최종보고서 최종.hwp

Transcription

1 제 출 문 국립환경과학원장 귀하 본 보고서를 수환경에서의 미생물 생태조사 및 수생태계 영향 연구 (I) 용역 결과보고서로 제출합니다 연구기관명 제주대학교 연구책임자 운노타쯔야 연 구 원 김 성 표 박 희 수 Carl Angelo Medriano Dennis Espineli Salcedo 김 유 미 오 경 제 이 채 용 - i -

2 요 약 문 Ⅰ. 연구개요 연구과제명 국문 수환경에서의 미생물 생태조사 및 수생태계 영향 연구 (I) 영문 Study of Freshwater Microbial Community in Relation to the Freshwater Quality (I) 연구기관 제주대학교 연구책임자 소속 성명 연구기간 ( 7 개월) 생명자원대학 운노타쯔야 연구개발비 136,363 천원 참여연구원수 총 8 명 내부 : 2명, 외부 : 6명 Ⅱ. 연구목적 및 필요성 현재 국립환경과학원에서는 국내 하천에서 900 군데 이상의 수질 측정망을 운용 중에 있는 데, 이 숫자는 향후 더욱 증가될 전망이다. 본 연구에서는 수백개의 시료를 동시에 처리할 수 있는 NGS(Next Generation Sequencing)를 이용한 미생물 기반의 수질 측정 방법에 대해 연구 하였다. 현재 국내 수질 모니터링에는 미생물을 이용한 방법이 없는바, 본 연구는 이를 미생 물 기반의 수질 측정이 가능여부를 조사해 보고자 한다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 국립환경과학원에서 지정한 79개 모니터링 지점(19개 주요지점 포함)을 포함한 금강 유역을 연구 대상구역으로 하였다. 기본적인 샘플링 채취 방법은 한달에 한번, 79개 모니터링 지점을 채취하고, 이 중 주요 19개 지점의 경우, 한달에 두 번 채취하여 지점내 미생물 데이터 베이 스(DB)를 구축하였다. 미생물 군집은 계통도와 OTU로 만들어 DB화 하여 분석하였다. 또한 수 질 데이터와 미생물 군집간의 유용성을 연구하기 위해서, 분변성 미생물군집과 구축된 DB와 의 상관관계를 비교 분석하였다. Ⅳ. 연구 결과 본 연구를 통해 총 7개의 MiSeq을 수행하여 6천만 이상의 시퀀스(Sequence)를 확보하였다. 미생물 군집 변화는 예상보다 환경 변화에 의해 다채롭게 나타났으며 현재까지의 분석으론 수질 파라미터인 BOD/COD와 ph 변화에 따른 경향성 파악이 어려운 것으로 판단되었다. 이 와 동시에 본 연구를 통해분변과 하천수 미생물간의 비교를 통한 분변 오염물질 상관성 분석 을 실시하였다. 본 연구의 결과로 하천수 환경내에서 여러 오염물질을 모니터링하기 위한 목 - ii -

3 적으로 미생물 DB 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. Ⅴ. 연구결과 활용에 대한 건의 잘 알려지지 않은 생리적 기능을 이해하기 위한 미생물 군집 DB를 이용하는 방법이 학계내 에서 점점 인기를 끌고 있다. 예를 들어, 인간 미생물군집 프로젝트 경우, 비만/암/당뇨의 인 간 질병과 인간 장내세균과의 관계를 밝히려는 연구가 시도되고 있다. 또한, 미생물에 의한 환경시스템 변화를 이해하려는 지구 미생물 군집 프로젝트도 시작되었다. 본 연구는 하천수의 미생물 군집 DB를 만들어 이를 이용해 보려는 국내의 첫 시도이다. 아직까지는 미생물군집변 화를 이용하여 하천수 수질 변화에 관한 상관인자로 만들 수 있는지는 정확한 답을 주지는 못하나, 향후 지속적인 미생물 군집 변화 연구는 하천 수계내 건강성 지표 인자로 사용 가능 여부에 대한 해답을 줄 것으로 판단된다. - iii -

4 Abstract We examine bacteria-based water quality monitoring method using next generation sequencing that allows hundreds of samples to be analyzed at a time, to examine whether microbes are applicable to be a water quality parameter. Seventy nine sites along the Kuem River were studied for microbial community analyses from May to November, We developed microbial community DB once a month for the 79 sites and twice a month for the 19 important sites defined by National Institute of Environmental Research. Comparison of microbial community was done based on taxonomy and operational taxonomic units distribution. Total 7 MiSeq runs were conducted for this study to obtain more than 60 million sequences. Microbial community shifts were more various than expected, showing no correlation to the environmental parameters such as BOD/COD and ph. On the other hand, we have conducted microbial community comparison between fecal and freshwater microbes to estimate fecal pollution. The results suggest the possibilities of using microbial community DB for various pollution monitoring especially for the freshwater environments. This is the first attempt to build freshwater microbe DB in Korea. The use of microbes as a freshwater monitoring parameter has still been in question. Further researches will provide an answer to the question of whether freshwater microbes can be used as an indicator for the freshwater monitoring. - iv -

5 목 차 제 1 장 서 론 1 제 1 절 연구목표 1 제 2 절 이론적 배경 2 1. 금강 유역 기본 정보 2 2. 금강 유역의 오염원 현황 6 3. 담수 수질 모니터링 9 4. Next Generation Sequencing과 담수 수질 모니터링 9 5. 최상의 NGS-based 미생물 군집 분석 방법 탐구 미생물군집 분석을 통한 수질 감시 12 제 2 장 연구내용 및 방법 13 제 1 절 연구내용 담수 미생물 군집 분석을 위한 적절한 protocol의 개발 금강미생물 Sequencing DB 구축 수생태계조사자료-미생물생태 조사 분변오염원 추적기술 이용한 분변오염도 조사 14 제 2 절 연구방법 금강 유역 시료 채취 분석 방법 20 제 3 장 연구 결과 및 고찰 24 제 1 절 금강 수질 변동성분석 BOD TP TN 25 제 2 절 Sequence DB 구축 27 제 3 절 미생물 생태 분석 32 제 4 절 수질조사 자료 - 미생물 생태 기초자료분석 38 - v -

6 2. 정준상관분석(Canonical correlation analysis)을 통한 연관성 분석 분석 결과 한계점 및 보완방향 49 제 5 절 수생태계조사 자료 - 미생물 생태 50 제 4 장 결론 57 제 5 장 활용방안 58 제 1 절 담수모니터링 시스템 개발을 기반한 미생물 군집 58 제 2 절 지속형 장기모니터링 시스템의 활용 59 제 3 절 Fecal Source Tracking Tool의 활용 60 제 6 장 참고 문헌 61 제 7 장 부록 64 - vi -

7 표 목 차 Table 1-1. 금강 수계 주요 하천 현황 3 Table 1-2. 금강수계 내 주요댐 및 저수지 4 Table 1-3. 생활계 오염원 현황(인구수) 6 Table 1-4. 행정구역별 축산 현황 7 Table 1-5. 행정구역별 산업체 페수발생 현황 7 Table 1-6. 행정구역별 양식장 현황 7 Table 1-7. 행정구역별 토지이용 현황 8 Table 1-8. 매립시설 현황 8 Table 1-9. 두 종류의 NGS 시스템 형식 비교 12 Table 2-1. 지역별 시료채취 지점 17 Table 개 지역의 BOD, COD, TN, TP의 상관관계 분석 26 Table 3-2. 본 연구에서 얻은 시퀀스 수 (red indicates less than 1000 ) 27 Table 월 금강의 수질측정 38 Table 월 금강의 수질지표 유의성 40 Table 3-5. Phylum 수준에서의 존재하는 평균 미생물 수 41 Table 3-6. OTU의 Phylum 수준에서 평균 및 표준편차 41 Table 3-7. 정준변수 쌍의 상관관계 44 Table 3-8. 수질지표와 정준변수(수질자료) 간 상관계수 45 Table 3-9. Phylum 수준과 정준변수(OTU자료) 간 상관계수 46 Table 정준변수분석을 통한 샘플링 사이트 간 상관관계 49 Table 분변미생물 유전자 Amova test 51 Table 동물별 특정 분변미생물 종 53 Table 특정 동물 분변미생물 검출 가능성 확인을 위한 테스트 결과 53 Table 주요 19개 지점의 7월 미생물 데이터 55 Table MST 분석 결과와 NIER의 생태학적 평가 비교 56 Table 7-1. Raw data의 Sequence 수와 Processing후 sequecne 수(Trimmed), qpcr(copy수) 결과 64 Table 7-2. 오염원인 추적 분석 88 Table 7-3. Shared-OTU를 이용한 분변오염원인 분석 94 - vii -

8 그 림 목 차 Fig 오염원의 분류 6 Fig 금강 인근의 비점오염원에 의한 분변오염 분포 15 Fig 금강 수계 시료채취 지점 18 Fig 시료의 전처리 및 배송방법 19 Fig Miseq 시퀀싱을 위한 전체적인 실험과정 21 Fig 개 조사 지점별 BOD 비교 분석 24 Fig 개 조사 지점별 TP 비교 분석 25 Fig 개 조사 지점별 TN 비교 분석 26 Fig 표본 성향 분석 32 Fig 금강수계 주요 19지점 33 Fig 월 19개 주요지점의 Phylum 분포 34 Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 34 Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 35 Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 36 Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 36 Fig 수질지표 상관관계 39 Fig Phylum 수준에서 미생물들의 상관계수 42 Fig 정준변수 쌍의 상관관계 44 Fig 수질지표와 Phylum 수준에서의 미생물과의 상관관계 47 Fig 정준변수분석을 통한 샘플링 사이트 간 상관관계 48 Fig 분변미생물생태 분석 51 Fig 동물 특정미생물을 응용한 분변오염원 추적 52 Fig 분변과 강물 간 미생물생태 차이 52 Fig 년 1-9월에 금강 중요지점의 총 대장균수와 지도 54 Fig NGS 결과를 기반으로 한 수질모니터링 모식도 58 Fig Sequencing 기술의 발달사 59 Fig NGS 기반의 분변미생물 오염원 추적 60 Fig 개 주요지점의 Phylum 분포 82 Fig 개 주요지점의 Family 분포 85 - viii -

9 제 1 장 서 론 제 1 절 연구목표 최근 들어 4대강을 위시하여, 하천 수질관리의 중요성이 부각됨에 따라 다양한 수질관리 모 니터링 및 기법들이 제안되고 있다. 특히 2007년부터는 하천에서의 수생태계 건강성을 평가하 고 있으나, 수생태계 구성요소간의 상호 관계 해석은 여전히 미흡한 실정이다. 미생물은 수생 태계의 가장 하층을 담당하는 요소로 수생태의 근간을 구성하고 있으며, 분해자의 역할을 수 행하고 있어 미생물 생태계의 이해는 전체 수생태계를 이해하는 하나의 시발점이 될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나, 국내 하천의 미생물 생태에 대한 이해도와 DB 구축에 대한 기본적 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본연구의 목표는 국내 하천내의 미생물 생태계 DB 구축 및 이를 활용한 오염원 추적 기법을 제시 하는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 세부 연구 계획 이 수립 되었다. 담수 미생물 군집 분석을 위한 적절한 protocol의 개발 금강미생물 Sequencing DB 구축 수생태계조사자료-미생물생태 조사 분변오염원 추적기술 이용한 분변오염도 조사 - 1 -

