약학회지제 43 권제 5 호 606~613(1999) Yakhak Hoeji Vol. 43, No. 5 발열성물질시험과세균내득소시험의버교연구 이유경 강윤숙 * 백선영 김용관 신광훈 ** 민홍기 ^ 식품의약품안전청생물학평가부세균제제과 * 식품의약품안전청식품평가부식품미생뮬

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1 약학회지제 43 권제 5 호 606~613(1999) Yakhak Hoeji Vol. 43, No. 5 발열성물질시험과세균내득소시험의버교연구 이유경 강윤숙 * 백선영 김용관 신광훈 ** 민홍기 ^ 식품의약품안전청생물학평가부세균제제과 * 식품의약품안전청식품평가부식품미생뮬과 ** 식품의약품안전청생물학평가부혈액제제과 (Received June 28, 1999) Comparison of LAL Test with Pyrogen Test Yoo Kyoung Lee, Yoon Sook Kang*, Sun Young Baek, Yong Kwan Kim, Kwang Hoon Shin** and Hong Ki M il/ Bacterial products Division, Biologies evaluation Department, KFDA *Food Microbiology Division, Food evaluation Department, KFDA **Blood products Division, Biologies evaluation Department, KFDA Abstract To survey the possibility of replacing the pyrogen test with Limulns Amebocyte Lysate (LAL) test and to find out a standard methods suitable to our blood products made in Korea, 100 samples of 20% human serum albumin were tested by commercial LAL test kits and results of those were compared with rabbit pyrogen test. The LAL test is used both kinetic-chromogenically and kinetic- turbidimetrically. Both methods equally showed broad detection range ( EU/m/), excellent sensitivity ( > EU/ ml) and predominant recovery rate within valid dilution range, but kinetic-turbidimetric method seemed to be more reproducible than kinetic-chromogenic method(kinetic-chromogenic method : S.D.=15-88, kineticturbidimetric method : S.D.=8.12). After heating the sample at 75 다 C for 15 min, the results showed a little elevated recovery rate with both methods. After performing the test on 100 albumin samples with both kits, the results were analysed using the USP standard (1.33 EU/m/). 7% of samples in kinetic-chromogenic methods and 1% of samples in kinetic-turbidimetric method exceeded the limit of endotoxin levels regulated for blood products in USA. Because this phenomenon was not observed in both methods at the same time and both methods have high sensitivity ( ^ EU/m/), these results seemed to depend on nonspecific reaction. Considering its sensitivity and reproducibility, we could assure that LAL test is proper to detecting pyrogenic with good sensitivity. Keywords Limulus Amebocyte Lysate(LAL) test, rabbit pyrogen test, kinetic-chromogenic method, kinetic-turbidimetric method. 