, 이러한특성을이용하여 Cronobacter spp. 의제어에활용할수있을것으로판단된다

66 Table. 5. Plaque morphology and sample origin of virulent phage isolates Origin Plaque morphology Swine feces ES2, Kimchi ESSI-2, ES-I, ESII EI-I, ESSI-3 ES-III, KCES2 KCES3, KCES sewage ESP , ESP

67 Table. 6. Host spectrum of virulent C. sakazakii phages in Cronobacter spp. isolates EI-I ES-I ES-II ES-III ES-2 ESSI-2 ESSI-3 KCES-2 KCES-3 KCES-4 ESP ESP KYU1 X X X X O X X X X X KYU2 X X O KYU3 O O KYU4 O KYU5 O O KYU6 KYU7 O O KYU8 O KYU9 O O KYU10 O O KYU11 O O KYU12 O O KYU13 O O O O O O O O O O KYU14 O O O O O KYU15 O O O O O O O O O O KYU16 O O O O O O O O O O KTU18 KTU19 KTU20 O O O O KTU21 KTU22 O O KTU23 O KTU24 O O O O O O O O O (continued)

68 KYU26 EI-I ES-I ES-II ES-III ES-2 ESSI-2 ESSI-3 KCES-2 KCES-3 KCES-4 ESP O ESP KYU27 O O O O O O O O O KYU28 O O O O O O O O O O KYU29 O O O O O O O O O O KYU30 O O O O O O O O O O KYU31 O O O O O O O O O KYU32 O O O O O O O O O O KYU33 O O O O O O O O O O KYU34 O O O O O O O O O KYU35 O KYU36 KYU37 O O KYU38 O O KYU39 O O O O KYU40 O O KYU41 O O O O O O O O O O KYU42 O O O KYU43 O O KYU44 O KYU46 O O O O O O O O O O KYU47 O O O KYU48 O KYU49 O O O O O O O O O O KYU50 (continued)

69 EI-I ES-I ES-II ES-III ES-2 ESSI-2 ESSI-3 KCES-2 KCES-3 KCES-4 ESP KYU51 O O O O KYU52 ESP O KYU53 O O KYU54 O O KYU55 KYU56 O O O O O O O O KYU57 O O KYU58 O O O O O O O KYU59 O O O KYU60 O O O O O O KYU61 O O O O O O O O O O KYU62 O KYU64 O O KYU66 KYU67 O O KYU68 O O KYU69 O O KYU70 O O KYU71 O O O O O O O O O O KYU72 O KYU73 O O O O O O O O KYU74 O O O O O O O O KYU75 O O O O O O O KYU76 O O O O O O O KYU77 O O O O O O O (continued)

70 EI-I ES-I ES-II ES-III ES-2 ESSI-2 ESSI-3 KCES-2 KCES-3 KCES-4 ESP KYU78 O O O O O O O O ESP KYU79 O O KYU80 O O KYU81 O O KYU82 O O O O O O O O O O KYU83 O O O O O O O O O O KYU84 O O O O O O O O O O KYU85 O KYU86 O O O O O O O KYU88 O KYU89 O KYU90 O O KYU91 O O O O O KYU92 O KYU93 O O O O O O O KYU94 O O O O O O O KYU95 O O O O O O KYU96 O O KYU97 O O O O O O O O O O KYU98 O O O O O O O O O KYU99 O O O O O O O O KYU10 2 KYU10 3 O O O O O O O O (continued)

71 EI-I ES-I ES-Ⅱ ES-Ⅲ ES-2 ESSI-2 ESSI-3 KCES-2 KCES-3 KCES-4 ESP KYU105 O O O O O O O O O O ESP KYU106 O O KYU107 O O O O O O O O O O KYU108 O O O O O O O O O O KYU109 O O O O O O O O O O KYU111 O KYU112 O O O O O O KYU113 O O O O O O KYU114 O O KYU115 O O KYU116 O O KYU117 O O KYU119 O O O O O O KYU120 O O O O O O KYU121 O O O O O O KYU122 O O O O O O KYU123 O O KYU124 O O O O O O KYU125 O O O O O O KYU126 O O O O O KYU127 O O O O KYU128 O O O O O KYU129 O O O O O O O

72 나. 분리파지의형태학적특성 분리된 C. sakazakii 의용균성파지들에대한형태학적특성을투과전자현미경을이용하여 확인한결과는 Fig. 17 과같다. 분리된용균성파지대부분은 Myoviridae family 에속하는것 으로확인되었으나, ESSI-3 phage 는 Siphoviridae family 에속함을알수있었다

73 phage KCES2 phage KCES3 phage KCES4 phage EI-I phage ES2 phage Fig. 17. Morphology of virulent C. sakazakii phages by transmission electron microscopy

74 phage ES-I phage ESSI-3 phage Fig. 17. Morphology of virulent C. sakazakii phages by transmission electron microscopy

75 다. 파지 DNA 추출 분리한용균성파지들중 Cronobacter spp. 분리주들을모두제어가가능한숙주저해범위를갖는용균성파지인 ES2 phage, EI-I phage, ES-I phage, ESP , ESP2949-2, KCES2를대상으로하여 DNA를추출하고분석하였다 (Fig. 18). 용균성파지의 genomic DNA 를추출하여전기영동을수행한결과유사한크기의 genomic DNA를가지고있음을확인하였다. 하지만이들은서로다른숙주저해특성을나타내고있었으며, 분리원들또한김치, 오수, 돼지분변으로달랐으므로서로다른용균성파지로판단된다

76 M M2 Fig. 18. Agarose gel electrophoresis of DNA isolated from virulent C. sakazakii phages.(lane 1:EI-I phage, Lane 2: ES-I phage, Lane 3: ES2 phage, Lane 4: KCES2 phage, Lane 5: ESP2949-1, Lane 6: ESP

77 라. 분리된용균성파지에대한 genome sequence 분석 분리된용균성파지인 ES2 phage와 ESSI-2 phage의 genomic DNA에대한 sequence 분석을수행한결과, ES2 phage는 22,162 bp의크기를갖고있었으며, 약 50.8% 의 G+C contents임을확인하였으며, 30개의 open reading frame(orfs) 를보유하고있었다. 그리고 ESSI-2 phage는 28,765 bp의크기였으며, 약 55.17% G+C contents 값을나타내고있었으며, 36개의 ORFs를보유하고있었으마, trna는확인되지않았다. ES2 phage와 ESSI-2 phage의 ORF 의기능과 genomic map은 Fig. 19, Table 7, 8과같다. Genomic DNA sequence에대한분석한결과파지가가져야하는 replication/regulation, DNA packaging, structure/morphogenesis, lysis module을포함하고있었다. 특히 ESSI-2 phage의경우는 lysogenic module이일부포함되고있었다. 용균성파지와용원성파지의중요한차이점은 lytic cycle만을갖느냐 lysogenic cycle을보유하고있느냐가가장큰차이점이다. 하지만최근다양한연구보고를통해유산균이나 Mycobacteria의용균성파지에서 lysogenic module 이포함되고있다는보고가있으며, 이부분은용원성파지와용균성파지들간에 genetic evolution과연관되어연구가진행중에있다. 따라서본연구에서확인된 ESSI-2의 genome sequence에대한내용을바탕으로 C. sakazakii의용원성파지와용균성파지에대한유전학적연관관계에대한연구가추가적으로필요할것으로사료된다

78 Fig. 19. Schematic representation of the dsdna genome of the virulent phage ESSI-2. Putative 36 ORFs are presented as arrows, with predicted functions where available. Proposed modules are based on predicted functions. Green: Structure/Morphogenesis, Red: Lysis, Gray: DNA packaging, Blue: Replication/Regulation, Yellow: Lysogeny, White: hypothetical protein, : rho-independent terminator

79 Table. 7. Database matches of the predicted ORFs of phage ESSI-2 ORF (strand) Predicted protein pi/mw Putative function (Matched Database) Function in phage E-value Genome Position Size (aa) 1 (-) / hypothetical protein (YP_ ) 0.0E0 2 (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 4e-73 3 (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 5e-82 4 (-) / tail fiber assembly protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 8e-31 5 (-) / tail fiber protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 3e (-) / hypothetical protein (YP_ ) 1e-91 7 (-) / hypothetical protein (YP_ ) 0.0E0 8 (-) / hypothetical protein (YP_151787) 5e-39 9 (-) / phage tail tape measure protein Structure/Morphogenesis 0.0E0 (ZP_ ) 10 (-) / hypothetical protein (YP_151789) 5e (-) / hypothetical protein (YP_ ) 1e (-) / hypothetical protein (YP_ ) 3e (-) / phage holin (YP_ ) Lysis 2e (-) / tail tube protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 2e (-) / tail sheath protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 0.0E0 16 (-) / phage virion morphogeneis protein Structure/Morphogenesis 8e-82 (ZP_ ) 17 (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 2e (-) / phage head completion protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 2e (-) / terminase endonuclease subunit DNA packaging 3e-93 (YP_ ) 20 (-) / phage major capsid protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 3e (-) / capsid scaffolding protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 7e (+) / terminase ATPase subunit (YP_ ) DNA packaging 0.0E0 23 (+) / phage portal protein (YP_ ) DNA packaging 4e (+) / transcription regulator (YP_ ) Replication/regulation/mo 2E-38 dification 25 (-) / conserved domain protein (ZP_ ) 5e

80 ORF Predicted protein (strand) Genome Position Size (aa) pi/mw Putative function (Matched Database) Function in phage E-value 26 (-) / replication protein A (YP_ ) Replication/regulation/m 0.0E0 odification 27 (-) / DNA adenine methylase (YP_ ) Replication/regulation/m 2e-148 odification 28 (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 1e (-) / hypothetical protein (YP_ ) 2e (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 1.1E (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 4e (-) / regulatory protein CII (ZP_ ) Replication/regulation 2e (+) / CI repressor (YP_ ) Lysogeny 1e (+) / phage integrase (ZP_ ) Lysogeny 3e (-) / hypothetical protein ( ZP_ ) (-) / hypothetical protein (ZP_ ) 2e

