2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp

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1 가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사 최종보고서 국립환경과학원

2 제 출 문 국립환경과학원장 귀하 본 보고서를 가축 매몰지 주변 지하수 병원성미 생물조사 연구 (연구기간 : 2011년 2월 10일 ~ 2011년 12월 10일)의 최종보고서로 제출합니다. 2011년 12월 10일 한국미생물학회 회장 남 두 현

3 연 구 진 총괄연구책임자 안태석 (강원대학교 환경학과 교수) 참여 연구자 가톨릭대학교 교수 백순영 강래형, 김충호, 김지연, 오동렬, 이보람, 조민규, 김민주, 김주은, 김지연, 백인원, 손우재, 이아라 강원대학교 교수 안태석 김주영, 김효숙 건국대학교 교수 이중복 이정아, 정은주, 김경민, 김은주, 박병주, 안효영, 이상은, 최슬기, 최수원 경희대학교 교수 정용석 구응서, 김원일, 유창훈, 유혜령 부산대학교 교수 장경립 김성현, 안형준, 오혜리, 우영주, 인디라 티와리, 임수연, 임주송 서울대학교 교수 고광표 윤현선, 김성연, 김수정, 김지영, 박성준, 시지연, 안경목, 이성희, 이희태, 조연우, 김현주 K Water 책임연구원 이규철 김민정, 민동예, 오성애, 이유진, 최상민 DK EcoV 환경미생물연구소(단국대) 연구소장 이옥재 안태영(단국대, 교수), 김민호, 김하나, 김현주, 이원정, 홍청화, 이진, 최재영 (주)바이오니아 센터장 윤홍란 이병기, 이소현, 최향순, 김지영 (주)아워홈 부원장 장성호 이수미, 김보연, 김현미, 안재현, 김재용 (주)쎄니젠 대표이사 박정웅 김상우, 우동진, 이원희, 임성빈, 전경일, 최선봉, 김성윤, 서상훈, 손용태, 양수진, 정재훈, 지용현, 최새봄, 김재상, 박광수, 박문수, 박용연, 박성욱, 박종우, 송민경, 윤현서, 정재훈, 진종성, 하수근

4 요 약 문 1. 연구의 필요성 최근 구제역 바이러스의 확산으로 전국에 가축 매몰지가 기하급수적으로 늘어났으며, 이러한 매몰지에서는 사체가 부패 하면서 침출수가 발생하게 된다. 침출수는 토양 생물 의 활동 및 지질학적 변동 등에 의하여 인근 지하수에 유입될 수 있으며, 침출수 내 오 염물질은 인간 및 가축들의 보건에 문제를 일으킬 수 있다. 따라서 매몰지 주변에 공급되는 지하수의 철저한 사후관리가 필요한 실정이나, 매몰지 로부터 병원체의 발생 및 거동에 대한 체계적, 정량적 이해가 이루어지지 않고 있으므 로, 매몰지역에서 병원성 미생물의 존재 여부를 조사하고, 토양 및 지하수의 생물학적 안전성을 확인할 필요가 있다. 이 연구에서는 전국 가축 매몰지 중 부실이 우려되는 매몰지 주변 지하수에서 병원성 미생물을 선정하여 해빙기 이전 및 강우 후 2회에 걸쳐 오염조사를 실시하고 향후 관 리 방안을 마련하고자 하였다. 1.1 사업명 가축매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사 1.2. 사업시행자 한국미생물학회, 한국바이러스학회 1.3 사업규모 소요예산 : 2,305,116,000원 사업기간 : ~ 연구 내용 연구목적 : 가축 매몰지 주변의 지하수에 대하여 국민건강 보호를 위한 바이러스 및 병 원성 미생물에 대한 조사를 실시하고, 지하수에 대한 사후 관리 방안을 마 련하고자 하였다. 4

5 대상지역 : 상수원 상류에 위치한 가축 매몰지를 중심으로 시료 채취가 가능한 경우 매 몰지 유출수를 포함한 300m이내의 지하수 1,000여개 지점을 선정하였다. 조사대상 : 분원성대장균군(Fecal coliform), 대장균(Escherichia coli), 병원성대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 노로바이 러스(Norovirus), 엔테로바이러스(Enterovirus) 정도관리 : 조사에 참여하는 기관은 정도관리를 통하여 세균과 바이러스 분석의 정확성 을 확보하고자 하였다 결과평가 : 모든 분석 결과를 취합 정리하고, 현장조사 항목과 기후 및 주변 환경 여 건 등을 조사하여 병원성 미생물의 분포와 관련된 물리화학적 요인과 주변 환경적 요인 을 검토하고자 하였다. 3. 연구 결과 3.1 대상지역 상반기와 하반기에 각각 1,003개, 1,000개 지점을 조사하였으며, 음용 지점은 상반기에 75.6%, 하반기에 67.9%를 차지하여 음용지하수 위주로 조사가 진행되었다. 지역별로 총 2,003개 지점 중 56.5%가 경기도에 분포하였고 경상도 19.8%, 강원도 15.6%, 충청도 6.9%, 전라도 1.2% 순으로 나타났다. 5