주사제나비경구용의약품에의한발열은주로자연계에존재하는내득소 (endotoxin) 에의한것으로서내득소란그람음성균의 outer membrane 의한구성성분인 lipopolysaccharide(lps) 로구성되어있으며 LPS는친수성 (hydrophilic) 인 0-specific polysaccharide 와 core oligosaccharide 부분과소수성 (hydrophobic) * 본논문에관한문의는이저자에게로 ( 선화 ) ( 팩스 ) 인 lipid A의 3부분으로세분화되어있다. 내득소는체내의가장중요한발열물질로서 LPS가혈류률타고체내에들어오게되면체내에서단핵구나대식세포에의해내인성발열물질이유리되며이내인성발열물질은직접또는임파구률통하 ^ 혈액으로유리되어시상하부의체온조절중추를자국하늬발열번응을유도한다.«내득소의체내침투는발열빈용이외에치사성쇼크, 체중감소, 혈중글루코스감소, macrophage 활성화등다양한생리현상을초래하기도한다.2' 내득소 606

2 빌열성물질시험비교 607 는열에매우안정하식 180~200 C의 dry heat 에서도완전하게불활성화되지않으며멸균용여과를통과하는반면알칼리용액에서는쉽게불활성화되는특성이있다.^ 1912 년토꺼를이용한발열성시험이처옴실시된이후현재의약품의내득소의검출방법으로는가장널리사용되어왔으나 1963 년 Levin 과 Bang 등에의하여투구게의혈구내에있는 Limulus amebocyte lysate(lal) 가내득소에특이적으로반응하는특성이있옴이밝혀진이래 LAL test는경제성이높으며감도가우수하고신속하다는등의여러장점이보고되고있어 LAL을이용한내득소의검출방법으로점차발열성시험을대체할수있는추세이다.^ 반응원리는세균의내득소가 LAL과접촉하게되면적어도 3개의 serine protease zymogens인 factor C, factor B, prodotting enzyme이포함된효소번 ' 응 이개시된다 (Fig. 1). Endotoxin pathway 는단계적으로 amebocyte coagulogen을번화시켜 coagulin gel을생성한다. LAL에있는또다른단백질으로는 anti-lps factor가있으며 limulus clotting enzyme-2] LPS-mediated activation 을조절한다. > 그동안 LAL은세균의내득소하고만부 ] 적으로반용 하는것으로알려져왔으나최근세균의내득소이외에 carboxymethylated(cm)p-d-glucan 등이비특이빈움을유도할수있다는사실이보고된바있다. LAL과반응하는 glucan 에는세균의 curdlan, yeast 의 zymosan, 조류 (algae) 의 laminarin, fungus의 lentinan 등이포함된다. 이외에 hemodialyzer 의 houowfiber cellulose membrane에서 ' 나온 extracts 또한 LAL과반응하지만토끼의발열성시험에서는발열을유도하지못하는물질로알려져있다. 현재개발되어시관되고있는 LAL시약으로는 LAL 의 gel 형성여부에따라단지내득소의존재유무만확인하는정성시험분석법인 Gel clot 방법, gel 형성이탁도의번화를측정하는방법인비탁법 (turbidimetxic method) 이있으며여기에는일정시간내에도달하는최종탁도률측정하는중말점비탁법 (end-point turbidimetric) 과일정탁도에도달히는데소요되는시간을측정하는키네틱비탁법 (kinetic turbidimetric) 이있다. 또한응고효소에의해합성기질로부터유리되는발색기의양을측정하는비색법 (chromogenic method) 이있으며이방법은즉정방법에따라중말점비색법 (end-point chromogenic) 과키 endotoxin (1-^3)- &-glucan activated activated factor G factor C factor G factor ' activated factor B prodotting» clotting coagulogen- coagutin(gei) Fig. 1 - Cascade reaction in the endotoxin test. 