81 Table. 8. Database matches of the predicted ORFs of ES2 phage DNA

82 - 80 -

83 제 3 절. E. sakazakii(cronobacter spp.) 용균성파지를이 용한식품적용 1. 재료및방법 가. 분리된파지를이용한 C. sakazakii 의생육억제 분리된용균성파지를사용하여 C. sakazakii와분리주를선발하여각각 LBC broth에서대수증식기까지배양하였다. 배양후 50mL의 LBC broth에각각접종하고 MOI가약 0.1, 수준으로파지를각각접종한후시간에따라생육정도를흡광도를측정하여확인하였다. 나. Bacteriophage 를이용한식품중 C. sakazkaii 의저감화 실제식품에오염되어있을경우에생육억제효과를확인하기위해시판하는오염가능성이높은비가열채소쥬스와가장문제가많이되는조제분유중 C. sakazakii가검출되지않은분유를이용하여조제한후실험에사용하였다. 조제분유와채소쥬스시료에 C. sakazakii을약 4 log CFU/mL 수준으로각각접종한후파지를접종한후 37 에서배양하면서시간에따른생균수를 10진희석법에따라 DFI agar에각각도말한후 24시간이후에개수하였다. 다. 분리된용균성파지를이용한 biofilm 의제어 최근 bacteriophage를이용하여 biofilm을제어하는연구가활발하게진행중에있으며, 몇몇논문등을통해 bacteriophage를이용하여효과적으로 biofilm을제거할수있다고보고하고있다. 따라서본연구에서는분리된 bacteriophage를이용하여 C. sakazkaii가생성하는 biofilm을제어하고자하였다. C. sakazkaii가 biofilm 을형성시키기위해분리된 Cronobacter spp. 들은건조조건에노출하였으며, 그중 biofilm 생성능이높은균을대상으로실험을수행하였다. Biofilm이형성된후

84 분리한용균성파지를접종하여 biofilm 의감소효과를확인하였다. 라. Bifidobacterium, 유산균과용균성파지를이용한 C. sakazakii 의제어 본연구를통해분리한유산균인 Leuconostoc mescenteroides LAB kw5, Sterptococcus thermophilus LAB kw15와 Bifidobacterium BF8와 Bifidobacterium BF2-29를 Cronobacter spp. 의감소효과를확인하고자하였다. MRS broth에 0.05% L-cystein이첨가된배지에유산균을접종한후 3회계대배양하여활성화시키고실험에사용하였다. Bifidobacterium와젖산균배양액을 10,000g에서 10분동안원심분리후상등액을취해 ph 7.0으로조정한후 0.22 um membrane filter를이용하여제균한제균액과 ph 7.0으로조정하지않은상등액을제균하여이를희석하여 microplate에접종한후분리한용균성파지를약 6 PFU/mL 수준으로첨가하고시간에따른 C. sakazakii의생육억제정도를확인하였으며, 이때의 C. sakazakii의생육정도를 DFI agar에 10진희석하여도말한후 37 에배양한고집락을개수하였다. 또한조제분유에적용하여 Bifidobacterium 의상등액을이용해조제분유를혼합하고마찬가지로분리된용균성파지를약 6 PFU/mL 수준으로접종한뒤시간에따른생육정도를 DFI agar에 10진희석하여도말한후개수하였다. 마. C. sakazakii KYU90 으로부터 temperae phage 의분리및특성분석 본연구를통해분리된 C. sakazakii KYU90으로부터 temperate phage를분리하고그특성을비교분석하였다. 현재보고된 C. sakazakii의 whoe genome sequence에의하면 C. sakazakii의 genome안에는약 4종류의 prophage가존재하는것으로보고되고있다. 그만큼 prophage는 C. sakazakii의다양한특성에영향을미칠것으로사료된다. 일반적으로 prophage의형태에서 temperate phage 유도되어나와서 lytic cycle로진행되기위해서는다양한외부환경스트레스에기인하는것으로알려져있다. 보통 temperate phage를유도하기위해서사용되는것은대표적으로 UV 조사와 mitomycin C가대표적이며이외에도열충격등에의해

85 서도유도되어나오는것으로알려져있다. Cronobacter spp. 가오염되어있는조제분유의제조를위한가공고정은여러가지곡물, 야채, 과일등의 raw material 들을 wet blend를하고열처리공정후건조공정을거쳐 raw materials 들중 dry blend한제품과섞어서제조하는것이일반적인공정이고, 이후에소비자에게판매되어영유아에게조제되어섭취되게된다. 하지만건조내성등의외부스트레스에강한 Cronobacter spp. 는오염도또한다양한보고에따라면 4~14% 수 준으로알려져있어영유아식인조제분유는 상당한위험을내포하고있으며, 감 염시사망까지유발하는치명적인위험이있다. 하지만오염도와위험성에비해실제사고사례는비교적적은편인데이에대한원인을 Cronobacter spp. 의 prophage로부터유도되어나오는 temperate phage가 lytic cycle을하면서 Cronobacter spp. 가 lysis가되어자체적으로감소되었을가능성이있을것으로판단되었다. 따라서본연구에서는분리된 C. sakazakii KYU90의 temperate phage 를열충격을통해분리하고특성을확인하고자하였다. 본연구에서분리된 C. sakazakii KYU90을 LB broth에접종한뒤 37 에서 200rpm으로대수증식기까지배양한후 LBC broth에접종하고동일한조건으로배양하여실험에사용하였다. C. sakazakii KYU90으로부터 temperate phage를분리하기위해사용된방법은전통적으로많이사용되고있는 mitomycin C와다른외부스트레스로열충격을이용하여수행하였다. 배양된 C. sakazakii KYU90에흡광도 0.3~0.4 수준까지배양한후 mitomycin C를첨가하고재배양하면서흡광도의감소를확인하였으며, 열충격의경우 60 에서 30분간노출한후다시 37 에서재배양하면서마찬가지로흠광도의감소를측정하였다. 그리고흡광도의감소를확인한후원심분리후 10,000g에서 10분동안원심분리를수행하고 0.22um membrane filter를이용해제균한후 phage lysate로사용하였으며, 유도되어나온 phage의확인을위해 indicator strain으로 C. sakazakii ATCC29544를사용하여 spot assay를수행하고 plaque의생성여부를확인하였다. Phage lysate를이용하여투과전자현미경을이용한형태학적인특성을확인하였고, 실험방법은용균성파지에서의방법과동일하게수행하였다. 또한약 9~10 PFU/mL 수준의 phage lysate를 C. sakzakii ATCC29544에첨가해서생육저해효과를흡광도를측정하여확인하였으며, 방법은용균성파지에서의방법과동일하게진행하였다. 그리고조제분유에 C. sakazakii ATCC29544를오염시킨후여기에

86 mitomicin C와열충격으로유도된 temperate phage를각각첨가하여 C. sakazakii 의생육억제정도를시간에따라 DFI agar에 10진희석하여도말한후배양하고집락을개수해서확인하였다. 열충격으로 C. sakazakii KYU90으로부터분리된 temperate phage ENT90의 genome sequence를분석하였으며, 방법은용균성파지의 genome sequence와마찬가지로 GS-FLX sequencing을수행하였으며, genome sequence의분석도용균성파지의분석에사용된 software를사용하여수행하였다

87 2. 결과및고찰 가. 분리된파지를이용한 C. sakazakii 의생육억제 분리된용원성파지들중 Cronobacter spp. 분리주들에대한숙주저해를대부분가능하도록하게하는 EI-I phage, ES-I phage, ES2 phage, KCES2 phage, ESP phage, ESP phage 들을대상으로하여 C. sakazakii에대한생육저해특성을 MOI에따라확인한결과는 Fig. 20, 21과같다. MOI가 0.1과 0.001일때의 6주의용균성파지들모두 C. sakazakii의초기흡광도값에서 5시간이후에는크게변화하지않는것으로나타나생육억제효과가우수한것으로나타났으며, 용균성파지를첨가하지않았을경우에는 5시간이후에흡광도값이약 0.9 수준까지증가하였다. 또한분리된용균성파지들을 MOI가약 0.1이되도록하여 LBC broth에접종하고생육정도를 DFI agar에도말하여확인한결과는 Fig. 22와같다. 용균성파지를접종하지않은경우초기약 4 log CFU/mL에서 8시간이후에는약 8 log CFU/mL 수준으로증가하는것을확인할수있었으나, 용균성파지를접종했을때는 ES2와 ES-I phage의경우는초기균수를유지하는것으로나타났으며, 나머지용균성파지의경우는 6시간이후에는 C. sakazakii가검출되지않았다. 따라서이들용균성파지들을이용하여식품에적용하여다양한 C. sakazakii에대한제어가가능할것으로판단된다

88 Fig. 20. Growth inhibition of C. sakazakii ATCC29544 by virulent phages

89 Fig. 21. Growth inhibition of C. sakazakii ATCC29544 by virulent phages

90 Fig. 22. Survival of C. sakazakii ATCC29544 by virulent phages in LBC broth

91 나. Bacteriophage 를이용한식품중 C. sakazkaii 의저감화 분리된용균성파지 6주를이용하여식품에오염되었을때의제어효과를확인한결과는 Fig. 23~26와같다. 분리된용균성파지 6종은본연구에확인대 Cronobacter spp. 의대부분을감염할수있기때문에이들각각의용균성파지를섞어 cocktail 형태로만든후실제 Cronobacter spp. 분리주를이용해식품에적용하여감소효과를확인하였다. 사용된 Cronobacter spp. 분리주들은용균성파지들의저해범위가많은것부터적은것까지선별하여수행하였다. 그결과대체적으로초기균수들을유지하거나감소효과를나타내는것으로확인되었다. 하지만앞선실험에서는순수배양된 C. sakazakii가 LBC broth에서는 6시간이후에 C. sakazakii의생육이확인되지않았지만, 실제조제분유에적용하여수행했을때는그렇지못하였다. 이는분유에다양한식품의구성성분이존재하고있기때문에, 용균성파지가세포표면에부착을방해하거나숙주내에서 replication의억제, 조제분유자체에오염되어있는일반세균등에의한것으로판단되다. 따라서보다완벽한제어를위해서는조제분유에존재하는여러가지성분에의해용균성파지가제대로증식을하지못하는구성물을조절해서 C. sakazakii를온전히제어를해야할것으로보인다

