<5B D DB8E9BFAABAB4B8AEBCBEC5CD2DBFA1C0CCC1EEC1BEBEE7B9D9C0CCB7AFBDBAB0FA5D20BFA1C0CCC1EE20BBFDB9B0C0DABFF820C8AEBAB8C3BCB0E820BFEEBFB

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1 최종결과보고서요약문 과제명에이즈코호트생물자원확보체계운영 중심단어 에이즈, HIV, 에이즈코호트, PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell), 주관연구기관네오딘의학연구소주관연구책임자황유성 연구기간 년국내에서첫에이즈감염환자발견이후로 년까지 HIV/AIDS 누적감염인수는약,명이상으로꾸준히증가하고있어이에따른대책과실제적이고구체적인관리체계가시급히요구되는실정이다. 이에국가차원의에이즈환자들의감염관리와더불어생물자원으로서의에이즈환자들의시료를체계적으로수집및보관하여에이즈생물자원의확보에기여하고자하였다. 에이즈코호트생물자원확보체계구축 사업을통하여이루어진확보체계를더욱개선보강하여에이즈감염인혈액의운송시스템구축, 시료제작및보관에관한프로토콜개발및구축, 제작한시료의위치관리시스템구축, 내부정도관리프로토콜의개발및시스템을구축하고 차년도사업에적용, 운영하였다. 각지역의 개의참여병원에서채혈된에이즈환자들의혈액을본연구소로안전하고신속하게검사실로운송하여, 혈액으로부터 Plasma와 PBMC를분리하여시료를제작및보관하고시료에대한위치관리시스템을적용하여실시간확인가능하게하였으며, 보관된시료는질병관리본부생물자원은행으로최종운송하였다. 에이즈환자의혈액이므로운반자뿐아니라취급자들의감염예방을위해혈액을 중포장된전용용기에운송하였고, 시료제작과정을단순화시킬수있는 CPT(Cell preparation tube) 를사용하였다. 안전하게운송된혈액으로부터 바이알의 Plasma 과한바이알당 (ml) 세포수기준으로 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell) 를분리하여보관시료를제작하였다. 사업기간동안총 명의대상자로부터혈액을운송하여 PBMC, 바이알 ( cells/ 바이알 ), Plasma(.ml), 바이알의시료를제작하여액체질소탱크에보관하였다. 이렇게제작된시료들은질병관리본부생물자원은행으로운송하였고, 이후다양한 연구자들에게분양되어에이즈의기초연구에좋은생명자원이될것으로생각된다.

2 Summary Title of Project The management of Korean Multicenter AIDS Cohort Specimen Repository as a Biological Resource Banking System Key Words AIDS, HIV, PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell), AIDS cohort Institute NeoDIN Medical Institute Project Leader Yoo-Sung HWANG Project Period Since first case of Korean HIV patient was discovered in, cumulative total of HIV/AIDS cases has been, at the end of in Korea. Because HIV infected patient is increasing, specific and actual government official system is required urge ntly. Accordingly, we wish to contribute to infection control and security of specime n as a biological resource of AIDS patient. Through the st-year project of "The Development and Construction of Korean Multi center AIDS Cohort Specimen Repository as a Biological Resource Banking S ystem", we obtained that transport system construction of HIV infected blood, prot ocol development for specimen processing, internal quality control and storage, and BSRS(Biospecimen Storage and Requisition System) system construction. Using the se established systems, nd -year project was managed. Blood of HIV/AIDS patients were transported rapidly to Neodin laboratory with safety precautions, and then we processed and stored specimen(plasma and PBMC). Storage specimen applies BSRS and enabled real time confirmation. After a certain period of time, storage samples were transported to Bio-bank team of KCDC. To prevent damage and infection in transit, collected tube is wrapped with desicc ant paper, impact modifier and triple aluminum can and then transported. To simp lify PBMC (peripheral blood mononuclear cell) sample manufacturing process, CPT(C ell preparation tube, BD) has been used. Plasma( vials) and PBMC( /vial)we re prepared from safely transported blood. We had collected blood sampless of AIDS patients during about months, prepared the specimen of PBMC, vials ( /vial) and Plasma, vials (. ml) and then kept those in liquid nitrogen tank. Produced specimens were safely t ransported to Bio-bank team of KCDC. - -

3 제 장최종연구개발목표. 목표. 연구의배경 가. HIV/AIDS는 년에첫사례가발견되었으며, 년 월기준으로현재우리나라의내국인 HIV/AIDS 누적감염인수는약,명수준으로매년증가하는추세를보이고있다. 이러한감염인의빠른증가추세는국가보건, 사회경제적부담으로작용하고있다. 나. 우리나라에서는 HIV 에감염이확인되면법률에의해감염자명부를작성하고, 검진 및전파경로의파악을위해역학조사를실시하며, 전문치료기관에서치료를받도록 할수있게되어있고, 감염자부양가족을국가가보호할수있도록하고있다. 다. 우리나라는아직은 HIV 감염율이다른나라들에비해낮은편이고등록된감염자에대해검진및발병시치료등을국가가책임지고있는데, 현재신규감염자가빠른속도로증가하고있으므로향후에이들에대한관리대책의수립을위해서는감염의진전양상및합병질환과치료에대한과학적인조사가필요한실정이다. 라. 질병의양상에대한체계적조사를위해쉬운방법으로는단면적시점에서의자료집계인데, HIV/AIDS 와같이유병기간이길고우리나라에서처럼유병률이낮은질병의경우에는 cross-sectional study로는유의한결과를얻기어렵고, Cohort study가필요하다. 마. 한편, 우리나라와같이 HIV 감염인이많지않은나라에서 HIV/AIDS와관련한여러가지의장기적인연구를위해서는 Cohort 연구와더불어주기적으로혈액및체액등을체계적으로채취보존하는보관소구축을병행하는것이효과적이다. 이를통해서향후에예방, 퇴치및치료약제효능및내성에관한여러가지연구를거듭수행할수있을것이다. 바. 일종의생물자원화 (Biological Resources Bank) 된에이즈코호트검체보관소 (AIDS Cohort Repository) 의구축과운영을위해서는참여기관에서채취된혈액검체를안전하고신속하게운송하고, 일정하게처리하여, 안정적이고체계적으로보관하는시스템의고안과구축이필요하다. - -

4 . 연구의필요성 가. 에이즈코호트에서확보한생물자원에대한최적품질을유지, 보관하여향후에이즈 연구에활용할수있는자원보관시스템운영이필요하다. 나. HIV 감염부터에이즈발생또는사망까지의질병진전에영향을미치는바이러스및 유전학적영향분석또는 HIV 자연사의장기적연구를위해서는국내 HIV/AIDS 감염인의지속적인생물자원의확보가필요하다.. 연구목적 ㆍ 차년도에이즈코호트사업을통해, 본연구소에서는우리나라실정에맞는생물자원수송에대한신속하고안전한운송및관리시스템을구축운영하였으며, 확립된시스템에따라검체를운송, 처리및보관하여코호트검체보관소 (Repository) 를구축운영하였다. 또한구축된코호트의적정성을제고하기위하여내부정도관리프로토콜을개발하였다. ㆍ 차년도에수행한연구를토대로한 차년도에이즈생물자원확보체계운영사업의 목적은다음과같다. 가. 에이즈코호트연구를위한협력병원과의인프라구축및에이즈환자혈액의안전한 운송및관리시스템을잘운영하고, 혈액으로부터분리제작한 Plasma, PBMC 등의 생물자원을안정적으로관리하고자한다. 나. 궁극적으로확립된시스템에따라검체를운송, 처리및보관하여코호트검체보관소 (Repository) 를구축운영함으로써향후구축된생체시료를이용한연구를통하여감염자의생존기간연장및삶의질향상에도모하고자하며, 이를통해과학적근거중심의에이즈예방관리와연구활성화에기여하고자한다. - -