네틱비색법 (kinetic chromogenic) 으로나뉘어진다. 본실험에서는국내에서제조된알부민의 LAL시험에가장적합한시험방법및조건을설정하고, 기존의발열성시험과 LAL test 결과를비교하쉬알부민의발열성물질측정법으로사용가능한지검토하고국내알부민에적합한기준을설정하기위하여생물학평가부에검정의뢰된 20% 알부민 100 건을수집하식발열성시험과 LAL test률수행하였으며현재시관중인여러종류의 LAL kit률구매하식비교검토함으로써알부민분석에적합한시험방법과실험조건을설정하였다. 재료및방법실험재료시료 - 혈액제제인사 람혈청알부민 (20%) 중국검시발열성물질시험을통해발열성물질이검출되지않은제품 100개률검체로사용하였다. 시약 - (1) LAL 시약 (Limulus amebocyte Lysate) : 미국 Bio Whittaker 사의 QCL-1000(No U), 미국 Charles River Endosafe 사의키네틱 -비색법시약인 endochrome-k와키네틱 -비탁법시약인 KTA2 률사용하였다. (2) 내득소표준품 : 미국 FDA외 reference standard endotoxin (10,000 EU/m/) 에표준화한 Charles river endosafe^}s] control standard endotoxin(10 ng/vial)#^ 사용하였으며각각사용한 LAL 시약과의역가는 Charles River Endosafe 사에서제공한 certificate of analysis를이용하였다. (3) LAL 시험용물 (LAL reagent water) : 영국 Charles River Endosafe Limited 사의제품을이용하 Vol. 43. No. 5, 1999

3 이유경 강윤숙 백선영 김용관 신광훈 만홍기 여보증된엔도톡신함량은 EU/mi 이하의다. 사용기구 시료의준비에시용된튜브는폴러스티렌재질로엔 도톡신이없는일회용튜브 (Falcon 2057>t 사용하였 으며시험에사용된모든플라스틱피뱃팀도엔도톡 신 free 한립 (eppendorf, biopur) 을시용하되이를습 열멸균 (12;TC, 15 분 ) 한후 80 C dry oven 에서건조 시켜사 용 하였다. 분석에사용된 microplate 는역시 폴리스티렌재질의내득소가없는 96 well plate (Falcon 3072) 를사용하였다. 내득소표준품희석에사 용된튜브는 borosilicate 재질의유리튜브를주사용 중류수로세척한후 250 C Dry Oven 에서 4 시간건 열멸균하겨사용하였다. 시험방법 < 키네틱 - 버색법과키네틱 - 버탁범 > 표준액의제조 - 본시험에서사용된 LAL kit 는 endochrome-k(endosafe, R1710K), KTA2(Endosafe, R1900) 였으며, 표준액으로사용한내득소는 E. coli 055:B5 로부터주출한 lipopolysaccharide(endosafe E120) 이었으며, 시험용액제조를위한완충액으로는 non-pyrogenic 멸균증류수 (Endosafe W120) 를사용하 였다. E. coli 055:B5 를제조사에서지시한용량의 non- pyrogenic 멸균중류수에녹여 50EU/W 농도의 stock solution 을만든후, 10 배희석법을이용해 5EU/m/, 0.5 EU/m/, 0.05 EU/m/, EU/m/ 의표준농도률 만늘어표준곡선을만드는데사용하였다. 최초저장액 은 5 분간 vortex mixer 률이용해혼합하며연속적인 희석계열의작성시에는 borosilicate 튜브룰사용해 1 분간 vortexing 하였다. 또한사용직전 30 초간잘흔 합하여사용하였다. 시료조제 - 각각의시료에서 20010/ 를취해 LAL 시 험용수 1,400 에혼합해 1:8 희석액을만든후언속 적으로희석해 1:80, 1:160, 1:240, 1:360, 1:480 의 시료를만들었다. 시료의엘처리 - 각각의시료에서 률취해 LAL 시험용수 1,400 에혼합해 1:8 희석을만든후 75 C 로설정한수욕조에서 15 분간중탕으로가열하였 다. 처리후 LAL 시험용수로희석해 1:80, 1:160, 1:240 의시료룰만들었다. 제품양성대조 (positive product control)-각각의희석시료에 0.5 EU/m/ 의농도로 endotoxin을첨가하였다. 