DOI: /jkaoms 백서두개골결손모델에서실크단백과골형성단백이식체가골재생에미치는영향 남정훈 1,2 노경록 1,2 방은오 1,2 유우근 1,2 강응선 1,2 권해용 3 김성곤 4 박영주 1,2 1 한림대학교의과대학강남성심병원구강악안면
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- 영자 궁
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1 DOI:.1/jkaoms 남정훈 1,2 노경록 1,2 방은오 1,2 유우근 1,2 강응선 1,2 권해용 3 김성곤 4 박영주 1,2 1 한림대학교의과대학강남성심병원구강악안면외과학교실, 2 한림대학교임상치의학대학원구강악안면임프란트학과, 3 농촌진흥청, 4 강릉원주대학교치과대학구강악안면외과학교실 bstract (J Korean ssoc Oral Maxillofac Surg ;36:366-74) The effect of silk fibroin and rhmp-2 on bone regeneration in rat calvarial defect model Jeong-Hun Nam 1,2, Kyung-Lok Noh 1,2, Eun-O Pang 1,2, Woo-Geun Yu 1,2, Eung-Sun Kang 1,2, Hae-Yong Kweon 3, Seong-Gon Kim 4, Young-Ju Park 1,2 1 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Kangnam Sacred Heart Hospital, College of Medicine 2 Department of Oral and Maxillofacial Implantology, Clinical Graduate School of Dentistry, Hallym University 3 National cademy of gricultural Science, Rural Development dministration 4 Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Gangneung-Wonju National University Introduction: This study evaluated the capability of silk fibroin (SF) and recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF (SF-MP) as a bone defect replacement matrix when grafted in a calvarial bone defect of rats in vivo. Materials and Methods: total 7 calvarial critical size defects (. mm in diameter) made on 3 adult female Sprague-Dawley rats were used in this study. The defects were transplanted with (1) rhmp-2 loaded silk fibroin graft (SF-MP:.8+ μg), (2) Silk fibroin (SF: μg), and (3) no graft material (Raw). The samples were evaluated with soft x-rays, alkaline phosphatase activity, calcium/phosphate quantification, histological and histomorphometric analysis at postoperative 4 and 8 weeks. Results: The SF-MP group (48.86±14.92%) had a significantly higher mean percentage bone area than the SF group (24.96±11.1%) at postoperative 4 weeks.(p<.) In addition, the SF-MP group (4.1±12.43%) had a higher % bone area at postoperative 8 weeks than the SF group (33.26±.%). The mean ratio of gray scale levels to the host bone showed that the SF-MP group (.67±.8) had a higher mean ratio level than the SF group (.61±.9) at postoperative 8 weeks. These differences were not statistically significant.(p=.168 and P=.243, respectively) The ratio of the calcium and phosphate contents of the SF-MP (.93±.22) group was lower than that of the SF (1.9±1.42) group at postoperative 4 weeks. However, the SF-MP group (.7±.31) had a higher Ca/PO4 ratio than the SF (.68±.4) at postoperative 8 weeks. These differences were not statistically significant.