5 . 목표달성도. 에이즈코호트연구를위해우리나라실정에맞는혈액등생물자원수송에관한신 속하고안전한운송및관리시스템을구축및운영하였다.. 확립된시스템에따라검체를운송, 처리및보관하여코호트검체보관소 (Repository) 를구축및운영하였다.. 위의확립된시스템에따라 개센터 개참여병원에서 차년도사업기간동안 명의에이즈감염인대상자로부터채취되어네오딘으로운송되어혈액으로부터 Plasma, 바이알과 PBMC, 바이알의시료를제작하였다. 참여병원의참여부족으로인하여예상목표 건수에대한시료제작에는어려움이있었다. 이는시료제작을위한혈액검체가에이즈코호트 개센터, 개참여병원으로부터확보된에이즈코호트환자로부터유래되는연구여건에서기안한다.. 국내 외기술개발현황. 현재및미래의생체의학연구를위한바이오자원을확보하기위하여 Cryopreserved lymphocytes, DNA, EBV-immortalized cell lines, 혈장, 혈청검체와같은다양한바이오자원이제작보관되고있다. 특히 Cryopreserved lymphocytes 나 Immortalized cell 과같은세포의동결보관은 DNA, RNA와같은핵산의무한한 source가될수가있으며, 향후 viable cell을이용한세포의 functional study, immunological study 등에이용할수있는자원이되므로전세계적으로다양한역학연구및질환군연구에서이러한생체시료의제작및보관이이루어지고있다.. 본연구에서가장중요한점은향후발생가능한 AIDS 연구를위하여신선하고, 생존율이높은세포를확보하기위하여양질의 cryopreserved lymphocyte를제작, 보관하는것이다. 이를위해서는무엇보다검체채취가잘되어야하며, 가능한한빠른시간내에검사실로운반되어서신속하게시료가제작되어야하는검체채취및운송시스템을갖추는것이중요하다고본다. 또한검사실에서는 시간당직시스템을구축하여언제라도검체가도착하면즉시세포를분리하여시료를제작할수있는업무 process 를갖추어야한다. 또한장기간의보관을위해서는 Bar-code system을이용한검체보관의전산시스템이구축되어있어야하며, 검체의장기보관에따르는 Deep-Freezer 나 LN tank와같은저장소의 시간온도 check and monitoring system이구축되어있어야한다고본다. - -

6 . 또한, 다양한코호트사업의경험상검체및검사과정상의문제가있거나특이소견이 있는경우즉시사업주관부서에연락을하는상호 communication system 이구축되어 있어야한다고본다.. 이전의 cryopreserved lymphocytes vial 제작시말초혈액검사상정상 WBC count, l ymphocytes count를가진정상인을대상으로 ml 정도의전혈로 -개의 cryo-vial 이제작가능했었다. 이는건강인이라도 WBC 및 lymphocytes의비율이약간차이가나기때문이었다. 그러므로본사업에참여하는 AIDS 환자의일반적인 CBC 결과를참조하여서채혈하는전혈의양이충분하도록검체를채취하는것이중요하다고사료된다. 세포의수가너무적거나 viability가낮은경우는보관후해동시세포의이용이제한될수있다고본다.. AIDS 환자에서 HIV virus는 human T lymphocytes 특히 T(CD positive) lymphocy tes에주로감염을일으켜서그수가감소한다고한다. 그러므로 CD/CD cell, CD/C D cell ratio와같이 T 와 B lymphocte 수, 비율및 T, T lymphocytes의수및비율을지속적으로모니터링하는것이필요하다고본다.. 년부터는유럽및영연방 개국에구축된 개의에이즈관련코호트가공동연구 를수행하고있다.. 에이즈에대한연구가활발한미국에서는 년부터약 천명의동성애및양성애남 성을대상으로코호트연구사업이시작되어현재까지지속되고있으며, 이를통해지금 까지약 건의연구가수행되어그결과가발표된바있다.. 영국에서는 년부터 HIV 양성전이자를대상으로한코호트를구축하였고, 현재영국전역의 개병원으로부터약,명의감염자가등록되어있다. 년부터는유럽및영연방 개국에구축된 개의에이즈관련코호트가공동연구를수행하고있다.. 영국, 스위스등의유럽과미국에서는이미 년대부터에이즈코호트를구축하고 년이상운영하여이를기반으로활발한에이즈기초연구, 역학, 치료효과관련의수많은연구논문및가이드라인을개발하고정책개발로이어져에이즈예방에활용되는등다양한분야에기여하고있다. - -

7 . 스위스는 년부터 Swiss HIV Cohort Study (SHCS) 와 Mother & Child HIV Cohort Study(MoCHiV) 를두개의코호트를구축하여운영하기시작하였고, 년부터는 MoCHiV가 SHCS에통합되어운영되고있다. 스위스 HIV 코호트는에이즈연구활동을촉진함으로써 년부터 년까지 개에이즈연구프로젝트를수행및 개의논문들과 개의국제공동논문을산출하는좋은결과를얻고있다. 표. 외국의 HIV/AIDS 코호트 국가 코호트명 시작년도 코호트규모 캐나다및프랑스등유럽 개국 CASCADE (Concerted Action on Seroconversion to AIDS and Death in Europe), 명 캐나다 Southern Alberta Clinic, 명 유럽, 미국, 호주 Multi-national Cohort Collaboration, 명 스위스 Swiss HIV cohort study, 명 호주 Australian HIV observational database, 명 미국 Veterans Aging Cohort Study (VACS), 명 Women s Interagency HIV Study, 명 Changes in Opportunistic Prophy Study Group 명 The Multicenter AIDS Cohort (MACS), 명 영국 The UK Collaborative HIV cohort Study (CHIC) 명 UK register of HIV Seroconverters, 명 Clinic Cohort, 명 ** 자료출처질병관리본부국립보건원, 대한에이즈학회심포지움 - -

8 제 장연구개발내용및방법. 연구내용. 에이즈코흐트참여병원에대한지속적인담당자교육실시 ) 채혈시, 원심분리시, 검체전용기사용, 검체전달시주의사항 ) 물품청구및관리 ) 검체수송진행절차. 건이내의검체에대한에이즈감염인혈액의안전한수송 ) 수도권 ( 서울, 경기, 인천 ) 과지방 ( 대전, 원주, 충북등 ) 에소재한에이즈코호트참여병원으로부터에이즈환자혈액을안전하게수송 ) 항응고제처리된에이즈환자혈액을참여병원으로부터 ~시간내수송하여보관시료를제작할수있는검체수송체계운영 ) 검체운송시안전대책의수시교육을통해안전한검체수송전국 Network 운영. 수송된에이즈감염인의전혈로부터 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell), Plasma 를분리한보관시료를제작하여적정조건으로보관및운송 ) Cryo vial로제작하여 Plastic rack(*) 및 LN tank 사용 ) 생체시료영구보관을위해 에이즈코호트사업자원 ( 검체 ) 관리절차 에의거일정기간마다질병관리본부 ( 에이즈. 종양바이러스팀 ) 로일괄송부하여유전체생물자원센터에영구보관. 에이즈코호트검체보관및향후연구분양용검체관리 ) 바코드라벨에병원명, 고유번호가인쇄된 차원바코드와고유번호, 시료제작년월일, 시료명이인쇄된 차원바코드 labeling 시스템을통한검체관리 ) 시료의보관위치관리전산프로그램보완 ) 검체수송, cryo vial 제작정도관리시스템 ) 제작된 cryo의보관정도관리시스템 ) 안전한검체취급, 폐기물관리등안전관리 - -