조제방법은희석시료와엔도톡신의번움을최소화하기위해 well plate 에시료 률넣은후 LAL 시약을분주하기직전 5 EU/ml 농도의엔도톡신을 10 i/ 넣는방법인 in-plate spiking 기법을이용하였다. 따라서엔도톡신스3} 이크의농도률 0.45 EU/ m/ 로계산하였다. 음성대조 (negative control) - 옴성대조로서 LAL reagent water를사용하였다. 엔도록신측정및분석 - 96 well plate에음성대조액, 표준엔도톡신, 시료, 제품양성대조액의순으로각해당되는 well 에각각 100 씩담은후, 일부 well 에는 5 EU/m/ 의표준액을 10 pi씩분주하식회수율을검사할수있도록한다. LAL시약은 A] 용전상온에꺼내놓거나 37T에서 30& 가량놓아두어반응온도에손쉽게이률수있도록한후시용직전에 LAL water에녹여서각 well에 100 i/ 씩분주한다. 반응시간은자동적으로 1시간각 reading의간격은 15 초로총 241 reading하였다. Onset O.D. 는키네틱 -비색법의경우는 0.1, 키네틱 -버탁법은 0.05 로설정하였다. 시간의경과에따른탁도의번화의측정은미국 Bio- Tek Instrument 사의 ELx808IU률사용하였으며데이터획득및분석에는 KC-3 률사용하였다. 농도및회수율의계산 - 단계적으로희석된표준품들의 onset O.D. 에도달하는데걸리는시간에대한 double log를취한그래프률이용하식농도룰계산한후희석배수률곱한다. 결과들은 regression factor가 0.98이상이고회수율이 % 범위에들어같때의미률가지게된다. 회수율은샘폴내의물질이나어떤요인들로인해 LAL에대한활성도가증가또는억제되는정도룔파악하기위한방법으로 in-plate spiking 기법을이용하여첨가한엔도톡신의농도는 0.45 EU/m/ 로계산하되그식은아래와같다. 회수율 (%)= spike한 well의농도-spike안한 well의농도 : < 종말점-d 색법 > 표준액의제조 - 본시험에서사용된 LAL kit는 QCL-lOO(Biowhittaker) 이였으며, 표준액으로사용한 J. Pharm. Soc. Korea

4 609 빌열성 물질시험 비교 내득소는 E. coli 0111:B4로부터 추출한 lipopoly- 온차의 최대치의 할<>1 1.3X이하일 때 발열성물질 시 saccharide(biowhittaker)이었으며, 시험용액 제조를 위 험 옴성, 또는 2.5 C이상일 때는 발열성물질 시험 양 한 완충액으로는 내득소 제거 처리한 LAL 시약용 증 성으로 하였고, 체온의 차가 그 중간 또는 발열빈' 이 류수률 사용하였다. 이상하다고 인정될 때는 시험을 반복하식 두 번의 결 E. coli 0111:841- 제조사에서 지시한 용량의 LAL 과의 합이 3.0X 이하이면 음성으로, 4.2T 이상이면 시약용 증류수에 녹여 저장액 (22EU/m/>l 만든 후, 양성으로 관정하되 체온의 차가 그 중간 또는 발열반 1.0 EU/m/, 0.5 EU/m/, 0.25 EU/m/, EU/m/ 순 응이 이상하다고 인정될 때는 다시 한번 마지막으로 으로 희석하쉬 표준농도률 만둘어 표준곡선을 만드는 시험을 반복하식 세 번에 걸친 체온의 차가 5.0 C 미 데 사용하였다. 저장액은 15분간 vortex mixer를 이 만이면 움성으로, 5.0X 이상일 때 앙성으로 판정한다. 용해 혼합하며 연속적인 희석액의 작성시 1분간 잘 흔 합하였다. 또한 사용직전 30초간 vortexing하여 시용 실험 결 과 및 고 찰 하였다. 시 조제 - 각각의 시료에서 200 i/t 취해 LAL시약 LAL 시험의 혈액제제 중 사람 혈청 알부민에의 적 용 증류수 1,400 m/에 혼합해 1:8 희석액을 만든 후 용 가눙성을 확인하식 효과적인 수행방법을 모색하기 연속적으로 희석해 1:80, 1:160, 1:240, 1:360, 1:480 위해 먼저 LAL 시험을 이용한 몇 가지 시험법 중 먼 의 시료를 만돌었다. 저 다른 의약품 등에 광범위하게 시용중인 종말점-비 시약의 조제 - 발색기질시약(Biowhittaker)에 LAL 색법을 이용한 kit의 시'용을 시도하식 보았다. 일반적 시약용 증류수 6.5 m/률 첨가하여 2m M 농도로 만든 으로 샘폴 내의 저해작용요인 배제를 위해 우선적으로 후, LAL 시약에는 LAL 시약용 'o-n~r 1.4 m/을 가 희석법을 사용하는데 이때 최대 희 석배 수 (MVD, 하여 조심스럽게 흔들어 완전히 녹여서 사용하였다. 