(p=.126 and P=.627, respectively) For the bone-specific alkaline phosphatase (LP) activity, which is recognized as a reliable indicator of the osteoblast function, the SF-MP (23.71±8.6 U/L) groups had a significantly higher value than the SF group (12.6± 6.47 U/L) at postoperative 4 weeks.(p<.) t postoperative 8 weeks, the SF-MP (21.6±.2 U/L) group had a lower bone-specific LP activity than the SF group (16.72±7.3 U/L). This difference was not statistically significant.(p=.263) For the histological evaluation, the SF-MP group revealed less inflammation, lower foreign body reactions and higher bone healing than the SF group at postoperative 4 and 8 weeks. The SF group revealed more foreign body reactions at postoperative 4 weeks. However, this immunogenic reaction decreased and the remnant of grafted material was observed at postoperative 8 weeks. For histomorphometric analysis, the SF-MP group had a significantly longer bone length to total length ratio than those of the SF group at postoperative 4 and 8 weeks.(p<.) Conclusion: The rhmp-2 loaded silk fibroin graft revealed fewer immunoreactions and inflammation as well as more new bone formation than the pure silk fibroin graft. Therefore, silk fibroin may be a candidate scaffold for tissue engineered bone regeneration. Key words: Silk, Fibroins, Recombinant human bone morphogenetic protein-2, one regeneration, Tissue scaffolds [paper submitted / revised.. / accepted.. 19 ] 박영주 -9 서울시영등포구대림 1 동 번지한림대학교성심병원강남치과 / 구강악안면외과 Young-Ju Park Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Kangnam Sacred Heart Hospital, College of Medicine, Hallym University 948-1, Daerim-1 Dong, Yeongdeungpo-gu, Seoul -9, Korea Tel: Fax: kilhyun73@naver.com * This study was supported by a grant from the iogreen21 Program (No. PJ7176), Rural Development dministration, Suwon, Republic of Korea. 366
2 Ⅰ. 서론 현대치의학의목표는예견가능한방법으로환자들의구강건강을회복시켜주는것이다. 고령화사회의심화와더불어치아상실부의치조골흡수와위축이진행된경우가많다. 이에가용골의높이와폭경을늘리기위하여골이식이널리사용되고있다. 그중자가골이식술을골결손부를회복하기위한치료방법으로많이채택한다. 자가골이식은골세포, 성장인자등을함께이식하여골형성측면에서효과적이나큰결손부를수복하기에는공급에한계가있고, 골채취를위한부가적인수술, 채취부위의손상을가져온다. 이를극복하고자동종골, 이종골또는합성골을사용할수있지만이는골전도능만을제공하는경우가많으며, 흡수되지않고남아있는경우도있어골유합의지연을초래하기도한다. 이러한문제점을해결하기위한방안으로다양한지지체와조직활성인자조합의골이식재연구가진행중이다. 골형성유도단백질로알려진 bone morphogenetic protein (MP) 은 Urist 1 가소개하였고, Mizutani 와 Urist 2 는인간의골육종세포로부터 MP 를분리하였음을보고하였다. Sato 와 Urist 3 는 MP 의아미노산염기서열을분석하였고조직배양에서 MP 로부터유도된연골을배양하였으며, Wozney 등 4 에의해 recombinant MP 가알려지게되었다. 