92 Fig. 23. Growth inhibition of Cronobacter spp. isolates by phage cocktail in infant milk formula

93 Fig. 24. Growth inhibition of Cronobacter spp. isolates by phage cocktail in infant milk formula

94 Fig. 25. Growth inhibition of Cronobacter spp. isolates by phage cocktail in infant milk formula

95 Fig. 26. Growth inhibition of Cronobacter spp. isolates by phage cocktail in infant milk formula

96 다. Bacteriophage 를이용한 biofilm 의제거효과 본연구를통해분리된 Cronobacter spp. 들을대상으로하여 biofilm의생성능이높은분리주들을대상으로하여 microplate assay법을수행해확인하였다 (Fig. 27, 28). 그결과 Cronobacter spp. 분리주들은다양한양상으로 biofilm을생성하는것으로확인되었다. 그중 biofilm 생성능이상대적으로높은 KYU13, KYU25, KYU26, KYU27, KYU28, KYU29, KYU30, KYU31, KYU48, KYU90, KYU97, KYU99, KYU102, KYU105, KYU106, KYU107, KYU111, KYU115, KYU118, KYU120, KYU126, KYU127, KYU128, KYU129을대상으로하여분리된용균성파지인 EI-I phage, ES-I phage, ES2 phage, KCES2 phage를접종하여시간에따른 biofilm의감소정도를확인한결과는 Fig. 29~32와같다. 그결과 Cronobacter spp. 분리주들이형성한 biofilm을분리된용균성파지들을접종함으로서감소시킬수있음을확인하였다. 따라서기존에다른연구보고에서용균성파지를첨가하여 biofilm을제거하는효과를확인한결과와유사한결과를확인하여, 본연구에서분리된용균성파지를이용해 biofilm을제어하는데응용할수있을것으로판단된다

97 Fig. 27. Biofilm formation of Cronobacter spp. isolates

98 Fig. 28. Biofilm formation of Cronobacter spp. isolates

99 Fig. 29. Reduction of biofilm of Cronobacter spp. by virulent phages

100 Fig. 30. Reduction of biofilm of Cronobacter spp. by virulent phages

101 Fig. 31. Reduction of biofilm of Cronobacter spp. by virulent phages

102 Fig. 32. Reduction of biofilm of Cronobacter spp. by virulent phages

103 라. Bifidobacterium spp., 유산균, 용균성파지를이용한 C. sakazakii 의제 어 Bifidobacterium BF-8과분리된용균성파지들을이용하여 C. sakazakii의저해효과를확인하였다. Bifidobacter BF-8의배양상등액을이용해희석하여 C. sakazakii 배양액을첨가하고생육저해효과를비교한결과는 Fig. 33과같다. Bifidobacterium BF-8의배양액을 2-1 ~2-3 희석하고희석된배양상등액이첨가되지않은 C. sakazakii의경우는시간이지나감에따라생육이활발하게일어나는 반면배양상등액을첨가하였을경우에는 2-1, 2-2 희석된배양액은 C. sakazakii 의 생육을 18시간동안저해하는것으로나타났으나, 2-3 의경우 6시간이후부터생육이시작되어점차증가하는양상을나타냈다. 그리고본실험결과를바탕으로 Bifidobacterium BF-8의배양상등액과분리된용균성파지들을각각 6 log PFU/mL 수준으로접종한후혼합하여 C. sakazakii를접종하고저해효과를실험한결과는 Fig. 34, 35와같다. 앞서 Bifidobacterium BF-8의상등액을희석해서 저해효과를확인했을경우 2-3 희석액에서는 6 시간이후에는 C. sakazakii 의증식 이되었던반면, 분리된용균성파지들을각각혼합하였을경우 ES2 phage, KCES2 phage, ESP phage의경우 C. sakazakii의증식이확인되지않았으며, ES-I phage의경우는배양액상등액만을넣은것에비해균증식이낮은것으로나타났다. 따라서 Bifidobacterium BF-8과분리된용균성파지들의혼합액을이용하여 C. sakazakii의저해를보다효과적으로저해할수있을것으로판단되다. 그리고 Bifidobacterium BF-8과분리한용균성파지들의혼합액에의해 C. sakazakii 의시간에따른 viability를 LB broth와분유에서확인하기위해 DFI agar에도말하여확인한결과는 Fig. 36와같다. 실험결과 Bifidobacterium BF-8 만을첨가하였을경우 24시간이후에는 C. sakazakii 만배양했을경우에비해약 5 log CFU/mL 수준으로감소되는것을확인하였다. 그리고분리된용균성파지들을혼합하여확인했을경우 ES-I phage, ES2 phage, ESP2949-1, ESP2949-2는모두 C. sakazakii가검출되지않았으며, EI-I phage와 KCES2 phage는각각약 6 log CFU/mL, 7 log CFU/mL 수준으로감소되었다. 또한우유에 C. sakazakii를접종하여 Bifidobacterium BF-8과용균성파지혼합액에의한생육저해정도를확인했을때도이와유사한결과를확인하였다. 하지만 ES2 phage와 ESP2949-2의경우

104 LB broth 에서비해분유에서는효과가약간떨어지는것으로나타났는데, 이는앞 서설명한것처럼식품자체가가지는 inhibitor 나 receptor 에특성등에기인한것 으로판단된다

105 Fig. 33. Growth inhibition of C. sakazakii by supernatant of Bifidobacterium BF-8. A: 2-1 diluent of supernatant, B; 2-2 diluent of supernatant, C: 2-3 diluent of supernatant

106 Fig. 34. Synergy effect of C. sakazakii by virulent phages with supernatant of Bifidobacterium BF-8. A: 2-1 diluent of supernatant, B; 2-2 diluent of supernatant, C: 2-3 diluent of supernatant

107 Fig. 35. Synergy effect of C. sakazakii by virulent phages with supernatant of Bifidobacterium BF-8. A: 2-1 diluent of supernatant, B; 2-2 diluent of supernatant, C: 2-3 diluent of supernatant

108 (A) (B) Fig. 36. Viability of C. sakazakii by virulent phages with supernatant of Bifidobacterium BF-8 in (A)LB broth and (B)infant milk formula

109 마. C. sakazakii KYU90 으로부터 temperae phage 의분리및특성분석 본연구에서분리된 C. sakazakii KYU90으로부터 mitomycin C와열충격의방법으로분리하고자하였다. C. sakazakii KYU90에 mitomycin C와 60 에노출시킨뒤에흡광도의변화를확인한결과와, 최종배양액을 0.2 um membrane filter를이용해서제균한 phage lysate를 indicator strain인 C. sakazakii ATCC29544를사용하여 spot assay를수행한결과는 Fig. 37과같다. Mitomycin C와열충격으로유도된 C. sakazakii KYU90의 temperate phage의확인을위해흡광도의변화를통해확인한결과 mitomycin C와열충격처리이후에흡광도값이감소되는것을관찰하였으며, lysate를이용하여 spot assay를수행한결과 mitomycin C와열충격처리이후에모두 plaque의형성을확인하여, 두조건에서모두 temperate phage 가유도되어나온것을알수있었다. 일반적으로미생물의 genome에는다양한 prophage가존재하는것으로알려져있으며, 이들은미생물의 evolution과 horizontal gene transfer 등에큰영향을미치는것으로보고되고있다. 그리고 E.coli O157:H7, S. aureus, C. botulinum 등의 virulence에관계하고있다고알려져있어 phage 들은미생물에있어서나인간또는동식물에큰영향이있을것이다. 하지만본연구에서는열충격등외부의자연적요인등에의해유도되어나올가능성이있는 temperate phage에의해농수산물등의 raw material이나분유등의 powdered foods에오염되어있는 Cronobacter spp. 가자연적으로감소될가능성에대해연구한것으로서, temperate phage에의한 gene transfer나독소관련유전자에대한연구는추가적으로진행되야할것으로사료된다. LBC broth에서열충격에의해 temperate page가유도되어나오는결과를바탕으로동일하게조제분유에 C. sakazakii KYU90을접종한후 50, 60, 70 에서유도되어지는 temperate phage를 plaque assay를통해확인한결과, LBC broth 에서와마찬가지로열충격에의해 C. sakazakii KYU90으로부터 temperat phage가유도되어나오는것을관찰하였으며, 60 에서가장많은수의 temperate phage가유도되는것을확인하였다 (Fig. 38). 또한 C. sakazakii KYU90이조제분유에오염되어있으면서 30분이후에약 4~5 log PFU/mL 수준으로유도되었다. 일반적으로일반가정등에서조제하는데있어서국내외권고사항은 60~70 에서제조하는것을권고하고있으며, 이는분유를조제하는온도에서는 Cronobacter spp. 의감소

110 시키는온도이기도하며, Cronobacter spp. 의 prophage가유도되어 temperate phage로될수있는온도일것으로판단된다. 또한조제분유의제조, 가공공정중의열처리과정또한유사할것으로보인다. 열충격과 mitomycin C에의해유도된 temperate phage에의한 C. sakazakii ATCC29544에서의생육억제효과를 LBC broth와분유에서확인한결과는 Fig. 39와같다. 분리된각각의조건에서유도된 temperate phage lysate는 C. sakazakii ATCC29544에감염되어생육을못하게하는것으로나타났다. 본연구에서분리했던용균성파지들과유사한생육제어효과를나타내고있었으나, temperate phage의특성이 integrase 등을보유하고있어다른세균에 integratoin 될가능성등이있으므로 temperate phage를이용하여식품에적용하여 Cronobactet spp. 를제어하는것은위험이따를것으로판단된다

111 (A) (B) Fig. 37. (A) Induction of temperate phage from C. sakazakii ATCC by heat and mitomycin C. (B) Plaque formation of temperate phage by mitomycin C and heat treatment

112 Fig. 38. Plaque formation of temperate phage induced from C. sakazakii KYU90 in infant formula according to temperature