반 Maximum Valid Dilution)가 중요한 지표가 된다. 최 응정 지액은 25v/v% 아세트산과 10% sodium dode- 대 희석배수는 희석 LAL 시약의 감도를 최대한의 희 cylsulfate로 제조하였다. 석배율을 결정해주는 지표로 중말점-비색법의 경우는 내득소 측정 - Microplate(Falcon 3072)에 시료, 표 준품, 옴성 대조군을 각각 50 Mi씩 분주하고, LAL 시 약을 50 Mi씩 첨가한 뒤, 37T에서 10분간 배양한 후, 미리 37*^로 가온해 둔 발색기질 시익을 100 률 첨 다옴과 같이 계산할 수 있다. 최대희석배수 (MVD)= _ endotoxin limit x potency of product X " 가하였다. Microplate를 37T 에서 6분 동안 배양한 _ 1.33 X 1 _ 1O q ^ ~ 0 T ^ ~ 오 서 다옴 각 well에 반응정지액 50 10/를 첨가한 다옴 microplate reader틀 이용하여 405nm에서 죽정하였다. - potency of product: volume-per-kilogram 투여 < 발열성물질시험> 발열성물질시험은 생물학적제제 기준 및 시험방법에 약물의 경우 1.0 ->L LAL시약의 최저 검출농도 의해 실시하였으며 그과정을 구체적으로 설명하면 다 옴과 같다. 한 검체 당 체중 1.5 Kg이상의 토꺼 3마 이내에 미리 약 37 C로 가온한 검체를 Kg당 3 m/씩 T 이정맥내에 주사하고 주사 후 3시간, 적어도 1시간마 다 체온을 측정하였다. 토꺼 3마리의 대조체온과의 체 VoL 43, No. 5, 멘 을 대조체온으로 하였다. 대조체온 측정 후 약 15분 S에 정 시간 안정시킨 다옴 측정하되 검체 주사전의 체온 % }9 1 2A J 9 A 8 y 않았다. 온도계는 일정한 깊이로 직장에 삼입하고 일 떼 시 부터 시험이 끝날 때까지 물 이외의 사료는 공급하지 ^ 리률 사용하였으며 주사기와 주사비늘은 미리 250 C 에서 30분 이상 가열 멸균하식 사용하였다. 10시간 전 240 Dilut F ig. ;es Dvery T 320 ' 480 a c to r w ith d ilu tio n

5 610 이 ^ 경 강 ^ 백선영 김 신광훈 민홍기 Table I - Changes of recovery rate after heating at 75, 15 min Methcxi/Treatment No. of sample Kineticchromogenic Kineticturbidimetric none(%) done(%) none(%) done(%) S' HQ K i n e t i c - c h r o m o g e n i c ' 상 g K i n e t i c - t u r b i d i m e t r i c - T T ^ m a w 1 서 ^ 흘 in 고그그그획며떠매 수율을보였다 (Fig. 4). USFDA GUIDEUNE(1987) and GUIDANCE(1991) 에서지정한바에따르면생물학적제제에대한 LAL test의유효성을검증하기위해 % 의회수율을요구하고있으므로 160 배희석했을경우저해작용이제거되었다고관단된다. No. of samples Fig. 3 - Comparison of endotoxin concentration detected with kinetic-chromogenic and kinetic-turbidimetric method in albumin samples. 이시약 i : 이용하식샘폴에대한시험을수행해본결 과 10 배까지는희수율이 50% 률넘지못했으므로저해 작용은제거되지앉았옴을확인할수있었다. 키네틱법 을이용한 kit 에대한시험결과, 희석을통해서저해작 용이제거되었으며 (Fig. 2), 열처리를하였을때회수율 이유의하게상승됨을확인하였다 (Table T). 발열성물질 시험을통과한검체 100 개를시료로선정하여키네틱 - 비색법과키네틱 - 버탁법을이용하여 LAL test 률실시하 여각각에대한시험을실시하식검체내내득소의농 도와회수율을검사하고 (Fig. 4-5) 이률바탕으로두방 법에대한생물학적제제특히알부민의내득소시험법 으로의이용가능성과적합성을비교하쉬보았다. 