10 제 2 절. 이론적 배경 1. 금강 유역 기본 정보 가. 금강유역의 일반 현황 금강 유역은 동경 ~ , 북위 ~ 사 이인 한반도 중서부에 위치하며, 충청남 북도의 약 절반과 전라북도의 약 1/4 정도를 차지하 고, 경상남 북도의 일부와 경기도 일부를 포함하고 있는 우리나라 제 3의 유역으로서, 유역 면적은 9,914.01km 이고, 유로연장은 km이며 유역 둘레는 km, 유역평균폭은 25.52km이다. 금강유역의 북쪽은 차령산맥을 끼고 우리나라에서 제일 큰 한강유역과 접해 있으며, 동쪽 은 소백산맥을 경계로 낙동강유역과 접하고, 남쪽은 섬진강 및 만경강 유역과 서쪽으로는 서 해와 접해 있다. 또한 금강유역의 북서쪽에는 안성천 삽교천 유역과 접하고 있다. 금강은 소백산맥 고봉중의 하나인 전라북도 장수군 장수읍 수분리 신무산에서 발원하여 북쪽으로 흐르다가 장수, 무주, 영동 부근의 산지부를 거쳐 옥천 부근에서 노령산맥을 관입 대청댐 수몰지점에 이르기까지 아주 심한 사행을 이루고, 주요 지류인 무주 남대천, 영동천, 초강, 보청천 등이 우안측으로 유입 합류된다. 보청천 합류후 부터는 북서로 사행하면서 소옥 천, 회인천, 주원천, 품곡천 등과 차례로 합류한 후 대청댐을 지나며, 이후 잠시 남서류하면서 역조정지댐을 지나, 신탄진 부근에서 갑천과 합류된 후 유향은 다시 북서류한다. 부강을 조금 지나서 미호천 합류 후 남서류 하면서 공주 부여 등 백제의 고도( 古 都 )에 이르러 유향은 다시 남동쪽으로 크게 바뀌어 강경까지 유하하여 논산천 합류 후 다시 남서쪽으로 유향을 바꾸어 좌안측으로 전라북도 군산시 성산면 성덕리와 우안측으로 충청남도 서천군 마서면 도삼리를 잇는 금강 하구둑을 거쳐 서해로 유입된다. 나. 수계의 구성 금강수계의 하천은 국가하천 7개소 km 이며, 지방하천 461개소 3,264.31km로 총 468 개소 3,745.81km에 달한다. 국가하천 구간이 km로 전체 하천연장의 12.85%를 차지하며, 자방하천이 3,264.31km로 전체 하천연장의 87.15%를 차지하고 있어 대부분 하천연장은 지방 하천이 차지하고 있는 것으로 나타났다

11 Table 1-1. 금강 수계 주요 하천 현황 하천명 유로연장 (km) 유역면적 (km 2 ) 등급별 하천연장(km) 국가 지방 금강 , 무주남대천 영동천 초강 보청천 소옥천 회인천 주원천 품곡천 갑천 유등천 대전천 미호천 , 백곡천 보강천 무심천 조천 유구천 지천 금천 석성천 논산천 노성천 강경천 마산천 어량천 길산천

12 다. 주요 시설물 현황 (1) 다목적댐 현황 금강수계내 주요댐으로는 다목적댐인 대청댐과 용담댐이 있으며, 대규모 농업용 저수지로 는 백곡천의 백곡지, 미호천의 미호지, 논산천의 탑정지 등이 있다 (Table 1-2). Table 1-2. 금강수계 내 주요댐 및 저수지 구분 다목적댐 농업용저수지 대청댐 용담댐 백곡지 미호지 탑정지 준공 년도 관할 기관 수자원 공사 수자원 공사 농촌공사 진천지사 농촌공사 논산지사 농촌공사 논산지사 (가) 대청댐 대청댐은 4대강유역 종합개발계획의 일환으로 건설된 다목적댐으로 금강 하구로부터 약 150km 상류, 대전시 동북방 16km 지점에 축조된 콘크리트 중력식과 사력댐의 복합댐이다. 대 청댐의 유역면적은 금강유역의 총 43.25%인 4,189km2이고, 만수면적은 72.8km2, 유효저수량은 790백만m 3 이며, 홍수조절용량은 250백만m 3 이다. (나) 용담댐 용담댐은 2021년 전주, 군산, 익산, 장항 지역의 장래 용수수요의 안정적인 공급을 위해 1992년 착공하여 2001년 완공된 다목적댐으로, 대청댐으로부터 190km, 금강하구둑에서 340km 상류지역에 위치하고 있다. 유역면적은 km2으로 금강 전체 면적의 9.37%를 대청댐 유역 의 22.17%를 차지하고 있다. (다) 금강하구둑 현황 금강하구둑은 대단위 농업종합개발사업의 일환으로 금강, 동진강, 만경강 하류연안의 농 경지에 용수를 공급하고, 군산, 익산, 전주시를 비롯한 인근 소도시에 생공용수를 공급하기 위 하여 금강하구(군산상류 5km 지점) 지점에 1983년 11월에 착공하여 1990년 11월에 준공되었 다. 금강하구둑의 건설로 인해 약 138백만m3규모의 담수호가 조성되었으며, 인근농경지 43,000ha에 대해 농업용수를 공급하고, 충남 및 전북 인근도시에 생활, 공업용수를 공급하였 으나 현재는 농 공업용수로만 사용되고 있다

13 (3) 배수펌프장 현황 배수펌프장은 저지대 내수배제 불량에 의한 침수피해를 방지하기 위한 시설로서 금강유 역내 배수펌프장은 2004년 12월을 기준으로 총 159개의 펌프장이 있으며, 이중 122개소가 한 국 농어촌공사에서 관리하는 배수펌프장이며, 지자체에서 관리하는 곳은 36개소, 기타 1개소 이다. (4) 비점오염원 저감시설 (가) 충남 서천군 장항농공단지(장치형) 농공단지에서 배출되는 비점오염물질을 처리할 경우 처리시설의 설치효과가 비교적 높 을 것으로 기대되는 지역이다. 상류부부터 우수박스로 유입되어 금강하구로 배출되는 지역으 로 주변에 농공단지 폐수처리장이 위치한다. (나) 충남 논산시 연무읍 양지리(장치형+인공습지) 오염부하가 큰 지역으로 배수구역 대부분이 축산 밀집이역으로 이루어져 있다. 상류부에 는 콘크리트 수로(폭 2.0m)로 형성되어 있다가 축산폐수공동처리장을 지나면서 자연수로로 형 성한다. (다) 충남 공주시 우성면 상서리(인공습지) 인근 논, 밭으로부터 유입되는 비점오염원을 달뿌리풀, 물억새, 애기부들, 갈대, 줄, 미나 리, 연꽃 등의 수생식물을 활용하여 다단계의 처리과정을 거쳐 금강수계의 수질정화를 도모한 다. (라) 충남 공주 탄천면 남산리(인공습지) 인근 논과 양계장에 의한 비점오염원을 저감시키는 시설로서 갯버들, 달뿌리풀, 갈대, 미 나리, 연꽃 등의 수질정화식물등을 활용한다. 정자, 관찰데크, 목책, 안내판, 통나무 등을 설치 하여 주민친수공간으로 활용 하도록 하였다

14 2. 금강 유역의 오염원 현황 가. 오염원 분류 오염부하는 발생된 각종 오염원의 하천 또는 호소에 유출되는 오염물질로서, 오염원은 크 게 점오염원과 비점오염원으로 구분할 수 있다 (Fig. 1-1). Fig 오염원의 분류 (1) 생활계 오염원 현황 금강유역의 행정구역별 인구현황은 각 시군의 오염총량관리계획 보고서 및 전국오염원 조사자료와 행정구역별 면적 편입율 자료를 참고하였으며, 하수처리인구 및 하수미처리인구로 구분하였다. 전체 인구수는 3,511,364명이며 이중 하수처리인구는 2,801,177명으로 전체 인구 의 약 80%를 차지하여 하수미처리 인구수는 710,187명이다 (Table 1-3). Table 1-3. 생활계 오염원 현황(인구수) 하수처리인구(인) 하수미처리인구(인) 합계 합류식 분류식 합계 오수처리 단독정화 수거식 합계 2,801,177 1,464,638 2,801, , , , ,187 3,511,364 (2) 축산계 오염원 현황 금강유역의 행정구역별 축산현황은 각 시군의 오염총량관리계획 보고서 및 전국오염원 조사자료와 행정구역별 면적 편입율 자료를 참고하였으며, 축종별로 구분하였다. 가장 많은 비율을 차지하는 것은 가금으로 전체 축종에서 약 95%를 차지하고 있다 (Table 1-4)

15 Table 1-4. 행정구역별 축산 현황 사육두수 : 마리 한우 젖소 말 돼지 산양사슴 가금 합 계 166,961 49, ,406 40,483 20,655,483 21,740,356 (3) 산업 현황 금강유역의 행정구역별 산업현황은 각 시군의 오염총량관리계획 보고서 및 전국오염원 조사자료를 참고하였으며, 도청 및 광역시청에서 관할하는 1종 및 2종 사업장과 시 군에서 관 할하는 3 ~ 5종 사업장으로 구분하였다. 전체 산업체의 폐수발생량중 1종 사업장에서 발생하 는 하루폐수발생량이 약 52%로 가장 많은 비중을 차지하였으며 5종 19.8%, 2종 13.7%, 3종 9.7%, 4종 4.6% 순으로 확인되었다 (Table 1-5). Table 1-5. 행정구역별 산업체 페수발생 현황 산업체 폐수발생량(m 3 /day) 1종 2종 3종 4종 5종 합 계 합 계 217,103 57,127 40,441 19,302 82, ,166 21,740,356 (4) 양식 현황 금강유역의 행정구역별 양식현황은 각 시군의 오염총량관리계획 보고서 및 전국오염원 조사자료와 행정구역별 면적 편입율 자료를 참고하였다. 충청남도와 전라북도의 양식장 면적 이 각각 44.9%, 42.6%로 다른 지역보다 비교적 많은 양을 차지하였다 (Table 1-6). Table 1-6. 행정구역별 양식장 현황 시설면적(m 2 ) 경상북도 전라북도 충청북도 충청남도 대전광역시 합 계 합 계 24, ,571 68, , ,652 21,740,356 (5) 토지이용 현황 금강유역의 행정구역별 토지이용 현황은 각 시군의 오염총량관리계획 보고서 및 전국 오 염원조사자료와 행정구역별 면적 편입율 자료를 참고하여 작성하였다. 금강유역에서 사용되는 토지의 비율은 임야가 61.4%로 가장 높게 나왔으며 답 19.7%, 전 8.5%, 대지 5.7%, 기타 4.7% - 7 -

16 로 확인되었다 (Table 1-7). Table 1-7. 행정구역별 토지이용 현황 단위 : km 2 전 답 임야 대지 기타 합 계 합 계 , , , ,740,356 (6) 매립시설 현황 유역내 매립시설은 20개소가 운영 중이며 발생되는 침출수는 대부분 인근 하수종말처리 장으로 연계 처리되는 것으로 조사되었다 (Table 1-8). Table 1-8. 매립시설 현황 시설명 위치 발생유량 (m 3 /일) 용정 매립장 청충북도 청주시 상당구 용정동 40.8 청주광역 매립장 충청북도 청원군 강내면 190 문암 매립장 충청북도 청주시 흥덕구 문암동 243 영동쓰레기매립장 충청북도 영동군 영동읍 19 옥천군북쓰레기매립장 충청북도 옥천군 군북면 16 연기 남면 매립장 충청남도 연기군 남면 14 공주시 위생매립장 충청남도 공주시 금학동 140 부여군 위생매립장 충청남도 부여군 남면 46 논산시 매립장 침출수처리시설 충청남도 논산시 은진면 24 왕덕 매집장 침출수 처리시설 충청남도 논산시 부적면 3.9 금산군 매립장 충청남도 군산군 추부면 35 용안 매립장 전라북도 익산시 용안면 100 부송 매립장 전라북도 익산시 부송면 40 금강 매립장 전라북도 익산시 금강동 30 폐기물 매립장 전라북도 군산시 미성동 400 진안(구룡) 매립장 전라북도 진안군 진안읍 1,472 무주군 폐기물종합처리장 전라북도 무주군 적상면 19 금고 매립장 대전시 유성구 구즉동 582 신대 매립장 대전시 대덕구 회덕동 80 상서 매립장 대전시 대덕구 덕암동