113 Fig. 39. Growth inhibition of C. sakazakii ATCC29544 by heat and mitomycin C inducing temperate phages

114 또한분리된 temperate phage ENT90의형태학적특성을투과전자현미경을통해확인한결과전형적인 Myoviridae famil에속하는것으로관찰되었다 (Fig. 40). 그리고 temperate phage ENT90의 genome sequence를 GS-FLX sequencing을통수행하고분석한결과, 총 genome 크기는 29,564bp로원형의 dsdna로확인되었으며, G+C content가 55.81% 였다. 그리고약 41개의 ORFs를보유하고있었으며, trna는확인되지않았다. 또한 temperate phage가보유하고있는일반적인기능을하는 structure/morphogenesis, replication/regulation/modification, lysis, lysogenic module, DNA packaging유전자들이있음을확인하였으며, genomic map 과각각의 ORF의특성은 Fig. 41. 과 Table 9와같다. 그러므로본연구를통해확인된바와같이 Cronobacter spp. 의 prophage는열충격등에의해서도유도되므로보다다양한외부환경스트레스에의한 temperate phage에대한연구가필요할것으로판단되며, 보다다양한 Cronobacter spp. 분리주들에대한연구도필요할것으로판단된다. 그리고실제유도되어나온 temperate phage들에의해분유등에오염되어있는식품에존재하는 Cronobacter spp. 에미치는보다명확한연구가추가적으로필요할것이다. 더불어앞서기술한바와같이이들 temperate phage 들의 horizontal gene transfer, evolution, virulence 등과관련된연구가보다심층적으로이루어질필요가있을것으로사료된다

115 (A) (B) Fig. 40. Electron micrograph showing morphology of phage ENT90 (A) contracted tail, (B)non-contracted tail

116 Fig. 41. Genetic prediction map of temperate phage ENT90 (Gene accession No: HQ110084) Pale blue: Morphogenesis/Structure, Red: Lysis, Yellow: DNA packaging Green: Replication/Regulation/Modification, Blue: Lysogeny, Gray: hypothetical protein Ω: rho-independent terminator

117 Table. 9. Database matches of the predicted ORFs of temperate phage ENT90 ORF (strand) Genome Position Predicted protein Size(aa) pi/mw Putative function (Matched Database) Function in phage E-value 1(+) / Tail fiber protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 1e-37 2(-) / Phage Tail Collar domain protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 1e-123 3(-) / Phage tail protein I(ZP_ ) Structure/Morphogenesis 5e-90 4(-) / Baseplate assembly protein J (YP_ ) Structure/Morphogenesis 2e-143 5(-) / Baseplate assembly protein W (YP_ ) Structure/Morphogenesis 2e-46 6(-) / Baseplate assembly protein V (YP_ ) Structure/Morphogenesis 2e-89 7(-) / Phage virion morphogenesis protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 1e-54 8(-) / Tail completion protein R (YP_ ) Structure/Morphogenesis 4e-63 9(-) / Control of lysis protein (ZP_ ) Lysis 4e-46 10(-) / Phage lysozyme (YP_ ) Lysis 7e-26 11(-) / Hypothetical protein (YP_ ) 3e-31 12(-) / Phage Tail Protein X (YP_ ) Structure/Morphogenesis 3e (-) / Enterobacteria phage P2 GpL (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 6e-43 14(-) / Terminase endonuclease subunit (YP_ ) DNA packaging 3e-87 15(-) / Major capsid protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 2e (-) / Capsid scaffolding protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 2e-82 17(+) / Terminase ATPase subunit (YP_ ) DNA packaging (+) / Phage portal protein PBSX family (ZP_ ) DNA packaging 3e (-) / Hypothetical protein (ZP_ ) (-) / SOS operon TUM protein (emb CBG ) Replication/regulation/modification 1e-17 21(-) / Replication protein A (YP_ ) Replication/regulation/modification (-) / Transcriptional regulator (ZP_ ) Replication/regulation/modification 2e-16 23(-) / Hypothetical protein (YP_ ) 3e

118 ORF (strand) Genome Position Predicted protein Size(aa) pi/mw Putative function (Matched Database) Function in phage E-value 24(-) / Hypothetical protein (YP_ ) 2e-43 25(-) / Hypothetical protein (NP_ ) 2e-08 26(-) / Regulatory protein CII ( ZP_ ) Replication/regulation/modification 1e-70 27(-) / Phage regulatory protein (emb CBG ) Replication/regulation/modification 5e-33 28(+) / CI repressor (YP_ ) Lysogeny 3e-69 29(+) / Integrase (ZP_ ) Lysogeny 3e (-) / Transcriptional activator (YP_ ) Lysogeny 2e-18 31(-) / Late control gene D protein (YP_ ) Replication/regulation/modification 3e-30 32(-) / Phage tail protein (YP_ ) 2e-48 33(-) / Phage tail tape measure protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis (-) / Phage tail E family protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 9e-27 35(-) / Major tail tube protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 4e-83 36(-) / Major tail sheath protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis (-) / DNA-invertase (YP_ ) Lysogeny 7e-55 38(+) / Tail fiber protein (dbj BAA ) Structure/Morphogenesis (-) / Tail fiber assembly protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis 2e-22 40(-) / Tail fiber protein (YP_ ) Structure/Morphogenesis (+) , / Tail fiber protein (ZP_ ) Structure/Morphogenesis 6e

119 제 4 절. Cronobacter spp. 의검출을위한용균성파지의이 용 1. 재료및방법 가. 분리된용균성파지들의 ferrous ammonium sulfate 에의한제거 분리된용균성파지들중 Cronobacter spp. 분리주들을대부분감염시킬수있는파지들을선별하였으며, 선발된 EI-I, ES-I, ES2, KCES2, ESP2949-1, ESP phage를 ferrous ammonium sulfate(fas) 의농도와시간에따른 viability를확인하였다. 또한 C. sakazakii ATCC29544가 ferrous ammonium sulfate의농도에따른 viability를확인하였다. 나. Phage amplification assay 에의한 C. sakazakii 의검출 분리된용균성파지를이용해 C. sakazakii ATCC29544에대한검출을 phage amplification assay를통해수행하였다. 대수증식기의 C. sakazakii를 10진희석한후희석액에분리된용균성파지 cocktail을첨가하고 1시간동안배양하였다. 그리고 FAS를첨가하고 30분동안추가적으로배양한후 LBC broth를첨가하고, indicator strain으로사용될 C. sakazakii ATCC29544를약 8 log CFU/mL 수준으로접종한후 1시간을추가배양하였다. 그리고 LBC soft agar와혼합한후 LBC agar에중층하고 37 에서 24시간동안배양한후 plaque의형성을확인하였다. 또한시간에따른 C. sakazakii의검출도를확인하기위해배양된 C. sakazakii를 10진희석하고이를배양하면서시간에따른검출도를확인하였다

120 다. 식품에오염된 Cronobacter spp. 의검출 식품에오염된 Cronobacter spp. 의검출을위해시판중인분유, 야채쥬스, 양상추를이용해실험을수행하였다. 조제분유와야채쥬스에배양된 C. sakazakii ATCC29544를 10진희석하여희석액을접종한후시간에따른검출도를확인하였으며, 방법은위와동일하게진행하였다. 그리고양상추는크기가 1X1 cm 2 로절단한후 70% alcohol에 30분동안담궈놓은후멸균수를이용해 2회수세한후사용하였다. 수세한후 C. sakazakii 배양액을 10진희석한후희석액에양상추조각을 20분동안담궈놓고이를꺼내양상추에오염된 C. sakazakii의검출에사용하였다. 라. Cronobacter spp. 분리주를대상으로한식품적용 분리된 Cronobacter spp. 분리주들을대상으로하여식품에적용하여실제검출이가능한지를확인하고자하였다. 분리된 Cronobacter spp. 들중용균성파지들의숙주저해를많이하는분리주부터적게하는분리주를선발하여실험을수행하였으며, 실험은위와동일한방법으로진행하였다

121 2. 결과및고찰 가. 분리된용균성파지들의 ferrous ammonium sulfate 에의한제거 분리된용균성파지 cocktail에존재하는파지를제거하기위한시약으로 FAS를사용하여실험을수행하였다. FAS는대표적인 virucidal agent로알려져있고, 다른연구보고에따르면다양한 ammonium compound를이용해 virucidal activity를확인했을때 FAS가가장우수한효과가있는것으로보고되어본연구에서는 FAS 를이용하여실험을수행하였으며, 그결과는 Fig. 42, 43과같다. FAS를농도와시간에따라분리된용균성파지의제거효과를확인한결과, 농도와시간에비례하여감소가되는것으로나타났고이결과를바탕으로하여 5% FAS의농도를처리한후 30분처리하는것으로 phage amplification assay를수행하고자하였다

122 Fig. 42. Viability loss of virulent phages isolates by ferrous ammonium sulfate

123 Fig. 43. Viability loss of virulent phages isolates by ferrous ammonium sulfate

124 나. Phage amplification assay 에의한 C. sakazakii 의검출 분리된용균성파지 cocktail을이용해 Phage amplification assay를통한 Cronobacter spp. 의검출을수행하였다. Phage amplification assay는개발된지십수년정도밖에되지않았으며, 최근 phage를이용한다양한응용분야의하나로각광받고있다. 일반적으로 phage를이용한미생물의검출방법은 luciferase gene 등의특정 reporter gene을 phage에삽입하여형광의증폭정도를확인하여검출하는방법과 phage가특정숙주를감염시키고난후특정 virucidal agent를사용하여감염되지않은 phage를제거한후 indicator strain에다시감염시켜 plaque 의형성유무를관찰하여미생물을검출하는방법이다. 이방법은조작이간단하고짧은시간에검출이가능하며, 숙주특이성이있는 phage를사용하기때문에선택성이우수한것으로알려져있다. 특히해외에서는 Mycobacteria와항생제내성 Mycobacteria 를 검출하기위한목적으로생산되어제품으로판매되고있다. 따라 서본연구에서도새롭게분리한 C. sakazakii의용균성파지들을이용하여이를 cocktail 형식으로혼합하여 Cronobacter spp. 의검출에사용하고자하였다. C. sakazakii ATCC29544의세균수에따른용균성파지 cocktail을이용한검출정도를비교하였으며, negative control로는 S. aureus ATCC12103을사용하여수행하였다 (Table 10). C. sakazakii ATCC29544를 10-2, 10-4, 10-6로 LBC broth로희석된희석액을시간이지남에따라검출되는정도는 1시간이후부터검출이가능하였으며, C. sakazakii의세균양에많을수록 plaque의형성이많았으며, 약 2 log CFU/mL 수준의 C. sakazakii의경우 2개의 plaque 만이확인되었으나, 시간이 3시간, 5시간지남에따라 plaque의양이계속증가함을알수있었다. 또한 negative control로사용된 S. aureus의경우 FAS의농도가 1% 일경우는 plaque 가형성이됨을알수있었는데이는 FAS의농도가낮아서처음에감염시킨용균성파지 cocktail에존재하는파지가나온것으로확인되었다. 그러므로 FAS의농도는 5% 이상을처리해야 false-positive 결과가없을것으로보인다. 따라서본실험결과적은수의 C. sakazakii가오염되어있을경우 3시간정도의배양시간이필요할것으로판단된다. 일반적으로식품에 Cronobacter spp. 가오염되어있을경우대부분적은양이오염되어있기때문에, 용균성파지 cocktail을이용해식품에오염되어있는 Cronobacter spp. 를검출하기위해서는 3시간이상의배양시간