9 . 검체정도관리를위한실험 ) 원심분리시간에따른세포의생존율확인 ; 채혈후원심분리시간지연에따른 PBMC 세포의생존율및회수율을확인하기위한실험 채혈후 시간, 시간, 시간후원심분리를실시하고 PBMC 세포를분리하여세포의생존율, 회수율확인및동결 일정기간동결보관후해동하여생존율조사및비교 ) 원심분리후 PBMC 분리시간에따른세포의생존율확인 ; 원심분리후 PBMC 세포분리시간지연에의한생존율및회수율확인을위한실험 채혈후 시간이내에원심분리를실시하고상온에보관 시간, 시간후 PBMC 세포를분리하여세포의생존율, 회수율확인및동결 일정기간동결보관후해동하여생존율조사및비교 ) 검체의온도에따른세포의생존율확인 상온, -, 등다양한온도에검체및운송가방을 시간보관 원심분리를실시후 PBMC 세포를분리하여세포의생존율, 회수율확인및동결 일정기간동결보관후해동하여생존율조사및비교 * 위의실험은정상인을대상으로채혈한검체를사용함.. 검체의온도관리 ; 검체운송과정의온도점검 ㆍ각참여병원의지역별로디지털온도계를사용하여주기적으로운송단계의실제적인 온도를점검 - -

10 . 연구방법. 연구수행체계 그림. 연구수행체계 가. 채혈후에이즈혈액검체는제 병원 ( 수도권 ) 은 시간이내, 제 병원 ( 지방 ) 은 시간 이내에본연구소에도착하여검체의분리및시료의제작이수행되고시료의보관 이이루어지도록한다. 나. 생체시료영구보관을위해 에이즈코호트사업자원 ( 검체 ) 관리절차 에의거질병 관리본부 ( 에이즈 종양바이러스팀 ) 에서정한기간에본연구소로부터일괄송부받아 유전체생물자원센터에영구보관한다. 다. 에이즈코호트기반구축을위한다기관에이즈코호트의참여기관으로부터수집되 는혈액검체에대한안전하고신속한수송, 분리및보관시스템을운영한다. - -

11 그림. 업무흐름도 - -

12 . 검체운송및관리시스템 : 수도권및지방에소재한에이즈코호트참여병원으로부터발생한혈액을안전하게운 송하고보관시료를제작, 관리, 수송할수있는시스템을구축한다. 가. HIV/AIDS 코호트참여의료기관대상검체 ( 자원 ) 수송및담당자교육 - 참여병원채혈및담당자교육내용 ; 참여병원담당연구진들이에이즈코호트생물자원확보체계업무를원활하게수행할수있도록실무교육을실시한다. 교육내용ㆍ채혈시주의사항및 CPT 사용시주의사항ㆍ원심분리시주의사항ㆍ검체전용용기포장방법ㆍ 한국에이즈코호트검체인수증 작성방법ㆍ검체전달시주의사항ㆍ물품청구및관리ㆍ네오딘의학연구소에이즈코호트콜센터및담당자연락처 나. 검체관리 ) 참여병원으로부터안전하고신속한검체수송체계확보 () 네오딘의학연구소본사에에이즈코호트콜센터를구축한다. () 참여병원에서는에이즈코호트검체발생시네오딘콜센터로전화연락을하도록한다. () 네오딘에이즈콜센터에서는서울, 경기, 인천지역은 시간이내, 원주, 대전, 청주는 시간이내로안전하고신속하게운송될수있도록제반업무를조정한다. () 검체의운송은 중으로제작한전용용기를이용한다. () 모든검체에는바코드라벨을부착한다. 참여병원의검체관련업무내용ㆍ대상자의채혈이결정되면네오딘에이즈콜센터에검체발생을통보한다. ㆍ대상자를정해진 CPT 개에각각 ml씩채혈한다. ㆍ 한국에이즈코호트검체인수증 을작성한다. ㆍ채혈후 분이내에,rpm으로 분간원심분리한다 ( 지방참여병원의경우 ). ㆍ검체운송용기를포장한다 ( 인수증을함께동봉 ). ㆍ검체를인계한다. - -

13 ) 참여병원지역별운송체계 () 평일오전 시 진료시간 : 시사이에검체가발생한경우규정시간내운송을원 칙으로한다. 제 병원 ( 수도권 ) 표. 제 병원 ( 수도권 ) 지역별운송체계 네오딘의학연구소 채혈확정 채혈및 운송 서울 경기 인천 전화 포장 병원방문 네오딘도착 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 제 병원 ( 지방 ) 표. 제 병원 ( 지방 ) 지역별운송체계 네오딘의학연구소 채혈 원심분리운송충북, 대전원주포장, 전화병원방문네오딘도착 : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : () 다만교통상황, 검체의처리시간등원활한업무를위하여서울, 경기, 인천지역은 :시이전, 원주, 대전지역은 : 시이전으로채혈및운송이이루어질수있도록질병관리본부와협의하여처리한다. () 그러나참여병원과에이즈코호트대상자의사정에따라오후 시이후에도착한검체와토요일검체도처리한다. - -

14 ) 바코드시스템활용 - 바코드라벨에병원명, 고유번호가인쇄된 차원바코드와고유번호, 시료제작년월일, 시료명이인쇄된 차원바코드 labeling 시스템을통한검체관리함으로서에이즈코호트검체보관및향후연구진을위한분양을위한검체관리시스템을구축한다. 검체 차원바코드시스템구축 검체및분리제작한시료는고차원바코드를부착하여관리한다. 차원바코드는실온, 냉장, 냉동, 극저온에서도견딜수있는특수라벨을사용한다. 차원바코드라벨에는고유번호, 시료명, 제작일이인쇄되도록하며추가정보사항은질병관리본부와협의하여결정한다. ) 제작한 PBMC, Plasma 질병관리본부운송 () PBMC : 동결바이알로제작하여 Plastic rack( ) 에담은후 LN tank에보관하였다. () Plasma : 동결바이알로분주하여 Plastic rack( ) 에각각담은후 LN tank 에보관하였다. () 제작되어보관된 PBMC와 Plasma 시료는검체건수가 건 (plastic rack: ) 이채워지면사전에생물자원은행팀과에이즈종양바이러스팀에시료운송을통보하여미리보관장소를확보토록하였다. () 시료는드라이아이스로운송하며시료와함께 한국에이즈코호트검체인수증, 시료확인대장도함께운송전달하고시료확인대장등필요서류에상호확인, 서명하는시스템을구축하였다. 다. 운송내역및특이사항실시간보고 ) 의료기관별수송한검체의수를일별로정리하였고, 매주질병관리본부에보고하였다. ) 검체의상태즉, 용혈, 부분응고, 검체량등해당검체의특이사항을보고하였다. - -

15 . 시료제작및보관시스템운영 가. 시료제작의업무흐름도 그림. 시료제작의업무흐름도 나. 검체의처리 ) 검체처리과정 검사실에도착한검체는신속하게처리한다. 검사자는바코드가부착된혈액과 한국에이즈코호트검체인수증 을전달받아바코드를출력한다. 출력된바코드를 worksheet와검체보관튜브등에부착한다. ) 검체처리규정 검체처리과정에서관찰되는검체상태 ; 용혈, 혼탁된 Plasma, RBC Swelling과같은이상을보이는검체는비고란에작성해둔다. 검체포장방법에이상이있을시참여병원에추가교육을진행하거나시정을요구하도록한다. ) 검체 차원바코드시스템구축 검체및분리제작한시료에는 차원바코드를부착하여관리하였다. 차원바코드는실온, 냉장, 냉동, 극저온에서도견딜수있는특수라벨을사용하였다. 차원바코드라벨에는고유번호, 시료명, 제작일이인쇄되도록하며추가정보사항은질병관리본부와협의하여결정하였다. - -