6 3.2 항목별 분석 결과 표 1. 조사항목 별 검출 결과 수온 ( ) 탁도 (NTU) ph 분원성대장균군 (MPN/100mL) 대장균 (MPN/100mL) 클로스트리디움 퍼프린젠스 (CFU/mL) 살모넬라 평균 상반기 하반기 전체 14.5 (1.5~28.0) 12.1 (1.5~25.0) 16.9 (6.5~28.0) 음용 14.4 (1.5~28.0) 12.1 (1.5~25.0) 16.9 (6.5~28.0) 비음용 14.4 (2.2~25.1) 12.2 (2.2~18.8) 17.1 (7.8~25.1) 전체 0.6 (0.0~38.8) 0.4 (0.0~35.3) 0.8 (0.0~38.8) 음용 0.4 (0.0~28.0) 0.3 (0.0~28.0) 0.5 (0.0~19.0) 비음용 1.0 (0.0~38.8) 0.8 (0.0~35.3) 1.2 (0.0~38.8) 전체 6.8 (4.8~10.4) 6.8 (5.0~8.6) 6.8 (4.8~10.4) 음용 6.8 (4.8~10.4) 6.9 (5.0~8.6) 6.8 (4.8~10.4) 비음용 6.7 (4.8~8.5) 6.8 (5.1~8.5) 6.7 (4.8~8.0) 전체 11.3 (0~2,419.6) 6.8 (0~2,419.6) 15.8 (0~2,419.6) 음용 12.3 (0~2,419.6) 5.5 (0~2,419.6) 19.7 (0~2,419.6) 비음용 8.8 (0~2,419.6) 10.5 (0~2,419.6) 7.5 (0~478.6) 전체 3.4 (0~2419.6) 1.4 (0~920.8) 5.3 (0~2419.6) 음용 3.8 (0~2419.6) 1.8 (0~920.8) 6.0 (0~2419.6) 비음용 2.3 (0~365.4) 0.4 (0~93.3) 3.7 (0~365.4) 전체 0.02 (0~11) 0.02 (0~11) 0.02 (0~4) 음용 0.02 (0~11) 0.02 (0~11) 0.01 (0~2) 비음용 0.03 (0~4) 0.02 (0~4) 0.03 (0~3) 전체 9 ((0.4%) 불검출 9 (0.9%) 음용 5 (0.3%) 불검출 5 (0.7%) 비음용 4 (0.7%) 불검출 4 (1.2%) 쉬겔라 전체 불검출 불검출 불검출 대장균 O157:H7 전체 불검출 불검출 불검출 노로바이러스 엔테로바이러스 전체 32 (1.6%) 13 (1.3%) 19 (1.9%) 음용 23 (1.6%) 11 (1.5%) 12 (1.8%) 비음용 9 (1.6%) 2 (0.8%) 7 (2.2%) 전체 26 (1.3%) 7 (0.7%) 19 (1.9%) 음용 13 (0.9%) 3 (0.4%) 10 (1.5%) 비음용 13 (2.3%) 4 (1.6%) 9 (2.8%) 3.3 정도관리 병원성 세균 분석 정도관리는 분원성대장균군(Fecal coliform), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens)를 대상으로 하였고, 정도관리 결과 10개 기관이 표준 정도관리 시료와 동 일 및 적합한 결과를 도출함으로써 정확한 분석이 수행되고 있음을 확인 하였다. 바이러스 분석 정도관리는 엔테로바이러스에 속하는 human coxsackievirus type B6 와 human poliovirus type 3로 제작하였고, 10개 기관 모두 적절한 결과를 도출함으로 6

7 써 분석결과에 대한 신뢰성을 확보하였다. 3.4 분석결과 평가 표 2. 1차 조사 시 행정구역 별 세균 검출 결과 시/도 용도 지점수 Fecal coliform E.coli C.perfringen s Noro virus Entero virus 강원도 경기도 경상도 충청도 총지점수 비음용 음용 총지점수 비음용 음용 총지점수 비음용 음용 총지점수 비음용 음용 % 1.5% 0.0% 1.5% 1.5% % 10.0% 0.0% 0.0% 0.0% 10.0% % 12.5% 1.8% 0.0% 1.8% 0.0% % 1.2% 1.0% 0.9% 0.4% % 4.6% 1.1% 1.7% 0.6% 1.1% % 2.4% 1.2% 0.8% 1.0% 0.2% % 3.4% 0.0% 2.4% 0.0% % 3.1% 1.6% 0.0% 1.6% 0.0% % 7.6% 4.2% 0.0% 2.8% 0.0% % 0.0% 2.1% 2.1% 6.4% % 0.0% 0.0% 0.0% 9.1% 9.1% % 0.0% 0.0% 2.8% 0.0% 5.6% 7

8 표 3. 2차 조사시 행정구역(도)별 세균 조사 결과 시/도 용도 지점수 Fecal coliform E.coli Salmonell a 강원도 경기도 경상남도 경상북도 전라남도 충청남도 충청북도 C.perfrin gens Noro GI Noro GII Entero virus 전체 % 17.9% 0.4% 0.8% 0.0% 0.8% 1.6% 비음용 % 22.6% 11.3% 1.6% 0.0% 0.0% 1.6% 1.6% 음용 % 22.8% 20.1% 0.0% 1.1% 0.0% 0.5% 1.6% 전체 % 9.6% 1.3% 1.6% 0.2% 2.7% 1.8% 비음용 % 15.3% 10.2% 1.7% 2.8% 0.0% 2.3% 2.3% 음용 % 16.6% 9.2% 1.1% 0.7% 0.4% 3.0% 1.5% 전체 % 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 비음용 % 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 음용 % 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 전체 % 5.5% 0.6% 1.1% 0.0% 1.1% 2.2% 비음용 % 19.0% 6.9% 0.0% 1.7% 0.0% 1.7% 3.5% 음용 % 21.8% 4.8% 0.8% 0.8% 0.0% 0.8% 1.6% 전체 % 8.7% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 4.4% 비음용 % 20.0% 20.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 음용 % 16.7% 5.6% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 5.6% 전체 % 6.8% 0.0% 0.0% 0.0% 1.7% 3.4% 비음용 % 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 12.5% 25.0% 음용 % 17.7% 7.8% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 전체 % 6.1% 3.0% 3.0% 0.0% 6.1% 0.0% 비음용 % 37.5% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 0.0% 음용 % 16.0% 8.0% 4.0% 4.0% 0.0% 8.0% 0.0% 8