기존의연구에서보고된 MP 는포유류의골조직, 골육종세포, 치아의경조직등에서분리추출된것으로그추출량이제한되어있었으며과정또한복잡하였다. 그러나최근에와서는유전자조작기술의진보로다량의 MP 를만들수있게되었다. MP 는다른비교원성단백질에비하여소량존재하며종간특이성을가지지않는다는특성이있다. MP 는미분화간엽세포를연골세포나조골세포로분화시켜발생하는것으로알려져있고, recombinant human MP- 2 (rhmp-2) 는적절한운반매개체와함께조합했을때골결손을치료하는데유용하다 골재생에있어그효과가이미잘알려진만큼 rhmp-2 의서방출이가능한지지체의연구가많이시도되고있다. 조직공학에서지지체는세포외기질의구조및생물학적기능과유사해야한다. 즉, 기계적으로공간을지지하고수혜부에유도분자나세포를운반하며새롭게형성된조직의구조와기능을조절해야한다. 최근이러한전달체로 polymer (hydroxyapatite, hyaluronic acid 등의천연재료나 polylactide-co-glycolide acid, polylactide acid 등의합성 polymer) 나 hydrogel 등최근에는우수한생체친화성, 적절한기계적물성, 생분해성및다공성등의 scaffold 가각광을받고있다 누에고치의실크에서추출한단백질인 silk fibroin (SF) 역시지지체로서관심이고조되고있고, 이를이용한인조골연구가활발히진행되고있다. SF 은생체친화성, 느린분해속도, 적절한기계적성질등지지체로서우수한특징 을가지고있다 18-. 과거에는 silk 로옷을만들거나식품, 화장품등을만드는데사용하였으나, 근래에는실크막의섬유아세포배양효과가확인되었고 21, 실크지지체의연골및골아세포배양효과도보고되고있으며 22-, 국내에서도연구가활발하여실크나노지지체를이용한골재생에대한보고가있었다 본연구에서는백서두개골결손모델을통해 SF 과 rhmp-2 조합의골재생능을측정하여 rhmp-2 의운반체로서 SF 의효용성을평가하고자하였다. 1. SF 의제조 Ⅱ. 연구대상및방법 SF은한국농촌진흥청잠사과 iogreen 21 연구부 (Suwon, Korea) 에서제공받았다. 제조과정을요약하면, 누에고치에서절각견을추출하고, 과도한거품을방지하기위해겉껍데기인세리신을제거하고 fibroin만남겨산가수분해, 중성염가수분해, 효소가수분해를시행하고, 전기탈염장치와겔여과장치로중화시키고, 동결건조장치와분무건조장치를이용하여건조분말을만든후스펀지형태의이식재로가공한것으로분자량은약 3 kda이다. 2. rhmp-2 의준비 실험에사용할 rhmp-2 (R&D systems Inc., Minneapolis, MN, US) 는중국햄스터의난소세포에서발현되어 human MP-2 로유전자재조합된것으로, 제조사의설명에따라사용하였다. 3. 동물실험군및수술 체중 - gm 의 8 주령된 Sprague-Dawley 백서 (Oriental io Co., Seoul, Korea) 36 마리를사용하였으며, 이식재와실험기간에따라 3 개군으로분류하여실험하였다. SF-MP 군, SF 군, Raw 군은각 12 마리이며, 군별로 4 주, 8 주기간으로 6 마리씩반분하였다.(Table 1) 실험동물은 Xylazine mg/ml (Rompun, ayer korea Ltd., Seoul, Korea) 과 Tiletamine mg/ml 과 Zolazepam mg/ml (Zoletil, Virbac Laboratories, Carros, France) 의혼합액 (1:3 부피비,.4 cc, 복강내주사 ) 을사용하여마취하였다. 전두부를제모하고포비돈솜으로소독한후, 비골에서후두골사이의두개골시상봉합을따라약 2 cm 가량의절개를가한다음골막을포함하는피판을거상하여두정골까지노출시켰다. mm trephine bur (ce Surgical supply Co., rockton, US) 와 Max. 32, rpm 의저속드릴키트 (Sae Yang Machinery Co., Daegu, Korea) 를사용하여두정부에직경 mm 의원형결손부를양쪽에 2 개씩형성하였다. 367
3 J Korean ssoc Oral Maxillofac Surg ;36: 제거한골창은정상두정골의칼슘 (Ca) 과인산 (PO4) 의정량측정에사용하기위해냉동보관하였다. 예상하지못한출혈은 oxidized cellulose (Surgicel, Johnson & Johnson Medical, New runswick, NJ, US) 를이용하여지혈하였다. 골결손부에는 μg 의 SF 과.8 μg 의 rhmp-2 를이용하여각군의조성에맞게이식하였고, 피부는 - nylon (Ethicon, Johnson & Johnson Medical, New runswick, NJ, US) 으로봉합하였다. 실험 4 주, 8 주후각실험동물들을이산화탄소 (CO2) 질식을통하여희생시킨다음결손부를포함한두개골을채취하여방사선학적, 정량적, 조직형태학적분석을시행하였다. 본실험은한림대학교동물실험윤리위원회의승인하에시행하였다.( 승인번호 : No. Hallym 9-66) 4. 