Korean Journal of Obstetrics and Gynecology Vol. 48 No. 10 October 2005 새로운악성 Brenner 종양세포주확립 Department of Obstetrics and Gynecology, Catholic Univer

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1 Korean Journal of Obstetrics and Gynecology Vol. 48 No. 10 October 2005 새로운악성 Brenner 종양세포주확립 Department of Obstetrics and Gynecology, Catholic University Medical College, Department of Laboratory Medicine, Ewha Womans University College of Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Objective: Ovarian cancer is the most lethal disease among gynecologic malignancies. Although many efforts have been made to explore the mechanisms involved in its development, the genetic events in the pathogenesis of ovarian cancer are still unclear. We characterized a cell line (designated OHK) established from a malignant Brenner tumor cell. Methods: The cells were obtained during the operation of a 43-year-old Korean woman with ovarian cancer. The OHK cells continuously propagated in vitro over a period of about 36 months and, to date, have undergone over 200 passages, without being infected by either Mycoplasma or any bacteria. We measured the doubling time of OHK cells. To investigate the tumorigenecity of OHK, cells were inoculated subcutaneously into the back of nude mice. Several tumor markers were analyzed using culture media and lysates of cytosol. Morphology and ultrastructure were analyzed by phase-contrast microscopy and electron microscopy. OHK was also analyzed for gene mutation, the typing of human leukocyte antigen and Flow cytometric cell cycle analysis and DNA index. Results: They proliferated in a monolayered sheet showing a pavement-like arrangement without suppression by intercellular contacts. They also formed epithelial cell lining in shapes of polymorphism and polygons. Doubling time was 38.4 hour which was relatively slow compared to other cancer cells. Microscopic view revealed intranuclear infoldings which are typical in malignant Brenner tumors. The OHK cells secreted significantly high level of CA 125 into the culture medium. A 215th codon at exon 4 of p53 was mutated to C/C in OHK. BRCA 1 was a wild type and polymorphisms were detected in exons 2, 10, 11, 14 and 17 of BRCA 2. The cells showed aneuploidy with DNA index of measured by flow cytometry. When transplanted into nude mice, OHK cells successfully induced tumor which was histopathologically resembled malignant Brenner tumor. Conclusion: These results strongly suggest that OHK is a typical cell line of malignant Brenner tumor. This may provide a useful cellular resource for studying the pathogenesis of malignant Brenner tumor. Key Words: Malignant brenner tumor, Cell lines 서 론 악성 Brenner 종양은보통양성 Brenner 종양과이행세포암이동시에보이는상피성난소암의한아형으로, 평균발병연령은 55 세이다. 육안적으로는일부고