9 표 4. 채수시기별 미생물의 검출현황 채취시기 지점수 음용 비음용 전체 분원성 대장균군 대장균 클로스트리디움 퍼프린젠스 살모넬라 노로바이러스 엔테로바이러스 상반기 1, ( 4.0%) 11 ( 4.5%) 41 ( 4.1%) 하반기 1, (19.1%) 56 (17.4%) 186 (18.6%) 총 계 2, (11.1%) 67 (11.8%) 227 (11.3%) 상반기 1, ( 1.7%) 3 (1.2%) 16 ( 1.6%) 하반기 1, (11.0%) 30 (9.3%) 105 (10.5%) 총 계 2, ( 6.1%) 33 (5.8%) 121 ( 6.0%) 상반기 1,003 5 (0.7%) 3 (1.2%) 8 (0.8%) 하반기 1,000 6 (0.9%) 6 (1.9%) 12 (1.2%) 총 계 2, (0.8%) 9 (1.6%) 20 (1.0%) 상반기 1,003 불검출 불검출 불검출 하반기 1,000 5 (0.7%) 4 (1.2%) 9 (0.9%) 총 계 2,003 5 (0.3%) 4 (0.7%) 9 (0.5%) 상반기 1, (1.5%) 2 (0.8%) 13 (1.3%) 하반기 1, (1.8%) 7 (2.2%) 19 (1.9%) 총 계 2, (1.6%) 9 (1.6%) 32 (1.6%) 상반기 1,003 3 (0.4%) 4 (1.6%) 7 (0.7%) 하반기 1, (1.5%) 9 (2.8%) 19 (1.9%) 총 계 2, (0.9%) 13 (2.3%) 26 (1.3%) 3.5 국내 전염병 발생 현황 국내 세균성 전염병 발생현황에서 살모넬라, 쉬겔라, 병원성대장균에 의해 발생한 전염 병 발생된 전국 통계와 본 연구대상 지역인 경기도와 경북을 중심으로 비교하였을 때, 부천, 수원, 화성 및 용인 등 인구 밀도가 높은 곳에서 세균성 전염병이 주로 발생하였 으며 상당수의 매몰지가 존재하는 이천, 안성, 파주 등에서는 발생되지 않았다. 강원도 횡성에서 많은 살처분이 실시되었으나 세균성 전염병 신고 사례는 없었으며, 경 상북도 역시 구미, 포항 및 경주 등 큰 도시 위주로 3~5건의 감염 사고가 접수되었고 안동 및 영주 등에서는 1~2건의 발생이 일어났다. 엔테로바이러스의 질병발생 경향은 2005~2009년 동안 주로 하절기에 발생하였으며, 4~8월에 걸쳐 다수 검출되었는데, 특히 6~8월에 높은 양성율을 보이고 있어서 여름철 이 엔테로바이러스성 질환이 주로 발생함을 알 수 있다. 9

10 노로바이러스의 경우 2011년에 보고된 감염사례와 본 연구에서 검출된 지점 및 바이러 스 타입을 비교하였을 때 지하수 내 노로바이러스의 검출과 감염사고 간에 관련성을 추 론하기는 어려웠다. 4. 결론 및 제안 총 2.003개의 지하수 중 302개 지점에서 미생물이 검출되었으며, 음용수의 14.4%, 비음용수의 16.8%에서 미생물이 검출되어 비음용 지하수의 검출율이 다소 높게 나 타났다. 각 병원성 미생물의 검출 양상은 상반기에 비하여 하반기에 검출률이 증가하였는데, 분원성대장균군은 4.1%에서 18.6%로 검출율이 높아졌으며, 대장균은 1.6%에서 10.5%로, 클로스트리디움은 0.8%에서 1.2%로, 살모넬라는 0.0%에서 0.9%로, 노로 바이러스는 1.3%에서 1.9%로 검출율이 증가하였으며, 엔테로바이러스는 0.7%에서 1.9%로 증가되는 경향을 보였다. 쉬겔라와 병원성 대장균 O157:H7은 전 지점에서 검출되지 않았다. 통계학적 분석 결과, 미생물 검출은 강수량과 상관관계가 있는 것으로 분석되었으나, 매몰지와 관정과의 이격거리와의 상관성은 없는 것으로 나타나, 매몰지의 침출수에 의한 직접적인 영향의 증거를 찾기는 어려웠다. 이전 연구에서 나타난 지하수 중 노로바이러스 검출율과 매몰지 주변 지하수에서 나 타난 검출율을 비교한 결과, 노로바이러스의 검출율은 1.6%로서, 2010년에 조사된 지하수의 노로바이러스 검출율인 8.0%보다 낮게 나타났다. 외국의 가축 매몰지 선정 규정과 달리 우리나라의 경우 매몰지와 인접한 관정의 상 당수가 음용수로 이용되고 있는 실정이므로, 위험요소에 노출될 가능성을 배제하기 는 어렵다. 매몰은 가축 사체의 처리에 가장 쉽게 수행되는 방법이지만, 분해가 잘되지 않는다. 그러므로 오랫동안 사체 잔존물이나 세균으로 오염된 침출수가 지하수 및 수원으로 유입될 경우 피해는 클 수밖에 없으며, 지하수의 안전을 확보하기 위해서는 장시간 이 소요된다. 더불어 기후변화에 의해 집중 강수량이 많아지는 현실에서 매몰지 뿐 아니라 주변으로부터의 오염 가능성도 관리되어야 할 것이다. 매몰지로부터의 이격거리와와 병원성 미생물의 세균 검출간에 직접적인 관련성이 나 타나지 않았지만, 매몰이라는 사체 처분 방식이 토양 및 지하수 오염의 가능성을 항 10

11 시 내포하고 있으므로 철저한 사후관리가 지속적으로 이루어져야 할 것이다. 부실 매몰지에 대한 보강 뿐 아니라 주민들에게 매몰지 관리에 대한 중요성을 인식 시키고, 지속적인 모니터링을 통하여 자료를 확보함으로서, 향후 유사한 사건이 발생 할 때 신속하게 대처할 수 있는 방안을 모색하고, 매몰지 등의 개선 방안을 제시하 며, 오염현황 특성을 파악함으로서 향후 가축 매몰지에 대한 미생물학적 및 환경보 건학적 관리방안에 대한 대책 마련과 오염물질이 지하수에 유입될 경우 대처할 수 있는 체계적이고 종합적인 관리 시스템을 구축하여야 할 것이다. 11

12 목 차 제 1장 서론 연구의 필요성 지하수 중 병원성 미생물의 중요성 세균 분원성대장균군 (Fecal coliform) 대장균 O157:H7 (E.coli O157:H7) 살모넬라 (Salmonella) 쉬겔라 (Shigella) 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 바이러스 엔테로바이러스 (Enterovirus) 노로바이러스 (Norovirus) 15 제 2장 연구사업 목적 및 내용 연구사업의 목적 및 범위 연구사업의 내용 조사지점의 선정 조사대상 매몰지의 시료채취 병원성 미생물의 분석 정도관리 최종분석결과의 평가 연구팀의 구성 및 추진체계 23 제 3장 연구방법 시료 채취 세균분석용 시료 25 1