방사선학적분석 채취된조직을캐비닛형 soft x-ray (CM-2, Softex Co., Tokyo, Japan) 를관전압 kvp, 관전류 2 m, 노출시간 2 분의조건 ) 으로방사선사진을채득하였다. 방사선필름 (iomax, Kodak, Rochester, NY, US) 은디지털스캐너 (Cannon, Tokyo, Japan) 를이용하여디지털영상으로변환하였으며, 골재생부에서무작위로추출한 6 개점의방사선밀도를영상분석기 (OPTIMS, version , Media Cybernetics, L.P., Silver Spring, MD, US) 를이용하여흑화도 (gray scale) 의평균치를측정하였다. 또한획득한이미지에결손부의원래면적과새로재생한부위의외형을비교하여재생면적의비율을계산하였다.. 건조중량, alkaline phosphatase (LP) 활성도및 Ca/PO4 정량분석 Soft x-ray 촬영후, 조직학및조직형태학적분석을위해군별로개체의절반을할당하고남은나머지개체를 LP 활성도및 Ca/PO4 정량분석에이용하였다. mm 직경의원형결손부를수술용가위로절단하고골수와혈액을제거하기위해 phosphate buffered saline (PS) 에담구어 4, 72 시간동안단백질을추출하였다. 불용성물질을제거하기위해 4, 13, rpm, 분동안원심분리한다음동결건조기 (Labconco Co., KC, US) 에넣어 overnight 한후정밀저울을사용해건조중량을측정하였다. acetate, mm pnpp) 을신속히첨가하고잘섞어주었다. 4 nm 에서초기흡광도와 4 분경과후흡광도를 microtiter plate reader (Powerwave X34, io-tek instruments, Inc., Winooski, VT, US) 를이용하여측정하였다. LP 활성도는 U/mg 뼈건조중량으로계산하였으며, 1 U 는실온에서 1 분당기질 1 μmol 의산물로의전환으로정의하였다. 2) Ca 과 PO4 의정량분석 Ca 양과 PO4 의측정은 QuantiChrom calcium phosphate assay kit (ioassay Systems, Hayward, C, US) 를사용하여분석하였다. 건조된뼈를회화로에넣어 7, 2 시간동안희석재가될때까지태워 Ca 과결합한유기물성분을제거하였다. 회화가끝난시료는 6 N 염산 3 ml 을넣어 4 overnight 시킨다음, Whatman paper #1 로 filtering 하였다. Ca 양은 배로희석한시료 μl 를 96 well plate 에첨가하고 working reagent μl 첨가후실온에서 3 분간반응시켰으며, 612 nm 에서흡광도를 microtiter plate 를이용하여측정하였다. PO4 양측정을위해 배희석한시료 μl 를 96 well plate 에첨가하고 reagent μl 첨가후실온에서 분간반응시키고광밀도 6 nm 에서흡광도를측정한후여러 standard 의농도를비교하여샘플의농도를산출하였다. 6. 조직학및조직형태학적분석 Soft x-ray 촬영후, 각시료의절반을조직학및조직형태학적분석을위해처리하였다. 각조직은 % buffered formaldehyde 에고정하였으며, % formic acid 로탈회하였다. 시상봉합에직각으로골결손부의적도를포함하여양부위를 trimming 한후파라핀에포매하였다. 블록을 4 μm 두께로절단한후 hematoxylin and eosin (H&E) 과 Masson s trichrome (MT) 그리고 osteocalcin 면역염색을하였다. MT 염색을시행한슬라이드영상은 rtixscan 4TF (Microtek, Columbia, MD, US) 으로영상주사 (scan) 한후 SPOT version 4.6 (Diagnostic Instrument, Inc, Sterling. Heights, 1) LP 활성도분석 LP 활성도는 para-nitrophenyl phosphate (pnpp) 로부터 p-nitrophenolate 의시간의존적인형성에의해측정 (4 nm 에서빛의최대흡수 ) 되는 QuantiChrom alkaline phosphatase assay kit (ioassay Systems, Hayward, C, US) 를사용하였다. 96 microtiter plate well 에뼈추출물 μl 를첨가하였다. 반응을시작하기위해샘플 well 에전체반응양이 μl 가되도록 working solution (assay buffer, ph., mm Mg Fig. 1. Midsagittal reference line for histomorphometric analysis.. Harvested calvaria,. Soft X-ray image. 368