125 이필요할것으로사료된다

126 Table. 10. Detection limits of C. sakazakii by virulent phage cocktails Incubation time C. sakazakii cell 1hr 3hr 5hr plaque formation/plate 4.12X10 6 CFU/mL too many too many too many 4.12X10 4 CFU/mL 161 too many too many 4.12X10 2 CFU/mL too many

127 다. 식품에오염된 Cronobacter spp. 의검출 조제분유, 야채쥬스, 양상추에배양된 C. sakazakii ATCC29544를 LBC broth를이용해희석하여희석액을접종한후시간에따른검출도를확인하였으며, 방법은위와동일하게진행하였고 negative control은앞서와마찬가지로 S. aureus를사용하였다. 양상추와조제분유, 야채쥬스에 C. sakazakii를세균수별로인위적으로오염시킨후시간에따른 C. sakazakii에대한검출정도를확인한결과는 Table 11과같다. 그결과양상추와분유의경우앞서실험과유사하게 C. sakazakii가약 3 log CFU/mL(or g) 수준으로오염되어있을때 1시간후에는양상추는약 74 plaque formation/plate, 분유의경우는 36 plaque formation/plate 각각확인되었으며, 시간이 3시간, 5시간으로지나감에따라 plaque의형성이증가함을확인할수있었다. 하지만분유의경우 C. sakazakii의수가약 6 log CFU/mL(or g) 일경우에 1시간이후에약 158 plaque formation/plaque가나타났지만양상추의경우 1시간이후때부터많은수의 plaque가형성되었다. 이는양상추의표면에주로오염되어있던 C. sakazakii가 phage가감염되는데큰영향을미치는외적요인이거의없기때문이며, 분유의경우는분유자체에있는다양한물질들이 phage가감염되는것을방해하기때문인것으로사료된다. 또한야채쥬스의경우는 1 시간때는 plaque가형성되지않았으며, 3시간이후부터 plaque가형성되어 5시간에많은수의 plaque가형성되었다. 따라서본연구를통해분리된용균성파지 cocktail을이용하여 phage amplification assay를수행하여 Cronobacter spp. 의검출할때는초기균수의영향과식품자체가가지고있는성분, ph, inhibitor의존재유무등물성에대한특성을고려하여검출을해야할것으로판단된다

128 Table. 11. Detection of C. sakazakii by virulent phage cocktails from contaminated foods Lettuce Incubation time 1hr 3hr 5hr plaque formation/plate C. sakazakii 5.5X10 6 CFU/g too many too many too many 3.3X10 3 CFU/g 74 too many too many Infant milk formula Incubation time 1hr 3hr 5hr plaque formation/plate C. sakazakii 8.0X10 6 CFU/mL 4.2X10 3 CFU/mL Vegetable juice 158 too many too many 35 too many too many Incubation time 1hr 3hr 5hr plaque formation/plate C. sakazakii 7.7X10 5 CFU/mL 8.9X10 2 CFU/mL - 89 too many - 9 too many

129 라. Cronobacter spp. 분리주를대상으로한식품적용 Cronobacter spp. 분리주를대상으로하여숙주를저해하는용균성파지의수가많은것부터적을것들을임의로결정해용균성파지 cocktail을이용해조제분유에적용하여검출하고자하였다. 사용된 Cronobacte spp. 는 KYU14, KYU51, KYU53, KYU72, KYU116, KYU129를사용하여약 2 log CFU/mL 수준으로접종한후시간에따라검출되는 plaque를확인하여검출정도를확인한결과는 Table 12 와같다. 그결과 1시간배양시에는모든분리주에서 plaque를확인할수없었으나, 3시간이후에는 20~111개의 plaque를확인할수있었다. 그리고 5시간이후에는모든분리주들에서매우많은수의 plaque가나타났다. 따라서본연구를통해분리된용균성파지 cocktail을이용해 Cronobacter spp. 를약 2 log CFU/mL 수준까지검출이가능하였으며, 전체적으로실험이수행되는데걸리는시간은약 20 시간미만으로예상되며용균성파지의가장큰장점이자단점인높은숙주특이성때문에매우효과적인검출방법이될것으로사료된다. 따라서전통적인배양방법에의한검출과본연구를수행하여확인한결과와비교하면, 전통적인배양방법에의한검출의경우증균과생화학적특성분석을위해최소일주일이란오랜시간과많은비용이소모되고이와함께전문적인지식이필요한반면, 본연구에수행했던 phage amplification assay의경우비전문인이라도 plaque의형성유무를확인하게되는간단한실험방법과함께짧은시간에도특이적인검출이가능할것 이다. 그리고 PCR 의경우는 검출의특이성과시간적인측면에서많이이용되고 있으나, 일반식품업체등에서수행하는데있어초기에고비용이소요되고, 전문적인지식을필요로하는연구인력이요구되는단점이있다. 또한본연구에서얻어진결과를토대로식품에따른추가적인연구와검출을위한최적에조건에대한설정등이수반된다면보다다양한식품에적용할수있을것으로판단되며, 현재시판중인 Mycobacteria 검출용 kit에서처럼상용 kit 형태로연구개발한다면산업적으로높은수익이발생할것이다

130 Table. 12. Detection of Cronobacter spp. isoaltes by virulent phage cocktails in infant milk formula Incubation time 1hr 3hr 5hr plaque formation/plate KYU14-72 too many KYU51-82 too many KYU KYU KYU KYU too many KYU

131 제 5 절 C. sakazkaii 길항성유산균및 Bifidobacterium 분 리 1. 재료및방법 가. 발효식품으로부터유산균의분리 김치에서유산균을분리하기위해집과식당, 시중에파는김치와타락에서유산균을분리하였다. 총 sample은 10개로유산균수측정을위해사용한배지는 BCP 첨가평판측정용한천배지 (Plate Count Agar with Brom Cresol Purple), BCP 첨가한 MRS배지를사용했다. 이배지에식품으로부터분리한시료를적정한승수로희석 한균주를접종하여도말후접종이끝난 Plate Count Agar with Brom Cresol Purple 배지와 BCP 첨가한 MRS배지는 35~37 에서 72±3시간배양한후발생한황색의집락을유산균의집락으로확인하였다. Sample에서분리한유산균의집락을미리배양한표준균주의집락과비교하여크기와모양에따라분류하고, 생화학적특성확인을위해 3% KOH용액을이용하여 Gram 양 / 음성 test와 catalase test를기본적으로수행하였다. 다음으로 API 50 CHL Kit 이용하여당자화성등의특성분석을통해동정실험을하였다. API 50 CHL Kit에접종하기위해 20시간전에배양한유산균을멸균생리식염수를이용하여 10 진희석하였다. 희석한배양액을 Kit에접종하여각검출키트는 10배의희석균수를갖게된다. 접종양은 Kit에서지시하는양만큼을접종한다. 접종한뒤배양기에넣고 48시간후 Kit의색변화를관찰하고, BioMerieux 사에서제공하는동정 program을이용하여판독하고유산균을일차적으로분리하였다. 나. 발효식품으로부터 Bifidobacterium 의분리 발효식품으로부터 Bifidobacterium 의분리를위해유산균과유사한방법으로수행 하였으며, 추가적으로 16s rrna sequence 를통해 homology 분석으로통해최종적

132 으로 Bifidobacterium 를선발하였다. 다. 분리된유산균및 Bifidobacterium 에의한 C. sakazkaii 의길항작용 김치등의발효식품으로부터분리한 Bifidobacterium와유산균들이 C. sakazkaii 를효과적으로저해가가능한지에대한실험은수행하였다. 유산균과 Bifidobacterium를 L-cystein이포함된 MRS broth(mrsc broth) 에접종한후혐기적조건에서 3회활성화시킨후 100mL의 MRSC broth에접종하여혐기적조건에서배양하였다. 그리고배양상등액으로부터 bacteriocin을얻기위해 chloroform을이용하는방법으로추출하여 C. sakazkaii에저해정도를 double agar overlay 방법으로확인하였다. Bifidobacterium BF-8과 Bifidobacterium BF2-29를 MRS broth에서배양한후원심분리하고상등액을제균한후 ph7.0으로조정한배양액과 ph7.0으로조정하지않은상등액을각각 C. sakazakii의생육억제정도를흡광도를측정하여비교하였다. 또한고농도의농축을위해유기용매추출법대신동결건조를하여수행하였다. Bifidobacterium BF-8과 Bifidobacterium BF2-29를 100mL MRS broth에서배양한후원심분리하고상등액을취해 ph7.0으로조정하고 0.22um membrane filter를이용제균하고, 동결건조를통해농축하였다. 동결건조를수행후이를멸균수를이용해현탁한후농도에따른 C. sakazakii의생육억제효과를흡광도를측정하여확인하였다. 또한동결건조된배양상등액을 LB broth와조제분유에각각혼합하고 C. sakazakii를접종하였을때의생육도를시간에따라 DFI agar에 10진희석하여도말하여확인하였다. 라. 선발균주의생육특성분석 (1) 선발균주의생육에대한탄소원의영향 C. sakazaki 균주에대한항균활성이우수한것으로선정된 BF-8, BF-29의효과적인생산을위하여균주의성장에대한탄소원의영향을평가하였다. 기본배지로는 Lactobacilli MRS broth의기본조성 (Table 13) 을바탕으로 dextrose를다양한탄소원으로대체하여시간별생육을평가하였다. Starter는동일한배지 (Hardy