2 대한산부회지제48권제10 호, 2005 형성에유두형성부분이있고조직학적으로는침습성이행상피세포를보이는데, 다양한종류의항암화학치료를하고있으나완치는힘든실정이다. 1 그러므로악성 Brenner 종양의발병기전이나치료를위해 in vitro 실험을통한종양의특성파악이필요하다. 악성종양의발생원인및특성을파악하여암의치료를도모할수있는방법을찾는실험적방법은시험관내암세포주배양및유지에서출발한다고할수있다. 2 암세포의배양은정상세포와종양세포의형태와기능비교를위한유익한자료를제공할수있으며, 암세포의배양과정을통해종양의성장속도및분화도, 호르몬생산및의존성여부, 암표지항원의발현및분비, 면역학적진단및치료등종양세포의특징을확인할수있다. 3,4 암세포의단기간배양 (short-term culture) 은그리어렵지않지만, 장기간배양 (long-term culture) 할경우에는계속적인계대와배양액공급에도불구하고세포의원상태를유지하는것이어렵다. 특히암환자조직을이용한일차배양에서수많은실험배양을시행하여도불멸화된세포주를얻기는힘들며, 5 암세포의분화에관련된특성이장기간배양과정에서없어지기도한다. 이러한이유로, 지금까지여러난소암세포주들이보고되고있음에도불구하고난소암세포주들에서나타나는생물학적이상발현규명에적합한단일난소암세포주는없으며, 3 특히악성 Brenner 종양세포주의경우에는지금까지단한종만이보고되어있으나, 악성 Brenner 종양고유의특성이완전히유지되었는지밝혀지지않았다. 6 이에본연구에서는, 악성 Brenner 종양으로부터계대배양에성공한새로운세포주의특성규명을위하여시험관내성장특성, 세포의형태학적특성과초미세구조, 종양표지물질분비, 인체백혈구항원의규명, 발암유전자들의변이여부및생체내종양형성능력을검색하였다. 연구대상및방법 1. Brenner 종양조직의기원 이연구는가톨릭중앙의료원임상연구관리규정과헬싱키선언을준수하여성빈센트병원의임상연구윤리위원회 (IRB) 의인준을거친뒤환자에게서동의서 (informed consent) 를받은후에진행되었다. 확립된난소암세포주는 2002년 3월난소암진단을받은43세여자환자에서추출된종양조직으로부터유래되었으며, 임상병기는 FIGO 분류상 IIIc 기였다. 환자는전자궁적출술및양측자궁부속기절제술, 골반과부대동맥임파절절제술, 그리고대망절제술을시행받았다. 조직학적소견은악성 Brenner 종양이었다. 2. 일차배양과정및세포배양의조건 수술중추출된난소암조직은소독된 60 mm tissue culture dish (Falcon, Bedford, MA, USA) 에서섬유및괴사조직을최대한절제해낸후인산완충용액 (phosphate buffered saline, PBS) 에서 1-2 mm 2 절편이되도록분쇄한후 15% 우태아혈청 (FBS: fetal bovine serum, Gibco, Grand island, NY, USA), 2 mm sodium bicarbonate, penicillin 100 IU/mL, 그리고 streptomycin 100 µg/ml 이함유된 Medium 199 (Gibco, Grand island, NY, USA) 와 MCDB 105 (Sigma, St. Louis, MO) 1:1 혼합배양액을사용하여 37, 5% CO2 세포배양기에서배양시켰다. 단층배양된세포들이배양기바닥에 75% 정도덮였을때 PBS 로2 회세척을한뒤, 1 mm EDTA가함유된0.25% Trypsin 으로처리하여계대 (passage) 시켰다. 계대한종양세포주의 mycoplasma 감염여부를 mycoplasma detection kit (i-mycopcr mycoplasma detection kit, intron) 를이용하여 3 개월간격으로조사하였다. 3. 배양세포의형태학적관찰 배양된세포들은위상차현미경으로관찰하였다. 투과전자현미경표본제작을위하여 0.1 M PBS 완충액 (ph 7.4) 으로조정한 Karnovsky 고정액 (2% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 0.5% CaCl 2 )