17 3. 담수 수질 모니터링 강물은 식수원, 교통/수송로, 오폐물의 바다로 방출, 레저용 등 다양한 목적으로 이용되며, 따라서 수환경은 반드시 오염으로부터 보호될 수 있게 감시되어야 한다. 현재 수질 모니터링 의 주요 방법은 ph, BOD/COD, TP, TN 등 이화학적 측정값 이용에 의존하고 있다. 또한 담수 환경에 존재하는 물고기나 가재의 생태 조사 역시 수질 건강성 파악에 유용하게 이용된다. 하 지만 물고기나 척추동물들의 생태 조사는 많은 시간이 걸리고, 또한 해당 생물들을 채집하고 그들을 분류하는데 기술과 경험을 요하게 된다. 현재로서는 그러한 생태조사에 대해 대안이 없어 보이며, 따라서 물리 수치를 측정하는 전통적인 방법이 여전히 수십 년간 이용되고 있 다. 최근 낙동강에서 수천 마리의 물고기가 갑작스레 떼죽음을 당하였지만 해당 사건의 원인은 명확하게 밝혀지지 않고 여전히 의문으로 남아있다. 강물의 이화학적 수치나 죽은 물고기의 조직을 분석하였지만 어떤 비정상적인 부분도 찾아내지 못하였다. 이 사건으로부터 우리는 현 재 수질 감시 방법의 두 가지 문제점을 생각해 볼 수 있다. 가. 수질의 물리 수치는 오염을 감시하는데 있어 충분히 민감하지 않을 수 있다. 나. 물고기/가재의 생태 조사에 근거한 수질 평가는 많은 시간과 노동을 요하는 특성상 담수의 실시간 조사를 수행하는데 실패하게 된다. 그러한 이유들을 근거로, 시간과 노동을 절약할 수 있고 보다 더 정확한 수질 지표를 이용한 대안적 방법의 개발이 요구된다. 4. Next Generation Sequencing과 담수 수질 모니터링 차세대염기서열분석기법 (Next Generation Sequencing, NGS)이 개발된 이후로, 미생물 군집 분석에 근거한 PCR 증폭산물을 비롯한 많은 방법들이 다양한 연구 분야에 응용되어지고 있 다. 비만 메커니즘은 장내 미생물의 구성 변화로 설명되어질 수 있고(Ley et al. 2005), 간의 질병과 당뇨병의 치료 가능성 역시 장내 미생물 군집의 변화에서 제안할 수 있다(Myers et al. 2003). NGS가 가져온 이점들은 환경 연구 분야에서도 예외가 되지 않는다. 2010년에 광주 과학기술원 (허호길교수 연구실)에서 처음으로 pyrosequencing 기법을 이용한 미생물 오염 추 적 연구를 제안했고(Unno et al. 2010), 담수 미생물 군집 분석이 중금속 오염 감시에 이용되 어질 수 있다(Rastogi et al. 2011). 온도, ph, 지속시간(Lindstrom et al. 2005), 녹조 현상 (Eilersen et al. 2004), 토지이용 유형(Staley et al. 2013) 들은 담수 미생물 군집에 현저한 연 관성을 보이며, 이것은 담수 내의 미생물 군집 감시가 수질 감시 방법에 새로운 지표가 될 수 있음을 의미한다. 담수 수질 지표로써 NGS-based 미생물 군집 분석의 이용은 다음과 같은 3가지 이점들을 - 9 -

18 갖는다. 가. 높은 데이터 처리량 (어떤 다른 수치들보다 더 정밀한 데이터가 얻어질 수 있다.) 나. 쉽게 수행 가능하다. (물고기/척추동물의 개수 방법과 비교했을 때, 해당 방법은 단순히 물 시료의 채취와 DNA 추출 과정 정도를 요한다.) 다. 숙련된 기술을 요구하지 않는다. (DNA 추출과 PCR은 자동화될 수 있다.) 반면에, 3가지 결점이 있다. 가. 표준 프로토콜이나 규정된 기준이 없다. 나. 민감성 정도를 알 수 없다. (하나의 지표에 너무 민감하게 나타내어질 수 있다.) 다. 결과를 정량화 하는데 어려움이 있다. (NGS-based 미생물 군집 분석은 PCR 과정을 거친 후 수행된다고 알려져 있다.) 따라서, 현재로서는 미생물 군집 분석을 수질 감시에 응용하기에는 부적절하며, 상기의 결 점들을 해결하기 위해 우선적으로 해당 환경에 따라 어떤 종류의 미생물이 담수 시스템에 존 재하는지 미생물 군집 변화를 이해할 필요가 있다. 이러한 과정을 모두 거친 후, 수질 감시를 위한 적절한 NGS-based의 방법들을 개발할 수 있을 것이다. 5. 최상의 NGS-based 미생물 군집 분석 방법 탐구 십여년 전, National Institute of Health (NIH, US)는 Human Microbiome Project라고 불리는 연구 과제를 지원하였다(Turnbaugh et al. 2007). 연구를 통해, 사람의 많은 알려지지 않은 생 리학적 기능들이 장내 미생물군 (미생물 유전학)을 분석함으로써 설명되어질 수 있었다. 해당 연구는 비만의 기작(Ley et al. 2006), 간의 질병(Mattner et al. 2008), 당뇨병 기작들(Petrovsky 2010)이 장내 미생물들의 기능성 유전자들과 밀접히 관련이 있다고 보고하였다. 해당 연구 과 제로부터 많은 성공적인 연구 결과들이 쏟아져 나오는 와중에, 새롭지만 같은 접근 방법을 시 도한 Earth Microbiome Project (EMP) (Gilbert et al. 2010)라고 불리는 연구과제 또한 진행되 었다. EMP는 미생물 유전체에서 보여지는 변화를 분석함으로써 많은 알려지지 않은 자연적/ 환경적 물리 현상들을 이해하는 것이 목적이며, 환경미생물학, 생물정보학, 수문학 등의 분야 에서 선도적인 위치의 많은 과학자들에 의해 EMP가 시작되었다. 지리학적이고 일시적인 차이 점들을 고려하여 매우 다양한 시료들을 분석하여야 하기 때문에 환경 시료를 분석하는 것은 사람의 장내 미생물을 연구하는 것과는 매우 다르다. EMP에서는 실험적 오차를 줄이기 위해 서 DNA 추출과 NGS 프로토콜의 기준을 규정하였다. 비록 많은 연구자들이 미생물 군집 분석 을 위해 pyrosequencing을 이용하지만 EMP에서는 Illumina 염기서열분석장비 (HiSeq과 MiSeq)

19 의 사용을 제안하였다. pyrosequencing에 비해 Illumina가 가지는 강점은 분석 가능한 염기서 열의 전체 양이다. 같은 비용으로 pyrosequencing은 100만 DNA 절편들을 분석 가능하지만 Illumina는 10억개 이상을 분석할 수 있다. 반면에 Illumina는 한번에 오직 bp 정도의 DNA 서열을 결정할 수 있지만 pyrosequencing은 500bp 까지 가능하다 (가장 최신 버전은 750bp까지 가능하다.). Huse 연구팀은 in-silico simulation에 근거해 16S rrna의 짧은 절편만 으로도 미생물 군집 분석을 수행할 수 있다고 보고 하였다(Huse et al. 2012). 2011년에 Degnan et al.(degnan and Ochman 2012)은 Illumina 분석장비를 통해 16S rrna의 v6 hyper variable 부분 (60bp)을 분석하여 미생물 군집 구조를 연구하였다. v6 부분은 미생물 군집 분 석을 위해 많은 연구자들, 특히 Sogin이 이끄는 연구 그룹들에서 널리 응용되어지고 있다 (Eren et al. 2013). 하지만 미생물 군집 분석 분야의 또다른 선도적인 그룹인 Knight연구실은 Illumina 기기에 의해 생성되는 많은 인공적 염기서열들을 보고하였고, 염기서열들의 역치를 지정하는 것이 오류를 줄일 수 있는 방법이라고 제안하였다(Kuczynski et al. 2012). 다시 말해 서, Illumina를 이용한 V6의 분석은 오직 염기서열 역치에 cutoff를 설정해야만 작동하는데, 불 행하게도 공통적으로 모든 상황에 통용되는 cutoff가 없다는 것이 문제이다. 이상적인 cutoff 수치를 그려내기 위해 가상의 군집을 설정해야하고, 그러한 cutoff 수치는 시료의 상태에 따 라서 매우 다양해 질 수 있다. 따라서 Illumina 분석장비를 이용한 v6 부분의 분석은 pyrosequencing 방법보다 비용적인 면에서는 좋지만 정확성이 결여되어 있다(Zhou, Li et al. 2011). 또한, Caporaso et al.(caporaso et al. 2012)이 가상의 시료들에 있는 분류군을 정의하 는데 v4 hyper variable 부분에 기초한 미생물 군집 분석을 보고하였다. 하지만 v4 부분의 길 이는 Illumina가 분석할 수 있는 길이보다 좀 더 길어서(primer를 포함하여 350bp), 몇몇은 다 시 v4 부분에 집중을 하면서 pyrosequencing을 다시 이용하였다 (v1-3 부분의 길이가 약 500bp 이고 더욱 긴 서열이 더 높은 정확도를 의미한다고 생각하기 때문에, 일반적으로 v1-3 이 분석에 이용된다.). 2011년에 Caporaso et al.(walters et al. 2011)이 v4 부분을 타겟팅하는 Illumina 분석장비 HiSeq과 MiSeq의 이용을 보고하였다. 현재 HiSeq은 200bp 염기서열 길이까 지만 읽을 수 있고 v4 부분의 모든 길이를 커버할 수 없다. 하지만 v4 부분의 끝지점만 읽는 것이 v4 전체를 읽는 것과 정확도 면에서 큰 차이가 없다고 보고 되었다. 게다가, 현재 MiSeq 은 250x2bp (양방향으로 250bp, 따라서 500bp)까지 읽을 수 있고, 단지 총 결과가 HiSeq에 비 해 적을 뿐, pyrosequencing에 비해서는 훨씬 많다. 더불어 MiSeq의 한 번 분석은 단지 몇일 만 걸리는데 HiSeq의 구동에는 몇주가 소요된다. 결론적으로, MiSeq은 v4의 모든 부분을 분석 할 수 있고 분석에 몇 일만 소모되며, 과거 수년 동안 미생물 군집 분석에 이용되어진 pyrosequencing에 비해 더 많은 서열을 한번에 분석할 수 있는 능력이 있다 (Table 1-9)

20 Table 1-9. 두 종류의 NGS 시스템 형식 비교 454 (Titanium) Illumina (HiSeq 2000) # of sequences 700,000 1,500,000,000 Read length 450 bp 200 bp Consensus Accuracy 99.99% >80% 6. 미생물군집 분석을 통한 수질 감시 단지 물을 채취하고 분석 결과를 보여주는 컴퓨터 화면을 바라보는 것만으로 수질을 평가 할 수 있다면 그것이 가장 이상적일 것이다. 하지만 NGS-based 방법은 아직 수질 감시에 응 용되기에 준비가 되어있지 않다. 위에서 언급한 바와 마찬가지로, 어떤 NGS 플랫폼을 이용할 것인지, 어떤 환경 조건에 어떤 미생물 타입이 존재하는지에 대한 기본적 지식, 그리고 다른 종류의 오염물이 유입되었을 때 그들이 어떻게 변화하는지에 대한 방법론을 가질 필요가 있 다. MiSeq-based 방법이 가장 빠르고 미생물 군집 분석에 대해 만족할 만한 결과물의 양을 제공한다. 따라서 본 연구실에서는 MiSeq을 사용하여 세균과 고세균의 16S rrna 유전자의 v4 부분의 염기서열을 분석할 것이다. 매달 미생물 군집 조사를 실시하고 미생물 군집 DB 역시 구축 후, BOD/COD, TP, TN, ph와 같은 담수의 물리 수치와 비교분석하여 매우 다양한 환경 요인들에 미생물들이 어떻게 반응하는지 이해할 수 있게 될 것이라 기대한다