133 Diagnostics 사, 미국 ) 에 18시간배양하여활성화한것을사용하였고각각의배지에 1% (v/v) 이되도록첨가하여시간별로 OD를측정하였다. 각각탄소원의농도는 2% 로하였으며사용한탄소원으로는 Sucrose, Lactose, Dextrose, 액상과당, Frucro-oligosaccharide, Xylo-oligosaccharide, Rhamnose, Galacto-oligosaccharide, Arabinose, Maltodextrin, 결정과당, Pectin 등을사용하였다. 초기 ph는 6.5로조정하여 37 에서혐기적으로배양하였다. 모든실험은동일한조건에서 3회반복하여실시한후평균값을구하였다. (2) 선발균주의생육에대한질소원의영향 1차탄소원연구를수행하면서각탄소원에서배양한배양액의 C. sakazaki 균주에대한항균활성을평가하여상대적으로활성이우수한것으로나타난 BF-8 에대하여최적질소원을탐색하고자하는연구를수행하였다. 탄소원은 maltodextrin 혹은액상과당을 2% 첨가하여배지를제조하고질소원으로는다양한펩톤류 (Fish peptone, Beef extract, soy peptone, Proteose peptone) 를 1% 혹은 2% 되도록 Table 14와같이배합하여제조하였다. BF8균주는 lactobacilli MRS broth에 18h 배양하여활성화한후배양액에 1% v/v이되도록접종하였다. 배지의초기 ph는 6.5가되도록조정한후 37 에서혐기적으로배양하였다

134 Table 13. Composition of Lactobacilli MRS broth. Composition Source Grams/Litre % Dextrose Carbon source 20 2 Meat Peptone Nitrogen source 10 1 Beef Extract Nitrogen source 10 1 Yeast Extract Nitrogen source Sodium Acetate Growth factor Disodium Phosphate Buffer Ammonium Citrate Growth factor Tween 80 Growth factor Magnesium Sulfate Growth factor Manganese Sulfate Growth factor L-cysteine HCl Reduction agent

135 Table 14. Composition of modified MRS broth Composition Source Grams/Litre % maltodextrin or fructose syrup Carbon source 20 2 Nitrogen source group(Ⅰ) Nitrogen source 10 1 Nitrogen source group(Ⅱ) Nitrogen source 10 1 Yeast Extract Nitrogen source Sodium Acetate Growth factor Disodium Phosphate Buffer Ammonium Citrate Growth factor Tween 80 Growth factor Magnesium Sulfate Growth factor Manganese Sulfate Growth factor L-cysteine HCl Reduction agent

136 마. Bifidobacterium BF-8 의 bacteriocin 의정제 동결건조한시료를 1 ml 의 3 차증류수에녹이고 0.45 μm 여과지를통해여과한 후 0.1% trifluroacetic acid 용액으로평형화시킨 C18 칼럼에주입하여역상 HPLC 로분리하였다. 실험에사용한조건은다음과같다. <Conditions of HPLC analysis> - Mobile phase: 0.1% TFA (trifluroacetic acid) in H₂O (A pump) - Gradient: 0-100% acetonitrile with 0.1% TFA (B pump) - Running time: 40 min - Flow rate: 1 ml/min - Fraction volume: 1 ml - Injection volume: 50 ul - Column temp.: RT - Detection wavelength: 280 nm <Column> - ACE 5 C 18 column (particle size: 3 um; 4.6x150 mm) 바. Bifidobacterium BF-8 의 cell cytotoxicity 분리된 Bifidobacterium BF-8의 Hep-2 cell에서의 cytotoxicity를확인을위해 MTT assay를통해수행하였다. Hep-2 cell을 haemacytometer를사용하여 cell 수를확인한후 96 well plate에 cell을분주하고 Bifidobacterium BF-8의배양상등액과 Bifidobacterium BF-8의 pellet을 PBS buffer로현탁한후약 6 log CFU/mL 수준으로각각 well에첨가한다. 그리고 2시간, 4시간배양한후시료를제거하고각 well에 MTT soultion을첨가한후 4시간동안추가적으로배양한후 MTT soulution을제거하고 DMSO를첨가한다. 그리고 15분동안 shaker를이용충분히혼합한후 ELISA reader를사용하여흡광도 540nm에서측정하였다

137 사. Pilot 생산 선발균주를 8ml MRS 배지에서 1차활성화를거친후 500mL MRS 배지에서 2차화성화하고 5L에서 3차활성화를거친후 50L에서배양하면서시험생산을실시하였다. 5L 부터는최적조건으로선정된배지조성을적용하였으며 4N NaOH로 ph를 5.0으로일정하게유지하며혐기적인배양을실시하였다. OD의측정은 Trucell로 on-line monitoring 하였다. 출력은 4mA를기준으로설정되었다

138 2. 결과및고찰 가. 발효식품으로부터유산균의분리 김치와타락에서분리한유산균의심집락은평균 10 5 CFU/g 의수준으로나타났 으며, MRS에서생육한집락의형태학적인특성에따라분리한후 Gram test, catalase test, 현미경관찰을통해형태학적특성확인등을통해유산균으로의심되는균을선발하였다. 그리고 API 50 CHL kit를이용하여당자화성등의생화학적특성을확인하고그결과를동정프로그램을통해확인하였으며, 동정결과 (%) 가 85% 이상인균주만을선별하였다. 그결과 Lactobcillus curvatus, Leuconotoc mesenteroides, Lactococcus lactis, Weissella confusa, Lactobacillus fermentum, Streptcoccus thermophilus, Lactobacillus plantarum를각각분리하였다

139 Table 15 Identification of lactic acid bacteria by API CHL kit GLY ERY ? DARA LARA RIB DXYL ? LXYL ADO MDX GAL GLU FRU MNE SBE RHA DUL DUL INO MAN ? SOR MDM MDG NAG AMY - -? ARB ESC

140 SAL CEL MAL +? LAC MEL SAC TRE INU MLZ RAF AMD GLYG XLT GEN TUR LYX TAG DFUC LFUC DARL LARL GNT ? KG KG ? be hard to distinguish Lactobacillus curvatus: 1, 2, 3, 7, 8, Lactococcus lactis: 6, 12, Lactobacillus fermentum: 13, Weissella confusa: 9, 10, 14, Leuconstoc mensenteroides: 4, 5, 16 Streptcoccus thermophilus: 15, Lactobacillus plantarum: 11,

141 나. 유아분변으로부터 Bifidobacterium 의분리 유아분변으로부터의심되는 Bifidobacterium strains 들중최종적으로선정된 16 개균주 들을 16S rrna analysis, carbohydrate fermentation pattern(api test), Morphology 다음과 같은방법에의하여동정하였다

142 Table S rrna Analysis identified BF8 Organism & Strain Query coverage E-Value Max identity Bifidobacterium animalis 98% % Bifidobacterium animalis strain JSQ1 98% % Bifidobacterium animalis strain LZCL 98% % Bifidobacterium animalis 98% % Bifidobacterium animalis YIT % % Bifidobacterium animalis YIT % % Bifidobacterium lactis YIT % % B.lactis 98% % Bifidobacterium adolescentis strain KLDS % % Bifidobacterium sp 98% % Bifidobacterium infantis Y1 98% % Bifidobacterium animalis 98% % Bifidobacterium choerinum 98% % Bacterium ic % % Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum 98% % Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum 98% % Bifidobacterium pseudolongum 98% % Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum 98% % Bifidobacterium pseudolongum 98% % Bifidobacterium gallicum 98% % Bifidobacterium longum strain THT % % Bifidobacterium longum strain BG3 98% % Bifidobacterium longum strain BG 98% % Bifidobacterium longum NCC % % Bifidobacterium sp. group III-3 98% % Bifidobacterium sp. BBDP69 98% % Bifidobacterium longum strain SB11 98% % Metascardovia tsurumii 98% % Bifidobacterium animalis

143 Table S rrna Analysis identified BF2-29 Organism & Strain Query coverag e E-Value Max identity Bifidobacterium pseudocatenulatum 97% % Bifidobacterium sp. h12 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis strain KLDS % % Bifidobacterium catenulatum 97% % Bifidobacterium sp. oral strain A32ED 97% % Bifidobacterium pseudocatenulatum 97% % Bifidobacterium dentium 97% % Bifidobacterium angulatum 97% % Bifidobacterium ruminantium 97% % Bifidobacterium merycicum 97% % Bifidobacterium sp % % Bifidobacterium scardovii 97% % Bifidobacterium adolescentis ATCC % % Bifidobacterium sp. TM-7 97% % Bifidobacterium adolescentis isolate L % % Bifidobacterium adolescentis clone nru-5 97% % Bifidobacterium adolescentis clone nru-1 97% % Bifidobacterium sp. PL1 97% % Bifidobacterium bifidum strain klds % % Bifidobacterium bifidum 97% % Bifidobacterium bifidum KCTC % % Bifidobacterium pullorum 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis strain THT % % Bifidobacterium bifidum strain THT % % Bifidobacterium infantis 97% % Bifidobacterium longum strain THT % % Bifidobacterium breve strain BGM6 97% % Bifidobacterium longum strain SB11 97% % Bifidobacterium longum strain BG3 97% % Bifidobacterium longum strain BG 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis 97% % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium pseudocatenulatum

144 Table S rrna Analysis identified BF2-31 Organism & Strain Query coverage E-Value Max identity Bifidobacterium longum strain THT % % Bifidobacterium longum strain BG3 97% % Bifidobacterium longum strain BG 97% % Bifidobacterium longum NCC % % Bifidobacterium longum strain SB11 97% % Bifidobacterium longum strain SB11 97% % Bifidobacterium longum strain KLDS % % Bifidobacterium longum strain KB 6 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis strain BT1 97% % Bifidobacterium infantis strain KB 10 97% % Bifidobacterium longum 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis strain THT % % Bifidobacterium infantis 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis 97% % Bifidobacterium longum strain PFK1 97% % Bifidobacterium breve strain BGM6 97% % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain KB 92 97% % Butyrate-producing bacterium T % % Bifidobacterium breve strain BR2 97% % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium longum ATCC % % Bifidobacterium longum `