16 다. 자원제작 ) CPT 를이용한 PBMC 및 plasma 분리 제 병원수도권시료제작 그림. 제 병원 ( 수도권 ) 의 PBMC, Plasma 제작프로토콜 < 제병원-수도권 > CPT에채혈되어운송된검체상태 ( 그림 의좌측 ) 를육안으로확인한다. 예를들면, 검체량, 응고여부, 용혈여부등을육안으로확인하고이상이있는경우에는사진을찍어보관한다. 원심분리 (,rpm, min, Break off, ) 후, plasma 층은분리하여동결바이알에옮긴후 LN 탱크에보관한다. PBMC층을 ml conical 튜브로옮기고여기에 RPMI ml을넣어 inverted mix 후원심분리 (,rpm, min, ) 한다. 상층액을버리고세포 pellet을 RPMI media ml에혼탁한후세포수산정및생존율 (viability) 검사시행을위해 ul를덜어놓는다. 원심분리 (,rpm, min, ) 하여상층액을제거한다. 제 병원지방시료제작 그림. 제 병원 ( 지방 ) 의 PBMC, Plasma 제작프로토콜 - -

17 < 제병원-지방 > Gel 위의상층전체를 ml Conical 튜브로옮긴다. 원심분리 (rpm, min, ) 후, plasma 층을분리하여동결바이알에옮긴후 LN ₂탱크에보관한다. PBMC 층을 ml conical 튜브로옮기고여기에 RPMI ml을넣어 inverted mix 후원심분리 (rpm, min, ) 한다. 상층액을버리고세포 pellet을 RPMI media ml에혼탁한후세포수산정및생존율 (viability) 검사시행을위해 ul를덜어놓는다. 원심분리 (rpm, min, ) 하여상층액을제거한다. ) 세포수산정 (Cell count 법 ) 및세포생존율 (cell viability) 검사 세포부유액 (cell suspension) ul 를 Trypan blue(gibco, # -AG) ul 와섞 은후그중 ul 만을취해혈구계산판 (Haemacytometer) 과 cover glass 사이의 공간으로기포가생기지않도록살며시스며들게한다. 현미경 ( ) 으로보면서 WBC 칸의,,, 사분면의세포를모두센다. cf) Haemacytometer 와 cover glass 사이의공간은가로, 세로각각.mm, 높이. mm 이므로부피는.mm 이다. ml당세포수는 을곱해주면된다. 전체세포수를셀경우는최종부피량을곱해준다. 생존율검사 : 세포생존율 (%) = No. of viable cell / No. of total cell * Trypan blue로염색시살아있는세포는염색이되지않으나죽은세포는푸르스름한검은색 (dark blue) 으로염색이된다. 그림. Hemocytometer 모형 그림. Tryphan blue 로염색한 PBMC 현미경사진 - -

18 ) 동결 PBMC 제작 세포생존율검사후세포부유액을원심분리 (,rpm, min) 한후 pellet만남기고상층액을제거한다. 측정한세포수가한바이알당 이되도록 % DMSO가들어있는동결배지를넣고세포를잘풀어준다. 바코드가부착된동결바이알에부유된세포를 ml 씩분주한다. 동결시킬세포튜브를컨테이너에넣은후 - 초저온냉동고에서 시간방치시키고 LN 탱크로옮겨서보관한다. 그림. 동결배지에부유된 PBMC 현미경사진 라. PBMC, Plasma 시료보관시스템 검체보관및구분을위한라벨링시스템 : 라벨을위한실온 - 냉장 - 냉동 (- ) - 극저온냉동 (LN ) - 실온으로온도가 변화되어도부착되고지워지지않는 차원바코드시스템을이용한다. 그림. 차원바코드시스템 - -

19 . 에이즈코호트운영및결과보고 : 주간단위로의료기관별검체운송내역을보고한다. 표. 에이즈코호트일일업무보고서예시 표. 에이즈코호트검체상세내역보고예시 - -

20 . 정도관리 가. 에이즈코호트의정도관리프로토콜 ) 운송과검체처리에대한시간관리 : 대상자로부터채혈시간, 원심분리시간 ( 지방검체 ), 네오딘의학연구소도착시간, 원심분리시간, - 초저온냉동고입고시간및 LN 탱크입고시간을 한국에이즈코호트검체인수증 에기록하였으며업무보고시에도검체별전체운송시간을표기하여운송시간을관리하였다. ) 검체인수자및인계자에대한관리 : 한국에이즈코호트검체인수증 에참여병원에서검체송부자, 인수자그리고네오딘의학연구소에서검체를인수받은자의실명을기록하도록하여검체처리과정을관리하였다. ) Plasma의양, PBMC의세포수, 생존율등시료의질을관리하였다. ) 질병관리본부로의시료운송시검체의운반자, 인수자의실명을기록하였다. ) 운송및검체처리프로토콜의 Validation 혹은개선을위해필요한경우에현황파악을위한실험을수행하였다. 나. 에이즈코호트의정도관리시스템 ) 시약부문 () 시약표기 (Reagent labeling): 모든시약에는다음의사항이기록되어야한다. 제조회사로부터직접공급된시약 ( 이미병에시약명, 농도및양, 유효기간, 저장조건이기입되어야함 ) 입고일과개봉일을기입후표기한담당자가서명을한다. 검사실에서제조한시약 : 제조시제조과정을확인점검하고시약병에시약명, 농도, 양, 저장상태, 제조일, 유효기간을기입하며제조한담당자가서명한다. () 시약보관및사용 청구한시약수령시에청구한날짜와양을확인하고수령한다. 수령한모든시약은시약의 Cat. No. 와 Lot. 번호를확인하여 [ 시약점검및재고조사 ] 장부에항시작성한다. 모든시약은반드시유효기간을엄수해야한다. 원칙적으로유효기간이지나거나규정대로보관되지않은시약은폐기한다. - -

21 () 시약의입고및관리 사용할시약은 달동안사용될양만큼저장할수있도록하며, 공급받은날짜를기록한다. 시약은개봉날짜를표시하고사용자의서명및유효기간도표기한다. 청구된시약의수령시에는날짜와양그리고유효기간을확인하고시약, 소모품입고대장에기록한다. ) 장비부문 () 원칙 기기의설치및작동방법에관한기준지침이있어야한다. 기기의기능점검및일상점검등을매일기록관리한다. 유지, 기능점검을일정기간마다실시하고장비장부에기록한다. 정기적인보수는정해진기간마다반드시실시하고기기에대한보수및수리가이루어졌거나기기를다루는검사원이바뀔경우에는이를기록하고보관한다. 기기평가시이상이발견되면담당자는고장의원인과증상을자세히파악하여팀장또는담당전문의에게보고후수리를의뢰한다. 담당자는모든내용을장비정비, 점검기록부에기록하고보관하며수리한회사로부터반드시점검한내용의서류를받아서장비장부에같이보관한다. () Clean bench Clean bench 안은항상깨끗해야하며사용전후에는 % 에탄올로 clean bench 바닥을닦아주고, 외관이상이나전원등을확인하고매일기록한다. Iodine이나염기성화기물질을 bench안에서다루지말아야한다. 저녁에퇴근할때는 UV lamp를켜주어야한다. Filter가적절히작동하는지공기의흐름이규정대로작동하는지매년확인하고장비점검기록부에기록한다. () 원심분리 담당자는기기관리점점일지규정에따라서원심분리의청결상태와전원콘센트의이상유무를매일확인하며원심분리의정확도와성능을분기별로 tachometer를이용하여 rpm을점검하며, 허용범위는 ± 이내여야한다. 이상이있을경우는팀장에게보고하여기기의 A/S를요청해야한다. 오염에주의하고사용후에는항상 % ethanol로닦아주어야한다. - -