13 3.1.2 바이러스 분석용 시료의 채취 분석 방법 현장 항목 세균 분원성대장균군 (Fecal coliform) 대장균 (E.coli) 병원성 대장균 O157:H7 (E.coli O157:H7) 살모넬라 (Salmonella) 쉬겔라 (Shigella) 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 바이러스 바이러스 시료의 전처리 엔테로바이러스 (Enterovirus) 노로바이러스 (Norovirus) 염기서열 분석 정도관리 세균분석 정도관리 분원성대장균군 및 대장균 (Fecal coliform and E.coli) 살모넬라 및 쉬겔라 (Salmonella and Shigella) 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 바이러스 분석 정도관리 통계학적 분석 39 제 4장 연구결과 및 고찰 연구대상지역 항목별 분석 결과 현장항목 지표세균 및 병원성 세균 분원성대장균군 (Fecal coliform) 대장균 (E.coli) 47 2

14 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 살모넬라 (Salmonella) 쉬겔라 (Shigella) 및 병원성대장균 O157:H 바이러스 (Virus) 노로바이러스 (Norovirus) 엔테로바이러스 (Enterovirus) 정도관리 병원성 세균 분석 정도관리 바이러스의 정도관리 바이러스 분석용 양성대조군 제작 분석결과 평가 행정구역별 비교 미생물의 검출특성 및 원인 분석 국내 전염병 발생 현황 병원성세균 바이러스 엔테로바이러스 (Enterovirus) 노로바이러스 (Norovirus) 108 제 5장 결론 및 제안 116 참고문헌 119 부록 128 3

15 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 표 차례 표 년 전세계 구제역 발생 현황 3 표 2. 외국의 노로바이러스 관리 현황 17 표 3. 매몰지 지하수 조사 현장을 위한 채수조사료 26 표 4. 엔테로바이러스 유전자 분석을 위한 primer의 구성 35 표 5. 노로바이러스 유전자 분석을 위한 primers 36 표 6. 노로바이러스 분석을 위한 반응액의 조성 37 표 7. 매몰지 주변 지하수 지점 현황 41 표 8. 조사시기별 현장항목의 기술통계량 43 표 9. 분원성대장균군의 기술통계 44 표 10. 음용과 비음용 지점수에 따른 분원성대장균군의 검출률 46 표 11. 대장균의 기술통계 47 표 12. 음용과 비음용 지점수에 따른 대장균의 검출률 49 표 13. 클로스트리디움 퍼프린젠스 (C. perfringens)의 기술통계 50 표 14. 음용과 비음용 지점수에 따른 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens)의 검출 률 52 표 15. 음용과 비음용 지점수에 따른 살모넬라(Salmonella)의 검출률 54 표 16. 살모넬라 검출지점에 대한 채수 기록 55 표 17. 노로바이러스 검출 현황 56 표 18 음용과 비음용 지점수에 따른 노로바이러스(Norovirus)의 검출률 58 표 년부터 2011년까지 지역별 노로바이러스(Norovirus) 검출율 비교 59 표 20 노로바이러스(Norovirus) 양성 염기서열의 Blast 검색 결과 62 표 21. 음용과 비음용 지점수에 따른 엔테로바이러스(Enterovirus)의 검출률 74 표 22. 각 분석기관별 세균의 정도관리 결과 76 표 23. 표준편차지수법 (SDI)에 의한 정도관리 결과 77 표 24. 정도관리용 바이러스의 구성 및 염기서열 분석 결과 78 표 25. 분석 기관별 바이러스 분석 정도관리 결과 80 1

16 표 26. 1차 조사 시 행정구역 별 세균 검출 결과 86 표 27. 1차 조사 시 행정구역 (시/군)별 조사 결과 87 표 28. 2차 조사시 행정구역(도)별 세균 조사 결과 89 표 29. 2차 조사시 행정구역 (시/군)별 병원성 세균 검출 결과 90 표 30. 미생물 검출지점수 비교 99 표 31. 채수시기별 미생물의 검출현황 100 표 32. 상반기 환경요인과 미생물과의 Pearson 상관관계 분석결과 101 표 33. 하반기 환경요인과 미생물과의 Pearson 상관관계 분석결과 102 표 34. 하반기 시료채취 기간 중 강수량과 병원성 미생물의 검출율 비교 104 표 년부터 2011년까지 발생한 국내 세균성 전염병의 발병 현황 106 표 년도 월별 엔테로바이러스 분리 현황 109 표 년부터 2010년 사이에 국내 노로바이러스의 지역별 발생 현황 115 표 년 국내 노로바이러스 역학조사 결과 117 2

17 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 그림 차례 그림 년 세계 각국의 구제역 발생 현황 2 그림 2. 대장균, 분원성대장균군 및 총대장균군의 관계 6 그림 3. 노로바이러스의 genome 구성 15 그림 4. 연구팀의 구성 및 추진 체계도 24 그림 5. 시료여과장치 모식도 27 그림 6. 바이러스 시료채취 28 그림 7. 가축매몰지 주변 전경 29 그림 8. 지역별 노로바이러스(Norovirus) 검출현황 60 그림 9. 상반기 검출된 노로바이러스 GI 유전자의 계통분류학적 분석 67 그림 10. 상반기 검출된 노로바이러스 GII 유전자의 계통분류학적 분석 69 그림 11. 하반기 검출된 노로바이러스 GI 유전자의 계통분류학적 분석 69 그림 12. 하반기 검출된 노로바이러스 GII 유전자의 계통분류학적 분석 71 그림 13. 바이러스 정도관리시료 제작을 위한 분석 결과 78 그림 14. 엔테로바이러스 분석의 정도관리를 위한 전기영동 결과 79 그림 15. 외부유전자 삽입을 위한 T4 ligation 81 그림 16. 양성대조군 제작 과정 81 그림 17. 노로바이러스 GI 및 GII의 양성대조군 82 그림 18. 엔테로바이러스 양성대조군 82 그림 19. 조사시기별 가축매몰지 주변 지하수의 미생물 검출률 비교 101 그림 20. 강우 전 후 지하수 심도별 총대장균군 농도 변화 (정 등, 2011) 102 그림 21. 강수량 변화 (2006년~2011년) 103 그림 년 전국 54개 주요하천의 강우량 변화에 따른 하천수 미생물 농도 변화 103 그림 ~2009년 엔테로바이러스 분리 현황 108 그림 년에 분리된 엔테로바이러스 혈청형 분포 108 그림 ~2009도의 월별 엔테로바이러스 분포 경향 109 그림 년 급성설사질환 원인바이러스의 발생 비교 115 1