3 김현정외 8 인. Establishment of a novel malignant Brenner tumer cell line 으로 6시간이상전고정한후 0.1 M PBS buffer로 2시간수세(washing) 후1.33% OsO 4 로2시간후고정하였다. 후고정된시료는 0.1 M PBS로 10시간수세한뒤 alcohol을이용하여탈수한후 propylene oxide에 10 분간치환하였다. 이어서 EPON mixture (EPON 812, MNA, DDSA, DMP30) 와 propylene oxide 를 1:1 로혼합하여 18시간항온배양하고 EM OVEN에서 3 5 (6 시간), 45 (12 시간) 및 60 (24 시간) 의포매과정(Embedding) 을거친뒤Block을꺼내트리밍하였다. Ultramicrotome을이용하여조직을 0.25 µm 두께로절단하고 1% toluidin blue로염색한뒤광학현미경으로관찰한다음전자현미경으로관찰하고자하는부위를정하여 nm 두께로절단하였다. 절편을 Uranyl acetate와 lead citrate로각각 10분씩염색한후 TEM (transmission electron microscope- Nikon, Japan) 으로관찰하였다. 4. 성장속도계산 성장특성을파악하고자 FBS의농도에따른성장곡선을 Cell Titer 96 Aqueous one Solution cell proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) 를사용하여측정하였다. 96 well plate 의각 well 당 의세포를 100 µl의배지에잘섞어서분주한후 2일간격으로 6 일동안측정하였다. 측정시 20 µl의 MTS solution 을96 well plate 의각well 에넣고, 37 배양기에서 4시간동안배양한후 490 nm에서 ELISA reader (EL311, Bio-tek Instruments, New York, NY, USA) 기를이용하여 OD 값을측정하였다. 배가시간 (population doubling time) 은성장곡선으로부터구하였다. 5. 종양표지물질분비능검사 개의세포를 3일간증식시킨후그배양액을이용하여종양표지물질인 CA-125, CA19-9, carcinoembryonic antigen (CEA), 그리고 CA15-3 의 분비여부를 EIA (enzyme immunoassay) 방법으로검색하였다. 측정은 3 회이상반복실시하였다 인체백혈구항원 (human leukocyte antigen) 검사 HLA ABC DNA typing은 allele specific PCR (polymerase chain reaction)-ssop (sequence specific oligonucleotide probe) 방식을이용하였고, HLA DR DNA typing은 allele specific PCR-SBT (sequencing based typing) 방식을이용하여검사하였다 유전자변이검사 배양세포에서발암유전자인 c-myc, n-myc과종양억제유전자인 BRCA1, BRCA2, 그리고 p53의 exon 4, 5, 6, 7, 8, 9 의변이여부를검사하였다. BRCA1, BRCA2, 그리고 p53 exon 4-9 는 PCR-DHPLC (PCR based denaturing high performance liquid chromatography) 를이용하여조사하였으며, c-myc 과 n-myc 변이조사에는 competitive PCR 을이용하였다 세포내 DNA 양측정 DNA 양은 cycle TESTTM plus DNA reagent kit (Becton dickinson) 를이용하여유식세포분석기로측정하였다 개의세포들을말초혈액단핵세포들과 2 : 1의비율로섞은후250 µl의 solution A (trypsin buffer) 를첨가하여실온에서 10 분간배양하였다. 200 µl의 solution B (trypsin inhibitor and RNase buffer) 를첨가한후실온에서 10 분간배양하였고, 200 µl의 cold solution C (propidium iodide stain solution) 를각각첨가하고잘섞은후 4 에서 10분간배양하였다. 50 m nylon mesh 로여과시킨다음, 유식세포분석기 (flow cytometer) 로 DNA index를측정하였다. 배수성측정은 DNA index 로표현하였으며, 인체말초혈액백혈구들이 DNA 이배성의교정기준으로사

3주후누드마우스로부터적출한종양조직에서 hematoxylineosin (H&E) 염색을시행하였다. 결 과 1. 추출된종양조직세포의형태학적관찰 양측난소모두악성소의종양의크기는배율상약 Brenner 종양이었으며, 좌측난 11.2 7.5 cm 였다. 유사분열은고 20 개를나타냈고, 종양의괴사, 림프관침윤, 정맥침윤은보이지않았다.