22 () 현미경 현미경은항상해상도가좋아야하므로주위환경을깨끗하게해야하며점검후에는점검기록부에기록한다. 전문적인점검을년 회혹은 회실시하도록한다. () 초저온냉동고 매일온도를확인하여기록한다. 일정온도에서많이벗어나상승하지않도록주의하여관찰한다. () LN 탱크 ➀ 시료를넣거나꺼낼때마다얼마만큼의 LN 가남아있는지확인하고, 장부에기록한다. ➁ 탱크의뚜껑이잘닫혔는지확인한다. ) 시료보관부문 장부기록 - 검체처리에대한기록을업무일지에기록한다. ( 예, 검체 ID, 검체상태, 검체량, 세포수, 생존율, 동결바이알제작수, 담당자등 ) 전산작업 - 장부에기록된내용을전산작업하여이중으로기록보관한다. 다. 감염방지및폐기물처리 : 네오딘의학연구소내의감염관리및폐기물관리지침을준수한다. ) 에이즈코호트혈액을처리하는경우반드시지정된안전상자내에서작업하였다. ) 검사자의경우반드시실험복, 장갑등의안전장비를착용하였다. ) 생존율과세포수계산에사용되는혈구계산판은일회용을사용하였다. ) 시료제작에사용한모든튜브와일회용소모품은소독액에일정기간처리후폐기하였고, 별도의 Biohazard bag을사용하여폐기하였다. - -

23 제 장연구개발결과. 참여병원에대한지속적인담당자교육. 참여병원담당자교육실시현황 가. 차년도사업에확대된참여병원의에이즈코호트담당자교육을실시하였다. 또한 참여병원의에이즈코호트담당자교체시나교육이필요하다고여겨지는병원은수 시로교육을실시하였다. 나. 교육은감염내과의사혹은간호사, 외래검사실의임상병리사를대상으로하였다. 다. 차참여병원으로추가된서울의료원및향후추가예정인분당차병원, 서울아산 병원에대한교육도실시하였다. 라. 기존참여병원에대해서도유선및방문을통해교육을실시하였다.. 참여병원담당자교육내용 : 참여병원담당연구진들이에이즈코호트생물자원확보체계업무를원활하게수행할수 있도록실무교육을실시하였다. 가. 채혈시주의사항 - CPT 사용시주의사항 : 채혈시혈액검체는 CPT 개에최소 ml 이상채혈하도록한다. 채혈이끝나면에이즈코호트검체인수증에병원용일차원바코드를붙이고, 질병관리본부에서부여한감염인별 ID와병원기관명, 병원등록번호, 채혈일, 채혈시간, 채혈량과튜브개수를적고검체송부자란에서명한다. 그리고제병원 ( 지방 ) 의경우에는원심분리시간도함께기입한다. 나. 원심분리시주의사항 : 지방에위치하는참여병원에서는채혈후, 분이내에원심분리 (,rpm, min,, break off) 가실행되도록한다. - -

24 다. 검체전용용기포장방법 튜브를은박보호관에넣고그위에흡습지로덮고뚜껑을닫는다. 첫번째운송캔에넣은후뚜껑을닫는다. 두번째운송캔에담은후뚜껑을닫는다. 마지막으로세번째종이캔에담아포장한다. 그림. 검체운송용포장방법 라. 검체전달시주의사항 : 제병원 ( 수도권 ) 의경우는채혈이확정되면바로네오딘에검체발생을통보하며, 제 병원 ( 지방 ) 의경우는채혈후, 원심분리시에네오딘에검체발생을통보하도록한다. 검체인계시에는인계자의서명과인수시간이기입되도록교육한다. 마. 물품청구및관리 : 각참여병원별로 CPT, 인수관련서류, 차원바코드, 에이즈코호트전용운송가방 등의재고가부족하지않도록물품관리가이루어지도록교육하였다. 바. 네오딘의학연구소에이즈코호트콜센터및담당자연락처 : 네오딘의학연구소에이즈코호트콜센터및담당자연락처및비상연락망을배부하 였다. 사. 한국에이즈코호트검체인수증 작성방법 : 검체인수증의블록 A 부분은병원에서작성하도록하며, 블록 B 부분은네오딘의학 연구소에서작성하도록한다. 아. 에이즈코호트검체의시료제작과정 : 에이즈코호트검체시료제작과정을교육하였다. - -

25 그림. 검체인수증작성요령. 에이즈감염인혈액의안전한수송. 참여병원으로부터에이즈코호트검체운송체계구축 가. 채혈후서울, 경기, 인천의수도권지역은채혈후 시간이내로본연구소로검체수송이이루어져 PBMC, Plasma를분리할수있도록검체수송체계를확보하였다. 나. 그외대전, 원주, 충북의지방지역은채혈후 시간이내로수송체계를확보하였으나국내운송여건상운송시간이지연될경우라도최장 시간이내에도착될수있도록수송체계를확보하였다. 다. 검체의안전한운송을위해국제규격에맞는병원체안전수송용기 (Class., UN) 를사용하였고, 전용운송가방에는감염성물질위해표시, 방향표시라벨등을표시하였다.. 에이즈코호트검체수송체계구축현황 : 건중 건은참여병원에서채혈일시에대한기록을하지않았고 건은참여병원에서검체발생통보를채혈당일에하지않아운송이지연되었다. 이 건은표 의집계에포함시키지않았다. - -

26 표. 전국검체운송네트워크 사업관리본부 전화번호 책임자명 주소 사업총괄 )- 이봉우 서울성동구용답동 - 사무소명 전화번호 소장명 주소 서울서부 T)-- 이석구 서울마포구현석동 -호 층 서울동부 T)-- 윤주용 서울송파구잠실동 - 층 서울북부 T)-- 엄을용 서울시동대문구전농동 - 동아아파트상가 동제호 인천 T)-- 박종국 인천남동구구월동 -번지대성빌딩 층 경기수원 T)-- 손형학 경기수원시장안구송죽동 - 태영빌딩 층 경기안양 T)-- 이운석 상동 원주 ( 영서 ) T)-- 박상우 강원원주시단계동 번지 층 호 강릉 ( 영동 ) T)-- 신광호 강릉시옥천동 -번지 대전 T)-- 손훈택 대전광역시동구소제동 - 번지소제동우체국 층 충북청주 T)-- 신종균 충북청주시상당구영운동 -번지 충주출장소 T)-- 김순진 충북충주시칠금동 번지 층 충남천안 T)-- 이태경 충남천안시봉명동 층 전북전주 T)-- 박재현 전주시덕진구인후동인후동 가 - 부흥타운 층 전남광주 T)-- 문희 광주광역시풍암동 - 층 목포출장소 T)-- 김홍모 목포시상동 번지선찬빌딩 층 부산 T)-- 안상기 부산시연제구연산 동 - 층 경남울산 T)-- 여규철 울산남구삼산동동원빌딩 층 - 경남마산 T)-- 성학기 경남창원시팔용동 - 층 경북대구 T)-- 신일훈 대구수성구만촌동 번지만촌보성상가 동 호 경북안동 T)-- 정종호 경북안동시당북동 -번지 층 경북포항 T)-- 김헌영 경북포항시북구죽도동 - 층 제주 T)-- 박진용 제주시연동 - 로얄오피스텔 호. 에이즈코호트검체운송시안전대책 가. 검체의포장은 중으로밀폐처리된전용용기를사용한다. 이때검체는파라필름으로 sealing 한후흡습지로감싸서용기에넣는다. 차년도에는검체의포장이지침대로 수행되지않는경우가종종있었는데 차년도에는이러한부분이많이개선되었다. 나. 운송자에대한안전교육은지면을통하여실시하였다. 다. 검체운송중사고발생시운송자는즉각네오딘에이즈콜센터로연락하도록교육하였다. 검체가누출될경우에는용기안에있는흡습지가혈액을흡수하게되어있어안전하지만네오딘에서사고확인후수습할수있도록하였다. 라. 차년도과제기간중운송과정에서의사건은한건도발생하지않았다. - -