4 MI, US) 으로화상화 (capture) 하였다. 조직형태학적분석은 1. 배의배율로이식부위에서신생골의길이와면적을계측하고, 전체길이및면적에대한신생골의비율을 Optimas 소프트웨어프로그램을통해분석, 계산하였다.(Fig. 1) 창상의감염이나예상치못한조직반응은발견되지않았다.(Table 1) 2. 방사선학적분석 7. 통계학적방법 조직형태학적, 방사선학적, 정량적분석을통해얻은결과는 Statview version..1 (SS Institute Inc, Cray, NC, US) 통계프로그램을이용하여 one-way analysis of variance (NOV) test 로분석하였다. 유의성있는결과가관찰되면 a pairwise multiple test 인 Fisher s protected least significant difference (PLSD) 를이용하여각군을비교하였다. P-value 가. 이하일경우유의성있는차이로간주하였다. Ⅲ. 결과 수술 4 주차에서신생골형성은 SF-MP 군 (48.86± 14.92%) 이 SF 군 (24.96±11.1%) 보다통계적으로유의하게많았다.(Fig. 2, P<.) 광밀도에있어서주변정상골에대한신생골의비율은 SF-MP 군 (.7±.7) 과 SF 군 (.7±.9) 이 Raw 군 (.67±.12) 보다다소높았으나유의성은없었다.(Fig. 3, P=.418 와 P=.424) 수술 8 주차에서는신생골형성이 SF-MP 군 (4.1±12.43%) 이 SF 군 (33.26±.%) 보다많았으나통계적으로유의한차이는없었고,(Fig. 2, P=.168) 주변정상골과신생골의광밀도비율분석에서도 SF-MP 군 (.67±.8) 이 SF 군 (.61±.9) 보다높았지만유의성은없었다.(Fig. 3, P=.243) 1. 실험동물과실험술식 3. Dry weight, LP 활성도및 Ca/PO4 정량분석 모든동물은수술직후회복되었으나 Raw 군 8 주차 1 마리가술후 3 일째사망하였다. 따라서각군의실험동물은 SF- MP 군 12 마리, SF 군 12 마리, Raw 군 11 마리총 3 마리의 7 개의백서두개골결손부를분석하였다. 수술 4 주, 8 주후 1) Dry weight 수술 4 주차, 8 주차에서각샘플의 dry weight 은 SF-MP 군, Raw 군, SF 군순이었다. 수술 4 주차, 8 주차모두에서 SF-MP 군이 SF 군에비해통계적으로유의성있게높았 Raw SF SF-MP Raw SF SF-MP Fig. 2. % bone area of densitometric analysis.. The SF-MP group (48.86±14.92%) had a significant higher value than that of SF group (24.96±11.1%, *P<.) at postoperative 4 weeks.. The SF-MP group (4.1±12.43%) had a higher %bone area than that of SF group (33.26±.%) at postoperative 8 weeks. This difference was not, however, statistically significant.(p=.168) (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) Table 1. nimal grouping Groups N (sites/animals) Composition Graft 4 weeks 8 weeks SF-MP 12 (6) (6) rhmp-2 loaded silk fibroin.8+ μg SF 12 (6) 12 (6) Silk fibroin μg Raw 12 (6) 12 () Raw defect None (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) 369
5 J Korean ssoc Oral Maxillofac Surg ;36: Raw SF SF-MP Raw SF SF-MP.8 Fig. 3. Gray scale ratio to host bone.. The SF-MP group (.7±.7) and SF group (.7±.9) had a higher value than that of the Raw group (.67±.12) at postoperative 4 weeks. These differences were not, however, statistically significant.(p=.418 and P=.424, respectively). t postoperative 8 weeks, the SF-MP group (.67±.8) had a higher value than that of the SF group (.61±.9), however, it was not statistically significant.(p=.243) (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) Table 2. Dry weight Groups 4 weeks (mg) 8 weeks (mg) SF-MP 63.83± ±23. SF 611.7±4.3 7.±2.83 Raw ± ±13.47 (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) 다.(Table 2, P<.) 2) LP 활성도측정값이높을수록 PO 4 함유 substrate 의 hydrolysis 를증가시켜 orthophosphate 를형성하고 Ca 흡수를증진시켜골재생의좋은지표가되는 LP 활성도는 4 주차에서 SF-MP 군 (23.71±8.6 U/L) 이 SF 군 (12.6±6.47 U/L) 보다유의하게높았고 (P<.), 8 주차에서는통계적으로유의한차이는없으나 SF-MP 군 (21.6±.2 U/L) 이 SF 군 (16.72± 7.3 U/L) 보다높았다.