145 Table S rrna Analysis identified BF2-41 Organism & Strain Query coverage E-Value Max identity Bifidobacterium longum strain THT % % Bifidobacterium longum strain BG3 97% % Bifidobacterium longum strain BG 97% % Bifidobacterium longum NCC % % Bifidobacterium longum strain SB11 97% % Bifidobacterium sp. group III-3 97% % Bifidobacterium longum strain KLDS % % Bifidobacterium longum strain KB 6 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis strain BT1 97% % Bifidobacterium infantis strain KB 10 97% % Bifidobacterium longum 97% % Bifidobacterium longum THT % % Bifidobacterium infantis 97% % Bifidobacterium longum bv. Infantis 97% % Bifidobacterium longum strain PFK1 97% % Bifidobacterium breve strain BGM6 97% % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium breve strain KB 92 97% % Butyrate-producing bacterium T % % Bifidobacterium breve strain BR2 97% % Bifidobacterium breve strain JCM % % Bifidobacterium longum ATCC % % Bifidobacterium longum

146 Figure 44. Fermentation patterns of BF8 were determined by API 50CHL system [0] Control [1] Glycerol [2] Erycerol [3] D-Arabinose [4] L-Arabinose [5] L-Ribose [6] D-Xylose [7] L-Xylose [8] D-Adonitol [9] Methyl-βD-Xylopyranoside [10] D-Galactose [11] D-Glucose [12] D-Fructose [13] D-Mannose [14] L-Sorbose [15] L-Rhammose [16] Dulcitol [17] Inositol [18] D-Mannitol [19] D-Sorbitol [20] Methyl-αD-Mannopyranoside [21] Methyl-αD-Glucopyranoside [22] N-Acetylglucosamine [23] Amygdalin [24] Arbutin [25] Esculin ferric citrate [26] Salicin [27] D-Cellobiose [28] D-Maltose [29] D-Lactose [30] D-Melibiose [31] D-Saccharose [32] D-Trehalose [33] Inulin [34] D-Melezitose [35] D-Raffinose [36] Amidon(starch) [37] Glycogen [38] Xylitol [39] Gentiobiose [40] D- Turanose [41] D-Lyxose [42] D-Tagatose [43] D-Fucose [44] L-Fucose [45] D-Arabitol [46] L-Arabitol [47] Potassium gluconate [48] Potassium 2-Ketogluconate [49] Potassium 5-Ketogluconate

147 [0] Control [1] Glycerol [2] Erycerol [3] D-Arabinose [4] L-Arabinose [5] L-Ribose [6] D-Xylose [7] L-Xylose [8] D-Adonitol [9] Methyl-βD-Xylopyranoside [10] D-Galactose [11] D-Glucose [12] D-Fructose [13] D-Mannose [14] L-Sorbose [15] L-Rhammose [16] Dulcitol [17] Inositol [18] D-Mannitol [19] D-Sorbitol [20] Methyl-αD-Mannopyranoside [21] Methyl-αD-Glucopyranoside [22] N-Acetylglucosamine [23] Amygdalin [24] Arbutin [25] Esculin ferric citrate [26] Salicin [27] D-Cellobiose [28] D-Maltose [29] D-Lactose [30] D-Melibiose [31] D-Saccharose [32] D-Trehalose [33] Inulin [34] D-Melezitose [35] D-Raffinose [36] Amidon(starch) [37] Glycogen [38] Xylitol [39] Gentiobiose [40] D- Turanose [41] D-Lyxose [42] D-Tagatose [43] D-Fucose [44] L-Fucose [45] D-Arabitol [46] L-Arabitol [47] Potassium gluconate [48] Potassium 2-Ketogluconate [49] Potassium 5-Ketogluconate

148 Figure 46. Fermentation patterns of v were determined by API 50CHL system [0] Control [1] Glycerol [2] Erycerol [3] D-Arabinose [4] L-Arabinose [5] L-Ribose [6] D-Xylose [7] L-Xylose [8] D-Adonitol [9] Methyl-βD-Xylopyranoside [10] D-Galactose [11] D-Glucose [12] D-Fructose [13] D-Mannose [14] L-Sorbose [15] L-Rhammose [16] Dulcitol [17] Inositol [18] D-Mannitol [19] D-Sorbitol [20] Methyl-αD-Mannopyranoside [21] Methyl-αD-Glucopyranoside [22] N-Acetylglucosamine [23] Amygdalin [24] Arbutin [25] Esculin ferric citrate [26] Salicin [27] D-Cellobiose [28] D-Maltose [29] D-Lactose [30] D-Melibiose [31] D-Saccharose [32] D-Trehalose [33] Inulin [34] D-Melezitose [35] D-Raffinose [36] Amidon(starch) [37] Glycogen [38] Xylitol [39] Gentiobiose [40] D- Turanose [41] D-Lyxose [42] D-Tagatose [43] D-Fucose [44] L-Fucose [45] D-Arabitol [46] L-Arabitol [47] Potassium gluconate [48] Potassium 2-Ketogluconate [49] Potassium 5-Ketogluconate

149 Figure 47. Fermentation patterns of BF2-31 were determined by API 50CHL system [0] Control [1] Glycerol [2] Erycerol [3] D-Arabinose [4] L-Arabinose [5] L-Ribose [6] D-Xylose [7] L-Xylose [8] D-Adonitol [9] Methyl-βD-Xylopyranoside [10] D-Galactose [11] D-Glucose [12] D-Fructose [13] D-Mannose [14] L-Sorbose [15] L-Rhammose [16] Dulcitol [17] Inositol [18] D-Mannitol [19] D-Sorbitol [20] Methyl-αD-Mannopyranoside [21] Methyl-αD-Glucopyranoside [22] N-Acetylglucosamine [23] Amygdalin [24] Arbutin [25] Esculin ferric citrate [26] Salicin [27] D-Cellobiose [28] D-Maltose [29] D-Lactose [30] D-Melibiose [31] D-Saccharose [32] D-Trehalose [33] Inulin [34] D-Melezitose [35] D-Raffinose [36] Amidon(starch) [37] Glycogen [38] Xylitol [39] Gentiobiose [40] D- Turanose [41] D-Lyxose [42] D-Tagatose [43] D-Fucose [44] L-Fucose [45] D-Arabitol [46] L-Arabitol [47] Potassium gluconate [48] Potassium 2-Ketogluconate [49] Potassium 5-Ketogluconate

150 Figure 48. Fermentation patterns of BF2-41 were determined by API 50CHL system [0] Control [1] Glycerol [2] Erycerol [3] D-Arabinose [4] L-Arabinose [5] L-Ribose [6] D-Xylose [7] L-Xylose [8] D-Adonitol [9] Methyl-βD-Xylopyranoside [10] D-Galactose [11] D-Glucose [12] D-Fructose [13] D-Mannose [14] L-Sorbose [15] L-Rhammose [16] Dulcitol [17] Inositol [18] D-Mannitol [19] D-Sorbitol [20] Methyl-α D-Mannopyranoside [21] Methyl-α D-Glucopyranoside [22] N-Acetylglucosamine [23] Amygdalin [24] Arbutin [25] Esculin ferric citrate [26] Salicin [27] D-Cellobiose [28] D-Maltose [29] D-Lactose [30] D-Melibiose [31] D-Saccharose [32] D-Trehalose [33] Inulin [34] D-Melezitose [35] D-Raffinose [36] Amidon(starch) [37] Glycogen [38] Xylitol [39] Gentiobiose [40] D- Turanose [41] D-Lyxose [42] D-Tagatose [43] D-Fucose [44] L-Fucose [45] D-Arabitol [46] L-Arabitol [47] Potassium gluconate [48] Potassium 2-Ketogluconate [49] Potassium 5-Ketogluconate

151 다. 유산균과 Bifidobacterium 의 C. sakazkaii 에대한저해효과 분리된 Bifidobacterium strain 들의 C. sakazkaii에대한저해효과를확인한결과는 Fig. 49와같다. Bifidobacterium가생산하는 bacteriocin(-like substance) 을 C. sakazkaii가접종된 5mL TSB에추출한 bacteriocin(-like substance) extract를접종후시간에따른생육을비교한결과는 Fig. 50과같다. 기존에보고된 Bifidobacterium 관련된 bacteriocin 혹은 bacteriocin like substance들은 Bifidobacterium bifidum에서최초로발견된이후다양한 Bifidobacterium spp. 에서보고되고있으며, pathogenic E. coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica 등다양한 host spectrum을나타내는것으로보고되고있다. 하지만 C. sakazkaii를저해하는 Bifidobacterium에대한보고는없었으나, 본연구를통해발효식품에서분리된 Bifidobacteia가생산하는 bacteriocin(-like substance) 에서 C. sakazkaii를특이적으로저해하는것을확인할수있었다. 따라서이를이용하여 sanitizer, 식품첨가물, 정장제등으로의이용할수있을것으로판단된다. 그리고분리된 L. lactis, L. fermentum, L. mesenteroides, L. curvatus, W. confusa 등에의한 C. sakazkaii의대한저해효과를확인한결과, 분리된유산균들에의한 C. sakazkaii에대한저해효과는없는것으로보여지나, 저해를위한 bacteriocin 분비의최적조건을위한추가적인확인이필요할것이라사료된다

152 Fig. 49. Inhibition of C. sakazkaii by bacteriocin of Bifidobacterium isolates

153 Fig. 50. Growth inhibition of C. sakazkaii by bacteriocin(-like substance) of Bifidobacterium isolates

154 발효식품등으로부터분리된다양한 Bifidobacterium와젖산균들중상대적으로 C. sakazakii에대한항균효과가좋은 Bifidobacterium BF8, Bifidobacterium BF2-29, Leuconostoc mescenteroides LAB kw5, Streptococcus thermophilus LAB kw15를 Cronobacter spp. 의감소효과를확인하고자하였다. Bifidobacterium와젖산균배양액을원심분리후상등액을취해 ph 7.0으로조정한후조정하지않은상등액을제균하여이를희석하여 microplate에접종한후시간에따른 C. sakazakii의생육억제정도를확인하였다. 실험결과 ph 7.0으로조정한상등액의경우 C. sakazakii의억제정도가미미한것으로나타났으며, ph 7.0으로조정하지않은상등액의경우저해효과가나타났다 (Fig. 51, 52). 이는 Bifidobacterium가생산하는다양한유기산들에의한것이거나, bacteriocin like substance의활성이매우낮던지농도가매우낮아나타나는현상으로판단된다