18 그림 ~2011년도의 월별 급성설사질환 바이러스 분포 경향 116 2

19 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 제 1장 서론 1.1 연구의 필요성 국내에서 구제역은 2000년 3월 20일 경기도 파주에서 처음 발생되었다. 첫 발병 당시 국가에서는 긴급 조사에 착수하고 해당 젖소 15마리를 도살하였으나, 이 후 충남 홍성에서 소 15마리 수포성 질환 발생 신고가 접수됨에 따라 농가 20 km이 내 가축이동을 제한하였다. 이후 2002년 5월 3일 경기도 안성에서 다시 구제역 발 생이 신고 되면서 충북 진천, 경기도 안성 및 용인 지역에서도 구제역이 발생하였 으나, 동년 8월 14일에 구제역이 최초 발생한 지 105일 만에 발생신고가 접수되지 않음으로서, 구제역이 종식되었다고 선언하였다. 그러나 8년만인 2010년 경기도 포천에서 다시 구제역 발생이 확인되었으며, 경 기도 연천, 인천 강화와 김포에서 다시 구제역이 발생 하였다. 이 후 11월에 경북 안동의 3개 면, 동에서 돼지 및 한우 구제역이 발생하였고, 동년 12월에 들어 안동 시 농가 5곳과 예천, 영양, 봉화, 영주, 영덕 및 의성 등에서 구제역 발생이 보고되 었으며, 1개월 사이에 경기도 포천, 철원, 강원도 횡성, 춘천, 화천, 인천 및 연천 등 전국적으로 확산되어 4개 도 26개 시군구의 60곳에서 구제역이 발생하였다. 이 에 따라 2,059개 농장에서 443,442마리 (소 57,772, 돼지 383,191, 염소 2,047, 사슴 432)의 가축을 살처분하였으며, 방역비용과 살처분 보상 및 생계 안정금 지원 등으로 약 5천억원에 달하는 예산이 소요되었다. 2010년도의 구제역 발생은 국내에서만 국한된 것이 아니라 전 세계 곳곳에서 발 생하면서 많은 나라들이 큰 타격을 입게 되었는데, 아시아 19개국을 비롯하여 아프 리카 17개국, 유럽 2개국 및 중남미 1개국 등 39개 국가에서 구제역이 발생하였다 (그림 1 및 표 1). 구제역이 발생한 각 국가들은 구제역의 확산을 막기 위하여 가 축의 이동제한, 살처분 및 백신접종 등을 실시하였다. 특히, 구제역이 상시 발생하 는 중동, 아프리카와 인접한 유럽의 경우 1954년부터 살처분과 백신접종을 통한 구 제역 방역 체제를 구축하였으며, 1985년 유럽의회 지침을 통하여 구제역 발생지역 으로 부터 반경 3 km와 3~10 km를 각각 보호구역 및 감시구역으로 지정하여 방 역을 철저히 함으로써 구제역의 전파를 방지하는 정책을 시행하였다. 그러나 2001 년 영국에서 구제역이 발생하였을 당시 초동 방역에 실패함으로서, 400여만 마리의 가축이 살처분되었으며, 아일랜드, 프랑스, 네덜란드 등 유럽 전역에 구제역이 확산 되었다. 네덜란드 역시 발생지역 당초에는 반경 2 km이내 가축의 링백신(발생 지 역을 중심으로 일정 반경 내에서 백신을 접종하는 것) 접종 후 살처분하는 방식을 1

20 적용하고 있었으나, 정책 실패로 구제역이 확산되었다. 이에 따라 2003년 유럽연합 은 구제역에 대한 대응책으로서 응급적 백신 사용을 허용하는 방침으로 전환하였 다. 특히 영국은 백신접종지역 이외에도 백신접종 경계지역 (접종 지역에서 반경 10 km이상)을 설정하고 다른 지역으로 가축이 이동하는 것을 제한하며 추가발생 및 전파 상황을 추적 및 감시하도록 하였다. 한편, 일본은 발생 농가별 살처분을 원칙으로 하고 있으나, 2010년 미야자키현에 서 구제역이 발생했을 당시에는 백신접종 후 살처분 정책을 실시하였다. 구제역 상 시 발생국인 대만과 중국의 경우, 대만은 살처분과 링백신 사용을 원칙으로 하고 있으며, 1997년과 2009년 구제역이 전국에 퍼지면서 백신접종을 실시함과 동시에 발생 농장에 대해서 살처분을 실시하고, 발생지 주변 1 km에 대해서 차량과 사람 및 동물에 대한 이동 통제를 실시하였다. 또한 중국은 소, 돼지 및 양에 대하여 백 신접종을 의무화 하고 있으나, 구제역에 대하여 중앙정부에서 관리하지 않아 발생 현황을 신속하게 파악하는데 어려움을 겪고 있다. 그림 년 세계 각국의 구제역 발생 현황 (구제역종합정보사이트 fmd.go.kr) 2

21 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 표 년 대륙별 구제역 발생 현황 (OIE 세계동물보건기구) 발생대륙 아시아 (19개국) 아프리카 (17개국) 유럽 (2개국) 중남미 (1개국) 국가 아프가니스탄, 캄보디아, 중국, 대만, 홍콩, 인도, 일본, 카자흐스탄, 한국, 미얀마, 팔레스타인, 카타르, 사우디아라비아, 몽골, 태국, 예멘, 베트남, 말레이시아 버냉, 보츠와니, 부르키나파소, 코트디부아르, 이집트, 에티오피아, 가나, 말라위, 모잠비크, 나미비아니제르, 소말리아, 수단, 우간다, 짐바브웨, 잠비아, 남아프리카공화국 러시아, 터키 에콰도르 우리나라에서는 최근 구제역 바이러스의 확산으로 가축 매몰지가 기하급수적으로 증가한 상태이다. 이러한 매몰지에서는 장기간에 걸쳐 호기성 및 혐기성 분해가 일어나게 되고 사체의 부패 과정에서 침출수가 발생하게 된다. 침출수는 토양 생물의 활동 및 지질학적 변동 등에 의하여 인근 지하수에 유입될 수 있으며, 침출수에 포함된 화학적, 생물학적 오염물 질은 인간 또는 가축들이 직접적으로 이용하는 토양에 노출되어 주변 환경에 문제를 야기 시키거나 인근 주민 건강의 보건에 위해를 가할 수 있다. 따라서 매몰지 주변에 공급되는 지하수의 철저한 사후관리가 필요한 실정이며, 토양 및 지하수의 생물학적 안전성은 직, 간접적인 평가를 통하여 확인할 필요가 있다. 그러나 지금까지 매몰지로부터 병원체의 발생 및 거동에 대한 체계적이고 정량적인 이해가 이루어지지 않아 매몰지와 그 주변에는 생물학적 위해성이 상존하는 것으로 간주되어야만 하는 상황이다. 따라서 가축 매몰지역 주변 지하수에서 병원성 미생물의 존재 여부를 조사하 고 이에 근거하여 매몰지 주변의 지하수의 안전성을 평가하고자 하였다. 따라서 이 연구에서 는 전국에 기하급수적으로 증가한 가축 매몰지 중 해빙기 이전 및 강우기 및 강우 후 2회에 걸쳐 부실이 우려되는 매몰지의 주변 지하수에 대하여 병원성 미생물의 분포를 조사하였고 향후 관리 방안을 마련하고자 하였다. 1.2 지하수 중 병원성 미생물의 중요성 국민 건강관리 측면에서 지하수를 포함한 식수의 관리는 가장 중요한 국가 관 리 요소이다. 전 세계적으로 지하수 자원에 대한 수요는 증가할 가능성이 대단히 3