27 . 보관시료 (PBMC, Plasma) 제작후보관및운송. 에이즈코호트검체수집현황 가. 참여병원현황 ) 다기관 HIV/AIDS 코호트의참여의료기관으로, 지역은서울, 경기, 인천, 원주, 대전, 충북지역으로, 지역내의대학병원이참여하였다. ) 진료과는에이즈치료를전담하는감염내과로구성되었다. ) 개의에이즈코호트센터에속한참여의료기관수는 개병원이참여하였다. 표. 각센터별참여병원현황 고대센터병원명병원코드 연대센타병원명병원코드 카대센타병원명병원코드 고대구로 연대병원 강남성모 한림성심 아주대 고대안암 인하대 영동 SV 한양대 이대목동병 원주기독 성빈센트 원 강북삼성 고대안산 충북대병원 일산병원 의정부성모 명지병원 서울의료원 길병원 을지병원 총 병원총 병원총 병원 나. 참여병원별, 월별검체수집현황 : 검체수집현황을보면총 건의대상자검체가접수되었으며, 고대센터는총검체건수가 건, 연대센터는총건수가 건, 카대센터는총검체건수가 건으로고대와카대센터는거의비슷하였으나, 연대센터의경우검체수가적었다. 참여병원중검체가발생하지않은곳은 개소였다. - -

28 표. 참여병원별, 월별검체접수현황 다. 채혈량에따른검체현황 : CPT tube 채혈시채혈량은 개의튜브에각각 ml씩채혈함을원칙으로하였으나실제채혈되어온양은표 과같이다양하였다. 참여병원별로채혈된혈액양의현황을참분석해본결과두개튜브의혈액을합친양이 ml 이하인경우가 건이었으며, 두개튜브에 ml 씩채혈한경우는 건으로가장많았다. 표. 참여병원별검체량 - -

29 . 에이즈코호트제작시료현황 가. Plasma 시료현황 ㆍ사업기간동안 건의대상검체로부터 Plasma 시료, 바이알을제작하였다. PBMC 층을건드리지않는범위내에서.ml씩 바이알의 Plasma을수집하였다. ㆍ차원심분리후 plasma가혼탁한 lipemic 한검체는총 건이었으며 Hemolysis 가일어난검체는총 건이었다. 표. 센터별, 참여병원별 Plasma 시료현황 나. PBMC 시료현황ㆍ사업기간동안 건의대상검체로부터 PBMC 시료, 바이알을제작하였다. PBMC 수를 ( 바이알당 ) 로계산하여대상자별로 ~ 바이알까지다양하게시료를제작하였다. 표. 센터별, 참여병원별 PBMC 시료현황 - -

30 그림. 제작된 PBMC vial 수현황. 에이즈코호트시료보관현황 가. 제작된시료의보관시스템 제작된 PBMC는 번의바이알과 번을제외한 PBMC를여분의 PBMC 바이알로구분지어보관하였다. 번바이알의 PBMC는 번바이알의 PBMC 만을보관하는 rack에순서대로담아보관하고, 번을제외한여분의 PBMC는여분 PBMC 로다시구분하여만든 rack에순서대로담아보관하였다. 제작된 PBMC 시료의보관시스템 제작된 PBMC vials 예시 PBMC vial < PBMC rack > 나머지 PBMC vials < PBMC rack 여분 > 그림. 제작된 PBMC 시료의보관시스템 - -

31 - - < Plasma rack > < Plasma rack > < Plasma rack > < Plasma rack > < Plasma rack > < Plasma rack > < Plasma rack > Plasma. ml vials 제작된 Plasma 시료의보관시스템그림. 제작된 Plasma 시료의보관시스템.ml 바이알로제작된 Plasma 는바이알에새겨진번호를따라그번호에맞는 rack 에시료순서대로보관하였다. 나. 제작된시료의위치관리시스템에이즈코호트에서제작된시료를보관하고관리하기위해네오딘의학연구소자체의 BSRS(Biospecimen Storage and Requisition System) 프로그램을사용하여보관된시료의위치와정보를관리하였다.. 질병관리본부로에이즈코호트시료운송 : 생체시료영구보관을위해 에이즈코호트사업자원 ( 검체 ) 관리절차 에의거하여일정기간마다질병관리본부 ( 에이즈종양바이러스팀 ) 로일괄송부하여유전체생물자원은행에보관하였다. 가. 수집된시료는일정기간마다드라이아이스와함께포장하여질병관리본부로운송하며시료와함께검체인수증, 시료확인대장도함께운송, 전달하였다. 나. 시료전달시시료확인대장에상호확인서명하였다. 다. 에이즈코호트시료는검체가 건이수집되면질병관리본부생물자원은행으로운송되었으며, 총 회에걸쳐서운송이이루어졌다.

32 표. 질병관리본부시료운송내역 차 차 차 차 차 운송일 년 월 일시료종류 Plasma vials PBMC vials 운송일 년 월 일시료종류 Plasma vials PBMC, vials 운송일 년 월 일시료종류 Plasma vials PBMC vials 운송일 년 월 일시료종류 Plasma vials PBMC vials 운송일 년 월 일시료종류 Plasma vials PBMC vials * 미불출건수 : 검체접수 건이채워지지않음. 향후연구분양용검체관리 : 에이즈코호트검체보관및향후연구진분양을위한검체관리로서바코드시스템 을도입하였다. 라벨은병원명, 고유번호가인쇄된 차원바코드와고유번호, 시료제 작연월일, 시료명이인쇄된 차원바코드 labeling 시스템을통한검체를관리하였다.. ID ( 고유번호 ) 체계확보 가. 에이즈환자의개인정보보호를위해고유번호만을사용하였다. 나. 에이즈환자의관리를위해의료기관별, 환자별 ID 체계를운영하였다. 다. ID 체계는 차년도에구축된시스템을이용하여사업, 병원, 일련번호순으로 ~ 자리로하되질병관리본부와협의하여결정하였다.. 코호트검체관리 ( 바코드라벨링 ) 가. 각병원마다고유번호가인쇄된 차원바코드라벨을 장씩출력하여제공하였다. - 바코드라벨정보 : 병원명, 고유번호 ( 일련번호포함 자리 ) - 바코드라벨부착 : 한국에이즈코호트검체인수증 장, 검체 장 - -

33 그림. 차원바코드 나. 각시료마다고유번호, 시료제작년월일, 시료명이인쇄된 차원바코드라벨을부착 하였다. 다. 차원바코드라벨의문양은다음과같다. 그림. 차원바코드. 정도관리. 원심분리시간에따른세포의생존율확인 가. 목적 : 세포회수율을높이기위해서는채혈후 시간이내에 CPT tube의 차원심분리를권고함 (BD CPT tube 매뉴얼 ). 채혈후원심분리시간지연시세포회수율및생존율변화양상을확인해보고자다음과같은테스트를수행. 나. 테스트조건 : 정상인혈액을 CPT tube에채혈하여아래의조건대로원심분리하여세포분리후회수율및생존율계산. 대상자확보에어려움이있어 N number는 로설정하여수행함. ) 채혈 시간후 차원심분리실시 ) 채혈 시간후 차원심분리실시 - -

34 다. 테스트결과 - 채혈후원심분리시간이지연될수록세포회수율은낮아지나세포생존율에는차이가없는것으로나타났다. - 세포의생존율은원심분리시간에따른큰차이는없었으나, 검체채취 시간후에원심분리를하였을때조금더높은생존율을보였다. 그림. 원심분리시간에따른세포회수율 * 세포회수율의경우 시간후원심분리하였을때회수되는세포의양을 % 로 하여계산함. 그림. 원심분리시간에따른생존율비교 - -

35 표. 원심분리시간에따른세포회수율및생존율 원심분리시간 hr 후원심분리 hr 후원심분리 Test 세포수 ( 단위 ) 생존률 (%) 라. 고찰 : BD CPT tube 매뉴얼이권고하는 채혈후 시간이내원심분리 에맞추어세포분리를수행하고운송시간이 시간이상소요되는지역의경우채혈병원에서원심분리를하여운송하는것이바람직함 ( 현재시스템대로유지 ).. 운송가방의기능테스트 가. 목적 : 채혈된 CPT tube는온도 + + 를유지하며운송하는것이좋다는권고에의해현재사용중인운송가방이그기능을 ( 외부열차단기능 ) 에적합한지여부를확인해보고자다음과같은테스트를수행. 나. 테스트조건 : 채혈된 CPT tube의실제운송조건과동일한상태 ( 디지털온도계 < 은박파이프 < 흡습지 < 삼중캔 < 종이박스 < 운송가방 ) 로아래의조건에방치한후 CPT tube 가위치하는운송가방내부의온도변화를관찰 ) 운송가방의외부온도를 + 로유지 (Oven) ) 운송가방의외부온도를 - 로유지 ( 냉동고 ) - -

36 그림. 검체의운송방법 다. 테스트결과 ) 운송가방을 + 에방치하였을때 시간 분후운송가방의내부온도 ( 실제 CPT tube가위치하는부위 ) 가 + 에도달 ) 운송가방 - 에방치하였을때 시간후 (+ + ) RT range를벗어났으며 시간후운송가방의내부온도 ( 실제 CPT tube가위치하는부위 ) 가 - 에도달 그림. 검체운송시온도테스트결과라. 고찰현재사용하고있는운송용기와가방은외부충격으로인한검체보호기능위주로제작이되어있으며외부로부터의열차단기능이없어 + + 를유지한운송에적용하기는무리가있으므로향후운송가방의개선이필요함. - -

37 . 온도관리. 수도권 ( 서울, 경기, 인천 ) 과지방 ( 대전, 원주, 충북 ) 의 개참여병원으로부터에이즈코 호트혈액검체를신속하고안전하게운송하는수송체계를구축하고운영하였다.. 서울지역은운송시간에대한중앙값이 시간 분이었고, 인천지역은 시간 분, 수원지역은 시간 분, 그리고원주지역은 시간 분이었다. 서울지역내일부병원의경우오전 시에검체채혈을실시하고즉시네오딘콜센터에검체발생을통보하지않아채혈후네오딘까지의운송시간이 시간 분이소요되기도하였다. 이러한몇몇의경우를제외한서울지역참여병원의검체운송은대부분 시간내에이루어졌다. 지방병원의경우검체운송에소요된시간이대부분 시간안팎이었는데이는현재의운송시스템이용에지역적제한이있어운송시간이예상보다많이소요된것으로판단된다. 즉원주나충북의경우운송수단이고속버스나시외버스등이어서도로상황에따라운송시간에차이가있었다 ( 표 ).. 에이즈코호트검체운송시간 운송시간 지역 서울인천수원안산원주충북 평균 : : : : : : 중앙값 : : : : : : 최소값 : : : : : : 최대값 : : : : : : 운송건수 - -

38 제 장연구결과및결론. 연구결과고찰및결론. 연구결과고찰. 차년도사업기간동안에이즈코호트 개센터에속한 개참여병원중 개병원에서 명의대상자로부터혈액을채취하여 Plasma, 바이알과 PBMC, 바이알의시료를제작하였다. 이는최초사업계획에서 명을대상으로한것에비해적은시료량으로이코호트사업이성공하기위해서는무엇보다에이즈코호트 개센터참여병원의적극적인협조가필요하다고사료된다.. 지방의참여병원에서검체가발생하는경우 CPT사의매뉴얼에언급되어있는대로채취후 시간이내원심분리를하기위해서병원에서직접 차원심분리를실시하고있다. CPT tube의특성상안전한원심분리를위해서는특수제작된전용랙을사용하고유리재질인 tube가파손되지않게하기위해서는원심분리속도나 balancing에세심한주의를기울여야한다. 이번사업기간동안지방한병원에서처리된검체중원심분리시파손된경우는총 건이었는데, 이를최소화하기위해서는담당자들의세심한주의가필요하다. 또한, 해당참여병원에직접방문하여검체처리시스템에대한교육, 원심분리장비및 accessory 등에대한점검이필요하다고판단된다.. Plasma는원심분리후 PBMC 층을건드리지않는안전한범위내에서.ml 씩 바이알을제작하고, PBMC의경우바이알당 세포가들어가도록동결하여대상자의세포수에따라 바이알까지다양하게제작하였다.. 말초혈액검사상정상백혈구수치와정상림프구수치를가진정상인을대상으로 ml 정도의전혈로 개의 PBMC 시료제작이가능했었다. 이는건강인이라도백혈구및림프구의비율이약간차이가나기때문이었다. 그러므로본사업에참여하는 AIDS 환자의 CB C 결과를참조하여채혈하는전혈의양이충분하도록검체를채취하는것이중요하다고생각된다. 채혈량이총 ml 이하인경우가 건이있었다. PBMC의수는기본적으로채혈한혈액량보다는대상자의백혈구수치에의해결정되는것이나생명자원으로서 PBMC를보관하고이후연구에사용하기위해서는가능한많은 PBMC를얻어서보관하는것이좋으므로이후사업에서는참여병원에서의대상자채혈에있어세심한주의가요구된다. - -

39 . PBMC의경우연구목적에따라다양한세포수로조정하여동결보관하고있다. 미국의 MACS(Multicenter AIDS Cohort Study, PACTG(Pediatric AIDS Clinical Trial Group)) 에서는 세포 ( 바이알당 ) 로, ACTG(The AIDS Clinical Trial Group) 에서는 세포 ( 바이알당 ) 로동결하고있다. 이후코호트에서수집된생물자원의활용면에있어한바이알당 Plasma의양이나세포수가세밀하게논의되어져야할것으로생각된다.. 본과제를수행하면서동결세포수별그리고동결세포의보관기관별생존율확인을위해다음과같은테스트를진행하고있다. 에이즈감염인의 PBMC 수집방법과동일한프로토콜을이용하여정상인의 PBMC를수집하였고바이알당다양한세포수로자원을제작해놓았다. 이자원은현재 년동안액체질소탱크에보관중에있으며이것을이용하여적정보관기간에대한동결세포의생존율측정을수행할예정이다. 물론, 본테스트가에이즈감염인의자원을이용한것이아니라는단점이있으나현재수행중인연구과제의 back data로써활용도는있을것이라사료된다.. CPT 매뉴얼에는세포의높은회수율확보를위해채혈후 시간내에원심분리를수행하여시료제작을하도록권장하고있다. 최상의세포확보를위해서는채혈후원심분리시간과원심분리후세포수거시간이중요한데현재수도권일부참여병원과지방채혈의운송시스템 ( 버스이용 ) 에서는위의사항을적용시키기가어려운실정이다. 따라서수도권 시간이내와지방 시간이내와같은현재기준시간은참여병원의재교육과운송시스템의문제점등을파악하여개선시킬수있을것으로생각된다.. 코호트사업이성공하기위해서는무엇보다참여병원의적극적인협조가필요하다. 채혈후 Plasma와 PBMC 분리시간까지의시간을최소화하기위해서는참여병원에서채혈이결정된이후즉시네오딘의학연구소콜센터로연락을취하여곧바로운송이진행될수있도록해야한다.. 현재사용중인에이즈코호트검체운송가방의기능테스트를수행하였다. 테스트시는드라이오븐 ( ) 와냉동고 ( 영하 ) 를사용하여환경을조성하였으나실제운송에서는운송가방을별도박스에넣어서운송하고, 거리가먼참여병원의검체운송은버스, 차량등을이용하므로외부온도에노출되는시간이테스트조건과는다르다. 그러나현재사용하고있는운송가방은외부충격으로인한검체보호기능위주로제작이되어있으므로적정온도를유지한검체운송을위해서는별도의운송박스제작이필요할것으로생각된다. - -

40 . 결론. 에이즈코호트연구를위해우리나라실정에맞는혈액등생물자원수송에관한신속 하고안전한운송및관리시스템을보완 운영하였다.. 확립된시스템에따라검체를운송, 처리및보관하여질병관리본부생물자원은행과로 자원을이송하기까지시료를보관할수있는검체보관소 (Repository) 를보완 운영하였 다.. 위의확립된시스템에따라 개센터 개참여병원중 개병원에서 명의에이즈감 염인대상자로부터혈액을채취하여 Plasma, 바이알과 PBMC, 바이알의시료 를제작하였다.. 사업기간동안제작된혈장, PBMC 시료와명부는총 회에걸쳐장기보관후자원으 로활용될수있도록질병관리본부로안전하게운송하였다.. 국내외연구동향. Swiss HIV Cohort Study(SHCS) : SHCS는 개의센터로구성되어있으며, 하나의센터에는각각하나의클리닉, 실험실, 그리고 MoCHiV로구성되어있다. 혈장의경우등록단계와매번의방문시마다 m씩 개 vial 에분주하여 - 에보관하고있다. Viable PBMC는일년에한번씩, 세개의튜브에분주 ( 최소. cells/vial) 하여 - 에보관하고있다. 또한, 년설립된 Core Genetic project에의해동의서를취득한대상자로부터 DNA를추출하여중앙보관소에보관하고있다. 모든검체처리와보관은국내에이즈코호트와는달리각센터에서이루어지고있다.. EuroSIDA : EuroSIDA는유럽 개국가와아르헨티나에서 년부터시작된전향적이관찰연구로총 개클리닉에서 단계 (년) 단계(년) 의코호트가진행되었고, 년말총,의환자가등록되었다. 추적조사는 개월간격 (CD와 viral load 는평균 개월 ) 으로진행되고, EDTA 혈액 ( ml) 을채혈하여혈장을 m씩 개바이얼에분주하여 - 에보관하고있다. 이과정은각클리닉에서이루어지고혈장은코펜하겐에있는 co-ordination center로옮겨져서장기보관하게된다. - -

41 제 장연구성과. 연구성과. 에이즈코호트시스템을우리나라실정에맞도록운영하였다.. 에이즈혈액의안전하고신속한운송시스템을운영하였다.. 한검체에대하여 바이알의 Plasma와한바이알당 (ml) 세포가되도록 PBMC 시료를제작하였다.. 제작된시료에대해보관및관리가능한코호트검체보관소 (Repository) 를운영하였다.. 성과내용. 에이즈코호트연구를위해검체의채취, 운송, 시료제작, 보관등전반적인시스템을더욱개선보강하여운영하였다.. 운송, 검체처리등의과정에있어취급자의안전을최대한보장하고, 에이즈환자의혈액을안전하고신속하게운송하여처리할수있도록검체의운송시스템을구축운영하였다.. 안전하게운송된에이즈환자의혈액으로부터 Plasma과 PBMC 시료를안전하게제작하였으며, 제작된시료를적절한조건으로보관하고관리할수있는코호트검체보관소를운영하였다.. 활용계획. 기대효과 가. 국내실정에맞는에이즈코호트시스템을구축한다. 나. 에이즈코호트의전국지역확대및운영을위한기본지침을마련한다. 다. 에이즈코호트의보관시료를활용한기초연구에자원을제공한다.. 활용방안 가. PBMC 시료의활용 : 에이즈코호트를통해제작되어보관중인동결림프구는향후 EBV-불멸화세포주제작등을통해서 DNA, RNA의지속적인공급처가될수있어 AIDS 환자군에서다양한분자생물학적, 분자역학적연구를하기위한생물자원을제공해줄수있다고본다. 또한, 살아있는세포자체는향후 AIDS 환자군에대한 Flow cytometry 연구, 유전자치료법, 약물치료를위한 pharmacogenetic/ pharmacokinetic study 등에유용하게이용할수있으리라기대된다. - -

42 나. Plasma 시료의활용 : 에이즈코호트연구가동일대상자를상대로, 개월마다추구조사를진행하므로보관된 Plasma 시료를사용하여 HIV viral load 측정할수있다. 이는환자의 AIDS의진행상태, 치료과정경과에따른 HIV의변화등을연구하는데좋은자원이될것이다. 다. 제작된시료의보관방법및위치관리방법 : 제작된시료의보관방법및위치관리 방법은향후코호트시료의보관및관리에도지침이될것으로생각된다. 라. 코호트관리시스템적용 : 향후에이즈고위험군등관련코호트구축시본연구 를통하여개발된코호트관리시스템을적용한다면코호트구축및관리가보다용 이하게될것으로사료된다. - -

43 제 장참고문헌. Hur DY, Lee MH,Kim JW, Kim JH, Shin YK, Rho JK,Kwack KB, Lee WJ, Han BG() CD signalling improves the Epstein-Barr virus-induced immortalization of human B cell. Cell Prolif. (): -.. Richard B. Hayes, Craig O. Smith, Wen-Yi Huang, Yvonne Read and William C.Kopp() Whole Blood Cryopreservation in Epidemiological Studies.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. ():-. Beck J. C., Beiswanger C. M., John E. M., Satariano E., West D.() Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: a resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev.,: -. Oh HM, Oh JM, Choi SC, Kim SW, Han WC,, Kim TH, Park DS, Jun CD ()An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. ():-.. Pressman S., Rotter J. I.() Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique. Am. J. Hum. Genet., :. Louie L. G., King M. C.() A novel approach to establishing permanent lymphoblastoid cell lines: Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. Am. J. Hum. Genet., : -. Penno M. B., Pedrotti-Krueger M., Ray T.() Cryopreservation of whole blood and isolated lymphocytes for B-cell transformation. J. Tissue Culture Methods, : -. Tremblay S., Khandjian E. W.() Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin. Biochem., : -. Doyle A., Griffiths J. B., Newell D. G. Cell and Tissue Culture : Laboratory Technique, John Wiley and Sons New York.. F,J, M. VAN Kupperveld, K. E, Johansson, J. M. D Galama et al. : Appl Environ Microbiol. -. O. Dussurget, D. Roulland-Dussoix. Appl Environ Microbiol, -. Cynthia A. Kleeberger, Robert H. Lyles, Joseph B. Margolick, Charles R. Rinaldo, John P. Phair and Janis V. Giogi, Viability and Recovery of Peripheral Blood Mononuclear Cells Cryopreserved for up to Years in a Multicenter Study ; Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Jan., p. -.. Susan A. Fiscus, Hrishikesh Chakraborty, Robin Shepard, and Melissa Goodman. Comparison of Blood Collected in Acid-Citrate-Dextrose and EDTA for Use in Human Immunodeficiency Virus Peripheral Blood Mononuclear Cell Cultures. ; J. - -

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