155 Fig. 51. Growth inhibition of C. sakazakii by supernatant of Bifidobacterium spp

156 Fig. 52. Growth inhibition of C. sakazakii by supernatant of L. mescenteroides LAB kw5 and S. thermophilus LAB kw

157 Cronobacter spp. 에대해항균효과를젖산균과 Bifidobacteria 들중젖산균의경우유사한결과가있었기때문에본연구에서는 Bifidobacteria를중심으로진행하였다. 따라서 Bifidobacterium spp. 의배양상등액농도를높여저해효과를확인하기위해배양상등액을 ph 7.0으로조정한후동결건조를수행하고이를 1g/mL 에농도로현탁한후희석해서이용하여 C. sakazakii의저해효과를 microplate를이용하여확인하고자하였으며, 또한 C. sakazakii의 viable cell을 DFI agar에 10진희석하여도말한후 24시간후에집락을계수한결과는 Fig. 53과같다. 배양상등액을동결건조한후이를이용해생육저해를확인한결과약 40mg/mL의농도에서 C. sakazakii의생육이되지않았음을확인하였으며, 또한이때의 C. sakazakii의 viability를 DFI agar에도말하여확인한결과 6시간이후에 C. sakazakii가검출되지않았다 (Fig. 54). 따라서앞서결과에서 bacteriocin의낮은활성으로인해고농도로농축을통해 C. sakazakii를제어할수있을것으로판단된다. 그리고실제조제분유와배양상등액을동결건조한것을혼합하여 C. sakazakii의저해효과를확인한결과에서는조제분유에서는 C. sakazakii가 6시간이후에는약 7 log CFU/mL 수준으로증가하였으나, Bifidobacterium spp. 의동결건조한것을혼합했을경우초기균수인 4 log CFU/mL수준이유지되는것을확인할수있었다 (Fig. 55). 이는조제분유와동결건조한것이혼합되면서실제식품에서는효과가감소함을알수있었다. 따라서조제분유의성분과 Bifidobacterium spp. 의배양상등액의조성에대한추가연구가필요할것으로사료된다

158 Fig. 53. Growth inhibition of C. sakazakii by lyophilized supernatant of Bifidobacterium spp

159 Fig. 54. Viability loss of C. sakazakii by lyophilized supernatant of Bifidobacterium spp

160 Fig. 55. Viability of C. sakazakii in infant milk formula with lyophilized supernatant of Bifidobacterium spp

161 라. 선발균주의생육특성분석 (1) Bifidobacterium BF8의생육에대한탄소원의영향각탄소원에대한 Bifidobacterium BF8의성장을관찰한결과 sucrose, maltodextrin, fructose syrup 등이가장우수한생육을보였다. 반면 rhamnose, arabinose, 결정과당등에서는성장을관찰할수없었다. sucrose는성장속도가가장빠르게나타났으며 maltodextrin의경우는성장속도는느렸지만최대의 OD 값을나타내었다. 액상과당은비교적우수한생육을보인데반하여결정과당은거의성장에기여하지못하여흥미로운결과를보였다. 16시간경과후 OD값에서는 sucrose가가장높게나타났지만배양액에서의생균수를측정한결과 maltodextrin에서가장높은 2.55X10 9 CFU/ml을보였다. 따라서 BF8의고농도배양과효율적인생산을위해서는탄소원으로는 maltodextrin이가장우수할것으로판단되었다

162 Table 20. Growth of Bifidobacterium sp. BF8 on various carbon sources. 1) 2) control 1 12h 2 14h 16h 18h final ph MRS (Hardy) Sucrose Lactose Dextrose fructose syrup Fructo oligosaccharide Xylo oligosaccharide Rhamnose Galacto oligosaccharide Arabinose Maltodextrin 결정과당 Pectin control means the OD of each medium at starting point. OD at each time - each control

163 Table 21. Viable count of Bifidobacterium sp. BF8 at 16hr. * 10 7 cfu/ml Mean 169 MRS Sucrose Dextrose fructose syrup Maltodextrin X X X X X

164 Fig. 56. Growth curve of Bifidobacterium sp. BF8 according to each carbon sources

165 (2) Bifidobacterium sp. BF29의생육에대한탄소원의영향 BF8과동일한방법으로각탄소원에대한 Bifidobacterium sp. BF29의성장을관찰한결과 BF8과는다르게 Fructooligosaccharide, fructose syrup, lactose 등에서우수한성장을보였다. 반면에 rhamnose, arabinose, 결정과당에서는저조한생육을보였다. 16시간경과후에배양액에서의생균수를측정한결과액상과당에서가장높은 3.12*10 9 CFU/ml을나타내었다

166 Table 22. Growth of Bifidobacterium sp. BF29 on various carbon sources. control 1) 12h 2) 14h 16h 18h final ph MRS (Hardy) Sucrose Lactose Dextrose 액상과당 Fructo oligosaccharide Xylo oligosaccharide Rhamnose Galacto oligosaccharide Arabinose Maltodextrin 결정과당 Pectin ) control means the OD of each medium at starting point. 2) OD at each time - each control

167 Table 23. Viable count of Bifidobacterium sp. BF29 at 16hr. * 10 7 cfu/ml Mean 212 Lactose 액상과당 Fructooligosaccharide * * *

168 Fig. 57. Growth curve of Bifidobacterium sp. BF29 according to each carbon sources

169 (3) Bifidobacterium sp. BF8 의생육에대한질소원의영향 탄소원을 maltodextrin 혹은 fructose syrup으로고정하고다양한질소원을농도별로조합하여배양한결과 Fish peptone+beef extract, Beef extract+soy peptone, soy peptone+proteose peptone을조합이우수한것으로나타났으며그중에서도 maltodextrin 2% 에 soy peptone과 proteose peptone의조합이 OD값과생균수 (2.14X10 9 CFU/ml) 에서가장높게나타났다

170 Table 24. Growth of Bifidobacterium sp. BF8 on various combination of nitrogen sources with maltodextrin as carbon source. * F: Fish peptone, B: Beef extract, S: soy peptone, P: proteose peptone

171 Table 25. Viable count of Bifidobacterium sp. BF8 in the modified MRS medium (maltodextrin) at 16hr. * 10 7 cfu/ml Mean Fish+Beef Beef+Soy Soy+Proteose * * *

172 Fig. 58. Growth curve of Bifidobacterium sp. BF8 according to maltodextrin and various nitrogen combinations

173 Table 26. Growth of Bifidobacterium sp. BF8 on various combination of nitrogen sources with fructose syrup as carbon source all fish all beef all soy all proteose F+B F+S F+P B+S B+P S+P 초기배지 평균 h 초기뺀값 h 초기뺀값 h 초기뺀값 * F: Fish peptone, B: Beef extract, S: soy peptone, P: proteose peptone

174 Table 27. Viable count of Bifidobacterium sp. BF8 in the modified MRS medium (fructose syrup) at 16hr. 생균수 (7 승 ) 평균 Fish+Beef Fish+Proteose Beef+Soy * * *

175 Fig. 59. Growth curve of Bifidobacterium sp. BF8 according to fructose syrup and various nitrogen combinations

176 마. Bifidobacterium BF-8 의 bacteriocin like substance 의분리 C. sakazakii에대한상대적으로높은항균효과를나타냈던 Bifidobacterium BF-8에대한 bacteriocin like substance를분리하기위해동결건조된배양상등액을 HPLC를통해분리정제하고자하였으며, 그결과는 Fig. 60과같다. 배양상등액을동결건조한것을 HPLC를이용해분획한결과 bactericin like substance 로확인하지못하였다. 최근다양한 Bifidobacterium 가생산해내는 bacteriocin에대한연구가진행중에있다. 보고에따르면일반적으로알려져있는다른젖산균들의 bacteriocin과유사하게분자량이 10kDa 미만의크기인것과분자량이 100 kda 이상되는것도보고되고있다. 따라서본연구에서수행했던 Bifidobacterium BF-8의경우도분자량이매우커서불안정하기때문에분리가되지않았을가능성이있으며, 따라서보다다양한실험을통해분리, 정제가추가적으로수행되야할것으로판단된다

177 Fig. 60. Purification of bacteriocin like substance from lyophilized supernatant of Bifidobacterium BF-8 by HPLC

178 바. Bifidobacterium BF-8 에대한 cell cytotoxicity Bifidobacterium BF-8의안전성에대한연구를위해 Hep-2 cell을사용하여 MTT assay를수행하여확인한결과는 Fig. 61과같다. Bifidobacterium BF-8을배양한후배양액을원심분리하여 cell pellet을 PBS buffer로현탁한것과배양상등액을 Hep-2 cell 접종하여 1시간, 4시간이후에 MTT assay를수행하여 Hep-2 cell에미치는영향은배양상등액과 Bifidobacterium BF-8 cell 모두 1시간이후에는 control에비해다소높은수치를나타내고있었다. 그리고 4시간이후에는 control에비해약간감소하는것을확인하여 Bifidobacterium BF-8은 Hep-2 cell 에낮은 cytotoxicity를나타내고있었다. 특히 Bifidobacteria의경우젖산균과마찬가지로 GRAS로인식되고있어서, 안전성에대한문제는배제가가능하리라사료된다

179 Fig. 61. Cytotoxicity of Bifidobacterium BF-8 by MTT assay in Hep-2 cell

180 사. Pilot 생산배양 배양결과초기의유도기를거쳐약 3시간후부터는대수기에접어들어 13시간만에정체기에도달하였다. 또한이를회수하여동결건조하여생균수 1.5X10 11 CFU/g 수준의시제품을생산할수있었다. 이는기존에당사에서상업용으로생산하고있는균주들과유사한성장속도와수율을보이는것으로판단되어제품화에큰문제가없는것으로보인다

181 Fig. 62. Growth curve of Bifidobacterium sp. BF8 in pilot fermentor

182 (A) (B) Fig. 63. Freeze dried product of Bifidobacterium sp. BF8. (A) freeze dried powder, (B) Aluminum pack

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