4 대한산부회지제48권제10 호, 2005 용되었고, 이배체백혈구의 DNA index는 1.0 이었다. DNA index (DI) 는간질세포의 G0/G1 channel 수에대한종양세포의 G0/G1 channel 수의비율로계산하였다. 10. 누드마우스에서종양형성능력측정 생후 4-5주된 10 마리의누드마우스 (athimic nu/nu on BALB/c background) 의피하부위에 trypan blue dye로염색하여검사상생존도가 95% 이상인 개의세포를 200 µl의 PBS 에섞어주사하였다. 주사후 2일간격으로 7 주간종양크기를측정하였다. 3주후누드마우스로부터적출한종양조직에서 hematoxylineosin (H&E) 염색을시행하였다. 결 과 1. 추출된종양조직세포의형태학적관찰 양측난소모두악성소의종양의크기는배율상약 Brenner 종양이었으며, 좌측난 cm 였다. 유사분열은고 20 개를나타냈고, 종양의괴사, 림프관침윤, 정맥침윤은보이지않았다. 간질침윤과핵주위침윤소견이있었으나, 임파절전이는발견되지않았다. 조직학적소견으로는조밀한섬유성기질들이상피세포를둘러싸고있으며, 크고둥근세포핵과호산구성세포질이관찰되었다 (Fig.1). 2. 세포주의확립 세포배양시작후 5일이지나세포성장이관찰되기시작했다. 세포들은 flask에부착되어서로들사이에중첩되어성장하였으나접촉에의한억제현상은관찰되지않았다. 초기배양시작후 14일째첫계대가시행되었으며현재까지 3년간 200계대이상까지진행되었다. Fig. 1. Histopathologic finding of malignant Brenner tumor. Ovarian tumor mass which was dissected from the patient were stained with hematoxylin-eosin. A. Scattered foci of welldifferentiated tumor was surrounded by dense fibrotic stroma (40 ). B. High magnification view shows large round nuclei and several nucleoli. The epithelial cells are polygonal and of the squamoid type, with pale, eosinophilic cytoplasm and oval nuclei having distinct nuclei and longitudinal grooving, a coffee-bean appearance (400 )

김현정외 8 인. Establishment of a novel malignant Brenner tumer cell line Fig. 2. Microscopic findings of OHK cell line.

OHK showed polygonal shape with a large round nucleus (B) and infolding of the nuclear membrane, a specific feature of malignant Brenner tumor (C, arrow). Magnifications. A, 40x; B, 400x; C, 20,000x.

전자현미경소견상에서는, 세포의핵과세포질비율 (nucleus-cytoplasmic ratio) 이높게나타났으며악성 Brenner 종양세포의특징인핵의주름 (nuclear groove) 이접힌 (infolding) 형태로관찰되었다 (Fig. 2C). 4. 성장특성 었으나 (P<0.

5 김현정외 8 인. Establishment of a novel malignant Brenner tumer cell line Fig. 2. Microscopic findings of OHK cell line. A cell line (OHK) which was successfully established from malignant Brenner tumor was examined using phase contrast (A, B) and electron microscopy (C). OHK showed polygonal shape with a large round nucleus (B) and infolding of the nuclear membrane, a specific feature of malignant Brenner tumor (C, arrow). Magnifications. A, 40x; B, 400x; C, 20,000x. 3. 형태학적특징 위상차현미경소견으로는, 단층으로배양된세포간의접촉에의한억제현상이없었으며, 큰핵을가지고있는다각형형태의상피성형태로나타났다 (Fig. 2A, B). 전자현미경소견상에서는, 세포의핵과세포질비율 (nucleus-cytoplasmic ratio) 이높게나타났으며악성 Brenner 종양세포의특징인핵의주름 (nuclear groove) 이접힌 (infolding) 형태로관찰되었다 (Fig. 2C). 4. 성장특성 었으나 (P<0.05), CA15-3, CA19-9 및 CEA 는차이를보이지않았다 (Table 1). OHK 세포주는 10% 와 15% FBS 에서유사한지수성장곡선을보여주었고, 세포증식의배가시간은약 38.4 시간이었다 (Fig. 3). 5. 종양표지물질검사 계대배양후 3일간배양시킨배양액으로부터종양표지물질을검사한결과,CA125가유의하게높게측정되 Fig. 3. Growth curve of OHK cell line. OHK cells (3 103) were cultured in 96 well tissue culture plates in the media containing 0 ( ), 10 ( ) or 15% ( ) FBS, and cell number was estimated at the indicated times as described in Materials and Methods. Doubling time of OHK cells was 38.4 hr in the media containing 10% FBS