회석율이용한저해작용제거효과 키네틱법을이용하는경우 MVD 는다옴과같은방 법으로산출할수있다. 최대희석배수 (MVD)= 1.33x 본실험에서는희석을통해저해작 을제거하기위 한적정희석비율을얻기위해시료를 80 배, 160 배, 240 배, 그러고최대희석배수값에는벗어나지만 480 배, 720 배까지희석하식시험을수행하였을때, 160 배 이상부터는비색법과비탁법에서공히 50% 이상의회 열처리를이용한저해작용의국복일반적으로 LAL test에있어서의저해작용은제제의생산및공정중에재료로시용되거나정상적으로접족할수있는물질들, 특히액상외 thimerosal, sodium bisulfite, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, urea, rose bengal 등이 LAL 시약내의단백질을번성시키거나효소활성을억제하식유도되며, 따라서소량첨가된내득소의회수가억제또는증가하게된다. 그중 benzyl alcohol등과같은저해제는희석을통해손쉽게극팍서 7] 능하지만보다적극적으로 detergent 를사용하거나일정시간가온하여저해작용을제거할수있는데본시험에서는후자의방법을선텍하식 75 C에서 15 분간가온하식희수율의번화률확인하였다 (Table I). 시험방법에따른열처리효과의차의를비교하기위해시험의유의성의척도인시료의내득소회수율 을기준으로통계적처리률수행하였다. 각방법간및처리간의분산분석을수행하식 F 검정을수행하였으며처리간의차이의유무를각방법간의결과를 pairedcomparison을수행한결과키네틱 -비색법과비탁법의경우모두열처러에위해회수율이유의하게증가되었옴을확민할수있었고, 특허키네틱 -비탁법에있어비색법에비해현저한회수율의상승효과를보였다 ( 키네틱- 비색법 :S.D.-1.33, 키네틱 -비탁법 :S.D ). 결국, 본시험에서의최적 LAL test 조건은 160 배희석에 75X, 30분열처리률한경우인것으로 SK1 되었다. 커네틱 -b 색법과키네틱 -b 탁법의비교 생물학적제제, 특히알부민에대한 LAL test 의적 J. Pharm. Soc. Korea

6 발열성물질시험비교 >ouai스% > A j 이No. of samples Fig. 4 - Comparison of recovery rate in albumin samples after test in kinetic-chromogenic and kinetic-turbidimetric methods. 91 No. of samples Fig. 5 - Concentration of endotoxin in albumin. 기준이상의결과률보였다. 이는일중의중진작용 (enhancement) 에의한것으로사료된다. 보통증진작용은 LAL을활성화시키는포도당중합체인 glucans 이존재할때발생하는것으로보이는데, glucan 간섭에대해위험한수준에있는물질은셀률로오즈의 hollow fiber, 세척되지않은셀룰로오즈아세테이트필터, carvoxymethyl cellulose 또는세균의증식에의한 curdlan, 효모증식에의한 zymosan, 조류 (algae) 의 laminarin, 곰광이의 lentinan 능으로볼수있다. 이들물질돌은 LAL과반응하지만발열성물질시험에서는발열을유도하지못하는물질로알려져있으므로본실험에서의나타난증진작용둘은본제제의제조공정중에노출된물질들에의한것으로보인다. > 합성을확인하고시관중인 kit중보다용도에부합하는방법을선정하기위해 rabbit pyrogen test 에서합격한 20% 사람혈청알부민 100 건을선정하식각각키네틱 -비색법과키네틱 -비탁법을이용한 LAL test를수행하였다 (Table n, Fig. 3-5). 본시험에서와같이 E. coli 055:B5 률표준품으로용하고있는미국의기준인 1.33 EU/ml을결과에적용해보았을때, 키네틱-비색법에서는 7% 가, 키네틱-비탁법에서는 1% 가 재현성조사본시험에서는각 LAL 시약들을이용한시험을국가검정시에적용할경우가장문제가될수었는재현성의안정화룰위해각각의 kit에대해시료중에서임의로선정한 10건의알부민에대해재현성을검사 하였다 (Table II). 10 건의시료에대해각 kit률이용하여동일한시험을연속적으로실시한결과를역시미국의기준인 1.33EU/m/ 을적용했을때, 키네틱 -비 Vol. 43. No. 5, 1999