(Fig. 4, P=.263) 3) Ca 과 PO 4 의정량분석 Ca 의경우 4 주차에서 SF-MP 군 (28.67±14.28 mg/dl) 이 SF 군 (12.3±.1 mg/dl) 과 Raw 군 (12.16±4.63 mg/dl) 보다유의하게높았고 (P<.), 8 주차에서는 SF-MP 군 (28.6±.44 mg/dl) 이 SF 군 (2.83±1.38 mg/dl) 보다유의하게높았 다.(Fig., P<.) PO4 의경우 4 주차에서 SF-MP 군 (.77 ±12.2 mg/dl) 이 SF 군 (12.28±11.87 mg/dl) 과 Raw 군 (12.6±6.99 mg/dl) 보다유의하게높았고 (P<.), 8 주차에서는 SF-MP 군 (34.9±12.37 mg/dl) 이 SF 군 (4.±2.34 mg/dl) 보다통계적으로유의성있게높았다.(Fig. 6, P<.) 수치가높을수록 maturation level 이높은골광화도 (degree of matrix mineralization) 를나타내는 Ca 과 PO4 비율 (Ca/PO4) 의경우, 4 주차에 SF 군 (1.9±1.42), Raw 군 (1.±.36), SF- MP 군 (.93±.22) 순이었고, 8 주차에서는 SF-MP 군 (.7 ±.31), Raw 군 (.71±.14), SF 군 (.68±.4) 순이었으나모두통계적유의성은없었다.(P=.126 와 P=.627) 4) 조직학및조직형태학적분석조직학적소견상 SF-MP 군의경우, 이물반응과염증이적으며 8 주로갈수록골형성이빨리진행되었고, 술후회복과골재생이잘되는양상이관찰되었다.(Fig. 7) SF 군의경우, 초기에이물반응과염증반응이심하며, 8 주로갈수록줄어드는양상을보였고, 아직이식체가잔존함이관찰되었다.(Fig. 8) 조직형태학적분석에서신생골길이는 4 주차에 SF-MP 군이 SF 군에비해유의성있게높았고 (P<.), 8 주차에는 SF-MP 군이 SF 군과 Raw 군에비해유의하게높았다.(P<.) 신생골면적에서는 4 주차와 8 주차모두에서 SF- MP 군이다른군보다높은수치를보였지만통계적으로유의한차이는없었다.(Table 3) Table 3. Histomorphometric analysis Groups one length (mm) one area (mm 2 ) 4 weeks 8 weeks 4 weeks 8 weeks SF-MP.±.26.4±.44.13±.13.27±.41 SF.24±.82.13±.16.2±.7.8±.9 Raw.16±..97±.14.11±.18.2±.2 (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) 37
6 SF SF-MP R SF SF-MP R Fig. 4. LP activity.. The SF-MP group (23.71±8.6 U/L) had a significant higher value than that of the SF group (12.6± 6.47 U/L) at postoperative 4 weeks.(*p<.). The SF-MP group (21.6±.2 U/L) had a higher value than that of the SF group (16.72±7.3 U/L) at postoperative 8 weeks. However, there was not statistically significant difference.(p=.263) (LP: alkaline phosphatase, SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) 3 SF SF-MP Raw SF SF-MP R 4 Fig.. Ca 2+ quantification.. The SF-MP group (28.67±14.28 mg/dl) had a significant higher value than that of the SF group (12.3±.1 mg/dl) at postoperative 4 weeks.(*p<.). The SF-MP group (28.6±.44 mg/dl) had a significant higher value than that of the SF group (2.83±1.38 mg/dl) at postoperative 8 weeks.(*p<.) (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) SF SF-MP Raw SF SF-MP R 4 Fig. 6. PO4 2- quantification.. The SF-MP group (.77±12.2 mg/dl) had a significant higher value than that of the SF group (12.28±11.87 mg/dl) at postoperative 4 weeks.(*p<.). The SF-MP group(34.9±12.37 mg/dl) had a significant higher value than that of the SF group (4.±2.34 mg/dl)at postoperative 8 weeks.(*p<.) (SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) 371