22 높으며, 국내의 정책에서도 지하수의 활용방안 및 개발 기술은 필수적이라 할 수 있다. 또한 국가적으로도 지하수 자원에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있다. 2006년 기준으로 우리나라의 지하수 개발 가능량은 연간 약 108억 5,000만 톤 수준이며, 이중 지하수 이용량은 전국 130 여만 개 취수공에서 37억5000만 톤으 로 수자원 총량의 3%에 해당이 되고, 용수 총 이용량으로 보면 전체의 약 11% 를 차지하고 있는 중요한 수자원이다. 그러나 지하수의 경우 그 이동경로나 정확 한 사용여부 등을 확인하기가 어려우므로 지하수의 관리는 국민의 보건위생학적 측면에서 매우 중요한 사안이다. 2004년 이후부터 국가지하수정보센터에서 지역 별로 산재에 있는 지하수원을 서로 연계하여 수위, 수온, 수질 등을 지속적으로 관측함으로서 수질 오염 등을 방지하고 있으며, 효율적으로 이용하기 위해 전국 320여 개 지하수원을 네트워크를 통해 관리하고 있다고는 하나 생활용수의 신고 및 누락 등이 시급한 문제이며, 전문 인력의 부족과 다원화로 인해 효과적이고 경제적인 관리에 문제가 있어 이에 대한 보완이 필요하다. 우리나라의 경우 집단 급식소와 식자재공급업체 특성상 사용용수로 지하수를 이용하지 않을 수 없는 실 정이며 이렇게 부득이한 상황 속에서 경제적 측면과 국민 건강 측면을 고려할 때 지하수에 대한 미생물적 위해요소 분석 (microbial Risk Analysis, mra)이 반드 시 선행되어야 하며 향후 위해요소 분석을 통한 위해요소 관리 (Risk Management) 방안을 마련하여 효율적이고 경제적인 지하수 관리를 시행하여야 한다. 이런 엄격한 관리를 통해 활용되는 지하수 자원의 경제적 가치는 현재 수 준에 10%만 수준을 향상시킨다 해도 단순히 최소 2,000억원 이상의 가치를 지니 고 있다고 추정할 수 있으며, 이는 미래 환경적인 측면과 관리 측면까지 감안할 때 지하수 관리의 경제적 가치가 얼마나 큰지를 판단할 수 있다. 특히, 수자원으로 유입되는 병원성 미생물은 오래 전부터 수인성 전염병 집단발 생의 주요 원인이 되어 왔으며, 병원성 미생물에 의한 수자원의 오염은 여러 경 로를 통해 이루어지는데 불완전한 하수나 분뇨처리로 인해 유입된 병원성 미생물 이 각종 생활용수로 유입되면서 이를 이용하는 사람들에게 전달되어 감염을 일으 키게 된다. 이런 측면에서 지하수에 대한 병원성 미생물의 실태조사는 국민의 건 강보호를 위하여 수행되어야 하며, 지하수의 사후관리를 위한 당위성을 갖게 된 다. 특히, 최근에 발생한 구제역으로 인해 전국에 기하급수적으로 가축 매몰지가 증가되었고, 매몰지 주변의 지하수를 이용하는 측면에서 병원성 미생물에 대한 안전성 확보는 매몰지 주변의 주민 건강보호 및 지하수의 사후관리를 위해 필수 적이라 할 수 있다. 따라서 본 과제에서는 지하수의 미생물학적 안전성을 확인하 기 위한 지표세균, 병원성 세균 및 바이러스를 선정하고, 가축 매몰지 주변 지하 4