6 대한산부회지제48권제10 호, 2005 Table 1. Concentraion of tumor markers released in the conditioned media 7. 종양유전자의변이검사 Tumor marker # OHK CA CA CA 19-9 <2.0 CEA <0.5 OHK cells were cultured for 3 days, and the concentration of the released tumor markers were measured as described in Materials and Methods. When compared to the normal serum level, OHK released significantly higher concentration of CA125. P<0.05, compared to the normal serum level (<35 U/mL). 6. 인체백혈구항원 (human leukocyte antigen) 검사 1) p53 p53 유전자 exon 4의 215 번째 codon인 G/G 가 OHK 에서 C/C 로변이되었으며, exon 5-9 는 wild type과동일하였다. 2) BRCA1과 BRCA2 OHK의 BRCA 1은 wild type 이었으며, OHK의 BRCA 2에서는 exon 2, 10, 11, 14와 17에서 Table 3과같은다형성 (polymorphism) 이관찰되었다 (Table 3). 3) c-myc 과 n-myc OHK 세포주에서 c-myc 유전자와 n-myc 발암유전자들의변이는관찰되지않았다. Allele specific PCR genotyping 방식을이용하여배양세포의 human leukocyte antigen을분석한결과 HLA class I phenotype들은 A, B와 Cw로나타났으며, HLA class II allele specificity들은allele l에서 DRB1 15, Allele 2에서 DRB1 15 로나타났다 (Table 2). 8. 유식세포분석기를이용한세포내 DNA 양측정 OHK 의 DNA index는 로비배수성(aneuploid) 인 4 배체이하 (hypotetraploid) 로나타났다 (Table 4). 9. 종양형성능력과종양세포의조직학적관찰 Table 2. HLA typing of OHK cell line Locus HLA A HLA B HLA C HLA DR Allele 1 Allele 2 A0201 B4001 Cw0401 DRB115 A2402 B5201 Cw0501 DRB115 OHK 세포주를누드마우스의피하에주사한후종양의형성을관찰하였다.5일째에 0.5cm 2 였으며,21일째에는평균종괴의크기는 2.4cm 2 였다. 조직학적소견으로는다각형형태의상피세포들이편평형의호산구성세포질과크고둥근핵, 그리고 Brenner 종양의특징소견인특징적인핵의주름 (grooving) 이관찰되었다 (Fig. 4)

(Ser 2414 Ser) Exon 17: 8034-14 T to C Exon 22: 8983-66 T to C Missense mutation 고 찰 Fig. 4. Tumorigenic effect of OHK cell line.

7 김현정외 8 인. Establishment of a novel malignant Brenner tumer cell line Table 3. of BRAC 2 gene in OHK cell line Mutation Mutation type Mutation effect Exon 2: G203A (5 UTR) Exon 10: C1342A (His 372 Asn) Exon 11: A3624G (Lys 1132 Lys) Exon 11 : del TTAA Exon 14: A7470G (Ser 2414 Ser) Exon 17: T to C Exon 22: T to C Missense mutation 고 찰 Fig. 4. Tumorigenic effect of OHK cell line. OHK cells ( ) were subcutaneously injected into the back of nude mice, and the formation of tumor mass was examined. At 21 days after the transplatation, tumor size reached 2.4 cm 2 (A), and microscopically, solid and partially cystic epithelial nests which were surrounded by bundles of tightly-packed spindle-shaped cells were shown (B) (400 ). 악성모든난소암중 Brenner 종양은상피성난소암에포함되지만, 1% 미만에해당되는드문암이며, 지금 까지단한종의세포주가보고되었으나, 아직확실하게그특성이규명되지않았고, 6 또한배양과정중에여러가지변화가나타나는종양세포주의특성상새로운악성 Brenner 종양세포주의확립이필요하다. 본연구에서는또다른악성 Brenner 종양세포주인 SNU 과비교해볼때 DNA 양측정, p53, BRCA 1, 2 유전자변이및종양형성능력에대한여러연구를통하여악성Brenner 종양세포주에대해더많은정보를얻을수있었다. 또한배양세포를누드마우스에이종이식시킨후약 3 주만에종괴가형성되었고, 이종괴조직의병리학적형태가원래의악성 Brenner 종양과유사한결과를보인것으로보아, 본연구에서확립한 OHK 가악성 Brenner 종양의특성을갖고있다는것을확인할수있었다. 같은종류의암이라도 oncogene, tumor suppressor gene, 또는 missmatch repair gene 등에서변이정도가각각다르게나타나며또한항암제에대한감수성역시달라표준화된치료에대한환자의예후는다다르다. 이는암의분류가기존의병리학적형태에서유전적분류로바꿔져야함을뜻한다. 그래서우리는여러가지종양관련유전자들의변이를조사하였다. Apoptosis는세포괴사와는달리에너지를필요로하는능동적사망이고, 이를조절하는유전자중가장중