21 제 2 장 연구내용 및 방법 제 1 절 연구내용 1. 담수 미생물 군집 분석을 위한 적절한 protocol의 개발 본 연구에서 금강 유역의 시료를 채취하여 MiSeq 염기서열분석 기반의 미생물 군집 DB를 구축할 것이다. 해당 DB는 지리학적 변화, 토지이용 유형, 계절적 변화, BOD, ph와 같은 수 질인자에 따라 어떻게 미생물 군집이 변화하는지에 대한 기본 지식을 제공할 것이다. 상기의 연구목표를 이루기 위해 다음 항목들을 수행할 필요가 있다. 현재 다양한 protocol들이 환경 미생물 군집 분석을 위해 이용되고 있다. 본 연구에서는 DNA extraction, PCR, 염기서열 분석 에 대해서 Earth Microbiome Project(Gilbert et al. 2010)를 참조할 예정이다. 본 연구에서는 주기적 수질 감시를 위한 NGS-based 미생물 군집 분석 방법의 이용을 목적으로 한다. 따라서 염기서열분석 과정은 체계화될 필요가 있다. 79개씩의 샘플을 매달 2번씩 7달 동안 샘플링을 실시할 예정이며, 따라서 빠르고 정확한 처리 알고리즘을 보유할 필요가 있다. 다양한 Bioinformatics를 이용하면 해당 미생물 군집을 타 군집과 쉽게 비교할 수 있을 것이다. 반면 에 환경 요인과 미생물 군집 간의 연관성에 대한 연구는 많지 않다. 미생물 군집이 어떻게 환 경 요인들에 의해 영향을 받는지 이해하기 위해서 수질과 미생물 군집을 평가할 수 있는 적 절한 통계 툴이 필요하다. 새로운 시도임을 감안하여 우선적으로 regression analysis, t-test, chi-square test 같은 간단한 통계적 기법을 활용하고자 한다. 2. 금강미생물 Sequencing DB 구축 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information)는 거대한 시퀀 스데이터베이스와 다양한 분야의 연구자들이 분석방법으로 활용하고 있는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 제공한다. 본 연구에서는 광대한 미생물의 16S rrna 유전자 시퀀스 를 포함한 데이터베이스를 구축한다. 시퀀싱 데이터를 공개하여 다른 연구자들이 사용할 수 있도록 하는 목적이 명확하지 않을 수도 있다. 그러나 강물 미생물 생태조사를 시작으로 많은 연구자들이 환경을 보호할 수 있는 미생물생태모델과 다양한 기술들을 개발하는데 활용하는 등으로 의의가 있을 것이라고 생각한다. 전 세계에 있는 모든 환경 미생물의 16S rrna와 메 타게놈 샘플들의 시퀀스를 포함하는 하나의 데이터베이스를 구축하는 Earth Microbiome Project(EMP : 국제적 과제로 진행되고 있다. EMP는 환경

22 적인 분석을 위한 요소들로써 미생물 유전자를 사용하는 것을 포함하는 목표를 가지고 있다. 환경에서 생리적인 기능(탄소 순환, 오염에 의한 자연파괴, 천연 독성화학 물질의 생산 등)에 관해서 많은 부분들이 우리의 생각에서 벗어나는 경우가 많다. 최근, 인간 미생물유전체 프로 젝트(HMP, Human Microbiome Project)에서 당뇨와 암과 같은 질병으로부터 보호하는 인간 미 생물유전체를 발견하였다. 환경에 존재하는 미생물은 인간 체내에 비해 많이 존재하고 있다. EMP에서는 그러한 환경미생물들을 분류하고 기능적인 측면에서 밝히고자 한다. 미생물과 환 경적 현상의 상관관계를 규명하기 위해서 각 나라마다 200,000 샘플을 조사 할 것이라고 발표 를 하였는데, 이는 많은 시간과 시퀀싱 등의 노력이 필요하다. 본 연구에서는 다양한 분야의 연구자들이 시퀀스 데이터베이스를 사용 할 수 있도록 구축 할 것이다. 금강 샘플링은 수직측 정망 운영지점 중 79개를 선정하여 한 달에 두 번 실시하였다(주요지점인 19개의 사이트는 매월 중순에 실시). 샘플을 처리하는 과정에서 기술적인 문제가 발견되었다. 그것은 시퀀싱을 한번 했을 때 100개 샘플에서의 16S rrna 유전자보다 많은 시퀀스를 포함한 약 3.5 GB의 데 이터를 얻었는데, 이렇게 샘플링 지점에서 얻은 거대한 양의 시퀀스 정보를 사용할 수 있도록 하는 고급 웹 서버와 오랜 시간동안 다운로드를 할 수 있는 인터넷 인프라가 필요하다는 것 이다. 따라서, NGS에 의해 생성된 데이터는 SRA(Short Read Archives; i.nlm.nih.gov/sra)시스템을 이용하여 공개되어 질 것이다. 본 연구에서 얻은 데이터는 한국에서 금강 환경을 연구하는데 유용하게 사용 될 뿐만 아니라 SRA에 업로드 되어 EMP와 같은 국제 적 프로젝트 및 연관된 많은 연구에 기여 할 것이다. 3. 수생태계조사자료-미생물생태 조사 본 연구에서는 수생태계조사 자료와 미생물 생태의 연관성을 연구하였다. 수생태 조사는 국 립환경과학원에서 제공하는 수질측정망의 19개 지점의 7개 수질 파라미터 (BOD, COD, TN, TP, SS, DO, Temperature)를 기본으로 하였다. 이와 Miseq 데이터의 상호 연관성을 분석하였 다. 4. 분변오염원 추적기술을 이용한 분변오염도 조사 수질의 변화는 수질 오염과 기온의 변화, 퇴적물, 병원성미생물(pathogens), 영양물질 (nutrients), 중금속, 용존산소, ph, 농약 또는 유기 화학 물질 등에 의해 발생한다. 또한, 분변 에 의한 미생물 오염인 경우 수질을 악화시킬 뿐 아니라 식수, 해조류 양식 용수, 생활용수, 여가 목적으로 사용하는 것을 제한하는 등 많은 문제가 생긴다. 일반적인 분변 오염원의 예로 빗물에 의한 폐수의 유출, combined sewage overflows (CSOs) 또는 농지에서 유입, 야생 동물

23 에 의한 분변 오염 등을 생각할 수 있다. 비점오염원에 의한 분변 오염은 일반적으로 지속적이고 환경적 재정적으로 많은 문제를 일으킨다. 금강 인근의 비점오염에 의한 분변오염 분포는 다음과 같다(Fig. 2-1) Fig 금강 인근의 비점오염원에 의한 분변오염 분포 세계 보건기구에 따르면 fecal coliform bacteria 등 원래 하천에 존재하지 않는 미생물의 혼입 이 수인성전염병의 대표적인 패턴이며 분변 오염 된 물을 섭취함으로써 연간 무려 200만 명이 사망하고 있다. 또한, 인간의 배설물에 의한 수질오염 미생물은 Salmonella enteric serovar Typhi, Shigella spp., hepatitis A virus, 또는 Norwalk-group viruses 등이 알려져 있다. 가축의 분변 오염이 가축 자체가 병원균 (Salmonella, Escherichia coli, Cryptosporidium spp. 등)의 숙주 역할을 하고 있다는 것이 최근에 알려졌으며 중요시 되기 시작했다. 분변 오염에 의한 수인성 전염병을 야기하는 미생물은 특히 E. coli O157 : H7, Campylobacter jejuni, Salmonella, Vibrio cholera, Shigella 등이 알려져 있다. 이처럼 오염원을 규명하는 중요한 연구가 최근 몇 년 동안 연구가들로부터 많은 관심을 갖게 되었다. 이러한 미생물을 이용한 오염원 특정 연구를 일반적 으로 MST(Microbial Source Tracking)라고 부른다(Simpson et al. 2002). MST는 다양한 방법으 로 다양한 미생물 분석 모두를 포함하고 있으며, 주로 지하수, 식수, 야생 동물 거주 지역의 수질 오염원을 규명하는데 사용된다. Total coliforms, fecal coliforms, enterococci, E. coli는 현재 수질 오염 기준으로 이용되고 있 다. Coliforms는 lactose-fermenting, gram-negative, Enterobacteriaceae (E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobactor 포함)로 정의되어있다. 일반적으로 E. coli는 항온 동물 (인간, 가축)의 장 내에 존재하고 있는 미생물이며, E. coli의 하천에서 검출이 되었다면 직접적인 분변 오염의 증거가 되고 있으며 미국 환경청에서 담수의 분변 오염의 지표생물 (indicator bacteria)로 권 장되었다(Davenport et al. 1976). 또한, E. coli는 하천에서 장내 환경과는 크게 다르기 때문에 오래 살 수 없다. 개체수도 E. coli의 recovery rate 그대로 분변 오염을 나타내는 것이라고 믿어 왔다. 그러나 최근의 연구에 의해 E. coli는 하천 환경 속에서도 오래 생존하는 것으로 확인되어 E

24 coli 만에 의한 분변 오염 모니터링은 신뢰도가 낮다라는 것을 알 수 있었다(Ram et al. 2004). E. coli 뿐만 아니라 다른 Fecal Indicator Bacteria (Entercoccus, total coliform)의 사용에도 유 사한 문제가 있음을 시사한다(Wheeler et al. 2002). 2010년에 본 연구실의 첫 community-based MST의 예로는 Pyrosequencing을 이용하여 환경 샘플과 소스 샘플의 미생물 커뮤니티 전체를 비교하는 MST 법을 개발했다. 하천의 미생물 생태와 분변의 미생물 생태는 너무나 많은 차이가 난다. 따라서 두 시료를 직접적으로 비교하여 평가하는 것은 무의미할 수 있다(Unno et al. 2010). 따라서 pyrosequencing에서 얻은 OTU (operational taxonomic units)를 분 석함으로써 species level에서 분석했다. OTU의 장점 중 하나는 unclassified로 분류되는 많은 시퀀싱 결과를 염기서열 유사성을 기준으로 구별 할 수 있다는 점이다. 그 중에서도 shared OTUs (하천, 분변 모두 숙주특이성 (host- specific)으로 검출 된 OTU)는 결과를 통계 처리하여 MST를 가능하게 한다는 이론을 제시했다(Unno et al. 2012)

25 제 2 절 연구방법 1. 금강 유역 시료 채취 가. 시료 채취 지역 및 방법 채수 지점은 수질측정망 운영계획(2012) 의 수질측정지점에서 79곳을 선정하였다 (Fig. 2-2). 원활한 시료 채취를 위하여 지역을 4곳으로 나누었고 그 지역은 다음의 Table 2-1과 같 다. 시료 채취는 월 2회를 기준으로 하며, 시료 채취 후 실험실로 옮겨 실험하기까지 24시간 을 넘지 않게 하였다. Table 2-1. 지역별 시료채취 지점 지역 용담댐 세종시, 대전 미호천 논산천 지류 대청댐 상류, 초강, 영동천, 용담댐, 용담댐 하류, 무주남대천(17 개소) 대청댐, 갑천, 보청천(23개소) 미호천, 대청댐 하류, 보청천(19개소) 금강 공주, 논산천, 금강하구언(20개소)

26 Fig 금강 수계 시료채취 지점

27 나. 시료의 전 처리 여과지를 105 건조기에 건조 시켜 기존의 수분을 제거한다. 여과기에 준비된 여과지를 올려 좋은 상태로, 펌프를 가동하고 미량의 증류수 여과지를 적셔준다. 준비된 시료를 여과지에 거른 뒤, 시료를 진공포장 하여 냉동보관 한다. 보관한 시료를 한 달에 한번 아이스박스를 이용하여 드라이아이스와 포장한 뒤 제주대로 발송한다. Fig 시료의 전 처리 및 배송방법

28 2. 분석방법 가. DNA 추출 및 MiSeq preparation DNA 추출은 다음과 같은 방법으로 Exgene Soil DNA mini kit (GeneAll Biotechnology Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 수행되었다. : 제공되는 sterile 1.5 ml micro-centrifuge tube에 있는 비드를 멸균된 1.5 ml clean tube로 옮긴다. 원형의 필터는 집게를 이용하여 잡고 수술용 칼을 이용하여 튜브안에 들어 갈 수 있도록 사각형으로 자른다. 본 과정은 필터과정에서 시료가 묻지 않은 부분을 제거하고 튜브 안에 넣을 수 있도록 크기를 맞추기 위해서 수행한다. 필터에 묻은 시료는 최대 500 mg을 포함해야한다. 자른 필터를 말아서 튜브 안에 넣고, 다른 튜브로 옮겼던 비드를 다시 sterile 1.5 ml micro-centrifuge tube에 넣어 제공되는 프로토콜과 동일하게 진행한다. 모든 과정이 끝나면 시퀀싱을 위한 처리과정이 이루어지기 전까지 추출한 DNA는 20 에서 보관한다. 여러 부분으로 구성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는데 각 샘플 안에 있는 미생물의 16S rrna 유전자 중 V4 지역을 증폭시킨다. 그 프라이머는 어텝터, (키/패드), 바코드, 링크와 특정 표적 유전자 시퀀스로 구성되어있다(primer pairs: 515f & 806r). 특정 표적 유전자 시퀀스는 표적 유전자에 결합하 도록 보존되는 영역을 기반으로 디자인되었다. 프라이머의 구조와 시퀀스는 인터넷 웹상에 프로토콜 Miseq SOP에 자세하게 나와있다 ( 각 샘플은 주형 DNA 2 μl를 Maxime PCR PreMix Kit (intron Biotechnology Inc., Korea)를 사용하여 최종 20 μl 양으로 3번 PCR을 통해 증폭하였다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 유전자의 복사본을 만들기 위한 분자 유전학적 기법뿐만 아니라 유전자 시퀀싱 처리과정의 일부분 이다. Thermal cycling pattern은 다음과 같다 : 95 2 분; 30 cycles of 초, 초, 72 1 분; and 72 5 분. PCR 생성물은 agarose gel purification kit를 이용하여 정제된다. 전기영동은 다음과 같은 조건으로 수행한다 : TAE 용액과 1.5% 아가로스 겔을 준비한다. 30μl의 PCR 산물을 로딩하고 100V에서 50분 동안 전기영동을 수행한다. 표적 유전자의 PCR 산물은 미생물 생태의 16S rrna V4 지역으로써 약 300 ~ 350 bp 정도의 크기이다. 그 부분을 잘라서 AccuPrep Gel Purification kit(bioneer Inc. Seoul, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하고 20 에 보관한다. DNA를 정량하기 위해 sdna HS assay kit(invitrogen, USA)를 사용하여 Qbit으로 농도를 측정하였다. 각 샘플 DNA 농도를 동일하게 하나의 튜브에 모아 시퀀싱 하기 전 까지 20 에 보관한다 (Fig. 2-4)