23 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 수의 병원성 미생물의 분포실태를 파악하고자 하였다 세균 먹는물과 같은 생활용수로 사용되는 지하수는 병원성 미생물에 의하여 수인성 질병이 대규모로 발생할 우려가 있어, 공중보건의 측면에서 미생물에 대한 이해가 필요하다. 미생 물에 의해 발생하는 수인성 전염병을 관리하기 위하여 지표미생물을 지표로 사용하고 각 종 수질기준에 이를 활용하고 있다. 환경부 (2007)의 먹는물 수질기준 및 검사 등에 관 한 규칙 에 의하면, 수돗물의 미생물에 관한 기준은 일반세균, 총대장균군 (total coliform), 대장균 (E. coli) 또는 분원성대장균군 (fecal coliform)을 규정하고 있으며, 먹 는물 공동시설 (약수터, 샘터, 우물)에서는 여시니아균 (Yersinia)을 추가하고 있다. 먹는 물 가운데 암반대수층이나 용천수와 같은 지하수를 이용하는 샘물과 먹는샘물에는 중온일 반세균, 저온일반세균, 총대장균군, 분원성연쇄상구균 (fecal streptococci), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 (Salmonella), 쉬겔라 (Shigella), 아황산환원혐기 성포자형성균 (spore-forming sulfite reducing anaderobes, Clostidium) 등 모두 8개 항 목의 미생물을 규정하고 있다. 한편, WHO에서는 마시는 모든 물에 대하여 대장균 (E. coli) 또는 내열성 대장균군 (thermotolerant coliform, fecal coliform)을 규정하고 있으며, 미국은 안전먹는물법 (Safe Drinking Water Act)에 의하여 종속영양세균 (heterotrophic bacteria), 대장균군 (coliform; 분원성대장균군 및 대장균), Legionella, 장바이러스, Cryptosporidium과 Giadia lambria 등을 규정하고 있다. 일본은 건강관련항목 가운데 미생물 항목으로 일반세 균과 총대장균군을 규정하고 있으며, 캐나다는 캐나다 먹는물 수질지침 (The Guidelines for Canadian Drinking Water Quality)에서 총대장균군과 분원성대장균군을 규정하고 있 다. 유렵연합 (European Union, EU)에서는 총대장균군, 분원성대장균군, 일반세균, 분원 성연쇄상구균, 황산염환원 클로스트리디아 (sulfite-reducing clostiridia)를 규정하고 있 다. 이와 같이 각국의 미생물학적 규정은 지표미생물과 병원성미생물을 규정하고 있다. 수질오염은 결국 물에서 사는 생물체 주변 환경변화를 초래하기 때문에 서식 환경의 영 향을 받는 생물의 분포 및 종 조성을 조사하여 수질변화를 평가하는 방법, 즉, 생물학적인 평가가 물리화학적 용인의 분석에 의한 평가보다 근본적이며 궁극적인 조사방법이 된다. 이와 같이 주변 환경변화에 따라 분포양상이 변화함으로서 환경변화의 정도를 알려주는 미생물을 지표미생물 (indicator microorganisms)라고 하며, 이 중 사람이나 가축의 배설 물이 물로 유입되었음을 알려주는 미생물이 대표적인 지표 미생물이다. 특히 수인성 질병 은 배설물 오염과 밀접한 관계가 있으나, 자연계에서 병원성미생물은 비병원성 미생물에 5

24 비하여 훨씬 적게 분포할 뿐 아니라, 종류도 많으며 검출방법이 매우 까다롭고 검사자의 오염 우려와 같은 문제점들 때문에 비병원성이지만 분원성 오염원, 즉, 배설물과 관련성이 높은 특정 지표미생물의 분포상황을 대산 측정함으로서 수인성 질병 원인균의 존재 유무 를 파악하는 방법을 주로 사용하는 것이 일반적이다 분원성대장균군 (Fecal coliform) 대장균군 (coliform)은 수질오염의 지표세균으로 가장 널리 쓰이고 있다. 수인성 병원균 의 대부분은 장에서 서식하는 장내세균으로서 이들의 존재를 일일이 확인하는 것보다 장 내세균 군집의 한종류 존재하는 대장균군의 분포상황을 파악함으로서 배설물 오염에 의한 병원성 미생물의 존재 가능성을 확률적으로 나타낼 수 있다. 총대장균군과 함께 분원성대 장균군은 각국에서 규정하고 있는 가장 대표적인 지표미생물이라고 볼 수 있다. 분원성대 장균군은 온혈동물의 배설물에서 발견되는 그람음성, 무포자 간균으로서 44.5 에서 젖당 을 분해하여 가스와 산을 발생하는 호기성 또는 통성혐기성 간균으로서, 배양온도가 총대 장균군보다 높기 때문에 열저항성 대장균군이라고도 한다. 분변오염의 대표적 지표로서, 총대장균군에서 온혈동물의 장내온도를 감안하여 자연환경에 있는 세균의 성장을 억제하 면서 장내세균이 자랄 수 있는 온도에 배양함으로서, 총대장균군보다 특이성이 높아 분원 성 오염에 더욱 가까운 지표세균으로 간주된다. 특히 환경중에서 인간이나 다른 포유동물 및 조류의 분변에 많은 수가 존재하고 분변에 오염되지 않은 물이나 토양에서는 거의 발 견되지 않기 때문에 분변오염의 지표로서, 지하수의 수질 현황을 파악하기에 중요한 항목 이라고 판단된다. 그림 2. 대장균, 분원성대장균군 및 총대장균군의 관계 (안 등, 2009) 6

25 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 대장균 O157:H7 (E.coli O157:H7) 대장균 (Escherichia coli)은 혈청형에 따라 다양한 성질을 지니고 있으며, 대장 균은 균체를 구성하는 항원성분 (균체항원:O항원, 협막항원:K항원, 편모항원:H 항원)의 면역학적 특이성에 의해서 구별되며, 180여종의 O항원, 90종의 K항원, 50 종의 H항원으로 분류된다. 설사성 질환과 관련 있는 대장균은 장출혈성 대장균 (enterohemorrhage E. coli, EHEC), 독소성 대장균 (enterotoxigenic, E. coli, ETEC), 장병원성 대장균 (enteropathogenic E. coli, EPEC), 세포침입성 대장균 (enteroinvasive E. coli, EIEC), 장관흡착성 대장균 (enteroaggregative E. coli, EAggEC) 의 다섯 종류로 나눌 수 있다 (국립보건연구원, 2005). 대장균 0157:H7은 1982년 미국에서 집단 설사병이 2회에 걸쳐 발생하고 그 원 인균은 대장균 0157:H7 이라고 동정되었다. 그 후 이 대장균이 베로독소 (verotoxin)를 생산하고, 종래의 어떤 부류에도 속하지 않는 특수한 설사원성 대장 균인 것이 확인되었다. 이 부류의 대장균 감염증은 때때로 심한 출혈성 설사를 주 요한 특징으로 하는 임상증상을 나타내기 때문에 출혈성 대장염 (hemorrhagic colitis, HC)라고 불리고, 그 원인 대장균은 장관 출혈성 대장균 (enterohemorrhagic E. coli EHEC)이라고 명명되었다. EHEC의 임상증상으로는 무 증상 보균자, 단순 설사, 출혈성 장염, 용혈성 요독 증후군 (Hemolytic Uraemic Syndrome, HUS)의 다양한 임상 양상을 나타낸다. 대장균 0157:H7에 의한 질병 은 계절과 관계없이 발생하며, 여름철에 약간 많이 발생하는 편이다. 장관 상재 대 장균의 일종으로 널리 보균되어 있기 때문에 환자, 보균자, 동물의 배설물이 문제가 되고 있다. 이 균의 분포가 가축, 동물, 건강인, 자연환경 등 광범위하므로 원인식품 은 특별히 한정된 것이 없고 균에 오염되어 증식된 식품이면 무엇이든 원인체가 될 수 있다 (국립보건연구원, 2005) 살모넬라 (Salmonella) Salmonella균은 오염된 음식이나 물, 기구 등 다양한 전염원에 의해 사람이나 동 물에 질병을 일으킨다. 살모넬라 감염증의 임상 양상은 위장관염, 장염, 균혈증, 만 성보균상태 그리고 국소감염 등 다양한 증상을 보인다. 위장관계 감염 세균성 병원 체 가운데 장티푸스, 파라티푸스 및 살모넬라 병원체 (Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis 등)는 우리나라에서 토착화되어 있고 국가 감시질환 대상 병 원체로 중요시되고 있다. Salmonella균속은 장내세균과에 속하는 그람음성 간균이 7