8 대한산부회지제48권제10 호, 2005 요한것으로 p53, bcl-2, c-myc 등이있는데, 그중가장잘알려지고많은연구의대상이되고있는것은 p53 암억제유전자이다.p53은난소암에서 81% 정도에서까지이상이나타나고, 특히 p53의점돌연변이는불량한예후와관련이있다고보고되었다. 지금까지보고된대부분의 p53 유전자변이는 missense type 이었다. 가장빈번한변이가일어나는 exon은 5에서 8 사이였는데, 이는 p53 분자의가장기능적인부위를암호화하는것으로알려져있다. 7 본연구결과에서는 p53 유전자의 exon 4의215번째codon인G/G wild type이ohk 에서 C/C 로변이되었고, exon 5-9는 wild type 을나타냈다. BRCA 1 유전자는최근유전성유방암/ 난소암에서종양억제유전자로서중요한역할을하는것으로밝혀지고있으나그생화학적성상이나기능에관해서는아직정확히알려져있지않다.90% 이상의유전성유방암 / 난소암증후군환자군에서 BRCA 1 유전자의변이가발견되며또한 BRCA 1 유전자의변이가있는경우 60세까지유방암과난소암이발병될가능성은각각 54%, 30% 인것으로보고되었다. 8 실험결과, OHK 의 BRCA 1 은 wild type 을나타냈다. 한편 BRCA 2 유전자는 1994 년 Wooster 등에의해 BRCA 1과연관되지않은가족성유방암환자의연관분석을통해최초로알려졌다. 전체유전성유방암가계의약30% 가BRCA 2 유전자와연관되어있는것으로보고되고있으며, 특히 BRCA 1과 BRCA 2의 germline mutation 이있는여성의경우, breast/ovarian cancer syndrome 이발생하는것이알려져있다. 최근미국의몇몇 medical center에서 BRCA 1, BRCA 2 및기타유전성암유전자에대한유전자검사를시행하고있으며, 이는 BRCA 1, BRCA 2 돌연변이를조기에진단하여유전성난소암을조기예방, 치료하기위함이다. OHK의 BRCA 2에서는 exon 2, 10, 11, 14, 17, 22 에서 polymorphism 이나타났으며, 그중 Exon 10의 1342번째염기서열은 C가 A로바뀐 homozygote로아미노산 histidine이 aspargine으로치환되는 missense mutation 을보였다. 난소암은 CA125 와질식초음파를병합하여양성예측율을 10-20% 까지보고하고있다. CA125는상피성난소암에서상대적으로특이성을가진종양표지물질로 OHK 에서높은수치로측정되는것을확인하였다. 종양세포의증식능을정량화하려는여러연구중유세포분석을통한 DNA 정량검사가많이쓰인다. 그동안의연구에의하면난소암에서비배수성종양이이배수성종양에비해분화도나병기가더높고불량한예후를보이는것으로보고되고있다. 9 합성기분율 (S phase fraction) 이높으면종양의공격능이증가한다고보고하고있으며, 특히난소암에서는이배수성종양에비해비배수성종양에서높은합성기분율을보인다고하였다. 10 본실험결과,OHK 세포주는비배수성이었으나, 합성기분율이상대적으로낮았다. 이는 OVCAR-3나 SKOV-3와같은알려진세포주에비해상대적으로느린배가시간과일치하는것으로생각된다. 11 또한 OHK를누드마우스에이종이식시켜종양의형태학적변화를분석한결과, 형성된종양조직은본래의조직소견과유사하게나타나 OHK의높은종양형성능력을보여주었다. 본연구에서는한국여성의악성Brenner 종양조직을채취한후세포배양을통하여다양한세포주의특성을지닌악성Brenner 종양세포주 (OHK) 를확립하였다. 아형별로치료법을다르게적용시키는현재의조류로볼때본세포주를이용한실험은항암제민감도실험또는병리기전실험등에서유용하게사용될수있을것으로사료된다. 참고문헌