29 Fig Miseq 시퀀싱을 위한 전체적인 실험과정 나. 소열Data 처리와 미생물 군집 분석 Miseq 출력물을 얻기 위해서는 무료로 제공되고 있는 Mothur 소프트웨어(Schloss et al. 2009)를 사용하여 프로세싱과정을 거쳐야 한다( < >에 처리과정에 관한 설명이 자세하게 나와있다. 본 연구에 서 강물의 미생물생태분석에 사용하기 위해 그 프로토콜을 조정하였다. (1) 모든 시퀀스 데이터를 "make.contigs"이라는 명령어를 사용하여 애매한 DNA 시퀀스(N으로 나타남)나 275bp 보다 긴 시퀀스를 제거한다. 그런 다음 SILVA reference DB를 사용하여 aligne을 하고, 그 결과 중에 겹치지 않은 부분을 제거한다. 게다가 오류제거는 UCHME을 이용하여 키메라 유전자들을 제거하고, Ribosomal Database project classifier로 엽록체나 미토콘드리아와 같이 미생 물이 아닌 다른 DNA 시퀀스를 제거한다(batch 파일에 대한 부록 참조). (2) 이렇게 처리한 모든 시퀀스들은 비교분석을 위해서 클러스터링이 필요하다. 또한 각 샘플당 적으면 1,000개나 많으면 50,000개 정도의 시퀀스가 있기 때문에 표준화를 시켜야 한다. 표준화를 시키는 것은 매개변수의 크기를 1,000으로 하여 "sub.sample"이라는 명령어를 이용하여 가능하다. 따라서, 분류학적 분류도 역시 크기를 1,000으로 하고 'sub_tax.pl'이라는 perl 스크립트를 이용하여 가능하다(부록참조). "cluster.split"이라는 명령어는 Operational Taxonomic Units (OTUs) 기반의 분석을 위해 시퀀스 결과를 클러스터링을 하는데 사용한다. 클러스터링 후, shannon, chao, and

30 inverse simpson diversity indices 들은 "summary.single"이라는 명령어에 의해 얻을 수 있다. 그래서 OTU 데이터는 두 생태구조 사이의 유사성을 알기 위해서 nonmetric multidimensional scaling (NMDS) 와 Yue & Clayton 의 측정을 위해 사용되었다. 다. 세균/고세균 정량분석 (qpcr) 기존에 미생물정량분석을 하기위해 사용되어 오던 16S rrna는 House Keeping gene(어떠 한 미생물에서든 항상 발현이 되고 생명 활동에 필수적인 유전자로써 DNA복제, 세포분열, 에 너지 대사 등과 관려된 유전자를 뜻함)이기는 하나 species에 따라 다양한 유전자 갯수를 갖 고 있기 때문에 미생물의 정량분석에 대한 정확한 데이터를 얻을 수가 없었다. 하지만 그와 반대로 rpob 유전자(Wang et al. 2007; Ye 2011)는 350bp 정도의 크기로 박테리아의 RNA 중 합효소 β 소단위체(RNA polymerase β subunit)의 유전적 정보를 담고 있는 House Keeping gene으로 거의 모든 미생물이 갖고 있으면서, 단 하나만의 유전자를 갖고 있어 정량분석을 하는데 유용하게 사용할 수가 있다. 이에 따라 본 연구에서는 rpob gene을 타겟으로 하여 샘 플에 들어있는 미생물을 정량분석하는데 사용했다. rpob gene으로 정량분석을 하는데 사용한 각각의 primer는 다음과 같다. - Forward primer: CGAACATCGGTCGGTCTGATCAAC - Reverse primer: GTTGCATGTTCGCACCCAT qpcr을 하는 실험적인 방법은 다른 것에 비해 아주 간단하다. 준비된 qpcr Premix, Forward primer, Reverse primer, Sterilized Water와 DNA template를 넣어주기만 하면 된다. qpcr을 수행할 때 각 튜브에 넣는 양은 다음과 같다. SYBR Premix Ex Taq 2 PCR Forward Primer PCR Reverse Primer Template(DNA) dh₂o(sterile distilled water) Total 10μl 1μl 1μl 2μl 6μl 20μl 이와 같이 각 튜브에 넣게 되면 많은 시간을 허비하게 된다. 따라서, DNA template를 제 외하고 샘플 개 수 만큼의 각각의 시약들을 한 튜브에 모아 Mixture를 만들어 준다. 예를 들 면, 본 연구실에서 사용하는 qpcr 기계(TP700, TAKARA, Tokyo, Japan)는 총 48개의 샘플을 한번에 처리할 수 있다. 그래서 DNA template를 제외한 각각의 시약들을 49개 또는 50의 샘

31 플을 처리할 수 있는 만큼의 양을 한 튜브에 넣어준다. 50개라고 생각하고 양을 계산해보면 SYBR Premix Ex Taq II 500μl, Forward primer 50μl, Reverse primer 50μl, Sterilized Water 300μl이 된다. 샘플의 총 개수는 48개이지만 한 두 개 정도의 여유분으로 넣는 이유는 파이펫 팅을 하면서 Mixture solution이 팁에 묻기 때문에 정량으로 넣게 되는 경우 부족 할 수 있기 때문이다. 이렇게 Mixture solution을 만들고, 각 튜브에 DNA template를 2μl씩 넣어 준다. 그 다음 각각 Mixture solution을 18μl씩 넣어 total volume을 20μl로 맞춰준다. 가장 중요한 사항은 모 든 과정이 낮은 온도에서 작업을 요하기 때문에 얼음 안에서 수행되어져야 한다. 마지막으로 vortex로 섞어주고 난 다음, spin down을 하여 qpcr 기계에 넣기 이전의 작업을 마무리 한다. 그래서 준비된 튜브들을 기계에 넣고 95 for 30 s 40 cycles of 95 for 5 s, 55 for 30 s로 기계를 설정하여 증폭을 한다

32 제 3 장 연구 결과 및 고찰 제 1 절 금강 수질 변동성분석 2010년부터 2013년 기간동안 3~8월의 금강수계 중 샘플 채취 지점의 수질데이터를 분석하였 다. 본 연구의 샘플링 지역은 세종시를 기준으로 용담댐 지역, 대전 지역, 미호천 지역, 금강 하구 지역으로 4개 부분으로 나누어 실시하였다. 수질 데이터는 물환경정보시스템 ( go.kr)을 사용하였으며 각 월별로 평균을 내어 데이터를 분석하였다. 다음은 각 4개 지역의 BOD, TP, TN의 3년간의 월별 수질 변화를 보여 준다. 1. BOD 4개 샘플링지역에서의 BOD는 대체적으로 비슷한 경향을 보였다. 월별로는 5월과 6월은 높 고, 4월과 8월의 BOD 평균 농도는 다른 달과 비교하여 비교적 낮게 나타났다. 용담댐 지역과 대전 지역은 전반적으로 미호천 지역과 금강하구 지역보다 낮은 BOD 수준을 보였다(Fig. 3-1). 가. 용담댐지역 ( ) 나. 대전지역 ( ) 다. 미호천지역 ( ) 라. 금강하구지역 ( ) Fig 개 조사 지점별 BOD 비교 분석

33 2. TP TP의 경우 BOD 만큼의 월별 변화 경향은 보여 주지 않았다 다만, 7,8월 경우 다른 달에 비해 높은 농도가 관찰 되었다. 또한 미호천 및 금강하구지역의 평균 농도가 용담 및 대전지역에 비해 높지 않았다(Fig. 3-2). 가. 용담댐지역 (0-0.1) 나. 대전지역 (0-0.1) 다. 미호천지역 ( ) 라. 금강하구지역 ( ) Fig 개 조사 지점별 TP 비교 분석 3. TN TN의 월평균 데이터는 전체적으로 시간이 갈수록 3월에 비해 8월의 농도가 낮아지는 경향 을 보였다. 다른 BOD와 TP 지표와 마찬가지로 용담댐지역 및 대전지역의 월평균 TN 은 다른 지역보다 비교적 낮게 나타났다(Fig. 3-3)

34 가. 용담댐지역 ( ) 나. 대전지역 ( ) 다. 미호천지역 ( ) 라. 금강하구지역 ( ) Fig 개 조사 지점별 TN 비교 분석 Table 개 샘플링지역의 BOD, COD, TN, TP의 상관관계 분석 BOD COD TN TP Pearson 상관계수 **.881 **.939 ** BOD 유의확률(양쪽) N Pearson 상관계수.978 ** **.942 ** COD 유의확률(양쪽) N Pearson 상관계수.881 **.916 ** ** TN 유의확률(양쪽) N Pearson 상관계수.939 **.942 **.904 ** 1 TP 유의확률(양쪽) N

35 4개 지역의 월평균 데이터를 이용하여 상관관계를 분석한 결과 강한 양의 상관관계에 있는 것을 확인하였다 (Table 3-1). 이것은 수질분석요인 4개 중 한 개의 농도가 증가하면 다른 수 질분석요인도 같이 증가할 수 있다는 것을 알 수 있다. 제 2 절 Sequence DB 구축 연구시작 초기에는 금강수계 79개 지점의 시료채취를 한 달에 두 번씩 수행하였다. 5월과 6월 이후 부터는 한 달에 한번은 79개 지점을, 다른 한번은 국립환경과학원에서 지정한 19개 주요지점에서 시료 채취를 수행하였다. 이를 통해 약 600 여개 시료에서 총 1,110,787 유용한 시퀀스(Sequences)를 확보하였다 (Table 3-2). 총 7번의 MiSeq을 수행하였고 결과로 도출된 시퀀스 값은 상이 하였는데 이는 시퀀스 확보 과정 중에 제외된 에러 시퀀스의 양이 다르기 때문이다. 이는 아마도 샘플 종류의 차이 (분변 또는 하천수) 또는 MiSeq의 기계적 상태에 기인하기 때문인 것으로 판단된다. 이유에 대해서는 향후 좀 더 심도 있는 연구가 필요한 것으로 사료되나, 본 연구에서는 연구하기에 충분한 시퀀스 양을 확보하였다. 본 연구과제는 한국에서 최초의 시 공간을 고려한 하천수 미생물 DB 구축 작업이다. 본 연구진은 미생물 하우스키핑 유전자, rpob를 이용하여 총 미생물의 양을 산정하였다. 일반적으로 총 미생물 양을 산정하기 위하여 많이 사용되는 16S rrna는 각 미생물마다 카피수가 다르기에 미생물 군집 분석 시 다소 편중된 결과치를 얻을 수 있다. Table 3-2. 본 연구에서 얻은 시퀀스 수 (red indicates less than 1000 ) 지점 5월 1차 5월 2차 6월 1차 6월 2차 7월 1차 7월 2차 가막 8,933 6,036 1,463 4,354 16,063 진안천 7,085 5, ,370 용담댐1 7,201 6,007 2,119 11,583 용포 11,843 13,836 1, ,263 6,611 국립공원수질 측정망 11,012 3, ,037 무주남대천-1 13,010 2, ,129 29,361 12,976 제원 10,109 3,637 2, ,084 봉황천 11,002 3,524 1,095 9,675 13,517 영동 8,553 16,980 1, ,575 21,479 영동천1 6,862 3,585 2,615 22,753 영동천2 12,704 2,046 4,012 16,809 초강1 3,879 5,667 1,865 1,659 19,823 추풍령천 4,467 3,749 2,693 3,383 18,445 초강2 16,978 10, ,690 4,544 옥천 11,611 8, ,121 14,946 5,