7 이유경 강 s 숙 백선영 김 용관 신광훈 민홍기 Table II Comparison on reproducibility of LAL test between kinetic-chromogenic and kinetic-turbidimetric method Method/Treatment No. of sample S.D. Kineticchromogenic Kineticturbidimetric Concentration (Eu/m/) Recovery (%) Concentration(Ei]/m/) Recovery (%) 색법의경우 8회는적합, 2회는기준초과인것으로확인되었고표준편차는내득소농도에대해서는 0.23 으로나타났으며, 키네틱 -비탁법의경우 10 회모두적합한것으로확인되었고표준편차도 8.44로나타나키네틱 -비색법에비해오차가현저히적은것으로결론지을수있었다. 이러한오차의발생은알부민내의저해물질돌에의한간섭현상이외에도내득소의물리적성상이관여하는것으로보인다. 내득소는검출과제거에있어문제률야기하는독특한화학적, 물리적성질을가지고있다. 내득소분자의탄수화물복분은물과같은극성용매에서의분산을 서하게하고, 비극성용매에서는분산되지않도록한다. 유기용매내에서는용매가지질 A의배치를번화시키고활성을없애기때문에 LPS룰회수하는것은불가눙하다고할수있겠다. 정제되지않은내득소는지질, 란수화물, 그리고단백질을포함하고있어물에서안정하고손쉽게분산되므로, 시료에대한잘흔합하는것이필요하지않은반면, 정제된내득소는안정화단백질 group이없어물에서분산할만큼안정하지못하므로조제와유지를위해잘혼합한것이필요하고특히, leu/m / 이하의저농도인내득소희석액은유효한상태로유지하기가어렵다. 하지만정제되지않은내득소와는달리정제된내득소는약물시료와흔합되면서배열상에번화룰일으켜간섭현상을나타내는경우가많으므로실제적으로문제가되는것은안정한상태인정제되지않은내득소라고할수있겠다. 그러므로오차률방지하기위해서는최대한내득소에노출되는 7] 능성을즐이고표준품조제시나내득소스과의크액조제시에사용직전에조제하쉬바로사용하되정해진시간만큼철저히잘흔합할것이권장된다. FDA에서 LAL 시험을승인하기이전의문제들중하나는내득소가아닌발열성물질의문제였다. LAL 시험에대한모든연구는이시험이의약품품질관리시험에있어어떠한발열성물질도놓처지않는다는것을보여주고있으며, 특히 1979 년 Baxter 사세서정맥주사제와의학적기구에대해수행 된 143,194 건의 LAL 시험과 28,410 건의토꺼발열성 물질시험결과률보고하였다. 이결과에따르면용액 과기구내의발열성물질은자연상태의내득소이므로 LAL 시험과토끼시험모두에서양성빈움을나타내며, 설명되지않는옴성 LAL 시험결과와앙성토끼시험 결과는없었고, LAL 시험에의해검출될수있는대 부분의내득소유래의발열성물질이토끼실험에서는 검출되지않는경우가확인되었으며, LAL 시험시보 다높은재현성을얻을수있옴이확인되었다.""* 결국, FAD 에서 1987 년에발열성시험을 LAL 시험으로대 체할것을승인한후, 현재대부분의약전은 LAL 분 석을기본적인내득소시험방법으로받아 들여지고있 는데 rr 0 있다. 이는 LAL 시험의감도, 특이도, 정확도, 경제성 고려한것으로본시험결과와일처한다고볼수 결 본연구에서는사람혈청알부민내의내득소검출을 위해 LAL 시험을현재시용되고있는발열성물질시 험의대체또는병행시험으로의시행기 능성을타진 하고시판중인 LAL 시험키트듣에대한시험을수행 하여가장신속하고손쉽게정확한걸과률얻을수있 는시험법을선정하고현실정에적합한기준설정을 위해수행되었다. 1. LAL 시험을이용하여사람혈청알부민내의내 득소분석시, 160 배희석, 75 C 로 15 분간열처리할 론 때최적의회수율을얻을수었었다. 2. 국내에서제조한 20% 알부민 100 건에대한발 열성시험시모두적함하였으나, LAL 시험결과키네틱 - 비탁법에서 1%, 키네틱 - 비색법에서 7% 가 1.33 EU/ 초과한것으로관찰되었으나움성 LAL 시험결과 와양성토꺼시험결과는없었고, 키네틱 - 비탁법과키네 틱 - 비색법이모두데우높은감도룰나타냄을고려할 J. Pharm. Soc. Korea