7 J Korean ssoc Oral Maxillofac Surg ;36: C D E F C D E 372 F Fig. 7.. Postoperative 4 weeks.(h&e staining, original magnification x). Postoperative 8 weeks.(h&e staining, original magnification x) C. Postoperative 4 weeks.(masson s trichrome staining, original magnification x) D. Postoperative 8 weeks.(masson s trichrome staining, original magnification x) E. Postoperative 4 weeks.(osteocalcin immunoreactive staining, original magnification x) F. Postoperative 8 weeks.(osteocalcin immunoreactive staining, original magnification x)(rhmp2: recombinant human bone morphogenetic protein-2, SF: silk fibroin, SF-MP: recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded SF) Fig. 8.. Postoperative 4 weeks.(h&e staining, original magnification x). Postoperative 8 weeks.(h&e staining, original magnification x) C. Postoperative 4 weeks.(masson s trichrome staining, original magnification x) D. Postoperative 8 weeks.(masson s trichrome staining, original magnification x) E. Postoperative 4 weeks.(osteocalcin immunoreactive staining, original magnification x) F. Postoperative 8 weeks.(osteocalcin immunoreactive staining, original magnification x)(rhmp2: recombinant human bone morphogenetic protein-2, SF: silk fibroin)
8 Ⅳ. 고찰 본연구에서는 rhmp-2 의운반체및골재생의지지체로서 SF 의효용성을평가하고자백서두개골결손모델을이용하여 rhmp-2 와 SF 이식체의골재생능을측정하였다. 누에고치로부터추출하는 SF 은저렴하고생체친화성이좋으며적절한기계적성질및느린분해속도등의장점이있다 18-. 그러나 SF 을이용한여러연구에서염증반응과면역반응이있음이보고되었다 29,. 본연구에서도조직학적으로순수한 SF 을이식한경우, 초기에이물반응과섬유화, 비만세포및대식세포등이관찰되며염증반응과면역반응을보인반면, rhmp-2 를함께이식한경우초기염증이최소화되는양상과 8 주에가서도 SF 군보다염증반응및면역반응이적은것을볼수있었다. 또한, SF-MP 군은 8 주차에서다른군에비해경계부주변에골생성유도가많이나타났다. 이로미루어 rhmp-2 는 SF 의이물반응과염증반응을적절히조절하는데어느정도역할을했으리라여겨지고, SF 또한 rhmp-2 의지지체역할을하였으리라판단한다. 방사선학적분석에서광밀도와신생골로추정되는방사선불투과성부위의면적을측정해보았을때, SF-MP 군이 SF 군보다 4 주, 8 주차모두에서골재생능이우수한것으로보였고, Ca 과 PO4 의정량분석, LP 활성도역시같은결과를보였으며, 이는조직학적소견과일치하는것으로보인다. 실험군이 raw defect 의 healing phase 에비해서는 4, 8 주동안높은 Ca/PO4 비율과 LP 활성도를나타내는것으로보아서골재생의새로운대안재가될수있다고여겨진다. 본연구에사용된 SF 은분자량 3 kda 의고분자물질이고생체내에서서서히분해되는절차를밟는데, 대개술후 24 개월이걸리는것으로알려져있다 31. 즉, SF 이차지하고있는공간이완전흡수가일어나면서재생골로대체될때까지많은시간이소요되리라예상되며, 이과정에서많은염증세포의도움이필요하며, 주변의재생골이생성되는부위와분리되는섬유성조직이차단막처럼형성되게되며, 이는자가골이식시재생골의 direct contact 이나느리게분해되고공간을차지하고있는합성골이식재와는다른골재생경로를가진다고여겨진다. 또한, 분해되는동안면역반응을나타내며임파구및다핵성거대세포등이관찰되는데, 이러한한계를극복하고염증과이물반응을줄이기위한방법으로표면처리, 입자크기의조절, 간엽줄기세포및각종성장인자와조합등을꾀할수있다. Zhao 등 32 은 in vitro 연구에서 SF 이 Rat Genome Database (RGD) 펩타이드와화학적결합시골형성이유의하게증가됨을보고하였다. SF 과 hydroxyapatite 복합체의 in vitro 연구중 Kino 등 33 은세포부착능과 LP 활성도의증가를보고하였고, Zhao 등 34 은 SF-hydroxyapatite 복합체가골모세포의증식과생존에유리함을보고하였다. 