36 우산 155 8, ,916 18,549 21,165 보청천1 41,615 10,896 2,226 2,010 항건천 53,540 5,286 1,048 2,493 보청천2 83,985 6,414 1,049 1,840 보청천3 5,193 6, ,263 14,958 보청천4 9,626 4,032 1, ,836 5,897 대청댐4 22,031 3,436 1,057 1,631 옥천천 12,690 3, 회인천 7, ,378 주원천 43,289 4, 품곡천 52,842 6, 현도 42,211 9, ,155 18,238 두계천1 25,782 3, ,953 봉곡2교 32,307 3,799 7, ,204 갑천1 27,367 2, ,949 22,531 대전천3 35,042 3, ,606 25,005 유등천1 33,826 8,463 2,660 8,031 유등천5 21,515 2,925 1,880 3,529 16,875 갑천3 28,908 2, ,938 21,911 갑천5-1 37,006 7, ,566 26,384 현도공단 91,935 11, 청원-1 35,171 1,843 3,736 25,333 미호천1 19,045 1,738 3,016 2,096 36,851 칠장천 1,465 1,848 8,730 1,875 15,624 미호천2 47,916 3,659 2,482 1,414 15,488 백곡천1 21,872 2,154 2,590 1,650 28,938 백곡천2 26,123 2,518 1,185 1,771 18,515 초평천 22,078 2,726 3, ,380 보강천 110,668 3, ,454 25,209 미호천7 14,792 2, ,606 미호천3 33,385 3, ,840 미호천4 25,945 4, ,046 무심천1 32,058 4,597 1,116 6,338 23,380 무심천2 65,702 4,416 1,475 13,787 39,305 병천천 23,598 5, ,488 미호천8 22,359 4,112 3,300 2,309 25,173 조천 20,425 1,452 4,820 5,811 22,799 미호천5 44,614 3,512 3,127 24,899 월하천 21,402 3,080 5,449 24,152 미호천6-1 30,770 3,957 2,914 2,606 25,851 25,450 용수천 46,466 3,096 1,087 1,591 연기 22,464 2,481 2,688 31,412 33,780 대교천 2,427 2,314 25,699 공주1 5,888 4,690 1,328 20,639 24,690 정안천 3,228 8,394 1,983 5,322 41,687 유구천 5,315 6,892 3,464 1,475 25,509 공주2 6,106 6,287 7,060 1,940 24,598 지천 5,211 2,002 2,893 39,

37 정동 6,445 6,075 2,090 1,558 28,424 35,951 은산천 3,201 5,558 3,183 23,816 금천 25 5, ,125 26,256 석성천 5, ,635 31,515 부여1 68 4,867 7,584 4,029 28,875 성동 235 3,327 10,004 8,892 23,088 34,158 논산천1 32,200 3, ,505 26,274 노성천 4,016 6, ,774 29,463 수철천 28,648 5, ,439 강경천 29,501 8, ,332 17,232 논산천2 4,565 5,190 9,683 3,800 31,467 방축천 21,410 4, ,968 22,197 논산천4 4,671 10, ,803 28,157 강경 30,679 6, ,838 20,246 길산천 17,484 3, ,348 31,832 양화-1 18,868 2,253 4,113 7,873 32,523 28,673 지점 8월 1차 8월 2차 9월 1차 9월 2차 10월 1차 10월 2차 11월 1차 가막 45,595 49,284 18,743 89,558 1,470 3,637 진안천 19,491 30,158 1,332 4,178 용담댐1 11,788 13,773 1, 용포 12,938 47,810 13,515 55, ,540 국립공원수질 측정망 28,714 12,448 1,103 무주남대천-1 10,419 16,691 21,199 33,442 1,384 2,742 제원 20,875 24,533 2,133 3,187 봉황천 13,288 18,821 1,484 6,633 영동 17,391 61,939 39,349 1,110 1,407 4,594 영동천1 9,912 19, ,901 영동천2 19,290 1, ,079 초강1 48,299 21,894 2,157 2,396 추풍령천 8,741 26,430 3,758 초강2 20,641 56,294 19,236 76, ,960 옥천 14,938 41,018 41,021 5, ,886 우산 18,140 47,976 18,847 4,002 1,085 2,559 보청천1 13, ,035 항건천 88, ,315 보청천2 8, ,798 보청천3 10,970 29,146 1,776 7,659 보청천4 19,706 53,679 15,972 36, ,360 대청댐4 31,504 29,779 20,495 1,622 2,855 1,004 옥천천 7,232 18, ,155 회인천 53,760 24, ,212 주원천 57,517 20, 품곡천 55,403 6, ,139 현도 62,588 24,116 18,012 15,

38 두계천1 35, ,635 봉곡2교 32, 갑천1 17, ,457 대전천3 28,800 7,916 1, 유등천1 33, ,104 유등천5 40,652 1,105 1,788 갑천3 17, ,475 갑천5-1 28,211 32,677 19,190 60,211 2,185 4,764 현도공단 65,438 23, ,731 청원-1 17, ,966 미호천1 90,994 1, ,480 칠장천 15,550 1, ,224 미호천2 1E+05 55, ,116 백곡천1 40,520 33, ,884 백곡천2 46,374 32, ,094 초평천 17,707 12, ,525 보강천 39,980 33, ,976 미호천7 92,996 28, ,071 미호천3 80,631 45, ,726 미호천4 81,334 33, ,141 무심천1 92,387 45,032 1,185 5,936 무심천2 94,012 25,823 3,722 병천천 36,222 32, ,541 미호천8 37,887 37, ,778 조천 41,623 23, ,999 미호천5 76,466 31,969 11,558 월하천 39,944 32, ,292 미호천6-1 87,412 57,977 2E+05 2,229 용수천 28, ,844 연기 31,000 68,123 28,813 40,119 2,317 대교천 91,803 20, 공주1 66,182 32,361 18,485 55,423 1,538 1,234 정안천 70,848 16, ,617 유구천 55,945 8, ,274 공주2 69,565 13,858 1, 지천 83,531 5,014 1,102 2,916 정동 34,780 41,260 14, ,482 4,165 은산천 17, ,252 금천 89,469 14,168 1,263 1,226 석성천 38,232 23,104 1,074 3,780 부여1 40,975 14, ,536 성동 46,966 30,133 17,713 84,770 1,317 5,900 논산천1 33,714 26,041 2,104 노성천 18,782 12,594 1,263 4,898 수철천 42, 강경천 73,940 30,446 1,009 5,144 논산천2 50, ,099 방축천 36,017 1, ,

39 논산천4 29,259 31,654 55, ,723 13,700 강경 76,443 21,466 1, 길산천 66, ,372 양화-1 17,063 35,060 88,445 2,071 1,985 3,094 NGS를 이용하여 미생물 군집 분석을 수행할 때의 단점 중의 하나는 절대적인 정량 분석이 어렵고 이 보다는 상대적인 정량 분석이 가능하다는 점이다. 만약 NGS가 수행된 다른 샘플내 총 미생물의 양이 많거나 적든지 간에, 각각의 샘플 내 미생물양의 분포가 상대적으로 비슷하다면 이 둘간의 미생물 군집 분포는 같아 보이게 된다. 반대로, 정량 PCR(q-PCR)의 단점은 미생물의 양의 산정이 각각 DNA 추출효율, 시료의 보관 상태나 시료 종류에 영향을 받는 다는 점이다. 다음 결과는 지점별, 시료 채취 시기별로 정량 PCR과 NGS 결과를 상대 분석한 것이다

40 제 3 절 미생물 생태 분석 차세대 sequencing은 대량의 sequencing 결과를 얻기에 좋지만, 정확도는 약 80%이며 오차 제거가 필요하다. Caporaso(Caporaso et al. 2012)등의 연구에서는 베타 다양성 비교(샘플과 샘 플의 비교)는 sequence의 깊이에 영향을 받지 않을 수 있다고 하였다. 그리고 Schloss (Schloss et al. 2011)등의 연구에서는 PCR 증폭 편향을 줄이기 위해 하위 샘플링을 하는 것이 좋다고 하였다. 이 연구에서 1000개의 sequences 결과를 분석하였고, sites의 비교 분석이 연구 결과 에 영향을 미칠 수 있는 경우에 대비하여 추가 분석을 하였다. 분석 결과 중 reads 수가 높은 5개의 샘플을 선택하였고, 이를 Yue & Clayton 를 이용하여 하위샘플과 비교하였다 ( ) 분석 결과는 DNA Tree 형식으로 표시하였다 (Fig. 3-4). Fig 표본 성향 분석 샘플의 이름은 KR-A-# 과 KR A # 로 하였다. 샘플 이름에서 - 는 원래의 샘 플을 표시하였고, 는 하위 샘플을 의미한다. 위의 결과는 하위 샘플 1000개는 sites비교에 영향을 주지 않는다고 할 수 있다. 시료당 미생물 분석을 일정하게나누기 위해서, 각 시료당 1000개의 미생물 시퀀스를 임의적으로 뽑아 분석하였다 (만약 시료가 1000개 이하의 미생물 시퀀스를 포함하는 경우 이 시료는 분석에서 제외 시켰다). 다음의 결과는 각 미생물의 분포 를 문(Phylum)에서 산정한 것이다

41 Fig 금강수계 주요 19지점 19개의 주요 지점(Fig. 3-5)에서의 미생물 분포가 다음에 정리되어 있다. 전체적으로 하천 미 생물의 미생물 군집은 상당히 비슷한 분포를 보인다 (예를 들어 대부분은 Proteobacteria와 그 다음은 Frimicutes). 또한 몇몇 지역은 지역 별로도 Phylumn 분포가 변화되는 것을 알 수가 있다

42 Fig 월 19개 주요지점의 Phylum 분포 우선 5월달 자료를 보면(Fig. 3-6) 대체적으로 Phylum 분포는 금강 상류지역에서 상당히 유 사한 분포를 보이나 (가막-우산) 대청댐4에서는 다른 경향을 보이기 시작한다. 이를 과 (Family)로 내려가서 살펴보면(Fig. 3-7) 상류 지역과 대청댐 4이하의 하류지역이 더욱 다르게 분포됨을 알 수가 있다. Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포

43 이 중 Moraxellaceae 와 Bacillales Incertae Sedis XII의 주요 19개 지점에서의 분포도는 큰 차이를 보여준다. 일반적으로 Moraxellaceae은 주로 인간과 동물을 숙주로 하는 유해하지 않 은 기생미생물이며 상온에서 서식한다. 반면, Bacillales Incertae Sedis XII에 대한 환경내 생태 정보는 그리 많은 편이 아니다. 다만 하류 지역에서의 상당히 높은 비율의 Moraxellaceae 발 견은 금강 주변의 도시화와 관련 되어 있는 것으로 판단된다. 위의 결과를 보면 Family 수준 의 분석이 Phylum 수준의 분석 보다 더 다양한 표를 볼 수 있으므로 7월, 9월, 11월의 미생물 군집분석은 Family 수준의 분석을 시행하였다. Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 7월 여름철의 결과를 보면, 모든 지점에서 Moraxellaceae 계열의 미생물이 많이 발견되는 것 을 알 수 있었다. 이에 대한 정확한 이유는 알 수 없지만, 이는 빈번한 여름철 강우에 의해 외부에 존재하는 오염물질이 유입된 정도가 큰 것이 아닌가하는 판단이 된다. 실제로 7, 8월 경우에 금강변에 TN, TP가 증가되는 경향이 보인다(Fig. 3-3, 3-4). 따라서, 본 연구의 결과는 강우에 의한 비점 오염원 증가에 따른 미생물 군집에도 영향을 받는 것이 아닌가하는 판단을 하게 된다. 추후 이에 대한 좀 더 명확한 분석이 필요할 것으로 사료된다