8 발열성물질시험비교 613 때, 비특이반응에의한결과인것으로추측되었다. 3. 재현성시험에있어서는키네틱 - 비색법에비해키 네턱 - 비탁법이우수한결과률나타내었다. 4. 본실험결과률종합하쉬볼때 LA L 시험을발열 성물질시험의대체시험또는병행시험이가능할것으 로생각된다. 문 1) Lanisng, M. E, John, R H. and Donald, A. K.: Microbiology, 2nd ed. An. C. Brown Publishers, p55, (1993). 2) Lillehei, R. C., Longerbeam, J. K. and Bloch, J. H.: Physiology and therapy of bacteremic shock, Experimental an clinical observation. Am. J. Cardiol. 13, 599 (1963). 3) Clas, E and Loos, M. : Killing of the S and R forms of Salmonella minnesola via the classical pathway complement activation in guinea pig and human 헌 sera. J. Immunology. 40, 547 (1980). 4) Kanoh, S., Mochida, K. and Ogawa Y. : Studies on heat-inactivation of pyrogen from E. coli Biken. J. 13, 233 (1970). 5) Cooper, J. E, Levin, J., Wagner, H. N. : Quantitative comparison of in vitro and in vivo methods for the detection of endotoxin. /. Lab. Clin. Med. 78(1), 138 (1971). 6) Wachtel, R. E., Tsuji, K.: Comparison of limulus amebocyte lysate and correlation w ith the United States pharmacopeial pyrogen test. A ppl Environ. Microbiol. 33(6), 1265 (1977). 7) Poole, S., Dawson, P., Gaines, Das, R. E. : Second international standare for endotoxin : Calibration in an international collaborative study. J. Endotoxin. Reserck 4(3), 221 (1997). 8) Steere, A. C., Rifaat, M. K., Seligmann, E.B., Hochstein, Jr. H. D., Frieoland G., Basse P., Wustrack K. 0., Axnick K, J., Barker L. E : Pyrogen reactions associated with the infusion of 25% normal serum albuinin(human). Transfusion 18(1), 102 (1978). 9) Cooper, J. E, Weary, M. E., Jordan, E T. : The impact of non-enxotoxin LAL-reactive materials on lim ulus amebocyte lysate analyses. PDA. J. Pharma. Sci. Tech. 51(1), 2 (1997). 10) Roslansky, R E, Novitsky, T. J. : Sensitivity of Limulus Amebocyte Lysate(LAL) to LAL-reactive glucans. J. Clin. Microbiol 29(11), 2477 (1990). 11) Ikemura, K., Ikegami, K., Shimazu, T, Yoshioka, T, Sugimoto T.: False positive result in lim ulus test caused by limulus amebocyte lysate-reactive material in immunoglobulin products. /. Clin, Microbiol 27(9), 1965 (1989). 12) Muscoli, C., Weary, M. K.: Application of the Limulus Amebocyte Lysate(LAL) pyrogen test for parenteral injectable products. Biomedical applications of the horseshoe crab(limulidae), Elias Cohen Ed, A R Liss, (1979). Vol. 43, No. 5, 1999

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,