또한 Kirker-Head 등 23 은 SF scaffold 와간엽줄기세포, 골형성단백을이용한골재생능실험 에서골이유의하게증가하였음을보고한바있다. 최근에는 SF 의크기를줄이거나, 분자량을낮추는방법으로생분해를 6 주이내에이룰수있는것이보고되었으며, 저분자량화처리한 SF 이식재가 in vitro 상에서 LP 활성도나 collagen type 1, fibronectin 값이 dose dependant 하게증가되는결과를얻었고, in vivo 실험에서도 platelet-rich fibrin 과동시이식하였을때골재생의좋은결과가보고되었다 또한최근발전된정제기술로 glycosylated protein 의오염을피하면생체친화적이고비염증성, 면역반응이없는형태로제조할수있는것으로알려져있다. 본연구와여러연구를종합할때, SF 은세포나성장인자등을이용한조직공학적골재생에서지지체로서의능력을지닌만큼그자체보다는염증이물반응을줄이고세포인자나성장인자의서방출을위한전처리나조절능을부여할수있도록향후부가적인연구가필요하다고생각한다. Ⅴ. 결론 본연구에서는백서두개골결손부의골재생실험에서 SF, rhmp-2 를조합하여다음과같은결과를얻었다. 1. rhmp-2 를첨가한 SF 을이식한경우 SF 만이식한경우보다골재생능이우수하고, 특히다른군에비해경계부주변에서골생성유도가많이일어났으며, 4 주차에염증반응이최소화되고, 8 주차까지염증및이물반응이적은결과를보였다. 2. 본연구를통해서조직공학적골재생에있어서 SF 단독으로사용하기보다는 rhmp-2 와조합하는것이더우수하며, 이는향후골재생능의향상을위해 SF 의표면처리나저분자량화같은전처리및성장인자와의조합에대한부가적인연구를시사하고있다고생각한다. References 1. Urist MR. one formation by autoinduction. Science 196;: Mizutani H, Urist MR. The nature of bone morphogenetic protein (MP) fractions derived from bovine bone matrix gelatin. Clin Orthop Relat Res 1982: Sato K, Urist MR. one morphogenetic protein-induced cartilage development in tissue culture. Clin Orthop Relat Res 1984;183: Wozney JM, Rosen V, Celeste J, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, et al. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities. Science 1988;242: Sampath TK, Reddi H. Homolgy of bone-inductive proteins from human, monkey, bovine, and rat extracellular matrix. Proc Natl cad Sci U S 1983;8: Chai Y, Slavkin HC. iology of bone induction and its clinical applications. Oral Maxillofac Surg Clin North m 1994;7: Wozney JM. iology and clinical applications of rhmp-2. In: Lynch SE, Genco RJ, Marx RE, eds. Tissue engineering: applications in maxillofacial surgery and periodontics. Chicago: Quintessence; 1999:
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醫 史 學 제18권 제2호(통권 제35호) 2009년 12월 Korean J Med Hist 18ː57 72 18ː173-188 Dec. Dec. 2009 2009 C 大 韓 醫 史 學 會 ISSN ISSN 1225 505X 1225-505X 지방병 연구와 식민지배 : 1927년 영흥 및 해남지역 에메틴 중독사건을 중심으로 신 규 환* 1. 머리말 2. 일제의
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양성자가속기연구센터 양성자가속기 개발 및 운영현황 DOI: 10.3938/PhiT.25.001 권혁중 김한성 Development and Operational Status of the Proton Linear Accelerator at the KOMAC Hyeok-Jung KWON and Han-Sung KIM A 100-MeV proton linear accelerator
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