44 Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포 여름철이 지난 후 (Fig. 3-9) 금강변의 미생물 군집은 좀 더 다양한 형태를 띄게 된다. (여기 그림에서 Others 는 많이 검출되지 않은 미생물을 전부 합친 것을 의미함). 9월의 경우에는 Oxalobacteraceae가 주요 종으로 등장하고 있고Comamonadacea가 그 뒤를 따르고 있다. Oxalobacteraceae는 주로 흙과 물속에 존재하는 환경미생물이다. Comamonadacea에 대한 미생 물 종은 그리 많이 알려져 있지는 않으나 주로 환경 내에서 발견되고 있다. Fig 월 19개 주요지점의 Family 분포

45 11월에는 Moraxellaceae 계열의 미생물이 소수의 군집으로 변화되고 있고 Verrucomicrobilaceae가 나타나기 시작한다 (Fig. 3-10). Verrucomicrobilaceae 계열 미생물이 주 로 동정 되는 곳은 하천수, 흙과 인간의 분변으로 알려져 있으나, 배양하기 어려운 단점으로 인 해 이 종들에 대한 자세한 정보는 알려져 있지 않다. 정리해보면 미생물 군집은 지역적 영향 및 시기적 영향을 받는 것으로 판단된다. 지역적 특성으로 보았을 때, 대청댐을 금강유역의 미생물 군집 변화의 하나의 기준선으로 볼 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 변화는 지점별 토지 이용, 오염물질등의 패턴에 기인하는 것으로 여겨지며 도시화 (Urbanization)와 관련되어 지는 것 으로 보여진다. 또한 시기적으로 보았을 때 여름철에서부터 겨울철까지 관찰 되어지는 미생물 family 패턴도 다름을 알 수 있었다 [여름 (Moraxellaceae), 가을 (Oxalobacteraceae 와 Comamonadacea), 겨울 (Verrucomicrobilaceae)]

46 제 4 절 수질조사 자료-미생물 생태 본 연구에서는 수질 자료와 미생물 생태의 연관성을 연구하였다. 수질자료는 국립환경과학원 에서 제공하는 수질측정망 19개 지점의 7개 수질 자료(BOD, COD, TN, TP, SS, DO, Temperature)와 Miseq 데이터의 상호 연관성을 분석하였다. 1. 기초자료분석 가. 수질데이터 수질자료는 국립환경과학원 수질측정망 자료를 활용하였으며, 19개 지점에 측정된 7개 항목에 대한 평균 및 표준편차는 아래의 표와 같다 (Table 3-3). Table 월 금강의 수질측정 수온 DO BOD COD SS TN TP 5월 평균 표준 편차 개의 변수는 각기 수질오염의 지표로 활용되는 바, 변수간의 상관성이 높을 것으로 예상 되며, 그 상관성을 보기위해 변수간의 산점도를 아래에 수록하였다 (Fig. 3-11)

47 Fig 수질지표 상관관계 수온은 다른 수질관련 변수들과 강한 상관성이 없는 반면, BOD, COD, SS, TN, TP는 강한 양의 상관성을 보이고 있음을 알 수 있다. 이를 정량적으로 평가하기 위해 변수 간 상관계수 를 계산하고 이에 따른 유의성을 아래의 표에 기술하였다

48 Table 월 금강의 수질지표 유의성 수온 DO BOD COD SS TN TP 수온 * DO * BOD * * * * COD * * * SS * TN * TP 위의 표에서 *는 유의수준 5% 하에서 통계적 유의성을 보임을 의미한다. 위의 표에서 볼 수 있듯이, BOD, COD, SS, TN, TP는 서로 강한 양의 상관성을 보이고 있음을 알 수 있고, DO는 다른 지표들과 유의하진 않지만 음의 상관성을 보이고 있다 (Table 3-4). 나. OTU 자료 상기 기술한 19개의 측정지점에서 2회에 걸쳐 샘플을 채취하여 6,593종의 미생물의 수량을 계량하였다. 2회에 걸친 자료를 편의상 OTU1, OTU2라고 부르겠다. 본 표본조사 방식은 같은 위치에서 2회에 걸친 반복측정(repeated measure)을 통해 얻은 자료이므로, 반복측정에 따른 연관성을 고려하는 것이 바람직한 분석 방향이다. 하지만, 샘플 의 수 (19개지점)에 비해 변수의 수(6593종의 미생물)가 많으므로, 일반적인 반복측정 자료분 석법을 적용하는 것은 무리가 있다고 판단된다. 따라서, 본 연구를 위한 사전자료분석을 위해 2회에 걸친 자료의 평균값을 이용하여 분석을 수행한다. 특정 하천의 경우, 2회의 관측이 모 두 이루어지지 않은 경우도 있으므로(아래를 참조), 이러한 경우에는 1회 관측된 값을 평균값 대신 이용한다. OTU1 자료는 19개지점 중에서 초강2, 성동 2개 지점에 대한 자료가 누락되어 있으며, OTU2 자료에는 청원-1 지점에 대한 자료가 누락되어 있다. 위의 3개지 점은 1회 관측된 자료를 이용하였으며, 2회 모두 관측된 16개지점은 평균값을 이용한다. 6,593종의 미생물을 Phylum 별로 정리하여 Phylum내에 속한 미생물의 평균값을 자료분석에 이용하였다. 아래의 표는 26개의 Phylum에 속하는 미생물 종의 개수를 정리한 것이다. 각 Phylum별 속한 미생물의 개수는 매우 상이함을 알 수 있으며 이는 추후 분석 시 고려해야할 사항이다. 또한 phylum 단위가 아닌 하위단위로 정리한다면 미생물 특성을 고려한 해석이 더 용이할 것이다. 본 사전분석에서는 이를 고려하지 않고 phylum단위의 분석을 진행하였다

49 Table 3-5. Phylum 수준에서의 존재하는 평균 미생물 수 Acidobacteria Actinobacteria Armatimonad etes Bacteroidetes BRC1 Chlamydiae Chlorobi Chloroflexi Deinococcus- Gemmatimonad Firmicutes Fusobacteria Thermus etes Lentisphaerae Nitrospira OD1 OP11 Planctomycetes Proteobacteria Spirochaetes SR1 Synergistetes Tenericutes TM7 unclassified Verrucomicrobia WS3 총합 분석에 앞서 OTU자료의 각 Phylum별 평균과 표준편차를 아래에 수록하였다. Table 3-6. OTU의 Phylum 수준에서 평균 및 표준편차 Phylum Acidobacteria Actinobacteria Armatimonadetes Bacteroidetes 평균 표준편차 Phylum BRC1 Chlamydiae Chloroflexi Deinococcus-Thermus 평균 표준편차 Phylum Firmicutes Fusobacteria Gemmatimonadetes OD1 평균 표준편차 Phylum Planctomycetes Proteobacteria Spirochaetes SR1 평균 표준편차 Phylum Synergistetes TM7 unclassified Verrucomicrobia 평균 표준편차 Phylum Chlorobi Lentisphaerae Nitrospira OP11 평균 표준편차 Phylum Tenericutes WS3 평균 0 0 표준편차

50 위의 표에 제시되어 있듯이 6개의 phylum, Chlorobi, Lentisphaerae, Nitrospira, OP11, Tenericutes, WS3 는 19개 지점에서 모두 발견되지 않아 관 측치가 0인 것을 확인할 수 있다 (Table 3-6). 따라서 이후 분석에서는 6개의 phylum을 제거 하고 20개의 phylum만을 이용한다. 20개의 phylum들에 대한 상관성을 보기 위해 상관계수 값을 아래에 표현하였다. 전반적으 로 phylum별 상관성이 존재하며, 수질자료와 마찬가지로 이를 고려한 분석이 필요하다 (Fig. 3-12). Fig Phylum 수준에서 미생물들의 상관계수 2. 정준상관분석(Canonical correlation analysis)을 통한 연관성 분석 정준상관분석은 두 그룹의 변수로 이루어진 관측치가 주어진 경우, 두 그룹 간의 상관성이 가장 크게 주어지는 방향을 찾는 통계적 방법론이다. 두 그룹은 다수의 변수들로 구성되어 있으며, 각 그룹별로 변수들의 선형결합을 통해 하나의 새로운 변수를 만들되, 각 그룹에서 만들어진 새로운 변수는 서로간에 강한 상관성을 지니도록 구성한다. 이렇게 얻어진 변수를

51 정준변수(canonical variate)(alkan and Atakan 2011)라고 부른다. 따라서 두 그룹에서 가장 상 관성이 높게 되도록 얻어진 한 쌍의 정준변수는 두 그룹의 연관성을 설명하는 요약값으로 이 용가능하다. 가. 정준변수 간의 상관계수는 두 그룹의 연관성의 강도를 측정하는 지표로 활용할 수 있 다. 이는 두 그룹으로 이루어진 변수들 간의 연관성을 1차원으로 축소하여 살펴볼 수 있 는 장점을 가진다. 나. 각 그룹의 정준변수는 해당 그룹에 속한 변수들의 선형결합으로 표현된다. 변수들이 정 준변수에 기여하는 정도는 선형결합 상의 해당 변수의 계수로 표현된다. 즉, 계수가 양수 인 경우 변수와 정준변수간에 양의 상관관계가 있으며, 계수가 음수인 경우 변수와 정준 변수간에 음의 상관관계가 있고, 계수가 0에 가까운 경우 변수는 정준변수와 상관성이 없 다고 해석할 수 있다. 각 변수의 분포가 상이함을 감안하여 변수와 정준변수간의 연관성 은 선형결합 상의 계수 대신 상관계수를 이용하여 해석한다. 정준변수는 여러개의 쌍으로 얻어지게 되는데, 연관성이 가장 큰 정준변수쌍을 제1정준변수 라고 부르며, 순차적으로 제2, 제3,... 의 정준변수쌍을 구성할 수 있으나, 제1정준변수가 두 그룹의 연관성을 가장 잘 대표한다고 말할 수 있으나, 연관성이 복잡하게 얽혀있는 경우 일 반적으로 다수의 정준변수쌍을 이용해야 설명가능하다. 본 연구에 사용된 자료는 수질자료로 써 7개의 지표로 구성되어 있으며, OTU자료는 20개의 Phylum으로 구성되어 있다. 따라서 7 개의 지표를 요약하는 정준변수 및 20개의 phylum을 요약하는 정준변수를 통해 (1) 수질오염 과 생물종간의 연관성을 요약할 수 있으며, (2) 정준변수를 구성하는 변수의 계수를 통해 어 떤 변수들이 정준변수에 양, 음의 상관성이 있는지 파악할 수 있다. (1)을 통해 수질오염을 대 표하는 변수로 정준변수를 이용할 수 있고 또한 (2)를 통해 이와 가장 연관된 측정항목을 판 별할 수 있을 것이다. 일반적인 정준상관분석은 자료의 수(측정지점의 수)가 변수의 수(환경 지표의 수, Phylum의 수)보다 많아야만 분석이 가능하다. 하지만, 본 자료는 변수의 수가 자 료의 수보다 크다. 이러한 경우, 일반적인 정준상관분석을 통해 얻은 정준변수는 안정적이지 못하다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위해, 규제화된 정준상관분석(regularized canonical correlation analysis)(lu et al. 2013)을 이용할 수 있다. 3. 분석 결과 수집된 자료를 공개소프트웨어인 R을 통해 분석을 하였으며, R에서 제공되는 CCA 패 키지를 이용하여 규제화된 정준상관분석을 수행하였다. 총 7개의 정준변수 쌍을 얻었으며 각 쌍의 연관성 정도를 상관계수를 통해 살펴볼 수 있다. 해당 값을 표 및 그림으로 나타내었다

52 Table 3-7. 정준변수 쌍의 상관관계 정준변수 상관계수 Fig 정준변수 쌍의 상관관계 위의 표 및 그림에서, 제1 정준변수 및 제 2 정준변수 간의 상관성이 0.80, 0.77로 높은 반 면, 제 3 정준변수 이하의 상관성은 상대적으로 낮음을 알 수 있다. 따라서 두 그룹(수질자료 및 OTU자료) 간의 상관성은 두 쌍의 정준변수를 통해 살펴보는 것이 타당함을 알 수 있다 (Table 3-7, Fig. 3-13). 얻어진 두 쌍의 정준변수와 주어진 변수들과의 상관성 형태를 파악하 기 위해 정준변수와 변수간의 상관계수를 표로 정리하였다. Table 3-8. 수질지표와 정준변수(수질자료) 간 상관계수 구분 제1정준변수 (수질자료) 제2정준변수 (수질자료) 수온 DO BOD COD SS