9 김현정외 8 인. Establishment of a novel malignant Brenner tumer cell line 이종승조남훈김영태 김성훈 노종환 김재욱 상피성난소암 에서핵 정량검사와 의예후적 의의대한산부회 지 = 국문초록 = 목적 : 난소암은가장치명적인악성부인과질환으로알려져있다. 발생기전을포함한많은연구에도불구하고, 아직까지난소암의유전적병인은불분명한상태이다. 따라서보다나은연구성과를위해, 특정질병을잘표현하는세포주모델은연구에있어서필수적이라고할수있다. 본연구에서는난소암환자의조직으로부터계대배양에성공한악성 Brenner 종양세포주 (OHK 로명명) 의특성을규명하고자하였다. 연구방법 : OHK 세포주는배양과정중마이코플라즈마 (myoplasma) 와세균의오염없이 3년간 200 계대이상계속해서배양되었다. OHK 세포의증식배가시간을측정하였고, OHK의종양형성능력을조사하기위해세포를누드바우스의등에피하접종시켰다. 세포를키우는배지를이용하여몇개의종양포지자를연구하였고, 위상차현미경과전자현미경을통해세포의형태학적특성과초미세구조를분석하였다. 또한 OHK 의유전자변이검사와, 인체백혈구항원의검색과유식세포분석기를이용한세포내 DNA 양측정도시행하였다. 결과 : OHK 세포주의증식배가시간은 38.4 시간이었고, 위상차현미경소견에서단층으로배양된암세포는상호간의접촉에의한억제현상없이포장도로같은배열 (pavement-like arrangement), 다형성및다각형형태를갖는상피성형태를보였으며, 전자현미경소견에서는악성 Brenner 종양의특징인핵내에주름 (nuclear groove) 이접힌형태 (infolding) 가관찰되었다. 또한, 종양표지물질비교에있어서, OHK 세포주는난소종양표지물질인 CA 125의배지내농도가 U/mL 로더높게측정되었다. 종양억제유전자검사에서, p53 유전자의 exon 4의 215 번째코돈 (codon) 이 C/C로변이되었으며, BRCA 1은 wild type이었으나 BRCA 2에서는 exon 2, 10, 11, 14, 17 에서다형성 (polymorphism) 이관찰되었다. 암세포내 DNA index 는 로서비배수성 (aneuploid) 을보였다. 배양세포를누드마우스의등에피하접종시킨결과, 조직병리학적형태가원래의악성 Brenner 종양과유사한것으로보아 OHK 세포주가악성 Brenner 종양에서유래한것임을알수있었다. 결론 : 이러한결과들은 OHK가전형적인악성 Brenner 종양세포주임을제시하였고, 향후난소암의치료와연구에유용한실험적모델이될수있을것으로사료된다. 중심단어 : 악성 Brenner 종양, 세포주

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean