최 종 연구보고서 구

Transcription

1 최 종 연구보고서 구

2 제출문 해양수산부장관귀하 본보고서를 고분자키토산나노분말과수용성유도체의개발 식품과향 장에의응용및성인병예방효과에관한연구 과제의최종보고서로제출합니 다 년 월 일 주관연구기관명 세종대학교 주관연구책임자 곽 해 수 세부연구책임자 서 영 수 협동연구기관명 강릉원주대학교 협동연구책임자 김 상 무 연 구 원 안 성 일 연 구 원 서 미 화 연 구 원 신 희 찬 연 구 원 홍 은 경 연 구 원 김 유 리 연 구 원 김 은 진 연 구 원 우윈테한 연 구 원 김 남 정 연 구 원 최 미 정

3 요약문 제목 고분자키토산나노분말과수용성유도체의개발 식품과향장에의응용및성인병예 방효과에관한연구 연구개발의목적및필요성수산부산물 홍게껍질등 로부터추출한키토산의수용성고분자키토산나노분말을개발하여이를응용한천연식품보존제 기능성식품과향장품을개발하는데본과제의목적이있다 수산물의가공과정에서생성되는부산물인갑각류의껍질및오징어연골의이용성을증대시켜환경오염을최소화하고 부산물에서키토산을나노화하므로써체내흡수율을극대화하여다양한기능성이진보된키토산을개발하여어민의수익창출과국민건강에기여할수있기때문에본과제의수행필요성이절실하다 연구개발내용및범위본과제는우선키토산나노분말을제조하여다양한이화학적특성을규명하고 수용성고분자를선정하여화학적관능기의도입 키토산분말표면에수용성고분자를도입하여콜로이드의안정성을연구하고물성을측정한다 또한키토산나노분말의생리활성을측정하기위하여항균효과와동물실험을통한혈중콜레스테롤저하효과를검증한다 또한 차년도에는복합기능성수용성키토산나노분말을제조하여생리활성물질과키토산의자기조합현상을관찰하고 자기조합콜로이드의안정성과물성을연구한다 그리고응용분야에적합한키토산나노분말의기능화와생리활성연구로항산화효과 항노화활성그리고미백효과를탐색하며 복합기능수용성키토산분말의생리활성을규명하기위하여항균효과와동물실험을통한혈당조절작용의효과를검증한다 이와같이수행한다양한연구결과를기초로기능성식품소재화를입증하는식품보존제와기능성음료를개발하고 또한기능성향장소재화의입증으로기능성향장제품을개발한다 연구개발결과본연구에서는나노키토산의이화학적특성및수용성화가능성을평가하고 나노키토산의콜레스테롤저하 항균 항산화 항당뇨효과를규명하였으며 고기능성나노키토산의식품및화장품산업에적용가능성을평가하였다 일반키토산분말과나노키토산분말을 으로관찰해본결과키토산분말은평균직경이 정도였고 나노키토산분말은평균직경이약 과 정도로두키토산분말간에뚜렷한크기차이를보였다 나노키토산분말의일반성분을분석한결과수분함 - i -

4 량은키토산분말보다유의적으로증가하였으나회분과질소함량은유의적으로감소하였다 분자량은나노크기로분쇄함에따라 에서 으로분자량이 로감소하였으나 탈아세틸화도는거의유사한경향을보여주었다 나노키토산의수용성화평가결과고분자키토산입자는각 마다일정농도까지최대로팽윤되었다가그이상으로팽윤되면입자크기가작아져녹았다 는키토산입자를팽윤시켜분산을도울뿐아니라 콜로이드에기능성을더할수있는적합한물질로판명되었다 여기에계면활성물질인 를적용하여키토산콜로이드의분산력이조금상승되었다 가코팅된키토산콜로이드는 가코팅되기이전의콜로이드보다중화시에더안정적인변화를보였다 나노키토산분말의항균효과결과 미생물의종류에따라다르고 나노키토산분말의항균효과가키토산분말에비해현저히높다는것을알수있었다 항산화활성중 와 은나노화에대한차이가없었으나 는나노키토산이일반고분자키토산보다활성이강하였다 동물실험결과나노키토산분말에의해서혈중콜레스테롤 콜레스테롤그리고중성지질의수치가일반키토산분말과비교하여유의적으로감소하였고 콜레스테롤의수치는유의적으로증가되었다 그리고간중의총콜레스테롤과중성지질의수치도유의적으로감소시키는것으로보아나노키토산분말의콜레스테롤저하효과가일반키토산분말보다더우수한것으로사료된다 항당뇨동물실험결과나노키토산분말에의해서포도당농도 혈중콜레스테롤함량그리고중성지질의함량은일반키토산분말과비교하여유의적으로감소하는경향을보였고 인슐린농도는유의적으로증가하였다 췌장조직의형태변화를분석한결과나노키토산분말섭취군에서정상의췌장소도세포와유사한형태를나타낸것을알수있었다 따라서나노키토산분말의항당뇨효과가키토산분말에비해현저히높음을알수있었다 산업화연구의일환으로나노키토산첨가요구르트의연구에서 콜레스테롤을 제거한요구르트에나노키토산분말을첨가한후 일동안요구르트의 는 의범위를나타내었고 유산균수는 의범위를나타내어나노키토산의첨가는요구르트의유통기한을연장시킬있음을알수있었다 점도의변화에서나노키토산분말의첨가량에비례하여점도가감소함을알수있었다 색의변화에서 값은나노키토산분말의첨가량에따라낮은값을보였고 값은대조군과유의적인차이를보이지않았으며 값은나노키토산의첨가량이증가함에따라증가하는경향을나타냈다 관능평가에서 는대조군 나노키토산분말첨가군에서유의적차이가나타나지않았고 에서실험군의첨가비율이높을수록유의적차이가나타났다 수용성나노키토산을첨가한우유의 는첨가량이증가함에따라일반키토산보다높았으며 저장 일동안신선한우유품질을유지하였고 비타민 의함럄은첨가비율이높을수록높았으며 저장기간에따라감소함을알수있었다 색의변화에서수용성나노키 - ii -

5 토산을첨가하였을때저장 일동안 값은유의적차이가없었으며 저장기간중수용성나노키토산을첨가한우유의 값은유의적으로증가하였다 관능평가결과 에서대조군과수용성나노키토산첨가군간에유의적차이가없음을알수있었다 나노키토산을이용하여기초화장품 종 밀크로션 스킨로션 크림 을제조한결과 는약산성 중성의범위로 에의한피부자극은없는것으로확인되었으며 점도는나노키노산이일반고분자키토산보다더높아지는것으로확인되었다 나노키토산분말이첨가된화장품의종합적인기호도는여성에비하여남성이높았으며 스킨로션보다는밀크로션과크림에서높은점수를받았다 나노기술은물질의특성을나노스케일 억분의 에서규명하고제어하는기술로서나노구조가되면기존물질의특성이변형되거나새로운기능을창출할가능성을갖는다 나노기술은전자 통신 의약 에너지등에응용및융합되어산업의전면구도를바꿔놓을수있기때문에미국 일본 유럽연합등주요선진국들은나노기술을 세기국가성장동력의핵심기술로주목하고있다 또한나노기술은식품및의약품을포함한바이오길술과결합하여생명과학분야의혁신적인발전을이룰수있다 본연구에서 나노키토산은기존의키토산에비해콜레스테롤저하 항균 항산화 항당뇨효과가극대화되어의약품화되어질수있을것이며 이러한고기능성나노키토산을이용한혈중콜레스테롤감소와항당뇨효과를가진건강기능성요구르트 비타민 강화우유 그리고고기능성화장품의개발이가능할것으로기대된다 따라서고기능성물질인나노키토산을식품과화장품에접목시키면그가치가향상될것이며 건강기능성을한단계향상시킨최첨단제품이라고말할수있다 연구개발결과의활용계획본과제의수행결과가기대한대로나와서수산물의폐기물인키토산 오징어연골등의자원을이용하여 키토산제조업체와건강기능성식품및화장품업체 참여업체와협력및기술이전을통하여다양한기능성제품을개발및생산하고이를통한기술료도확보할계획이다 - iii -

6 Chitosan, the main derivatives of chitin, is a linear aminopolysaccharide, composed primarily of repeating units of β-(1 4)2-amino-2-deoxy-D-glucose (D-glucosamine) and is a biodegradable cationic polymer, which has been known as a potential biomaterial for a food ingredient, artificial skin and drug delivery system. As a food and cosmetic ingredient, applications of chitosan are currently somewhat restricted because it is insoluble in water. Nanosizing is an emerging technique used for enhancing physical and biological properties including solubility and stability. Therefore, in the present study, we applied the nano-technique to improve the biological and physical properties of the chitosan. The specific objectives of the present study were to (1) investigate physicochemical properties of nanopowdered chitosan, (2) measure the possibility of solubilization of nanochitosan particles, (3) evaluate the effect of nanopowdered chitosan on cholesterol lowering, antimicrobial, antioxidant and antidiabetic activities, and (4) determine the possibility of adding chitosan into dairy and cosmetic products. Commercially powdered chitosan was obtained from Samsung Chitopia (Seoul, Korea) and was ground to nanopowdered chitosan by the dry milling method in Apexel Co. (Pohang, Korea) at room temperature. The average particle sizes of commercially powdered chitosan and nanopowdered chitosan measured were about 150 μm and about 560 nm in diameter, respectively. The moisture content of nanopowdered chitosan was significantly higher than that of commercially powdered chitosan, however, ash and nitrogen contents were slightly lower in nanopowdered chitosan. Furthermore, the molecular weight of nanopowdered chitosan decreased to one fifth of the powdered chitosan, which was caused by nano-treatment. On the other hand, the degree of deacetylization was not significantly affected by nano-treatment. Through studies on the solubilization of nanochitosan particles, it was revealed that surface of commercially powdered chitosan can be treated with scell amount of acid, especially with ascorbic acid, from which it renders hydrophilic to be dispersed in water. Ascorbic acid is commonly known as vitamin C, is water-soluble material. It is an essential nutrient for human because it has a diversity of biological and medical functions. A surfactant added is successively a self-assembled onto it so as to be well-dispersed colloidal solution. It made strong chitosan colloid by floating. The colloidal solution was stable even after the solution was neutralized. Colloid formation and self-assembly process were monitored using dynamic light scattrering. - iv -

7 And also colloidal chitosan nanopowder in water was viewed using Cryo-EM. The antimicrobial activities of nanopowdered chitosan on Bacillussubtilis,Bacillus cereus, Candida albicans, Escherichia coli O157:H7, Lactobacillusbulgaricus,Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus mutans, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus were investigated. For all the microorganisams studied, nanopowdered chitosan exhibited the higher antimicrobial activities than commercially powdered chitosan. It was found that nanopowdered chitosan had the antioxidant potential in various antioxidant tests: DPPH, hydroxyl radical scavenging, and hydrogen peroxide radical scavenging activities. In addition, nanopowdered chitosan moderately inhibited tyrosinase, collagenase, elastase, β-glucuronidase and angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activities. Effects of nanopowdered chitosan on serum and liver cholesterol lowering in rats were determined. As compared to commercially powdered chitosan, the nanopowdered chitosan diet remarkably decreased the total cholesterol, LDL-cholesterol and triacylglycerol levels and increased the HDL-cholesterol level. Based on the studies on effects of nanopowdered chitosan on antidiabetic activity (glucose level, total cholesterol, triglyceride, insulin and pancreatic islets morphology) in db/db mice, it was observed that feeding the nanopowdered chitosan to the mice can reduce the glucose level, total cholesterol level and triglyceride concentration, and can increase the insulin level as compared to the commercially powdered chitosan, indicating the excellent antidiabetic effects of nanopowdered chitosan on the mice. Based on the data (physicochemical and functional properties of nanopowdered chitosan), for the purpose of industrialization of the nanopowdered chitosan, the possibility of producing dairy and cosmetic products containing nanopowdered chitosan was investigated. Through the studies on the development of a nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt, it was revealed that the ph values and mean lactic acid bacteria counts of nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt ranged from 4.19 to 4.41 and from 4.75 x 10 8 to 9.70x10 8 CFU/mL, respectively, when stored at 4 C for 20 days, thereby indicating a possibility of prolonging the shelf-life of yogurt. The sensory test revealed that the astringency scores significantly increased at 0-day storage when the highest concentration (0.7%, w/v) of nanopowdered chitosan was added into cholesterol-reduced yogurt. A possibility of adding the ascorbic acid-soluble nanochitosan into milk for improving the functionality of milk was evaluated. The - v -

8 storage test showed that ph and titratable acidity of the ascorbic acid-soluble nanochitosan added milk wcid-not changed when stored at 4 C for 15 days. The addition of the nanochitosan solution into the milk samples led to an increase in the amounts of L-ascorbic acid, thereby demonstrating an enhancement in health benefits. Color and sensory test revealed that the concentrations (1~3%, v/v) of the nanochitosan solution can be used to produce a nanopowdered chitosan-added milk without the significantly adverse effects on the physicochemical and sensory properties. Three prototypes of nanopowdered chitosan cosmetics (milk lotion, cream and skin lotion) were manufactured. The ph of milk lotion and cream were neutral, while that of skin lotion was weak acid. Total preference of three chitosan cosmetics was better for men than women. In conclusion, the cholesterol lowering, antioxidant, antimicrobial and antidiabetic activities of nanopowdered chitosan were significantly higher than those of commercially powdered chitosan. Moreover, the production of dairy products (yogurt and milk) and cosmetics (milk lotion, cream and skin lotion) which incorporate nanopowdered chitosan can broaden the utilization of chitosan. The final dairy products can be regarded as possible health-promoting nutraceutical foods. - vi -

9 Chapter 1. Introduction 1 Section 1. Necessity and objective 1 1. Necessity 1 2. Objective 1 Chapter 2. Status of domestic and overseas technical development and information of science and technology 2 1. Status of domestic technical development and information of science and echnology 2 2. Status of overseas technical development and information of science and technology 2 Chapter 3. Results 3 Section 1. Physicochemical properties of nanopowdered chitosan 3 1. Physicochemical properties of nanopowdered chitosan 3 a. Particle size 3 b. Chemical composition 3 c. Absorption capacity of water, oil and dye 5 d. Solubility 6 e. Weight average molecular weight and deacetylation degree 7 f. Adsorption capacity of heavy metal 9 g. Differential scanning calorimetry 10 Section 2. Functionality of nanopowdered chitosan Antimicrobial activity 12 a. Theoretical and experimental approach Physiological activity 14 a. DPPH radical scavenging activity 14 b. Hydroxyl radical scavenging activity 16 c. Hydrogen peroxide radical scavenging activity 17 d. Tyrosinase inhibitory activity 18 e. Elastase inhibitory activity 19 f. Collagenase inhibitory activity 21 - vii -

10 g. α-glucosidase inhibitory activity 22 f. β-glucuronidase inhibitory activity 24 g. ACE (Angiotensin I-Converting inhibitory Enzyme) inhibitory activity 24 h. Antibacterial activity 26 i. Antiacne activity 26 j. Inhibitory effect on the LPS-induced production of NO 27 Section 3. Colloid formation of nanopowdered chitosan Solubilization of nanopowdered chitosan with organic acid 28 a. Solubility of nanopowdered chitosna with organic acid 28 b. Swelling of nanopowdered chitosan at acidic conditions 28 c. Effects of PGMS on nanopowdered chitosan swollen by organic acid 30 d. Amounts of chitosan dispersed in supernatant 33 Section 4. Industrialization of nanopowdered chitosan Selection of materials for solubilization of nanopowdered chitosan 35 a. Sodium ascorbate (vitamin C sodium salt) 36 b. Inositol (vitamin B) 36 c. Retinol (vitamin A) and retinoic acid (vitamin A acid) 37 d. Ascorbic acid (Vitamin C) Colloid formation of nanopowdered chitosan 39 a. Solubilization of nanopowdered chitosan in ascorbic acid solution 39 b. Amounts of chitosan in colloid of nanopowdered chitosan 41 c. Effects of ascorbic acid concentration on particle size of chitosan colloid 42 d. ph of ascorbic acid and ascorbic acid-chitosan colloid 44 e. Changes in ph during neutralization of chitosan colloid 45 Section 5. Cholesterol lowering effect of nanopowdered chitosan Blood cholesterol lowering effect 47 a. Blood total cholesterol 47 b. Blood HDL-cholestero 48 c. Blood LDL-cholesterol Triacylglycerol lowering effect 49 a. Blood triacylglycerol level Liver lipid total cholesterol and triacylglycerol lowering effect 50 a. Liver lipid total cholesterol and triacylglycerol level 50 - viii -

11 Section 6 Antidiabetic activity of nanopowdered chitosan Blood glucose level 51 a. Determination of blood glucose level Blood insulin level 52 a. Determination of blood insulin level Morphology of the pancreas 52 a. Comparison of morphology of the pancreas 52 Section 7 Industrialization of nanopowdered chitosan Capsulation of nanopowdered chitosan colloid with PGMS 54 a. Evaluation of chitosan amounts in supernatant by addition of PGMS 54 b. Changes in particle size of chitosan after coating with PGMS 55 c. ph resistance Development of ascorbic acid-soluble nanopowdered chitosan-added mil k 58 a. Development of functional milk 58 b. Titratable acidity and ph 59 c. Color 61 d. Vitamin C 62 e. Sensory analysis Development of nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt 66 a. Development of functional yogurt 66 b. Titratable acidity and ph 66 c. Viscosity 68 d. Color 69 e. Lactic acid bacteria 72 f. Sensory analysis Development of nanopowdered chitosan-added cosmetics 76 a. Milk lotion 76 b. Skin lotion 77 c. Cream Physical and sensory properties of nanopowdered chitosan-added cosmetics 79 a. ph 79 b. Viscosity 80 c. Sensory analysis 80 Chapter 4. Achievement and contribution 82 - ix -

12 Section 1. Achievement Annual achievement 82 a. The first year 82 b. The second year 82 Section 2. Contribution of technical development in relative areas 82 Chapter 5. Plan for application of research results 84 Section 1. Plan for application of research results Application plan Expected effects 84 a. Technical aspects 84 b. Economic and industrial aspects 84 c. Social and cultural aspects 84 Chapter 6. References 85 - x -

13 목 차 제 장연구개발과제의개요 1 제 절연구개발과제의필요성및목적 1 연구개발의필요성 1 연구개발의목적 1 제 장국내외기술개발현황및과학기술정보 2 국내기술개발현황및과학기술정보 2 국외기술개발현황및과학기술정보 2 제 장연구개발수행내용및결과 3 제 절나노키토산분말의이화학적특성규명 3 나노키토산분말의이화학적특성및물성측정결과 3 가 입자크기측정e 3 나 일반성분분석 5 c. 나노키토산분말의수분 지방 색소흡착력 6 라 7 e. 9 f. 중금속이온흡착능 10 g. 시차주사열량 분석 12 제 절나노키토산분말의기능성검증 12 나노키토산의항균효과 12 가 이론적 실험적접근방법 12 의생리활성측정결과 14 가 14 나 16 다 17 라 18 마 19 바 21 사 α 22 아 β 24 - xi -

14 자. ACE (Angiotensin I-Converting inhibitory Enzyme) inhibitory activity 24 차. Antibacterial activity 26 카 항여드름균및항염증균저해활성 26 타 생성억제및세포독성실험 27 제 절 고분자키토산나노분말의콜로이드화 28 유기산을이용한나노키토산의수용성화 28 가 유기산에서키토산의용해도 28 나 산성조건에서의팽윤작용 28 다 유기산에의해팽윤된키토산에 도입과그영향 30 라 상등액에분산된키토산함량검사 33 제 절나노키토산의산업화를위한연구 35 나노키토산수용성화를위한물질선정 35 가 36 나 36 다 과 37 라 ) 39 고분자키토산나노분말의콜로이드화 39 가 용액에서고분자키토산나노분말의용해 39 나 나노키토산콜로이드에존재하는키토산양분석 41 다 농도에따른키토산콜로이드의입자크기분석 42 라 와 키토산콜로이드의 측정 44 마 키토산콜로이드중화시 변화 45 제 절동물실험을통한나노키토산분말의혈중콜레스테롤저하효과검증 47 혈중콜레스테롤저하효과 47 가 혈중총콜레스테롤함량l 47 나 혈중 콜레스테롤의정량 48 다 혈중 콜레스테롤의정량 48 혈중중성지질저하효과 49 가 혈중중성지질함량 49 간조직중총콜레스테롤과총지질함량저하효과 50 가 간조직중총콜레스테롤과총지질함량 50 제 절동물실험을통한나노키토산분말의항당뇨효과검증 51 혈중포도당농도저하효과 51 - xii -

15 가 혈중포도당측정 51 혈중인슐린농도 52 가 혈중인슐린농도측정 52 췌장의형태학적관찰 52 가 췌장의형태학적비교 52 제 절나노키토산산업화를위한연구 54 를사용한키토산콜로이드의캡슐화 54 가 의첨가에의한상등액내키토산의양검증 54 나 키토산에 를코팅후입자크기변화관찰 55 다 저항성연구 56 수용성나노키토산을첨가한우유의제조 58 가 기능성우유의제조 58 나 산도및 변화 59 다 색도변화 61 라 비타민 함량측정 62 마 관능검사 64 나노키토산분말을첨가한요구르트의제조 66 가 기능성요구르트제조 66 나 산도및 측정 66 다 점도측정 68 라 색도측정 69 마 유산균의변화측정 72 바 관능검사 72 을첨가한화장품제조 76 가 밀크로션 76 나 스킨로션 77 다 크림 78 5 을첨가한화장품의물성측정 79 가. ph 79 나 점도측정 80 다 관능평가 80 제 장연구개발목표달성도및관련분야에의기여도 82 제 절연구개발목표달성도 82 연차별목표달성도 82 - xiii -

16 가 차년도 82 나 차년도 82 제 절관련분야의기술발전에의기여도 82 제 장연구개발결과의활용계획 84 제 절연구개발결과의활용계획 84 활용계획 84 기대효과 84 가 기술적측면 84 나 경제 산업적측면 84 다 사회 문화적측면 84 제 장참고문헌 85 - xiv -

17 제 절연구개발과제의필요성및목적 연구개발의필요성 가 수산물의가공과정에서생성되는부산물인갑각류의껍질및오징어연골은수산물의가공수요가높아져갈수록더욱많이생성되어환경문제를불러일으킨다 나 또한 이러한가공부산물을이용한산업이발전하지않아대부분이폐기되고있는실정이다 다 따라서이러한갑각류의껍질및오징어연골을이용하여 을생산할경우환경문제의해결과더불어원가절감의효과를볼수있다 라 은탈콜레스테롤 항암 항고혈압 장내의유효세균증식 혈당조절 간기능개선및체내중금속및오염물질배출등의효과가있다 마 하지만 고분자 은흡수율이매우저조하고 특별한조건이외에서는용해도거의이루어지지않아산업에이용되기에많은제약이따른다 바 따라서 고분자 을 화하여저분자 을제조 흡수율과용해도를높여여러가지산업에응용이가능하며 사 생산원가절감과더불어국민건강증진에도기여할것이다 연구개발의목적 가 식품공장이나 가정에서버려지는수산가공부산물을이용하여 을생산할수있는기술을확립나 폐기되는수산가공부산물의이용으로인한원가절감및새로운산업창출 국내산업의해외진출기여다 노화억제 미백기능 면역증진등의기능성향장소재 용제품개발및생산기술확립라 의 화기술을접합하여식품 화장품및의약품에사용할수있는나노소재를개발함으로서국민건강증진에이바지 연구개발의장점 가 국민적으로기능성이널리알려져있는키토산을사용함으로써 기본적인홍보와산업적활용에문제가없다 나 최근각광받고있는신기술인나노테크놀로지를접목하여인체내흡수를더욱용이하게할수있다 다 가공부산물을활용하여이에관련한환경문제를해소하고원가절감의기회와더불어고부가가치를창출할수있다 - 1 -

18 국내기술개발현황및과학기술정보 가 현재국내의연구동향은대부분이고분자 위주이며 화기술을도입한 에대한연구는거의이루어지지않고있다 나 에대한기술로는식품첨가제 의류섬유제조 양어및농축산사료 의약품개발 새로운기능성 등의연구가이루어지고있다 다 화기술을도입한 에대한기술로는의료용재료로써의이용하는연구 가이루어지고있다 라 하지만 이첨가된화장품에대한연구는아직까지매우미비한실정이다 국외기술개발현황및과학기술정보 가 국외에서도고분자 에관한연구가주류를이루고있으며최근의연구에서 화기술이도입된 에대한연구 가발표된바있다 나 에대한국외의최신연구로는 의흡수율향상 의료용재료로써의이용 및효소를이용한고정화 등이있다 다 국내외의 에대한기술연구는대부분이의료용재료로써의이용에관한연구들이이루어지고있으며 그에대한기능성들이밝혀져있다 라 의타분야응용기술이요구되며 다양한연구가활발하게이루어져야할것으로보인다 - 2 -

19 제 1 절나노키토산분말의이화학적특성규명 1. 나노키토산분말의이화학적특성및물성측정결과 가. 입자크기측정 1) 이론적 실험적접근방법가 ) 키토산분말과나노키토산분말의입자를관찰하기위하여 SEM(Scanning Electron Microscope, HITACHI S-4700, JAPAN) 으로측정하였고, 나노키토산분말의입자의크기측정은 Particle analyzer(beckman coulter, Delsa Nano, CA, USA) 로측정하였다. A 2) 실험내용및결과가 ) 일반키토산분말과나노키토산분말의입자크기측정결과를 Fig. 1에나타내었다. B Powdered chitosan Nanopowdered chitosan Fig. 1 Scanning electron microscope image for powdered chitosan and nanopowdered chitosan. 나 ) SEM으로분석한결과일반키토산분말은입자가불균일한크기로흩어져있는반면, 키토산분말을분쇄하여나노화시킨나노키토산분말은비교적균일한크기로잘분산되어있었다. 일반키토산분말은직경이평균 150μm였고, 나노키토산분말은평균 600nm정도로나타나키토산분말의크기가마이크론크기에서나노크기로감소한것을알수있었다. Particle analyzer으로분석한나노키토산은약 560nm 크기로분포되어있는것을알수있었다 (Fig. 2) 나. 일반성분분석 - 3 -

20 Fig. 2 Particle size analysis of nanopowdered chitosan. 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) AOAC 방법 (1) 에따라수분함량은 105 상압가열건조법으로, 회분함량은 55 0 회화법으로측정하였으며질소함량은 micro-kjeldhal 방법으로정량하였다. 나 ) 점도는 Ubbeblohde 형점도계사용하여측정하였고, 분자량은 Saku- raada-houink 식에의해계산하였다 (52). 다 ) 탈아세틸화도는 Toluidine blue 지시약을이용한콜로이드적정법 (25) 을사용하 여측정. 2) 실험내용및결과 가 ) 나노키토산분말과대조군인일반키토산분말의일반성분함량은 Table 1 와 같다. 나 ) 나노키토산분말은수분이 8.82±0.05%, 일반키토산분말은 6.44±0.09% 를나타내어나노키토산분말의수분함량이일반키토산분말보다높았으며, 회분함량은나노키토산분말이 0.25±0.02%, 키토산분말은 0.29±0.02% 으로시료간의회분함량은큰차이가없었다. 질소함량은나노키토산분말이 6.66±0.01%, 일반키토산분말이 6.75±0.08% 로이론적인질소함량인 6.8% 와 - 4 -

21 유사한경향을보였다. 나노키토산분말과키토산분말의분자량을측정한결과, 500~600nm로분쇄된나노키토산분말의분자량은 16,500±12.70이고, 키토산분말의분자량은 90,900±33.00이었다. 그러므로나노크기로분쇄함에따라분자량은 1/5로감소됨을알수있었다. 다 ) 나노키토산분말과키토산분말의탈아세틸화도 (DDA) 를콜로이드적정법으로측정한결과나노키토산분말은 92.71±0.28% 였고, 키토산분말은 93.00±0.17% 으로측정되어거의유사한경향을보여유의적 (P<0.05) 인차이가없었다. Table 1. Composition of nanopowdered chitosan and powdered chitosan Composition Powdered chitosan 1) Nanopowdered chitosan 2) Moisture(%) 6.44±0.09 b 8.82±0.05 a4) Ash(%) 0.29±0.02 a 0.25±0.02 b Nitrogen(%) 6.75±0.08 a 6.66±0.01 b Molecular weight 90,900±33.23 a 16,500±12.70 b DDA 3) (%) 93.00±0.17 a 92.71±0.28 a 1) Commercial powdered chitosan with size 150μm 2) 500~600nm 3) Degree of deacetylation 4) Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test 다. 나노키토산분말의수분, 지방, 색소흡착력 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 시료 0.5g을원심분리관에넣고전체무게를잰후수분흡수량의경우증류수 30ml를, 지방흡수량의경우에는대두유 20ml가하고실온에서 1시간동안 15분간격으로교반한뒤에 1,600 g에서 25분간원심분리한후, 상등액을제거하고무게를측정하여건조시료 100g에대한중량 (g) 으로나타내었다 (33). 나 ) 색소흡착력의경우시료 0.1g에식용색소인적색40호 (FD&C Red No.40) 를일정농도 (5~20mg dye/l H 2 O) 가되도록증류수에녹인용액 10ml를가하여 10초간교반하였다. 1시간동안 20분간격으로 5초씩교반하고 1,600g에서 5 분간원심분리하여상등액을 505nm에서측정하여검량선과비교한후농도를계산하였다 (33). 2) 실험내용및결과 가 ) 나노키토산분말과대조군인일반키토산분말의수분흡착력실험결과는 Table - 5 -

22 2와같다. 나노키토산분말이 565.4±26.4g/100g로일반키토산분말보다많은양을흡착하였다. 지방흡착력실험결과는나노키토산분말이 776.3±35.9g/100g로일반키토산분말보다는많은양의지방을흡착한것을보였다. Knorr (26) 는이러한수분흡착력과지방흡착력의차이는시료간의염형성그룹의차이에의해나타난다고하였다. 이결과는흡수하는표면적이넓어졌기때문에차이가있다고사료된다. 나 ) 다음으로색소흡착력을측정하기위해적색색소 (Red No. 40) 농도를 5~20 mg dye/l로하여흡광도를측정하여검량선을작성하였는데, 검량선의회귀선식은 Y=0.44x+0.032(r 2 =0.998) 이었으며, 이를이용한색소흡착력을비교한결과나노키토산분말은시료 1g 당약 2.9±0.1mg의색소를흡착하였고, 일반키토산분말은약 9.6±0.4mg으로많은양의색소를흡착하였다. 이것은나노사이즈로변하면서나노키토산분말과일반키토산분말의결정화도에차이가생긴것으로, 적색색소가 SO - 3 기를가지고있어서나노키토산에 NH 2 와결합하기때문이라고생각되어진다. 그리고 Knorr (26) 는적색색소가키토산에흡착하며, 흡착된색소는 ph 7이상에서색소흡착력은감소하였으며, ph 2~6 범위에서이탈되지않았다고보고하였다. 다 ) 이와같이나노키토산은키토산에비해흡착력이높기때문에, 효소의정제나 불필요한물질을제거하기위한흡착제로이용이가능할것이라고사료된다. 라 이론적 실험적접근방법가 의방법에의하여측정하였다 즉 의 수용액에 의 을녹인뒤 로 를각각보정하여 로 에서 - 6 -

23 흡광도를측정하여용해도를산출하였다 실험내용및결과 가 용해도측정결과는 과 에나타내었다 나 은산성에서녹는성질이있기때문에 가 이하일경우는거의모두다용해되었으나 가 이넘어가면서용해도가급격하게떨어졌다 또한 α 의경우고분자보다나노화시킨것이 이상에서용해도가약 가량더상승하였는데 이것은나노화시킨 이용매와접촉하는표면적이넓어용해도가상승한것으로보인다 α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) α-chitosan β-nanochitosan β-chitosan T % 40 T% ph ph α β 마 이론적 실험적접근방법가 평균분자량의측정은 의방법 을변형하여의하여측정하였으며 탈아세틸화도는 의방법 에의하여측정하였다 실험내용및결과가 평균분자량및탈아세틸화도는 및 에나타내었다 나 고분자 의분자량은 α 이 β 이 이었고 은각각 과 였다 탈아세틸화도는 α 이 β 이 였으며 은각각 였다 다 이일반고분자 에비하여분자량이현격하게감소하였고 탈아세틸화도는 α 보다 β 이더높았으나분자량에의한탈아세틸화도의차이는없었다 - 7 -

24 α α α β β - 8 -

25 β β 바 중금속이온흡착능 이론적 실험적접근방법가 과 의완충용액으로희석하여제조한금속이온표준용액에키토산시료 을 의 에넣고희석한중금속표준용액 를가하여 상온에서 으로균일하게교반 일정시간간격으로금속용액을채취및희석하여원자흡광광도계를이용하여잔류금속함량을측정하여금속이온의흡착회수율을구하였다 실험내용및결과 가 의변화에따른중금속이온흡착실험의결과는 에나타내었다 나 과 는 에서키토산과착염또는흡착에의해 이상의제거율을나타냈으며 에서제거율이 이하로낮아졌다 이상에서는 가높아질수록제거율이높아졌다 는 에서흡착율이 의제거율을나타냈으나 가높아질수록제거율이높아지는결과를보였다 다 고분자 과 의흡착능은차이가없었다 - 9 -

26 사 시차주사열량 분석 이론적 실험적접근방법가 을취하여분당 로 까지열을가한후분당 로 까지식힌뒤분당 로 에서 까지열을가하여측정 실험내용및결과 가 시차주사열량분석결과를 에나타내었다 나 고분자 는 는

27 는 β 는 β 는 의 값을나타내었다 다 고분자 보다 이열에의한물성변화에강하였고 α 보다 β 이더높게측정되었다

28 β β 제 2 절나노키토산분말의기능성검증 1. 나노키토산의항균효과 가 ) 이론적, 실험적접근방법 1) 세균은 37 에서 48시간, 효모는 25 에서 48시간배양하였으며, 3회이상계대배양한것을사용하였다. colony수가 ml당 10 8 정도가되게희석하였고균수희석액 1ml에 0.1% 나노키토산 0.1ml(pH5.5) 를혼합하여 37 에서진탕하였으며, 일정시간마다시료를취하여 poured plate method (12) 에의하여생존균수를측정하였다. 나 ) 실험내용및결과 1) 세균인 S. aureus, E. coli O157:H7, B. subtilis 및 L. bulgaricus와효모인 C. albicans와 S. cerevisiae에대한나노키토산분말과일반키토산분말의시간경과에따른항균효과를측정한결과이다. 2) Fig. 18은 S. aureus 에대한항균효과로 24시간까지측정한결과나노키토산분말은반응 4시간까지는급격한감소를보이다가이후부터완만한감소경향을보여나노키토산분말은생균수가약 10-3 만큼감소하였으며, 일반키토산분말은약 10-4 만큼감소하여그차이는약 9배나더높아짐을알수있었다. 3) Fig. 19는 E. coli O157:H7에대한항균효과로써 S. aureus와유사한경향를보였으나, 항균효과는대조군에비해나노키토산분말은약 10-1 감소하였고, 키토산분말은대조군과비슷하여, 나노키토산분말의항균효과가약 5배증가함을알수있었다

29 4) Fig. 20 은 B. subtilis 에대한항균효과로써시간이경과함에따라완만한감소 를보였다. 항균효과의차이는나노키토산분말의균수감소율이약 2 배이상커 졌다. 5) Fig. 21 는 L. bulgaricus 에대한항균효과로써시간이경과함에따라일정한간 격으로감소하여나노키토산의항균효과가약 3 배가더높아짐을알수있었다. 6) Fig. 22 는 C. albicans 에대한항균효과로써나노키토산분말과일반키토산분말 이반응 24 시간까지일정한간격으로감소하여, 나노키토산의항균효과가약 4 배 가더높아짐을알수있었다. 7) Fig. 23 는 S. cerevisiae 의항균효과로나노키토산분말이반응 8 시간까지는급 격한감소를보이다가이후부터완만한감소를보여균주중가장큰차이로 27 배나증가함을알수있었다. 8) 그러므로모든균주에서나노키토산분말의항균효과는최소 2 배에서최대 27 배 까지차이가나는것을알수있었다. 특히, S. aureus 와 S. cerevisiae 는높은 항균효과를나타내었다. Fig. 18 Antimicrobial activity of nanopowdered chitosan on Staphylococcus aureus treated at 37 for 24hrs. Fig. 19 Antimicrobial activity of nanopowdered chitosan on Escherichia coli O157:H7 treated at 37 for 24hrs

30 Fig. 20 Antimicrobial activity of nanopowdered chitosan on Bacillus subtilis treated at 37 for 24hrs. Fig. 21 Antimicrobial activity of nanopowdered chitosan on Lactobacillus bulgaricus treated at 37 for 24hrs. Fig. 22 Antimicrobial activity of nanopowdered chitosan on Candida albicans treated at 37 for 24hrs. Fig. 23 Antimicrobial activity off nanopowdered chitosan on Saccharomyces cerevisiae treated at 37 for 24hrs. 의생리활성측정결과 가 이론적 실험적접근방법가 의방법 을사용하였다 즉 로농도를조정한시료 를취하고 와혼합하여실온에서 분간방치한후 에서흡광도를측정하여 소거활성

31 시료처리구의흡광도 대조구의흡광도 으로나타내었다 연구내용및결과 가 측정결과를 과 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 화한 은각각 로측정되었다 다 α 보다 β 이 활성이더좋았으며 분자량에의한 차이는없었다 α α α β β α DPPH radical scavenging activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) α-tocopherol DPPH radical scavenging activity (%) β-chitosan(control) β-chitosan(80mesh) α-tocopherol Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β

32 나 이론적 실험적접근방법가 의방법 을이용하여측정하였다 즉 용액 용액 시료를각각 씩가하고 를가하여 에서 시간반응시킨후 용액 를가하고반응을정지시킨다음 용액 를가하여다시 의수욕상에서 분을가열시킨후급냉한것을 에서흡광도를측정하였다 연구내용및결과 가 측정결과를 와 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 화한 은각각 로측정되었다 다 에대한 α β 및 에대한 활성의차이는없었다 α α α β β α

33 Hydrogen peroxide scavenging activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) α-tocopherol Hydroxyl radical scavenging activity (%) β- Chitosan β-nanochitosan α-tocopherol Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β 다 이론적 실험적접근방법가 의방법 에따라측정하였다 즉 와각농도의 섞인용액 와 μ 를 에첨가한뒤 에서 분간반응시켰다 그후 μ 와 μ 를첨가하여 에서 분간반응시킨뒤 로 에서흡광도를측정하였다 연구내용및결과 가 측정결과를 과 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 은각각 로 측정되었다 다 α 보다 β 이활성이좋았고 이일반고분자 보다활성이높게측정되었다

34 α α α β β α Hydrogen peroxide scavenging activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) α-tocopherol Hydrogen peroxide scavenging activity (%) β-chitosan β-nanochitosan α-tocopherol Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β 라 이론적 실험적접근방법가 등의방법 을변형하여측정하였다 즉 에 를녹인기질액 및시료액 의혼합액을 에서 분간예비반응시킨뒤 을첨가하여 에서 분간반응시켰다 반응액중생성된 을 에서측정한뒤 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타낸다

35 연구내용및결과 가 측정결과를 과 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 은각각 로 측정되었다 다 α 이 β 보다활성이좋았으나 화에의한활성차이는 없었다 α α α β β Tyrosinase inhibitory activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) Ascorbic acid Tyrosinase inhibitory activity (%) β-chitosan β-nanochitosan Ascorbic acid Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β 마

36 이론적 실험적접근방법가 의방법 을변형하여측정하였다 즉 의시료액및 의기질액을혼합 에서 분간반응시킨후 의 를 첨가하여반응시켜반응액중생성된 를 에서측정한다 연구내용및결과 가 측정결과를 와 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 은각각 로측정되었다 다 에대한활성은 α 과 β 이거의측정되지않았으며 에대한차이또한없었다 α α α β β

37 Elastase inhibitory activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) Urosolic acid Elastase inhibitory activity (%) β-chitosan β-nanochitosan Urosolic acid Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β 바 이론적 실험적접근방법가 의방법 을변형하여측정하였다 즉 의 용액과 의 를 에첨가하고 에서 분간예비반응시킨뒤 의 를첨가하여 에서 분간반응시켰다 그후 를첨가하여반응을종결시키고 의 를첨가하여강하게교반시킨뒤 에서흡광도를측정하였다 연구내용및결과 가 측정결과를 와 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 은각각 로측정되었다 다 에대한활성은 α 과 β 이거의측정되지 않았으며 에대한차이또한없었다

38 α α α β β Collagenase inhibitory activity (%) α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) Collagenase inhibitory activity (%) β-chitosan β-nanochitosan Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α β 사 α 이론적 실험적접근방법가 의방법 을변형하여측정한다 즉 에다양한농도의 과같은 에녹인 및 α 를첨가한뒤 에서 분간반응하였다 를가하여반응을정지한다음 에서흡광도를측정하였으며 α 의저해활성 은 α 활성 의감소로정의하였다 연구내용및결과 가 α 측정결과를 과 에나타내었 다

39 나 의농도에서일반고분자 은 과 로 측정되었고 은각각 로 측정되었다 다 α 에대한활성은고분자 에비하여 이 월등하게높았으며 특히 β 의경우는대조군인 보다도 높아 화시켰을경우항당뇨활성이커짐을알수있다 α α α α β β

40 α-chitosan α-nanochitosan A ( nm) α-nanochitosan B ( nm) Acarbose β-chitosan β-nanochitosan Acarbose Inhibitory activity (%) Inhibitory activity (%) Concentration (mg/ml) Concentration (mg/ml) α α α β 아 β 이론적 실험적접근방법가 의방법 을변형하여측정하였다 즉 에 β β 를가하여 에서 분간반응하였으며 를가하여반응을종료시킨후 에서흡광도를측정하여 β 저해활성을측정하였다 연구내용및결과 가 β 측정결과를 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 과 α β 에서활성이나타나지않았으며 α 는 로측정되었다 다 β 에대한 의활성은매우미약한것으로확인 되었으며 화시켰을경우약간의활성을나타낸다 자 이론적 실험적접근방법가 의방법 을변형하여측정하였다 즉 시료 μ 에 μ 및기질로 μ 를가하여 에서 분간예비반응시킨다 여기에 효소액 μ 를첨가하여

41 에서 분간반응시킨후 μ 를가하여반응을정지시킨다 β α α α β β 여기에 를가하여 초간교반한다음원심분리하여 상등액 를취한다 이상등액을완전히건조시킨뒤 를가하여용해한다음 에서흡광도를측정하였다 연구내용및결과 가 측정결과를 에나타내었다 나 의농도에서일반고분자 은 과 로측정되었고 은각각 로측정되었다 다 에대한활성은일반고분자 보다 에서활성이높게측정되었으나 에서는오히려활성이낮게측정되었다 α β β

42 차 이론적 실험적접근방법가 의방법 을이용하여측정하였다 와 와 의저해활성을측정하였다 연구내용및결과 가 측정결과를 에나타내었다 나 α 은대부분의균에서항균활성을나타내었으나 와 균의저해활성은낮게측정되었고 화시켰을경우대부분의균에서항균활성이향상된것을확인할수있으나 균에대한저해활성의향상은확인되지않았다 다 β 또한대부분의균에서항균활성을나타내었으나 에 비하여 에대한항균활성은높았고 다른균에대하여는항균활성이조금떨어졌다 라 β 을 화시켰을경우대부분의균에서항균활성이낮아지는 결과를보였다 α β β 카 항여드름균및항염증균저해활성

43 이론적 실험적접근방법가 를사용하여측정하였다 의 를사용하였으며 의저해활성을측정하였다 연구내용및결과 가 항여드름균및항염증균의저해활성측정결과를 에나타내었다 나 항여드름균및항염증균에대한 의저해활성은 농도까지 측정되지않았다 α α β β 타 생성억제및세포독성실험 이론적 실험적접근방법가 각 을 에용해하여농도별로 에처리하고 시간후 를 에처리하고 동안배양하였다 연구내용및결과 가 생성억제및세포독성의결과를 과 에나타내었다 나 α 과 β 모두 의생성저해활성은높게나타났다 다 세포독성은일반고분자 보다 이낮게검출되었으며 특히 β 과같은경우는세포독성이아주약하게측정되었다

44 제 절 고분자키토산나노분말의콜로이드화 많은생리활성기능을갖고있는것으로알려진키토산은물에녹지않아상업적인응용에제한을받아왔다 더구나저분자량키토산에비하여생리활성이더욱뛰어나지만물에대한용해도가더욱낮은고분자량키토산을화장품 음료등에적용하기위해서는고분자량키토산을수용성콜로이드화하는기술의필요성이대두되고있다 유기산을이용한나노키토산의수용성화 가 유기산에서키토산의용해도 이론적 실험적접근방법가 물에잘녹는유기산을선정하여산성조건에서키토산의용해도를조사하였다 키토산이팽윤된상태에서효과적으로 를도입하기위하여나노키토산입자가각유기산용액에서용해되는점을확인하여팽윤되는산의농도를검토하였다 나 용액을 의농도로 제조한뒤이용액에나노키토산입자를 을첨가한다 분동안 으로교반한후 분동안 하였다 와 도각각 농도의용액으로같은방법으로실시하였다

45 실험내용및결과가 는다양한유기산에서농도에따라나노키토산입자를넣었을때의변화를관찰한것이다 각유기산마다일정농도가되기전까지는탁한상태였다가일정농도부터는키토산이녹아서투명해지는것을볼수있었다 이렇게관찰한결과를 에나타내었다 나 용액 의농도에서나노키토산입자를넣었을때는혼탁한상태로팽윤현상이일어났다고추정하였고 용액부터는용액이투명해지고가루가완전히용해되어용해된시점인 용액의바로전단계인 용액에서나노키토산입자의가장많은팽윤이일어났다고판단하였다 다 용액 의농도에나노키토산입자를넣었을때는입자가완전히녹지않아팽윤현상이일어났다고추정되고 농도부터용액이투명해져완전히녹아서전단계인 에서나노키토산입자의가장많은팽윤이일어난것으로추정되었다 라 용액은 에서팽윤현상이일어나고 에서는완전히녹았다

46 나 산성조건에서의팽윤작용 이론적 실험적접근방법 가 앞서눈으로관찰한용해도검사에서조사된나노키토산입자가팽윤하는농도 를확인하고산용액의농도가키토산의팽윤정도에미치는영향을알아보았다 용액 를제조한뒤나노키토산입자 을첨 가하여 분 으로교반한후 분 하였다 제조한용액을 분원심분리하여상층액에뜨는작은입자의나노키토산입자를 분리하고 를이용하여각농도의 에 분포된입자의크기를분석하였다 나 용액도 농도로제조하여같은방법으로실시하였다 키토 산입자는유기산에서일정농도까지팽창되는성질을가지고있다 나노키토 산입자가용액중에팽윤이가장많이된상태에서 를도입하여분산을 유도하기위하여팽윤현상을 를사용하여분석 하였다 실험내용및결과 가 은나노키토산입자를혼합한 와 용액의입자크기

47 와분포를측정하여팽윤현상을분석한것을나타내었다 용액에서의나노키토산입자는 범위의넓은입도분포를나타내었고 에서피크를나타내었으며 용액에서의나노키토산입자는 범위에서 의뚜렷한피크를나타내었다 이는 용액에서나노키토산입자의팽윤이일어났음을시사하는것이다 나 용액에서의나노키토산입자는 범위에서넓은입도분포를나타내었고 의피크를나타내었으며 용액에서의나노키토산입자는 범위에서 의피크를나타내었다 이를통해 용액에서나노키토산입자의팽윤이일어났다고판단하였다 다 따라서나노키토산입자의가장큰팽윤이일어났다고생각되는 용액과 용액에서 를효과적으로도입할수있을것으로생각된다 (a) (b) (c) (d)

48 다 유기산에의해팽윤된키토산에 도입과그영향 이론적 실험적접근방법가 양쪽성을갖는고분자물질인 를 유기산으로 를이용하여나노키토산입자를용액상에분산시킨다 농도의용액 를제조하여 용액을각농도별로혼합한뒤나노키토산입자 을첨가하여 분교반한후 분동안 한다 제조한용액을 분원심분리하여상층액에뜨는작은입자의나노키토산입자를분리한뒤 를이용하여입자의크기를분석한다 나 용액도 농도로제조하여같은방법으로실시하였다 실험내용및결과가 나노키토산입자가팽윤된상태에서 를도입한후입자크기를 로분석하여입자의평균직경을비교한것을 에나타냈다 앞서조사된나노키토산입자의팽윤농도인 용액에서 의농도를달리하여입자크기를조사했다 나 를도입하였을때입자크기는직경이 였고 일때는 일때는 로나왔다 농도가묽어질수록입자의크기는작아지는경향을보였고 에서입자의크기가크게나온것은 의농도에서 가마이셀을형성하기때문인것으로생각된다 다 또한 의팽윤농도인 용액에서 의농도를달리하여입자 크기를조사한결과 의농도가 일때 일때 일때 였다 라 용액과 용액에 를넣었을때입자사이 즈가유사하게나왔고 이를통해나노키토산입자들이용액에녹지않고분산 되어있다고판단하였다

49 라 상등액에분산된키토산함량검사 이론적 실험적접근방법가 원심분리후에도상등액에분산되어있는키토산의양을잔류량이라하겠다 이것을측정함으로써용액중에키토산이얼마나분산되었는지판단하였다 나 의 와각농도별 용액에 를첨가하여제조한뒤 각각의샘플에 의나노키토산입자를첨가하여 분동

50 안 하였다 이샘플들을 분원심분리하여가라앉은잔여 물의수분을완전히제거한후남아있는고형분의함량을측정하였다 실험내용및결과가 나노키토산입자가용액중에분산되어있는정도를알아보기위하여 용액과 에 를도입한용액에나노키토산입자를분산시켜원심분리하여잔류량을조사하여 에나타내었다 나 를택한것은앞서실험한입자크기결과에서농도가 일때 와 에서유사한입자크기가나와긍정적인결과를 보였기때문이다 다 농도가진해질수록나노키토산입자의잔류량은감소하는경향을보였다 즉 의농도가진해질수록용액중에분산되어있는나노키토산입자가많아지는것으로생각된다 또한 에 를넣은경우잔류량이더많아진것을볼수있었는데 이는 를넣음으로서나노키토산입자와응집현상이일어났기때문인것으로생각된다 를도입함으로써잔류량이더감소하는것이기대하는결과였지만 장기적인측면에서는 가나노키토산입자가가라앉는현상을줄일수있을것으로예측되어더긍정적인효과가기대되며 이것은앞으로연구가더필요한부분이라고생각된다

51 라 은 농도가진해질수록나노키토산입자의잔류량은감소하는경향을보였고 이를통해용액중에분산되어있는나노키토산입자가많아진것으로판단된다 또한 에 를넣었을때잔류량이더적어진것을볼수있었는데 이를통해 를넣음으로써 용액상에서나노키토산입자가더효과적으로분산되었다고판단된다 제 절나노키토산의산업화를위한연구 나노키토산수용성화를위한물질선정 수용액중에서나노분말화된키토산입자는유기산에서일정농도까지녹지않고팽창되는성질을가지고있음을 차년도실험에서밝히고 등의유기산을사용하여콜로이드화하였다 나노키토산입자가용액중에가장많이팽윤된상태에서 를코팅하여수용액중의분산성을더욱향상시킬수있음을연구하였다 차년도실험에서는이와같은팽윤에의한수용성콜로이드화시에유기산과더불어기능성물질을사용하여키토산나노파우더내부로기능성물질을함유하여키토산콜로이드를기능성화하는연구를수행하였다 먼저키토산나노파우더에원활히도입될수있는물질을선정하고 그물질에따른적절한조건을확립하기위한연구를수행하였다 본연구에서키토산나노파우더의기능성화물질로시도했던물질들은수용성물질인 과지용성물질인 등이다

52 가 이론적 실험적접근방법가 는 가나트륨결합한물질로백황색을띠는결정성분말이다 녹는점은약 이며에탄올과식물성기름에는녹지않지만물에서의용해도는 이다 나 비타민 를경구투여하는경우 흡수를늘리고소화기에대한자극감을없애기위해서미네랄들과에스테르화시킨다 에스테르화된 는흡수도빠르고위장관에자극을주지않아서궤양때문에자극성음식 특히 를섭취하지못하는사람이라도복용이가능하다 다 와키토산의기능을접목시키기위해서 용액에키토산을콜로이드화시키는실험을하였다 정밀한실험을위해 들을깨끗이세척하고 수용액을 씩넣은후각각 의고분자나노키토산분말을첨가한다음 를사용하여혼합하였다 이샘플들을키토산나노입자가물리적인힘에의해파괴되지않도록약 분간 를유지하면서초음파처리하였다 실험내용및결과가 는물에잘용해되긴했지만용액상태에서키토산을녹이지못하였다 육안으로확인했을때 까지도키토산이잘녹아들어가지않았다 게다가 용액에키토산을첨가한상등액을한달정도보관하였더니침전물이생겼다 이는 용액에소량녹아있던키토산이침전된것으로보였으며콜로이드의안정성이떨어지는것으로판단되었다 나 이론적 실험적접근방법가 은백색결정성분말로지방족고리의 가알코올이며 가지의입체이성체로존재한다 모든동물조직 특히심장과뇌 에다량존재하며세포수준에서의건강을위해필요한성분이다 주로동맥경화예방에사용되며칼슘흡수량을증가시키고혈당감소효과를가지고있으므로영양학적관점에서식품첨가물로서의이용가능성이많은물질이다 나 의기능성을키토산의효능에접목시키고자 수용액에키토산을콜로이드화시키는실험을수행하였다 정밀한실험을위해서 들을깨끗이세척하고 수용액을 씩만들었다

53 은수용성비타민이기때문에에탄올 에테르 클로로포름에는잘녹지않지만물에서의용해도는 이다 각농도의 용액에 의고분자나노키토산분말을첨가한다음 를사용하여혼합하였다 이샘플들을약 분간 를유지하면서초음파처리하였다 실험내용및결과가 용해실험결과 의농도가 가될때까지도키토산이용해되지않았다 용액의농도를더높이게되면불필요하게많은양의 이첨가되고 이상의 수용액을만들수도없었기때문에더이상실험을진행할수없었다 다 과 이론적 실험적접근방법가 는엘라스틴의합성을촉진하여주름을감소시키고피부탄력을증대시키는데효과가있다 일찍부터이러한효능이알려져있었지만자극성이강하고피부안정성이떨어지기때문에응용이어려웠다 그래서개발된물질이 이며 체내로흡수되면다시 로전환되므로두물질의효과는차이가없다 나 세계적으로이물질들에대한연구가활발히진행되고있으며국내에서도레티놀이봉입된키토산에대한특허가등록된바있다 나와정 은새로운기능성물질로주목받고있는레티놀을산화또는변성이없이저분자량수용성키토산에봉입하여담지된레티놀을서서히방출함으로써레티놀의효과를높였다고한다 다 키토산을 나 을이용해기능성화시키기위해서는이물질들을용액화시켜야하는데 지용성물질이기때문에물에는용해시킬수없었다 그래서이들을소량의에탄올에녹이는방법을선택하였다 의에탄올에 또는 를 녹인후만들어진 키토산상등액에첨가하였다 첨가시에침전이발생하지않도록하기위해 짜리피펫을이용하여 에서 하면서 용액을매우소량씩가하였다 이용액속의물질들이충분히반응할수있도록교반시킨후 를이용해입자의크기를분석하였다 실험결과및분석가 를에탄올에녹인용액은진한형광노란색을띠고 나노키토산용액도노란색을띠는데위의용액을원심분리하면그색이투명해지고노란색을띠는물질들이가라앉는다 는위의제조방법으로만든

54 키토산콜로이드의입자들이시간이지나면대부분가라앉고원심분리하면투명해지는실험과정을보여주는것이다 이속에우리가원하는입자들이분산되어있지않고모두가라앉았다고생각했지만 정확한분석을위해 를이용하여상등액의입자크기분석을하였다 분석결과그래프를 에나타내었다 나 에서보면 을첨가한용액에서는입자크기가오히려감소하였고 원심분리결과상등액에뜨는키토산의양도줄어들었다 은물에녹아서산성을띄는물질이아니므로키토산을녹였다고보기어려웠고 오히려키토산의분산을막는것처럼보였다 다 의결과를보면 를첨가한용액에서는입자의크기가 까지증가하여어느정도키토산과의상호작용이있다고판단되었다 에탄올에녹인 의크기를 로분석한결과 부근에뚜렷한피크가나타났다 라 용액속에팽윤된키토산입자크기가 정도이고 를첨가한용액속에서입자크기가 정도임을고려하면 와 이서로상호작용을한다고짐작할수있었다 그렇지만 부터는키토산입자가작아지는반면에 를첨가했을땐키토산입자크기가증가하므로 와키토산과의관계를명확히할수가없었다 또한 의대응책으로사용한 가안정성이떨어지고피부에자극적이라는점을개선할방법을찾지못해실험을계속할수없었다

55 라 이론적 실험적접근방법가 는인체내에서환원제역할을하고콜라겐합성 항산화제로의작용 소장에서철분의흡수를돕는등의장점이있다 실험내용및결과가 는수용성비타민이기때문에물에잘녹았으며그용해도는 이다 키토산을잘팽윤시킬수있는 농도를찾기위해서넓은농도범위 의 용액을 씩만들어 의키토산을첨가한후용해정도를확인하였다 그결과 에서키토산이다녹지는않았지만용해현상이관찰되었고 이후로는모두녹아투명한액채가되었다 그래서 와 범위의 농도를이용하여본격적인실험을수행하였고다음에그내용을자세히나타내었다 고분자키토산나노분말의콜로이드화 가 용액에서고분자키토산나노분말의용해 이론적 실험적접근방법가 키토산의표면이적절히용해되어콜로이드화할수있는 의농도를알기위해서서로다른농도의 용액에서키토산의용해정

56 도를관찰하였다 정밀한실험을위해서 들을깨끗이세척하고 의 용액을 씩넣었다 각각 의고분자나노키토산분말을첨가한후 를사용하여혼합하였다 이샘플들을키토산나노입자가물리적인힘에의해파괴되지않도록약 분간 를유지하면서초음파처리하였다 그샘플들을 시간동안움직임없는상태로보관하여그전과후를비교하였다 실험내용및결과가 위의실험결과를육안으로관찰했을때 와같은결과가나왔다 에서 의농도가진해질수록용액이맑아지는것을확인할수있었다 까지의농도에서는용액이혼탁하였지만 이후의농도에서는용액이투명했다 까지는키토산입자들이녹지않았지만 부터는키토산의상당량이 에녹아들어가남아있는입자크기가매우작거나없어서투명하게보이는것으로판단된다 나 움직임없이 시간이지난후의샘플들의사진이 에나타나있다 에서는 샘플이불투명한상태였지만 시간후에는용액은투명해지고상등액에떠있던대부분의키토산입자가가라않아있는것을확인할수있다 각샘플마다같은양의키토산을첨가하였지만바닥에가라앉는키토산의양은 농도증가에따라감소하였다 다 의농도가증가할수록콜로이드화되는키토산양이증가하며 부터는가라앉는키토산없이투명한콜로이드가생성된것으로생각된다 또한 높은농도의 용액에서는나노키토산이녹고있음을알수있었다 차년도연구에서도각유기산의일정농도 까지는탁한상태였다가농도가증가함에따라키토산이녹아서투명해지는것을볼수있었는데 에서는그농도가 이므로 를 라고추측하고실험을진행하였다 라 실험도중에용액색깔이변하는점에대해서의문을가졌었다 와 를비교해보면같은농도의 지만용액색깔차이가확연하다 이는 의산화현상으로추정되며시간이지날수록용액은점점더진한갈색으로변했다 마 와키토산을접목한연구들이활발히진행되고있는가운데 에의하면 는공기 산소 빛 금속이온 식품진행과정 수분이많은상태등에서쉽게생물학적비활성화합물로산화된다고한다 이실험에서있었던 콜로이드의색깔변화는샘플을

57 만드는과정에서 에들어있던산소와 가만나서산화된것으로 추정되며 식품의일종인키토산과 가반응해서발생됐을가능성 또한배제할수없다 나 나노키토산콜로이드에존재하는키토산함량분석 이론적 실험적접근방법가 위에서는 농도증가에따라상등액속의키토산양이증가하는것을 를통해확인하였고이장에서는상등액에떠있는키토산의정확한양을측정하기위한추가실험을실시하였다 에 키토산을첨가한용액을 에서 분간원심분리하여상등액을추출 한뒤 가라앉은키토산을 에서 시간동안건조시킨후그무게를측정하였다 초기에첨가한키토산의질량 에서가라앉은키토산의질량을빼면상등액에분산되어있는키토산의양을알수있다 실험내용및결과가 상등액속에분산된키토산의양을 에나타내었다 의농도가증가할수록상등액에존재하는키토산의양이많아졌으나 이상의농도에서는농도증가에따른잔류량증가정도가줄어든것으로보아대부분의키토산이분산되었다고판단된다 나 정확한실험을수행하고자잔류량검사를여러번진행하였는데 그중한번은키토산용액을제조한뒤즉시원심분리를했더니 보다낮은수율을갖는키토산콜로이드가만들어졌다 키토산의아민기와 가반응하며키토산입자가팽윤되면서키토산나노분말이분산될수있는능력을갖게되는데 반응시간이충분하지못했기때문에키토산입자들이덜팽윤되어생긴현상이라고판단된다

58 다 그러므로키토산콜로이드의수율을높이려면키토산입자와 가충분히반응하도록수시간동안교반시켜야한다 본연구의모든실험은 와키토산을충분히교반시킨후수행하였다 다 농도에따른키토산콜로이드의입자크기분석 이론적 실험적접근방법가 본연구에서사용한키토산은고분자키토산이므로 입자내에수많은키토산분자들이얽혀있는상태로존재한다 이러한고분자키토산이 용액에용해된다는것은 엉켜있던키토산입자의바깥부분사슬들이 와반응함을의미한다 키토산바깥부분의분자사슬이풀어지면서팽윤되고 그안쪽에있는키토산사슬들은수소이온과반응하지않은고분자키토산그대로존재할것이다 이렇게입자내부에키토산이고분자상태로존재한다면 인체내에서더뛰어난생리활성을갖게될것으로예상된다 나 키토산용액을 에서 분간원심분리하였다 그상등액에분산되어있는키토산입자의크기를 를이용하여분석하였다 각샘플들은불순물없이깨끗한상태에서촬영되었다 간혹샘플에불순물이있을수있지만 하지않았고 불순물이가라앉을때까지기다렸다가측정하였다 만약불순물을없애기위해서 한다면 산에팽윤되어단단하지않은상태의키토산입자가파괴되거나찌그러져정확한분석이어렵기때문이다 의 용액에키토산을 다른실험샘플의 배 넣고 시간방치한뒤 에서 분간원심분리하였다 그상등액에분산되어있는키토산입자

59 의크기를 을이용하여분석하였다 실험결과및분석가 로분석한상등액속에분산되어있는키토산입자의크기를 에나타내었다 에서 까지의 용액에서는분산된키토산입자의크기가 농도증가에따라커진다 이후로는농도증가에따라입자크기가급격히줄어들다가 에서는 로크기분석이잘안될정도로입자크기가작아졌다 그러므로 에서팽윤이극대화되어있으며 보다높은농도에서는팽윤이지나치게많이되면서키토산고분자 이나노입자로부터빠져나와입자크기가줄어드는것으로판단된다 나 키토산의잔류량검사에서 보다 의 용액에서잔류량이더많았고 의결과를보았을때도 에서키토산의분산량이더많아보였다 그렇지만입자크기분석결과 에서는키토산입자가너무작으므로최대로팽윤되었다고볼수없다 팽윤정도가지나쳐서오히려입자가작아졌고 가벼워져서상등액에더많은키토산이포함된것으로보인다 다 은 와 용액에팽윤된키토산입자의 사진이다 와는다르게 보다 에서입자크기가더작아보이는데 그것은 와 이인식하고분석하는입자의크기가다르기때문이다

60 라 는입자의겉표면을측정하지만 은입자의 를중심으로뚜렷한부분만측정되므로 로는팽윤된부분까지모두측정되는반면 으로는팽윤되어흐릿한부분은배제되고촬영된다 그러므로 을통해실제로고분자키토산자체가 와반응하지않은채로존재하는양과그크기를알수있다 또한 와 을비교분석함으로써 와 에서입자의팽윤정도를짐작할수있다 속의키토산입자크기는 그래프에서는각각 정도이고 사진에서는각각 정도로비슷하다 라 와 키토산콜로이드의 측정 이론적 실험적접근방법가 는 이기때문에물에녹아산성을나타낸다 그리고키토산은각각의단량체마다아민기를하나씩가지고있기때문에 에키토산을첨가할경우 증가를예상할수있다 본연구에서사용한농도의 용액의 를측정하고 같은용액에키토산이첨가되었을때 의변화량을측정하였다 나 정확한 측정을위해 으로 의완충용액을 사용하였다 의 의 를측정한뒤 이용액에 의키토산을첨가하여원심분리하고상등액의 를측정하였다 실험내용및결과 가 은농도별 용액의 와같은용액에키토산을 첨가한상등액의 를나타낸것이다 에키토산을첨가하면

61 가상당량증가하긴하지만 여전히산성을띤다 반면키토산을물에첨가하면그용액의 는 로염기성을나타낸다 키토산을 에첨가하게되면키토산의아민기와 의수소이온이만나반응하면서 가증가하게되는것을확인할수있다 나 사용한키토산의몰농도 상등액에들어있는아민기의양 은 이고 의 속의수소이온의몰농도는 이다 의이온화상수는 로용해된 중의일부분만이수소이온을내놓으므로수소이온의개수는더줄어들게된다 이들의개수를비교해보면아민기의개수가더많으므로 가 이상이될것으로예상되나 측정한값은 하므로키토산의아민기가모두 되지않은것으로생각되어진다 따라서 된상태의키토산나노파우더의외부는대부분 되어수용성화된 상태를유지하고 나노파우더의내부로갈수록 이덜되면서내부의 부분은 되지않은형태를유지할수있다는가정을할수있다 마 키토산콜로이드중화시 변화 이론적 실험적접근방법가 위실험의결과에서보듯이나노키토산을 에용해하여콜로이드화하면콜로이드용액를산성화시킨다 나노키토산콜로이드용액이산성을띨경우상업적인응용에제한을받을수있다 본연구에서는매우낮은농도의 용액을사용하였을뿐만아니라 에키토산이

62 용해되면서 가상당량증가한다 하지만 단계가필요하다고판단된다 를중성근처까지높여주는 나 키토산콜로이드를중화시키면키토산이 되면서물에대한용해도가감소하여콜로이드간에응집이생길수있다 이실험에서는콜로이드화된키토산입자들의응집현상을체계적으로연구하였다 키토산이가장잘팽윤되어있는 의 키토산콜로이드를 의 로중화시키고그때의 변화를관찰하였다 가순간적으로다량첨가될경우골고루분산되지못해키토산입자의응집이생길수있는데 이것을방지하기위해 에서 하면서 를매우소량씩가하였고 응집반응이일어날때까지적정하였다 실험결과및분석가 은 키토산콜로이드를중화시킴에따른키토산입자의크기변화를나타낸것이다 그래프에서갑자기입자의크기가증가하는지점은침전이발생하는점이라고볼수있다 중화시키기전키토산의 는 이며그때의입자크기는 이다 까지는 가증가함에따라키토산입자의크기가점차적으로감소하다가 이되자침전이발생했다 까지는침전이일어나지않아 로입자크기를측정할수있었지만 그보다높은 까지중화시켰을땐다량의침전이생겨 로입자의크기측정이어려웠다 에서는맑았던키토산콜로이드에 를좀더첨가하여 이되자용액이뿌옇에흐려지더니시간이흐른뒤에는침전물이가라앉았다

63 제 5 절동물실험을통한나노키토산분말의혈중콜레스테롤저하효과검증 1. 혈중콜레스테롤저하효과 가. 혈중총콜레스테롤함량 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) ( 주 ) 아산제약에서제공하는효소법 나 ) 헤파린튜브에 Blood samples을모으고 3,000 rpm에서 20분간원심분리한뒤혈청을분리해 test tube에모아냉동보관하였다. 준비된혈청을 4 에서 24 시간해동하여해동한혈청 0.02 ml과효소시액 3.0 ml을잘혼합하여 37 에서 5분간방치하였다. 시약블랭크를대조로 60분이내에파장 500 nm에서흡광도를측정하고표준액도같은방법으로실시하였다. 검체의흡광도를표준의흡광도로나눈뒤 300을곱한수치를총콜레스테롤량으로하였다. 2) 실험내용및결과가 ) 총콜레스테롤의농도는첫주에는전실험군간에유의적인차이가없었으나, 키토산분말과나노키토산분말을 8주간섭취시킨결과, 키토산을섭취하지않은 control군의총콜레스테롤은 47.4mg/dl 정도증가하였고, 키토산분말섭취군은 27.8mg/dl정도증가하였으나, 나노키토산분말섭취군은불과 3.4mg/dl정도밖에늘어나지않아다른군들보다매우유의적인차이를보였다 (Table 16). 또한 8주섭취시킨후 control군의총콜레스테롤함량은 138.8mg/dl였으나일반키토산분말섭취군에서는 25.8mg/dl이감소하였고, 실험군인나노키토산분말의경우 64.7mg/ dl나감소하여 46.6% 의감소율을보였다. Table 16. Effects of experimental diets on the change of blood total cholesterol and in rats fed for 8weeks 1). 1) Values are mean±sd of 8 rats per group. 2) * : Cholesterol diet + no supplemented chitosan. ** : Cholesterol diet + 2% powdered chitosan.. *** : Cholesterol diet + 2% nano-powdered chitosan. 3) Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test

64 나. 혈중 HDL-콜레스테롤의정량 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 혈청 0.2ml과분리시액 0.2ml을잘혼합하여 10분간실온에방치후 3,000rpm에서 10분간원심분리하여상층액 0.1ml과효소시액 3.0ml를잘혼합하여 37 에서 5분간방치하였다. 시약블랭크를대조로하여파장 500nm에서흡광도를측정하며, 표준액도같은방법으로실시하였다. 검체의흡광도를표준액의흡광도로나눈뒤 100을곱한수치를 HDL-콜레스테롤량으로하였다. 2) 실험내용및결과가 ) HDL-콜레스테롤의농도를분석한결과첫주에는전실험군간에유의적인차이가없었고, 마지막주의혈청을분석한본결과 control군은 20.8±2.96mg/dl로 0.7mg/dl정도증가하여가장낮은증가율을보였고, 키토산분말섭취군은 4.6mg/dl, 나노키토산분말섭취군은 7.6mg/dl 증가한것으로나타났다 (Table 17). Table 17. Effects of experimental diets on the change lipoprotein in rats fed for 8 weeks 1) of blood high-density 1) Values are mean±sd of 8 rats per group. 2) * : Cholesterol diet + no supplemented chitosan. ** : Cholesterol diet + 2% powdered chitosan. *** : Cholesterol diet + 2% nano-powdered chitosan. 3) Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test. 다. 혈중 LDL-콜레스테롤의정량 1). 이론적, 실험적접근방법가 ) Friedewald식에따라총콜레스테롤-(HDL콜레스테롤 + 중성지질 /5) 에의해서계산하였다. 2) 실험내용및결과가 ) LDL-콜레스테롤의농도는첫주와마지막주를비교해본결과 control군은 24.4mg/dl 증가하는반면, 키토산분말군은 3.35mg/dl 감소했고, 나노키토산분말군은 14.58mg/dl 감소하였다 (Table 18). 이결과는대조군과비교하여나노키토산분말군의증가율이 56% 낮은것으로나타났다

65 Table 18. Effects of experimental diets on the change lipoprotein in rats fed for 8 weeks 1) of blood low-density 1) Values are mean±sd of 8 rats per group. 2) * : Cholesterol diet + no supplemented chitosan. ** : Cholesterol diet + 2% powdered chitosan. *** : Cholesterol diet + 2% nano-powdered chitosan. 3) Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test. 2. 혈중중성지질저하효과 가. 혈중중성지질함량 1). 이론적, 실험적접근방법가 ) 혈청 0.02ml과효소용액 3.0 ml을잘혼합하여 37 에서 5분간방치한후, 시약블랭크를대조로 550 nm에서흡광도를측정하였다. 표준액도같은방법으로실시하며, 검체의흡광도를표준액의흡광도로나눈값에 300을곱한수치를중성지질의양으로하였다. 2) 실험내용및결과가 ) 혈청중중성지질의함량은 Table 6와같다. 실험식이를섭취한후에중성지질의농도를분석한결과키토산을섭취하지않은 control군은 89.3mg/dl로증가하였고, 키토산분말섭취군은 64.7mg/dl증가하여 control군보다낮게증가해유의적인차이를보였다. 나 ) 나노키토산분말섭취군은단지 28mg/dl 증가하여 control 군, 키토산분말섭 취군과매우유의적차이를보였다. 그래서나노키토산분말이대조군보다 69% 나혈청중성지질이감소하는것으로나타났다

66 Table 19. Effects of experimental diets on the change of blood triacylglycerol in rats fed for 8 weeks 1) 1) Values are mean±sd of 8 rats per group. 2) * : Cholesterol diet + no supplemented chitosan. ** : Cholesterol diet + 2% powdered chitosan. *** : Cholesterol diet + 2% nano-powdered chitosan. 3) Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test. 3. 간조직중총콜레스테롤과총지질함량저하효과 가. 간조직중총콜레스테롤과총지질함량 1). 이론적, 실험적접근방법가 ) 간조직의콜레스테롤과중성지방의추출은 Folch법 (10) 을응용하였다. 나 ) 간시료 3g을취해 30ml의 chloroform : methanol (2 : 1, v/v) 혼합액을첨가하여균질하고 1시간동안 sonication2 Whatman No. 1 여과지로여과하여여액을감압건조하였다. 여기에에탄올 5ml을가하여지질을녹인후, 혈청콜레스테롤과중성지방분석과동일한방법으로효소법에따라비색측정하였다. 2) 실험내용및결과 가 ) 간의콜레스테롤함량과중성지방의함량은 Table 20 에나타내었고, 그룹간에 모두유의적인차이를보였다. 나 ) 간의총콜레스테롤함량은 conrol군보다키토산분말섭취군이 2.98mg/dl 감소하였고나노키토산분말섭취군이 4.91mg/dl 감소하였다. 또한나노키토산분말섭취군은키토산분말섭취군과비교하여 25% 가감소하여나노키토산분말섭취군이총콜레스테롤함량을낮추는효과가더우수한것으로나타났다. 다 ) 또한대조군과비교하면 5.4% 나감소하는것으로나타났다. 간의중성지방함량은 control군보다키토산분말섭취군이 8.72mg/dl 감소하였고나노키토산분말섭취군은 13.98mg/dl 감소하였다. 또한키토산분말섭취군과비교하여나노키토산분말섭취군은총중성지방함량이 42% 감소해나노키토산분말이총중성지방을낮추는데더효과적으로작용하는것으로나타났다. 또한대조군

67 과비교하면 66% 나감소하는것으로나타났다. 라 ) 결과적으로나노키토산분말의혈중콜레스테롤과중성지방함량의감소효과가 매우높은것으로사료된다. Table 20. Effect of experimental diets on the change of liver lipid total-cholesterol and triglyceride in rats fed for 8weeks 1) 1) Values are mean±sd of 8 rats per group. * : Cholesterol diet + no supplemented chitosan. ** : Cholesterol diet + 2% powdered chitosan. *** : Cholesterol diet + 2% nano-powdered chitosan. Values within the same column with different superscripts are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple-test. 제 6 절동물실험을통한나노키토산분말의항당뇨효과검증 1. 혈중포도당농도저하효과 가. 혈중포도당측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 혈당측정은 test-strip method를사용하였으며, 실험에사용된혈액은꼬리정맥에서일주일간격으로오전10~12시사이에채혈하여즉시혈당측정기 (Gluco Dr. AGM-3000, ( 주 ) 올메디쿠스, 한국 ) 로측정하였다. 2) 실험내용및결과가 ) 나노키토산을섭취한 db/db 마우스의혈중포도당농도변화를 Fig. 9에나타내었다. 정상대조군의혈중포도당농도는 160~200 mg/ dl로일정하게측정되었고, 당뇨대조군의혈중포도당농도는 490~590 mg/ dl로초기 0주째에서 8주째까지꾸준히증가하는경향을나타내었다. 나노키토산섭취군의혈중포도당농도는 0주째일때 555 mg/ dl에서 7주째 359 mg/ dl로꾸준히완만한감소를보이다가 8주째에 242 mg/ dl로혈중포도당농도가급격히감소하는경향을보였다. 키토산분말섭취군은 0주째에 533 mg/ dl에서 8주째에 383 mg/ dl로감소하는경향을보였다. 나노키토산분말섭취군은약 56% 로혈중

68 포도당농도가감소하였고, 키토산분말섭취군은약 28% 로감소하였다. 이는키토산섭취군에비해나노키토산분말섭취군에서약 2배이상높은감소율을보였다. 따라서나노키토산섭취군이혈중포도당농도를감소시키는데탁월한효과가있다고사료된다. 2. 혈중인슐린농도 가. 혈중인슐린농도측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 마우스 insulin ELISA kit (Shibayagi, Japan) 를구입하여 micro plate reader(elx800, Bio-TEK, USA) 로측정하였다. 2) 실험내용및결과가 ) 나노키토산분말을섭취한 db/db 마우스의혈중인슐린농도의변화를 Fig. 10에나타내었다. 정상대조군의혈중인슐린함량은 μu/ml로측정되었고, 당뇨대조군은 86.6 μu/ml으로약 μu/ml으로감소되어약 2배이상이낮은혈중인슐린농도를나타내었다. 나노키토산분말섭취군의혈중인슐린함량은 μu/ml 으로당뇨대조군에비해약 80.5 μu/ml으로증가되었고, 키토산분말섭취군은 μu/ml으로약 44.8 μu/ml으로증가되어유의적차이가나타났다 (P<0.05). 이는나노키토산분말섭취군에서당뇨대조군에비해혈중인슐린함량이약 48.2% 증가되었으며, 키토산분말섭취군은약 34.1% 증가되었음을알수있었다. 따라서본실험의결과나노키토산분말섭취군에서인슐린수치를정상으로호전시켰을것으로사료된다. 3. 췌장의형태학적관찰 가. 췌장의형태학적비교 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 조직학적관찰을위해췌장을 10% formalin(10% neutral buffered formalin ; NBF) 에서고정후조직내침착되어있는 formailn 색소와고정용액의중성분제거하기위해흐르는물에수세하고알코올농도차이에따라단계별 (70, 80, 90, 95%, 무수알콜 ) 로 1시간씩탈수하였다. 이어 xylene으로치환후, paraplast (60 ) 로 4시간침투시킨다음포매하였다. 포매된조직을 microtome (Microme-HM325, USA) 을이용하여 3~4μm의두께로절편을제작한후파라핀제거과정을거쳐 hematosylin과 eosin으로염색하였다. 염색후저농도알코올에서고농도알코올로탈수과정을거쳐제작된표본을광학현미경으로관찰한다. 2) 실험내용및결과 가 ) 나노키토산분말을섭취한 db/db 마우스의췌장조직의형태변화를분석한

69 Fig. 55. Effect of nanopowdered chitosan in serum insulin level in db/db mice during 8 weeks feeding. 1) Result are expressed as means±sd (n=7). 2) Control: no diabetic + no supplementation of nanopowdered or powdered chitosan. Group 1: diabetic + no supplementation of nanopowdered or powdered chitosan. Group 2: diabetic + supplementation of 2% powdered chitosan. Group 3: diabetic + supplementation of 2% nanopowdered chitosan. 결과를 Fig. 56에나타내었다. 정상대조군에서는췌장소도세포의형태는큰타원형이며이들조직의형태가잘보존되어있음을알수있었다. 그러나당뇨대조군에서는췌장소도세포의형태가정상소도세포에비하여그형태는수축되어있고, 부분적으로파괴되어침윤단핵세포가관찰되었다. 또한지방세포의분포도정상대조군에비해현저히많아짐을알수있었다. 나 ) 그러나키토산분말섭취군에서는췌장소도세포의형태가당뇨대조군에비해뚜렷하게관찰되었으며, 지방세포의분포도적어짐을알수있었다. 또한나노키토산섭취군에서는췌장소도세포의형태가정상대조군에서와비슷하게췌장소도세포의크기가커졌고, 침윤단핵세포부분도발견이어려웠다. 지방세포의분포도당뇨대조군에비해적어짐을알수있었다. 다 ) Kargar 와 Kawasaki (8,9) 는 db/db 마우스에서췌장 β-세포의함량이인슐린의분비능을조정하고, 당뇨병을야기시킨다는요인이라고하였다. 따라서나노키토산분말은췌장소도세포에서 β-세포의파괴를완화시키고과도한인슐린분비를촉진되지않게되어그형태가잘보존되었을것으로추정할수있다

70 Fig. 56. Effect of nanopowdered chitosan on the morphology of pancreatic islets stained by hematoxylin and eosin during 8 weeks feeding. 1) Magnification of histological section 100 2) Result are expressed as means±sd (n=7). 3) Control: no diabetic + no supplementation of nanopowdered or powdered chitosan. Group 1: diabetic + no supplementation of nanopowdered or powdered chitosan. Group 2: diabetic + supplementation of 2% powdered chitosan. Group 3: diabetic + supplementation of 2% nanopowdered chitosan. 제 절나노키토산산업화를위한연구 를사용한키토산콜로이드의캡슐화 가 의첨가에의한상등액내키토산의양검증 이론적 실험적접근방법가 차년도연구에서키토산의분산성을높이기위한방법으로키토산입자의표면에식품첨가물등급의계면활성물질인 를도입하였다 팽윤된키토산의표면에는 의소수성부분이붙고 친수성부분은물쪽을향하게함으로써키토산의분산성을향상시켰었다 차년도연구에서도마찬가지로 용액에팽윤된키토산의표면에 를도입하여키토산의분산성향상을유도하였다 나 용액에 키토산을첨가하였다 키토산이충분히팽윤되어야 가잘코팅될것이라고생각하여수시간교반시키고 가키토산표면에안정적으로흡착되도록 시간이지난이후에원심분리하였다 에서 분간원심분리하여상등액을추출 한뒤 가라앉은키토산을 에서 시간동안건조시킨후그무게를측정하였다 초기에첨가한키토산의질량 에서가라앉은키토산의질량을빼

71 면상등액에분산되어있는키토산의양을알수있다 앞서실험한 농도증가에따른콜로이드속의키토산양 를이용하여 의존재 에따른상등액에존재하는키토산의수율을비교하였다 실험내용및결과가 에 를첨가하기전과후의키토산수율변화를나타내었다 를첨가한 키토산콜로이드의수율을계산해보았다 키토산입자가가장많이팽윤되어있는 의농도에서키토산의수율이조금늘긴했지만큰차이는없었다 첨가한 가상등액속의키토산무게를측정할때영향을줄것이라고생각되어무게측정시 의첨가로인한오차를계산해보았다 사용한용액속에는 가 즉 들어있다 이를원심분리후건조시켜무게를측정하는용액의부피는 즉그속에존재할 함량은 정도였다 즉잔류량검사시 첨가로인해발생되는오차는무시할수있을만큼작았다 나 키토산에 를코팅후입자크기변화관찰 이론적 실험적접근방법가 키토산입자표면에 가흡착되면 가코팅되지않았을때보다입자의크기가커질것이라고예상하였다 용액에 키토산을첨가하였다 키토산이충분히팽윤되어야 가잘코팅될것이라고생각하여수시간교반시키고 가키토산표면에

72 안정적으로흡착되도록 시간이지난이후에원심분리하였다 에서 분간원심분리한상등액을추출한뒤 를이용하여 가코팅된입자의크기를분석하였다 앞서실험한 농도증가에따른콜로이드속의키토산입자크기변화 를이용하여 의존재에따른키토산입자의크기변화를비교하였다 실험내용및결과가 를이용하여 첨가전후키토산콜로이드의입자크기를비교 분석한결과를 에그래프로나타내었다 의첨가로인한키토산의분산력증대로예측할수있듯이 를 키토산콜로이드에첨가하면입자의크기가대체적으로증가하였고그정도는 이다 를첨가한콜로이드도첨가하기전과마찬가지로 까지는입자크기가증가하다가 이후로는 농도가증가할수록입자크기가감소하였으며 에서는 로분석이어려울만큼입자크기가작아졌다 다 저항성연구 이론적 실험적접근방법가 키토산콜로이드를중화시키는실험에서 에서침전이발생하는것을확인한바있다 키토산입자에 를코팅하면 코팅된 가키토산입자들간에발생하는인력을줄여주고 증가에대한저항성이커질수있다는가정하에실험을수행하였다

73 나 키토산이가장잘팽윤된상태에서 를도입하기위해 를사용하여 키토산콜로이드를만들었다 의 로콜로이드를중화시키면서 변화를관찰하였다 가순간적으로다량첨가될경우골고루분산되지못해키토산입자의응집이생길수있는데 이것을방지하기위해 짜리피펫을이용하여 에서 하면서 를매우소량씩가하였고응집반응이일어날때까지적정하였다 실험내용및결과가 키토산콜로이드중화실험에서 를코팅하기전과후에침전이발생하는 지점이달랐다 즉 증가로인해발생하는키토산입자간의인력을견디는능력이달랐다 그양상을그래프로그려 에나타내었다 코팅유무와관계없이두용액모두특정 까지는 가증가함에따라입도분포가작아진다 그렇지만응집이발생하는지점 즉입도가갑자기커지는지점이서로다르다 첨가전의콜로이드는 에서 첨가후의콜로이드는 에서응집이발생했다 를코팅하게되면코팅전보다더높은 까지키토산입자간의인력을견딜수있었다 나 또한침전이발생하는시점에서그크기변화가 첨가전에는 정도로매우컸지만 첨가후에는 정도밖에되지않았다 이런결과들로볼때 를키토산입자에코팅하는것은키토산입자간의인력을감소시키는효과적인방법이라고판단된다 다 은본연구의전체적인과정을그림으로간략이설명한것이다 유기산

74 의농도가진해짐에따라키토산나노파우더의표면이팽윤되어 로측정한전체입자의평균크기는커지나 의결과에서보이는바와같이키토산나노파우더내부는팽윤되지않고그대로보존된다 팽윤되어진나노입자표면의키토산 에의해서나노입자가수용성콜로이드가되었다 일단팽윤되어진나노입자는 가중성이되어도콜로이드의형태를유지하나염기성의 에서는침전이발생한다 하지만 에의해캡슐화되어진이후에는 이상되어도콜로이드상태를유지하고있는것으로확인되었다 라 따라서본연구에서개발된키토산콜로이드는산성에서염기성에이르는넓은범위 에서안정하여식품 의약 화장품에이르는영역에서산업적인응용이뛰어날것으로기대된다 2. 수용성나노키토산을첨가한우유의제조 가. 기능성우유의제조 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 나노키토산분말의수용성화 (1) 나노키토산분말의분산을위해사용된 0.3%(w/v) 아스코르빈산용액에

75 0.5%(w/v) 나노키토산분말을첨가하여 2시간교반하여나노키토산을팽윤시킨후, 여기에계면활성제로서 PGMS(polyglycerol monostearate) 를전체용액의 0.1 wt% 가되도록첨가하여상온에서 24시간방치하여반응시킨후 5,500rpm에서 5분동안원심분리 (HMR-220IV, Hanil Industrial Co., Seoul, Korea) 하여상등액을습득하여 NaOH 수용액으로중화 (ph 7.0) 시켰다. 나 ) 우유의제조 (1) 시유에 4,500ppm 농도인수용성나노키토산을 1, 3, 5, 7, 9%(v/v) 의비율로첨가하여 4 에서냉각시켜저장한것을 0일로하여 15일간저장하였다. 이때시유를개봉하지않고첨가물을실린지로주입하여외부의영향을최소화하여사용하여실험에사용하였다. 나. 산도및 ph 변화 1) 이론적, 실험적접근방법 가 ) 산도및 ph 의측정은요구르트와동일한방법으로사용하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 수용성나노키토산을 1, 3, 5, 7, 9% 로첨가한우유의저장기간중 ph변화를 Fig. 61 에나타내었다. ph의범위는 6.6 ~ 6.8 였으며, 이것은신선한우유의 ph이었다. 수용성나노키토산의함량이높을수록 ph가약간높게측정되었으며, 그이유는수용성나노키토산의 ph 7.0이므로첨가비율이높을수록 0.1N NaOH 함량도많아졌기때문이다. 대조군우유는 ph가 6.68로가장낮았으며, 모든시료들은 ph가저장 15일까지일정하게정상임이관찰되었다

76 Fig. 61. Changes of ph in ascorbic acid-soluble nanochitosan-added milk stored at 4 for 15 days 1) NC : Nanochitosan 나 ) 수용성나노키토산을첨가한우유의저장기간중산도변화를 Fig. 16에나타내었다. 저장기간이경과함에따라모든군에서약간의증가는있었으나거의일정하였다. 수용성나노키토산의첨가량이높아질수록산도는증가하였고, 대조군우유의산도는가장낮았다. Lee 와 Lee (32) 의결과에서도대조군의산도에비해수용성키토산의첨가하였을때산도가증가함을알수있었고, 0~ 5 로 30일간저장시에도산도의변화가거의없었음을알수있었다. 따라서수용성나노키토산을첨가하여도우유품질에영향이없음을알수있었다

77 Fig. 62. Changes of titratable acidity in ascorbic acid-soluble nanochitosan-added milk stored at 4 for 15 days 1) NC : nanochitosan 다. 색도변화 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 색도측정은요구르트와동일한방법으로사용하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 저장기간에따른색의변화를관찰하기위해 Hunter L-value, a-value, b-value를측정한결과를 Table 11 에나타내었다. 저장 15일동안수용성나노키토산을첨가 (1~9%) 하였을때대조군과 L, a-값은유의적 (P<0.05) 차이가없었고, b-값은유의적 (P<0.05) 차이가나타났다. Philips 등 (43) 은우유의 L-값은소비자의소비에큰영향을끼친다고하여, 본실험에서는저장15 일동안수용성나노키토산의첨가량이증가함에도 L-값에는영향을미치지않았기때문에긍정적인결과를가져왔다. 나 ) b-값은수용성나노키토산의첨가랑에비례하여증가하였다. 이는나노키토산분말의고유한색에영향을받았기때문이라고사료되며, 각시료간에저장기간이경과됨에따라유의적 (P<0.05) 인차이는없었다. 수용성나노키토산을 5~9% 첨가했을때저장기간중우유의 b-값은유의적 (P<0.05) 으로증가하였고, 수용성나노키토산을 1~3% 첨가하였을때 b-값은유의적 (P<0.05) 인차이가없었다. 따라서본실험에서우유에수용성나노키토산을 1~3% 첨가하였을때대조군과색도의차이가없었음을알수있었다

78 Table 21. Changes of color 1) for ascorbic acid-soluble nanochitosan(nc) Concentrations -added milk stored at 4 C for 15 days 2) Stroage Color value (%, v/v) of period sample (days) L a- b Control a 2.61 a 2.67 hij NC (1) a 2.67 a 2.88 efgh NC (3) a 2.67 a 3.10 bcde 0 NC (5) a 2.67 a 3.17 abcd NC (7) a 2.66 a 3.25 ab NC (9) a 2.63 a 3.32 a Control a 2.59 a 2.67 hij NC (1) a 2.65 a 2.77 ghij NC (3) a 2.65 a 3.04 bcdef 3 NC (5) a 2.67 a 3.11 abcde NC (7) a 2.64 a 3.19 abcd NC (9) a 2.62 a 3.23 abc Control a 2.56 a 2.62 ij NC (1) a 2.63 a 2.75 hij NC (3) a 2.63 a 2.97 defg NC (5) a 2.66 a 3.05 bcdef NC (7) a 2.61 a 3.05 bcdef NC (9) a 2.59 a 3.18 abcd Control a 2.58 a 2.62 ij NC (1) a 2.62 a 2.72 hij NC (3) a 2.64 a 2.84 fghi 9 NC (5) a 2.64 a 3.03 bcdef NC (7) a 2.58 a 2.97 defg NC (9) a 2.61 a 3.15 abcd Control a 2.58 a 2.57 j NC (1) a 2.62 a 2.73 hij NC (3) a 2.63 a 2.78 ghij NC (5) a 2.67 a 3.01 cdef NC (7) a 2.59 a 3.04 bcdef NC (9) a 2.60 a 3.11 abcd Control 88.79a 2.65 a 2.57 j NC (1) 88.80a 2.61 a 2.66 ij NC (3) 88.88a 2.63 a 2.73 hij NC (5) a 2.66 a 3.00 def NC (7) a 2.61 a 2.99 def NC (9) a 2.60 a 3.08 bcde 라. 비타민 C 함량측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 수용성나노키토산을첨가한우유의비타민 C 함량을측정하기위하여식품공전법의고속액체크로마토그래피방법 (Korea Food Code, 2008) 을이용하였으

79 며, 시료 5.0g을정확히달아동량의 10% 메타인산용액을가하여 10분간현탁시킨후적당량의 5% 메타인산을넣어균질화한다. 균질화된시료를 100ml 메스플라스크에옮겨 3,000rpm에서 10분간원심분리하여 filtering 한것을시험용액으로사용하여분석하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 우유에수용성나노키토산을첨가하여저장기간중비타민 C의함량변화를분석한결과를 Table 22에나타내었다. 저장 15일동안비타민 C의함량은대조군우유에비해수용성나노키토산을첨가했을때높았으며, 수용성나노키토산의첨가량에비례하여비타민 C의함량이증가했다. 0.3% 수용성나노키토산의저장 15일의비타민 C의함량과대조군우유의저장 0일의함량과유사하였다. 이것은수용성나노키토산을제조시에유기산으로나노키토산분말의분산을유도하였기때문에비타민 C의함량이증가한것으로사료된다. 수용성나노키토산을 1% 에서 9% 로첨가했을때비타민 C의함량은 4.17 ~ mg/l였다. 나 ) 비타민 C는쉽게산화되기때문에신체내에서자신이먼저산화되어다른물질이산화되는것을막는항산화역할을하며 (40), 무기철분의흡수를높여산화형의 Fe 3+ (ferric iron) 이환원형의 Fe 2+ (ferrous iron) 로전환되는것을돕기때문에흡수를돕는다. 그외에비타민 C는콜라겐의합성에필수적인성분이되고, 아미노산대사에도요구되는등인체내에서요구되는양은적지만없어서는안되는중요한성분이다 (60,61). 그러므로우유에수용성나노키토산을첨가하여비타민C의함량이증가되었으므로기능성유제품의적용이가능할것이다. 수용성나노키토산의첨가량에비례하게비타민 C의함량은증가하였으나, 저장기간이경과함에따라비타민 C 함량은손실되었다. 대조군우유의초기비타민 C함량은 3.26±0.11 mg/l에서저장 15일에는 1.88±0.13 mg/l 으로약 42% 감소하였고, 수용성나노키토산을첨가한우유에서도 37~51% 손실됨을알수있었다. 이것은비타민 C가쉽게산화되기때문에생겨난손실이라고생각된다. Table 22. Amount of L-ascorbic acid-soluble nanochitosan-added milk stored at 4 for 15 days 1) Concentrations (%, v/v) of sample Storage period (days) Amount of L-ascorbic acid (mg/l) Control 3.26±0.11 o NC 2) (1) 4.17±0.16 m NC (3) 5.97± NC (5) 7.85±0.13 g NC (7) 9.89±0.13 c NC (9) 11.79±0.16 a

80 Control 3.13±0.11 op NC (1) 4.03±0.19 n NC (3) 5.28±0.08 k NC (5) ±0.06 i NC (7) 8.79±0.16 ef NC (9) 10.43±0.08 b Control 2.91±0.07 pq NC (1) 3.12±0.03 op NC (3) 4.75±0.10 l 6 NC (5) 5.96±0.07 j NC (7) 8.61±0.07 f NC (9) 9.61±0.15 d Control 2.60±0.11 qr NC (1) 3.08±0.05 op NC (3) 4.81±0.09 l 9 NC (5) 6.01±0.11 j NC (7) 7.15±0.06 hi NC (9) 9.08±0.10 e Control 2.28±0.11 rs NC (1) 2.41±0.17 rs NC (3) 3.89±0.14 n 12 NC (5) 4.36±0.19 m NC (7) 5.09±0.16 kl NC (9) 7.47±0.09 h Control 1.88±0.13 t NC (1) 2.16±0.10 st NC (3) 3.23±0.14 op 15 NC (5) 4.09±0.17 nm NC (7) 4.83±0.13 l NC (9) 7.37±0.13 hi 1) Values with different letters within the same column differ significantly (P<0.05). 2) NC : nanochitosan 마. 관능검사 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 수용성나노키토산을첨가한우유를 4 에서 15일동안저장하면서 3일간격으로 color, rancidity, bitterness, astringency, overall acceptability를 7점법으로평가하였다. 관능검사요원과평가기준은요구르트의방법과동일하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 우유에수용성나노키토산을첨가하여제조한우유를저장기간에따라비교한결과를 Table 23에나타내었다. 우유를 4 에서 15일동안저장한것을 7점법으로평가하였다. 저장 15일동안대조군과수용성나노키토산 (1~9%, v/v) 첨가군에서 color, rancidity, bitterness에서유의적 (P<0.05) 차이는나타나지않았고, astringency에서는저장6일이전까지유의적차이가나타났으나, 저장 6일이후부터유의적 (P<0.05) 차이가없었다. 이는저장이진행되면서키토산의고유한떫은맛에감소가되었음을알수있었다. Overall acceptability의

81 경우를살펴보면저장 12일까지대조군과실험군의선호도가유의적 (P<0.05) 차이는없어, 우유의품질에는영향을받지않았다. 따라서대조군우유와수용성나노키토산을 7% 까지첨가하였을때는전체적인선호도에영향을미치지않음을알수있었다. Table 23. Sensory characteristics 1) for ascorbic acid-soluble nanochitosan -added milk stored at 4 for 15 days 2) Concentrations Stroage Sensory descriptions (%, v/v) period Color Rancidity Bitterness Astringency Overall of sample (days) Control 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.00 c 5.71 a NC (1) 3.86 ab 4.07 a 4.14 a 4.57 abc 5.71 a NC (3) 3.57 bc 4.14 a 4.29 a 4.64 abc 5.43 ab 0 NC (5) 3.71 abc 3.93 a 4.21 a 4.57 abc 5.50 ab NC (7) 3.57 bc 4.14 a 4.26 a 4.71 abc 5.42 ab NC (9) 3.43 c 4.14 a 4.36 a 5.14 a 5.00 ab Control 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.00 c 5.57 ab NC (1) 4.00 ab 4.00 a 4.14 a 4.14 bc 5.57 ab NC (3) 3.93 ab 4.02 a 4.14 a 4.58 abc 5.32 ab NC (5) ab 4.07 a 4.00 a 4.36 abc 5.00 ab NC (7) 3.86 ab 4.14 a 4.22 a 4.58 abc 5.00 ab NC (9) 3.71 abc 4.14 a 4.26 a 5.00 ab 4.50 ab Control 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.00 c 5.71 a NC (1) 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.14 bc 5.71 a NC (3) 4.00 ab 4.00 a 4.14 a 4.14 bc 5.57 ab 6 NC (5) 4.00 ab 4.14 a 4.29 a 4.29 abc 5.57 ab NC (7) 4.00 ab 4.14 a 4.29 a 4.43 abc 5.29 ab NC (9) 4.00 ab 4.21 a 4.29 a 4.57 abc 5.14 ab Control 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.00 c 5.29 ab NC (1) 4.00 ab 4.14 a 4.14 a 4.14 abc 5.00 ab NC (3) 4.00 ab 4.14 a 4.28 a 4.14 bc 5.00 ab 9 NC (5) 4.00 ab 4.43 a 4.28 a 4.36 abc 5.00 ab NC (7) 4.00 ab 4.50 a 4.28 a 4.36 abc 4.86 ab NC (9) 4.00 ab 4.50 a 4.28 a 4.57 abc 4.71 ab Control 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.00 c 5.85 a NC (1) 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.29 abc 5.75 a NC (3) 4.00 ab 4.00 a 4.00 a 4.29 abc 5.75 a 12 NC (5) 4.00 ab 4.14 a 4.14 a 4.50 abc 5.29 ab NC (7) 3.93 ab 4.14 a 4.28 a 4.79 abc 5.29 ab NC (9) 3.79 abc 4.14 a 4.43 a 4.86 abc 5.14 ab Control 4.00 ab 4.21 a 4.00 a 4.00 c 4.86 ab NC (1) 4.00 ab 4.21 a 4.14 a 4.21 bc 4.57 ab NC (3) 4.14 a 4.28 a 4.21 a 4.21 bc 4.00 ab NC (5) a 4.28 a 4.28 a 4.21 bc 4.00 ab NC (7) 4.14 a 4.28 a 4.28 a 4.43 abc 3.71 b NC (9) 4.14 a 4.42 a 4.28 a 4.79 abc 3.71 b 1) Mean of eight replicates. 2) Values with different letters within the same column differ significantly (P<0.05)

82 3. 나노키토산분말을첨가한요구르트의제조 가. 기능성요구르트제조 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 가교화 β-cyclodextrin (β-cd) 제조 (1) Powder β-cd 100g 증류수 80 ml에현탁시켜실온에서 2시간동안교반하여수세한후에, adipic acid를 β-cd의 2% 첨가하였다. 여기에 1M NaOH 용액을가하여 ph 10.0 으로조정하고, 실온에서 16시간교반하면서가교반응을진행시켰다. 가교반응을종결시키기위하여 acetic acid를사용해 ph 5로조정하였다. 이용액을 Whatman No. 2 여과지로여과한다음, 150ml의증류수로각각 3번수세하여여과하였다. 가교화된 β-cd는 60 dry oven에서약 17시간건조후, 100 mesh 체를통과시켜실험에이용하였다 (29). 나 ) 우유의콜레스테롤제거 (1) 콜레스테롤을흡착하기위하여가교화 β-cd 1% 를우유에첨가하고, 10 의교반온도, 800 rpm 의속도로 10 분간교반하였다. 흡착된 β-cd 를우유 로부터분리하기위하여 1,500rpm 에서 10 분간원심분리하였다 (45). 다 ) 요구르트제조 (1) 콜레스테롤을제거한우유 (40 ) 에 skim milk powder 3.7% 와 pectin 0.2% 를첨가한후 90 에서 10분간살균후 starter culture 0.04% 를첨가한후 incubator에넣어 43 에서 6시간동안발효시킨후 10 에서하루동안안정화시켰다. 그후 4 에서저장하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 콜레스테롤제거율 (1) 요구르트의가교화 β-cd를처리한콜레스테롤제거율의범위는 92.7~ 93.5% 로평균 93.1% 였으며, 가교화 β-cd 처리하여나노키토산, 키토산분말을첨가시에도유의적차이를나타내지않았다. 나. 산도및 ph 측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 산도는시료 9g과증류수 9ml을잘혼합한후페놀프탈레인용액 0.5ml을첨가하여 0.1N NaOH로중화적정한다. 적정에사용한 NaOH의양을젖산 % 함량으로나타낸다 (1ml 0.1N NaOH = 0.009g lactic acid) (45). ph는 ph meter(orion 900A, Boston, MA, USA) 를이용하여측정한다

83 2) 연구내용및결과가 ) ph 변화 (1) 콜레스테롤을제거한요구르트를제조하여나노키토산분말과키토산분말을즉시첨가하고 24시간후에 ph를측정한결과는 Fig. 6측정과같다. ph의범위는 였으며, 나노키토산분말의함량이높을수록 ph가높게관찰되었으며, 대조군요구르트는 ph가 4.2로가장낮았다. 모든시료들은 20일저장기간에 ph가감소하였지만키토산분말 0.3% 를제외하고는모두 ph가 4.2이상을유지하여품질계속유지되는것을시사하였다. 이러한경향은시료첨가량이증가함에따라 ph가증가한다는 Sung 등 (49) 의보고와일치하 Fig. 62 Changes of ph in nanopowdered chitosan-added and cholesterol- reduced yogurt stored at 4 for 20days 1). 1) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample 2) NPC : Nanopowdered chitosan PC : Powdered chitosan 여요구르트의바람직한 ph 범위가 4.0 ~ 4.4 이라는 Kroger (27) 의보고와도일치함을알수있었다. 따라서요구르트의 ph 저하는보존효과와영양학적가치및소화율을향상시키며저장 20일까지품질의저하는없음을알수있었다. 나 ) 산도변화 (1) 산도는요구르트의품질을평가하는기준의하나로 β-cd를처리하고나노키토산, 키토산분말을첨가하여제조한요구르트의산도변화는 Fig. 63에나타내었다

84 Fig. 63 Changes of titratable acidity in nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt stored at 4 for 20days 1). 1) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample 2) NPC : Nanopowdered chitosan PC : Powdered chitosan 저장기간이경과함에따라모든군에서산도가완만하게증가하였고, 나노키토산, 키토산분말의첨가량이높을수록산도가감소하는경향을나타내었다. 대조군은저장 0일에 1.38% 에서저장 20일에는 1.48% 까지증가하였으며, 나노키토산분말을 0.1% 첨가했을때는저장 20일까지 % 까지증가하였고, 나노키토산분말을 0.3% 첨가했을때는저장 20일까지 % 로, 0.5% 첨가했을때는 % 로, 0.7% 첨가시에는 % 로첨가량이증가함에따라산도는감소함이관찰되었다. 키토산분말도이와같이첨가량이증가함에따라산도는감소하였고 % 로증가함을알수있었다. (2) 이와같은결과는저장중산도의증가는젖산균의대사활동이서서히진행되고있어산의생성량이증가하기때문인것으로사료되었다. 또한적정산도를 Davis (9) 는 0.7~1.3% 에서나타났다고하였고, Rasic과 Kurmann (44) 은 0.95~1.20% 범위에서산미가증가한다고보고하여본실험의결과와일치하였다. 다. 점도측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 점도는 4 로저장된시료를 Brookfield-Viscometer (Model LVDV Ⅰ+, Version 3.0, Stongton, MA, USA), Spindle No. 2를사용하여 60rpm에서

85 분에서 8 분까지 1 분간격으로점도를측정하여평균치를사용하였다. 2) 연구내용및결과가 ) 요구르트는점도에따라기호성이크게달라지므로저장기간 20일동안요구르트의점도를측정한결과를 Fig. 64에나타내었다. 그결과요구르트의점도는저장 0일에는대조군 (51cps) 과키토산 0.7% 를첨가한군 (73cps) 을제외하고나노키토산, 키토산분말의첨가량에따라감소하는경향을보였다. 저장 15일까지는모든군에서증가하는경향을보이다가저장 15일이후부터감소하는경향을보였다. 그러나키토산분말을 0.5% 첨가했을때는저장 20일까지완만히증가하였다. 키토산분말을 0.7% 첨가했을때에점도가가장높게나타났다. 요구르트의점도에영향을주는요인은요구르트의혼합액의총고형분함량, 단백질가수분해정도, 사용균주의 slime 생산능력과산생성력등이영향을주는요인으로보고 (44) 되어있다. 라. 색도측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 색도는 4 로저장된시료를 Hunter 색차계 (Minolta CT-310, Tokyo, Japan) 를사용하여밝은정도를나타내는 L-value(lightness), 붉은색정도를나타내는 a-value(redness), 노란색정도를나타내는 b-value(yellowness) 을처리군별로 10회반복측정하였다. 이때사용한표준백색판 (Standard plate) 의 L, a, b 값은각각 97.75, -0.38, 1.88 이었다. 2) 연구내용및결과가 ) 저장기간에따른색의변화를관찰하기위해 L-value, a-value, b-value를측정한결과를 Table 24 에나타내었다. 저장 20일동안색의밝기를나타내는명도 L-값은대조군, 나노키토산, 키토산분말 (0.1~0.7%, w/v) 을첨가하였을때, 저장 10일째까지대조군과키토산분말첨가군에서는유의적 (P<0.05) 차이는없었고, 저장 15일부터유의적 (P<0.05) 차이가나타났다. 또한대조군과나노키토산첨가군에서는 0.3% 첨가량까지는대조군과유의적 (P<0.05) 차이가없었지만그이후농도부터는유의적 (P<0.05) 차이가나타났다. 나 ) 적색도를나타내는 a- 값은나노키토산, 키토산첨가량이증가함에따라감소 하는경향을나타냈으며, 저장 20 일까지대조군, 나노키토산, 키토산분말에는 유의적 (P<0.05) 차이는나타나지않았다. 다 ) 황색도를나타내는 b- 값은나노키토산, 키토산첨가량이증가함에따라증가 하는경향을나타냈으며, 저장 10 일까지대조군과유의적 (P<0.05) 차이는나 타나지않았다. 그러나저장 15 일부터대조군과나노키토산분말첨가군에서

86 유의적 (P<0.05) 차이가나타났다. 따라서요구르트에나노키토산 0.3% 까지첨가했을때대조군과색도의차이가없었음을알수있었다. 이는나노키토산의고유한색에영향을받았기때문이라고사료되나, 요구르트의품질에는영향을미치지않았다. Fig. 64 Changes of viscosity in nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt stored at 4 for 20 days 1) 1) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample 2) NPC : Nanopowdered chitosan PC : Powdered chitosan

87 Table 23. Changes of color 1) in nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt stored at 4 for 20 days 2) Concentrati ons (%, w/v) of sample Stroage period(days) L a- b + L a- b + L a- b + L a- b + L a- b + Control a 3.04 b 5.81 a a 3.05 ab 6.01 a a 3.07 abc 6.14 b a 3.20 a 6.84 b a 3.27 ab 7.06 b a 2.88 ab 6.20 a a 3.08 b 6.29 a ab 3.02 abc 6.34 ab ab 3.19 a 6.37 c d 3.29 a 6.41 c NPC 4) b 2.81 ab 6.29 a b 3.05 ab 6.33 a ab 3.08 abc 6.40 ab ab 3.20 a 6.42 c e 3.23 ab 6.46 c c 2.79 ab 6.38 a c 2.88 ab 6.39 a c 3.15 bc 6.41 ab b 3.10 a 6.45 c e 3.19 abc 6.49 c d 2.71 a 6.47 a d 2.73 a 6.40 a d 3.18 c 6.43 ab b 3.02 a 6.49 c f 3.08 abcd 6.53 c a 2.88 ab 6.04 a a 2.87 ab 6.12 a ab 2.85 ab 6.39 ab c 2.91 a 6.89 ab bc 3.02 bcd 7.30 ab PC a 2.81 ab 6.20 a a 2.82 ab 6.28 a b 2.88 abc 6.43 ab c 2.94 a 6.91 ab b 2.91 d 7.33 ab a 2.74 a 6.34 a a 2.75 ab 6.44 a ab 2.88 abc 6.67 a d 2.92 a 6.95 ab c 2.93 cd 7.35 ab 1) Mean of ten replicates a 2.65 a 6.48 a a 2.74 ab 6.52 a ab 2.79 a 6.70 a d 2.86 a 7.13 a e 2.94 cd 7.43 a 2) Means within column by the same letter are not significantly different(p<0.05). 3) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample. 4) NPC : Nanopowdered chitosan. PC : Powdered chitosan

88 마. 유산균의변화측정 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 나노키토산, 키토산분말을 0.1, 0.3, 0.5, 0.7% 비율로첨가한요구르트를멸균식염수에십진희석하여 MRS agar(difico Laboratories, Detroit, MI, USA) 에브롬페놀블루 (Bromophenol blue, BPB) 를 0.002% 첨가하여 37 에서 48 시간배양하여형성된 colony를계측하여 CFU(colony forming unit)/ml로나타내었다. 측정은 3회반복실험을실시하여평균값으로나타내었다. 2) 연구내용및결과가 ) 가교화 β-cd를처리하여나노키토산, 키토산분말을첨가한요구르트의저장중유산균수를측정한결과를 Table 24에나타내었다. 대조군은저장 0일에 CFU/ ml에서저장 20일에는 CFU/ ml으로감소하였고, 나노키토산분말을 0.1% 첨가한요구르트는저장 0일에 CFU/ ml에서저장 20일에 CFU/ ml으로, 0.3% 첨가시 CFU/ ml에서 CFU/ ml으로, 0.5% 첨가시 CFU/ ml에서 CFU/ ml으로, 0.7% 첨가시 CFU/ ml에서 CFU/ ml으로, 저장기간이경과함에따라모든군에서유산균수가감소함을알수있었다. 키토산분말을첨가한요구르트에서도첨가비율이높을수록유산균의수가적게나타남을알수있었다. 또한나노키토산의첨가량에비례하여유산균의생육이억제되었다. 나 ) 본연구의발효과정에서는 starter로단일균주를사용하지않고 Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus 혼합균주를사용하였음에도불구하고나노키토산분말에의한생육억제효과는뚜렷하게관찰되었다. 이는키토산이갖는항균력이기인하는결과로사료된다. 다 ) 우리나라에서요구르트의성분규격은신선한액상및호상요구르트의생균수는각각 10 7, 10 8 CFU/ ml이상으로정하고있어, 모든시료가성분규격에적합하였다. 따라서저장기간을연장하는데가능성을두고있다. 바. 관능검사 1) 이론적, 실험적접근방법가 ) 콜레스테롤을제거하여나노키토산, 키토산분말을 0.1, 0.3, 0.5, 0.7% 비율로첨가한요구르트는 4 에서 20일동안저장하면서 5일간격으로 appearance, flovor, taste, texture, overall acceptability 등관능적특성을측정하기위해관능검사를실시하였다. 관능검사요원은훈련된관능검사요원 8명을선발하여검사에임하였다. 관능적특성의강도평가는 7점법으로대단히강하다 (7점), 보통 (4점), 대단히약하다 (1점) 로평가하였다

89 2) 연구내용및결과가 ) β-cd를처리한요구르트에나노키토산, 키토산분말을첨가하여제조한요구르트를저장기간에따라비교한관능평가결과를 Table 25에나타내었다. 요구르트는 4 에서 20일동안저장한것을 7점법으로평가하였다. 저장기간 Table 24. Changes of lactic acid bacteria 1) in nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt stored at 4 for 20days 2) Concentraion (%, w/v) of sample Storage period (days) (unit : CFU/ ml ) Control NPC 3) (0.1) NPC(0.3) NPC(0.5) NPC(0.7) PC 4) (0.1) PC(0.3) PC(0.5) PC(0.7) ) Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus mixed starter culture yogurt 2) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample 3) NPC: Nanopowdered chitosan 4) PC: powdered chitosan 중 appearance의실험결과, whey-off는대조군과실험군간에유의적차이가나타나지않았고, color는나노키토산분말에서는유의적차이가나타나지않았지만, 키토산분말의첨가량이 0.7% 일때유의적차이가나타났다. Flavor 에서 fishiness와 rancid는실험군의첨가량에따라증가하는경향을보였지만유의적차이는나타나지않았다. taste에서 sourness는첨가량에따라감소하였고, bitterness, astringency는첨가량에따라증가하였다. Texture 실험결과

90 grainy와 weakness 대조군과유의적차이가없었다. Overall acceptability의경우를살펴보면저장10일까지는대조군과실험군의선호도가유의적차이는없었으나, 저장15일부터대조군과나노키토산, 키토산분말의첨가량이높아질수록전체적인선호도에영향을미쳤다. Table 25. Sensory characteristics for nanopowdered chitosan-added and cholesterol-reduced yogurt stored at 4 for 20 days 1) Concent -rations Stroage (%, v/v) periods of (days) sample Control Appearance Flavor Taste Texture fishi sour whey bitter color -nes rancid -nes -off ness s s over astrin -all grainy weak gency 4.0 a 4.0 a 1.0 b 1.0 a 4.0 a 4.0 abc 4.0 c 4.0 a 4.0 a 4.0 a a 4.0 a 1.3 ab 1.1 a 3.3 ab 3.9 bc 4.1 bc 4.3 a 3.4 a 3.4 a a 4.0 a 1.3 ab 1.0 a 2.9 ab 4.5 abc 5.1 abc 4.5 a 3.4 a 3.3 a NPC 4) a 3.6 a 1.3 ab 1.0 a 2.6 ab 4.8 ab 5.0 abc 4.2 a 3.1 a 3.1 a a 3.6 a 1.3 ab 1.3 a 2.3 b 5.5 a 5.8 a 4.6 a 3.9 a 3.1 a a 3.6 a 1.3 ab 1.3 a 2.8 ab 4.5 abc 4.8 abc 4.1 a 3.3 a 3.8 a PC a 3.1 ab 1.3 ab 1.3 a 3.0 ab 4.5 abc 5.1 abc 4.3 a 3.1 a 3.3 a a 2.9 ab 1.5 ab 1.1 a 3.1 ab 5.1 ab 5.3 ab 4.3 a 4.1 a 3.1 a a 2.1 b 1.8 a 1.0 a 2.1 b 5.1 ab 5.9 a 4.4 a 4.1 a 3.1 a Control 4.0 a 4.0 a 1.0 b 1.0 a 4.0 a 4.0 abc 4.0 d 4.0 a 4.0 ab 4.0 a a 4.0 a 1.3 ab 1.1 a 2.9 a 4.1 abc 4.5 bcd 4.2 a 4.1 ab 4.2 a a 4.0 a 1.3 ab 1.0 a 3.1 a 4.6 ab 4.8 abcd 4.5 a 4.4 ab 3.3 a NPC a 3.6 a 1.3 ab 1.0 a 3.4 a 4.7 ab 4.8 abcd 4.4 a 4.8 ab 3.1 a a 3.6 a 1.8a 1.3 a 3.3 a 4.7 ab 5.3 abc 4.6 a 5.0 a 3.1 a a 3.6 a 1.3 ab 1.3 a 3.6 a 3.4 bc 4.4 cd 4.1 a 4.6 ab 4.1 a PC a 3.0 ab 1.3 ab 1.3 a 2.7 a 3.4 bc 4.3 cd 4.3 a 4.0 ab 3.3 a a 2.9 ab 1.5 ab 1.1 a 2.6 a 5.1 a 5.4 ab 4.3 a 4.0 ab 3.1 a a 2.2 b 1.5 ab 1.0 a 2.6 a 5.1 a 5.6 a 4.4 a 4.8 ab 3.1 a Control 4.0 a 4.0 a 1.0 b 1.0 a 4.0 a 3.6 a 3.7 d 3.7 a 4.0 a 4.1 a a 4.0 a 1.3 ab 1.1 a 4.0 a 3.6 a 4.2 bcd 3.9 a 4.2 a 4.4 a NPC a 4.0 a 1.3 ab 1.0 a 3.5 a 4.0 a 5.0 abcd 4.1 a 4.5 a 3.8 a a 3.6 a 1.3 ab 1.0 a 3.5 a 4.4 a 5.2 abcd 4.4 a 4.5 a 3.5 a a 3.6 a 1.8 a 1.3 a 3.5 a 4.8 a 4.0 cd 4.4 a 4.7 a 3.1 a a 4.0 a 1.3 ab 1.3 a 3.4 a 3.4 a 4.4 bcd 4.1 a 4.2 a 4.1 a a 3.0 ab 1.3 ab 1.3 a 3.6 a 3.1 a 5.4 abc 4.3 a 4.5 a 3.3 a PC a 2.9 ab 1.5 ab 1.1 a 3.6 a 4.0 a 5.6 ab 4.3 a 4.5 a 3.1 a a 2.1 b 1.5 ab 1.0 a 3.1 a 4.8 a 6.3 a 4.4 a 4.7 a 3.1 a Control 4.0 a 4.0 ab 1.0 a 1.0 b 4.7 a 3.3 cd 3.4 d 4.0 a 4.1 a 4.9 a NPC a 4.3 a 1.1 a 1.3 ab 3.7 ab 4.1 bc 4.1 cd 4.1 a 4.2 a 4.3 ab

91 a 3.0 b 1.2 a 1.3 ab 3.6 ab 3.7 bcd 3.9 cd 4.1 a 4.3 a 4.0 ab a 3.2 ab 1.6 a 1.6 ab 3.3 b 4.5 bc 5.2 bc 4.3 a 4.1 a 3.0 bc a 4.0 ab 1.3 a 2.0 a 2.7 b 5.1 ab 6.7 a 4.3 a 4.3 a 2.4 c a 4.3 a 1.0 a 1.0 b 3.2 b 2.7 d 3.5 d 4.0 a 4.0 a 5.4 a PC a 3.6 ab 1.1 a 1.4 ab 2.9 b 4.3 bc 5.1 bc 4.0 a 4.6 a 4.1 ab a 2.9 b 1.1 a 1.7 ab 2.7 b 4.4 bc 5.0 bc 4.3 a 4.1 a 4.3 ab a 1.6 c 1.7 a 1.4 ab 2.6 b 5.9 a 6.0 ab 4.3 a 3.9 a 1.9 c Control 4.0 a 4.0 ab 1.0 a 1.2 b 4.1 a 3.3 c 3.7 c 4.0 a 3.9 a 4.7 a a 4.3 a 1.1 a 1.6 ab 3.5 ab 4.1 bc 3.7 c 4.1 a 4.0 a 4.1 ab NPC a 3.0 b 1.2 a 1.4 ab 3.2 ab 3.7 c 3.9 c 4.1 a 4.1 a 3.8 ab a 3.2 ab 1.6 a 1.6 ab 3.1 b 4.5 ab 4.9 ab 4.3 a 3.8 a 3.8 ab a 4.0 ab 1.3 a 2.0 a 3.1 b 5.1 ab 5.0 ab 4.3 a 4.1 a 2.8 bc a 4.3 a 1.1 a 1.3a b 2.8 b 3.1 c 4.4 bc 4.1 a 3.8 a 4.7 a PC a 3.6 ab 1.1 a 1.4 ab 2.9 b 4.3 bc 4.9 ab 4.0 a 4.4 a 4.0 ab a 2.9 bc 1.1 a 1.7 ab 2.7 b 4.4 bc 4.9 ab 4.3 a 4.1 a 3.7 ab a 1.9 c 1.3 a 1.2 b 2.6 b 5.9 a 5.9 a 4.3 a 3.9 a 1.7 c 1) Mean of eight replicates 2) Means within column by the same letter are not significantly different(p<0.05) 3) Milk used was treated with 1% crosslinked β-cyclodextrin for all sample 4) NPC : Nanopowdered chitosan PC : Powdered chitosan * The scale of appearance, flavor, taste, texture : 1=none, 4=moderate, 7=strong * The scale of overall : 1=dislike very much, 4=neither like, 7=like very much

92 을첨가한화장품제조 가 밀크로션 밀크로션의성분제조비율을 에나타내었다 첨가기초화장품제작비율 밀크로션 구분용도 상품명 용제정제수 방부제 배합한도 킬레이팅제 킬레이팅제 용제정제수 점증제 유분 유분 유화제 유화제 유화제 또는 또는 보습제 컨디셔닝제 컨디셔닝제 컨디셔닝제 또는 용제정제수 중화제 보습제 향 추출물키토산 합계

93 나 스킨로션 스킨로션의성분제조비율을 에나타내었다 첨가기초화장품제작비율 스킨로션 구분용도 상품명 용제정제수 보습제 킬레이팅제 킬레이팅제 용제정제수 점증제 용제 가용화제 또는 방부제 배합한도 향향 용제정제수 조절제 조절제 보습제 추출물키토산 합계

94 다 크림 크림의성분제조비율을 에나타내었다 첨가기초화장품제작비율 크림 구분용도 상품명 용제정제수 방부제 킬레이팅제 킬레이팅제 용제정제수 점증제 유화안정제 유화안정제 유화제 유화제 유화제 또는 또는 보습제 컨디셔닝제 컨디셔닝제 또는 컨디셔닝제 또는 용제정제수 중화제 보습제 향 추출물키토산 합계

95 이첨가된화장품의 시제품 을첨가한화장품의물성측정 가 이론적 실험적접근방법가 스킨로션은그대로사용하고 밀크로션과크림은 배희석하여 한국 로측정하였다 연구내용및결과 가 시제품의 측정결과를 에나타내었다 나 스킨로션은약산성 밀크로션과크림은중성으로측정되었으며 일반고분자 과 사이의차이는없었다 다 현재제작된시제품의 에대한피부자극은없는것으로확인되었다 및 의 측정결과 α α α β β