53 TN TP 위의 표는 수질오염을 요약한 2개의 정준변수가 수질지표와 가지는 상관계수를 정리한 것 이다. 예를 들어 제1 정준변수의 경우 수온, BOD, COD, TN, TP와 양의 상관계수를 가지고 있으며 DO, SS와 음의 상관계수를 가지고 있음을 알 수 있다. 이는 제 1정준변수는 수온, BOD, COD, TN, TP 값이 커지면 값이 커지며, DO, SS값이 커지면 값이 작아짐을 의미한다. 음의 상관성을 가지는 두 변수(DO, SS)에 해당하는 상관계수 값이 비교적 0에 가까우므로 이 에 대한 영향력은 적다고 판단되며, 제 1정준변수는 이를 제외한 다른 변수들에 대한 양의 상 관성을 가지고 있음을 감안하면 수질오염을 나타내는 하나의 요약지표로 활용될 수 있음을 알 수 있다. 제2상관변수도 이와 비슷한 방법으로 연관성을 파악할 수 있으나, 직접적인 해석은 명확하 지 않다. 하지만, BOD, COD, TN, TP의 상관계수가 작게 주어지므로 이들의 영향은 적으며, 수온, SS는 음의 상관계수를, DO는 양의 상관계수를 가짐을 통해 제1정준변수와 별도로 (수 온, SS) 및 DO의 차이에 의한 변동을 설명해 주는 것으로 이해할 수 있다 (Table 3-8). OTU 자료를 요약한 2개의 정준변수가 20개의 Phylum과 가지는 연관성을 파악하기 위해 상관계수 를 정리한 표는 아래와 같다

54 Table 3-9. Phylum 수준과 정준변수(OTU자료) 간 상관계수 구분 제1정준변수 (OTU자료) 제2정준변수 (OTU자료) Acidobacteria Actinobacteria Armatimonadetes Bacteroidetes BRC Chlamydiae Chloroflexi Deinococcus-Thermus Firmicutes Fusobacteria Gemmatimonadetes OD Planctomycetes Proteobacteria Spirochaetes SR Synergistetes TM unclassified Verrucomicrobia OTU의 상관변수와 각 phylum별 연관성의 정도는 위의 경우와 비슷하게 해석할 수 있다. 위에 제공한 수질자료 및 OTU자료의 상관변수를 종합적으로 살펴보기 위해 이를 2차원 그래 프로 나타낸 그림은 아래와 같다

55 Fig 수질지표와 Phylum 수준에서의 미생물과의 상관관계 위의 그림은 수질자료를 요약한 두 정준변수의 각 변수에 대응하는 상관계수를 가로, 세로 축으로 하여 변수를 표현한 것이 빨간색으로 나타내고 있고, OTU자료의 두 정준변수에 대응 하는 상관계수를 가진 phylum을 가로, 세로축으로 하여 파란색으로 나타낸 것이다. 가로축은 제1상관변수에 대응하는 상관계수이며 세로축은 제2상관변수에 대응하는 상관계수이다. 그림 상에서 BOD, COD, TN, TP가 비슷한 위치에 놓여 있음을 확인할 수 있는데, 이는 4개 의 환경지표가 수질을 요약하는 제1, 제2 상관변수에 비슷한 영향을 미치는 변수임을 나타내 준다. 이는 4변수간의 강한 양의 상관계수를 가진다는 기초분석의 결과와 합치하는 해석을 준 다. 또한 phylum(파란색) 들도 환경변수와 연관성이 강한 OTU자료의 상관변수 상에서 비슷하 게 대응하는 phylum 간의 군집현상을 발견할 수 있다. 이는 군집을 이루는 phylum들과의 생 물학적 연관성과 함께 해석해야 할 것이다. 이 그림을 통해 7개의 수질지표 및 20개의 phylum과의 연관성을 확인할 수 있는데, 예를 들어 4개의 BOD, COD, TN, TP는 그림상에서 미생물의 Phylum level에서는 BRC1, Chloroflexi, Fusobacteria, OD1, Proteobacteria, Spirochates, SR1, Synergistetes가 이 4개 항목 의 수질변화와 같이 연동함을 알 수 있었다. Proteobacteria, BRC1 등과 비슷한 위치에 놓이 는 것을 확인할 수 있다. 이는 두개의 phylum의 값이 커지면(두 생물종의 수가 많으면) 4개의

56 수질지표는 이와 연동하여 커짐을 의미한다. 이를 통해 어느 phylum들이 수질지표와 상관성 이 높은지 시각적으로 파악할 수 있다. 향후 더욱 구체적인 분석을 통해 이들 미생물과 수질 인자간의 상관관계를 더욱 살펴볼 필요가 있다 (Fig. 3-15). 아래의 그림은 요약된 정준변수를 통해 19개 지점의 상호간의 상관성을 나타내주는 그림이 다. Fig 정준변수분석을 통한 샘플링 사이트 간 상관관계 위의 그림상에서 19개지점이 2차원 그림으로 표시되어 있는데, 이는 각 지점의 오염정도 및 미생물의 수량과의 연관성을 보여준다(Fig. 3-15). 그림 상에 약어로 표현된 지점의 이름은 아 래표와 같다

57 Table 정준변수분석을 통한 샘플링 사이트 간 상관관계 Site 하천명 Site 하천명 X1 가막 X11 갑천5-1 X2 용포 X12 청원-1 X3 무주남대천-1 X13 연기 X4 영동 X14 미호천6-1 X5 초강2 X15 청동 X6 우산 X16 논산천4 X7 보청천4 X17 성동 X8 옥천 X18 강경 X9 대청댐4 X19 양화-1 X10 현도 예를 들어 X1(가막)은 가로축(Dimension 1)으로 양수의 값을 가지고 세로축(dimension 2)으 로 음의 값을 가지는데 이는 수질자료 및 OTU자료에 대한 제1정준변수 값이 양수이며, 제2 정준변수값이 음수임을 나타낸다. 제1정준변수값을 기준으로 하면, X1은 양수이므로 BOD, COD, TN, TP값이 상대적으로 큰 값을 가지는 지점임을 의미한다. 이러한 의미로 해석을 하면, 위의 그림은 19개의 지점을 오염도 및 미생물의 수량에 근거하 여 군집을 이루는 것을 알 수 있다. 군집에서 멀리 있는 X7 및 X10은 다른 지점에 비해 다른 패턴을 보여준다고 판단할 수 있다. 또한 일군의 군집도 다수의 군집으로 묶이는 것을 알 수 있는데 이는 수질오염 정도 및 미생물 발현정도에 따라 자연스레 묶이는 군집으로 이는 19개 측정지점의 지리적 인접성, 같은 하천의 상류, 하류 및 지천과 같은 요인과 연관되어 있을 것 이다. 예를 들어, X4(영동), X5(초강2), X6(우산), X8(옥천)은 그림 상에서 군집을 이루고 있는 데, 이는 모두 대청댐 상류에 위치한 측정지점으로 지리적 인접성을 띠고 있음을 확인할 수 있다 (Fig. 3-16, Table 3-10). 4. 한계점 및 보완방향 정준상관분석을 통하여 수질지표와 미생물 발현과의 연관성을 살펴볼 수 있었으며 부가적 으로 수질지표변수 및 미생물발현변수를 요약하여 연관성이 높은 상관변수를 구성하여 변수 간의 상관관계를 정량적으로 파악하였다. 정준상관분석은 연관성이 높은 변수를 정량적으로 파악하는데 효과적이지만, 그 연관성에 대한 통계적 유의성을 살펴볼 수 없다는 단점이 있다. 미생물발현이 수질지표에 미치는 정량적 효과 및 유의성을 판정하기 위해서는 다변수회귀분

58 석(multivariate regression analysis)를 사용하는 것이 바람직하다. 다변수회귀분석은 다수의 수질지표가 서로 상관성이 높게 존재하므로 이를 고려함과 동시에 미생물의 효과를 정량화하 여 해석하는데 바람직하다. 하지만, 관측된 지점의 수가 상대적으로 작기 때문에 일반적인 다 변수회귀분석을 시도하는 경우 분석의 신뢰도에 의문을 제기할 수 있다. 따라서 위의 기초분 석에 의거하여, 영향력이 없는 수질지표 및 미생물변수를 제거한 후 다변수회귀분석을 시도하 는 것이 바람직하다. 또한 미생물 관측은 동일지점에 대해 2회의 반복측정을 하였음에도 이를 적절히 고려한 방법론을 사용하지 않았다. 이는 수질자료가 미생물 관측시점과 동시에 이루어 지지 못함에 따른 부득이한 결과이다. 미생물 관측과 동일한, 혹은 비슷한 시점에서 관측한 수질자료를 취득할 수 있다면 반복측정에 따른 변동을 고려하여 정도 높은 분석 수행이 가능 할 것이다. 미생물을 phylum 단위로 묶어서 분석을 수행하였는데 이에 따른 부수적인 문제점 은 각 phylum에 속하는 미생물의 개수가 매우 상이하다는 점이다. 하나의 미생물로 구성된 phylum은 다수의 미생물로 구성된 phylum에 비해 관측에 의한 신뢰도가 떨어질 수 밖에 없 다. 위의 분석에서는 이러한 효과를 고려하지 않았다. 추후의 연구에서는 이러한 효과를 고려 한 분석이 필요하다. 또한 phylum이 아닌 하부 분류단위로 묶음을 통한 수질지표와의 연관성 분석을 통해 미생물 고유의 특성을 반영한 해석이 가능하게 하는 것이 향후 보완해야 할 사 항이다. 제 5 절 수생태계조사 자료 미생물생태 본 연구에서 사용된 분변성 미생물 데이터베이스 (DB)는 한우 73개 시료, 젖소 31개 시료, 돼 지 28개 시료, 닭 22개 시료, 오리 22개와 인간 29개 샘플로 구성하여 만들었다. 다음 그림은 각각 다른 종의 분변성 미생물의 분포도를 보여 준다. 물론 한우와 젖소의 경우 서식하는 분변 성 미생물 군집이 유사한 경향을 보이기는 하지만, 다른 종들 간 (닭, 돼지, 오리)에는 서식 미 생물이 다름을 알 수 있다. 그러나, 인간의 경우 상당히 넓게 분포 되어 있음을 또한 알 수 있 다 (Fig. 3-16)

59 (Black : 한우, Light blue : Fig 분변미생물생태 분석 젖소, Red : 닭, Green : 오리, Blue : 사람, Pink : 돼지) 아래 표에서 보여지는 바와 같이 각각의 종을 대표하는 분변성 미생물간의 p 값은 매우 적은 것(p < 0.001)으로 나타나 종들간 분변성 미생물의 특이성을 알 수 있었다. Table 분변미생물 유전자 Amova test 분변 소스 조합 Fs value p-value BC-Chiken-Duck-Human-MC-PIG <0.001* BC-Chiken <0.001* BC-Duck <0.001* BC-Human <0.001* BC-MC * BC-PIG <0.001* Chiken-Duck <0.001* Chiken-Human <0.001* Chiken-MC <0.001* Chiken-PIG <0.001* Duck-Human <0.001* Duck-MC <0.001* Duck-PIG <0.001* Human-MC <0.001* Human-PIG <0.001* MC-PIG <0.001*

60 또한 각 종들간 분변성 미생물의 특이성을 보기위해 metastats ( cbcb.umd.edu/detection.html) 분석을 실시하였다. 이 분석을 통해, 시료에서 특정 동물 미생 물 을 찾을 수 있었다 (Fig. 3-17). Fig 동물 특정미생물을 응용한 분변오염원 추적 이러한 총 217개의 분변성 시료의 시퀀스 결과를 가지고 주요 19개 지점에서 얻어진 하천수 시료의 시퀀스 결과와 상호 비교하였다. 아래 그림에서 파란색은 하천수에서 얻어진 미생물 군 집, 검은색은 분변에서 얻어진 미생물 군집의 생태적 비교를 보여준다. 그림에서 보여지는 바와 같이 분변성 미생물 군집과 하천수에서 발견된 미생물 군집은 서로 다른 원인에서 기인함을 보 여 준다 (Fig. 3-18). Fig 분변과 강물 간 미생물생태 차이 (Blue : 강물, Black : 분변)