26 다. Salmonella균속에 속하는 수많은 혈청형들은 사람과 동물에 병원체로 작용한다. 장티푸스의 원인균인 S. typhi와 파라티푸스의 원인균인 S. paratyphi A, B, C는 다 른 Salmonella와는 달리 사람에게만 감염되어 증상을 나타낸다. S. typhi는 bacteriophage에 의해 다시 세분 (phage typing)되며 이는 역학 조사에 중요한 자 료로 이용된다. 환경이나 음식물에 S. typhi가 생존할 수 있는 시간은 대변에서 60시간, 물에서 5~15일, 어름에서 3개월, 육류 8주등 생존 기간이 길고 추위에도 강해서 선진국에 서보다 위생 상태가 나쁜 개발도상국에서 유행이 계속되는 원인이 되고 있으며 보 균자 또한 중요한 발병 원인이 되고 있다. 주로 위장염을 일으키는 균종으로는 S. typhimurium, S. enteritidis, S. infantis, S. heidelberg 등이 대표적이지만 지역과 시대에 따라서 분리되는 빈도에는 차이가 있다. 살모넬라균속은 두개의 종으로 (S. enterica 와 S. bongori)로 분류되며, S. enterica는 S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae 그리 고 S. enterica subsp. indica의 6개의 아종 ( 亞 種 )으로 나뉘어진다. S. bongori는 이전에는 S. enterica subsp. bongori 로 명명되었으나 현재는 독립적인 종으로 분 류되어 있다. Salmonella 세포벽에는 lipopolysaccharide로 되어 있는 균체 (O)항원 이 있고 편모에는 편모 (H)항원이 있으며, 이들 항원의 조합에 의하여 다시 세분되 어 현재 2,500여종의 혈청형으로 구성되어 있다. 살모넬라증은 12~36시간의 잠복기간을 거쳐 발열, 두통, 복통, 설사, 구역, 구토 등의 위장증상이 나타난다. 탈수가 일어나고, 유아나 고령자는 중증이 될 수 있으 며, 급성증상은 1~2일 만에 사라지나 식욕부진과 설사는 7일간 계속되기도 한다. 때로는 급성장염으로 시작되어 패혈증이나 농양, 관절염, 담낭염, 심낭염, 폐렴, 농 피증, 신우신염 등을 초래하며, 유아나 고령자, 면역억제 환자가 사망하는 일이 있 지만 대단히 드물다. 장티푸스균의 병원소는 오직 사람이며 만성보균자가 될 수 있다. 때문에 장티푸 스보균자의 색출과 환자의 관리를 잘하면 장티푸스 감염을 효과적으로 예방할 수 있다. 장티푸스균을 제외한 기타 Salmonella균은 가금류, 돼지, 소, 이구아나, 거북 개 고양이 등의 애완동물, 설치류 등 가축 및 야생동물 모두를 병원소로 하고 있다. 인간의 경우 만성보균의 사례가 드물지만 동물과 조류에서는 보균율이 높다. 감염 된 동물에서 유래한 음식 또는 감염된 동물이나 인간의 분변에 오염된 음식물에 있 는 병원체를 섭취함으로서 흔히 감염사례가 발생한다. 불충분하게 조리되었거나 조 리되지 않은 계란 또는 계란 함유식품, 생우유 또는 생우유 함유제품, 오염된 음용 8

27 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 수, 육류 및 육제품, 가금류 및 가금류 제품에 의한 사례가 흔히 보고된다. 설사증 상이 있는 경우 사람과 사람간의 분변-경구 전파 역시 중요하다 (국립보건연구원, 2005). 국내 먹는물 수질공정시험기준 (환경부, 2007)에 의하면, 샘물, 먹는샘물 및 먹 는해양심층수에 존재하는 살모넬라를 분석하기 위하여 시험관법과 막여과법을 기술 하고 있으며, 250 ml에서 불검출되도록 규정하고 있다 쉬겔라 (Shigella) Shigella 속에 속하는 세균은 장관계 질환인 세균성 이질 (Shigellosis)을 유발하 며, 우리나라에서는 전염병 예방법에 따라 제1군 법정전염병으로 지정하여 관리하 고 있다. 병원체인 Shigella 균속은 1898년 일본의 Shiga에 의해 처음 분리되었고 현재 4개의 종이 있다. 일반적으로 오염된 식수의 섭취나 오염된 물로 조리한 음식을 섭취하는 경우 감 염이 이루어지고 병원소가 사람이며 고등영장류를 제외한 동물에게는 근본적으로 감염을 일으키지 않는다. Shigella 속은 장내세균과에 속하는 세균으로 운동성이 없 고 협막과 아포를 형성하지 않는 그람음성 간균이다. 락토오스를 분해하지 않으며, 당분해로 산을 형성하지만 기체를 형성하지 않는 생화학적 특성을 가진다. Shigella균속은 혈청군과 종의 분류가 일치한다. O 항원과 당을 이용한 발효 형태 에 따라 S. dysenteriae (혈청군 A), S. flexneri (혈청군 B), S. boydii (혈청군 C) 와 S. sonnei (혈청군D)로 분류되어지며, 혈청군 A는 15종, B군은 6종, C군은 18 종, D군은 1종의 혈청형으로 세분되어진다. 4가지 균속 중 S. dysenteriae의 병원 성이 가장 강하며, 이 균이 자연계에서 생존할 수 있는 시간은 물에서 2~6주, 우 유나 버터에서 10~12일, 과일이나 야채에서 10일, 의복에서 1~3주, 습기가 있는 흙에서 수개월, 위액에서는 2분, 60 에서는 10분 정도 생존할 수 있다. 균이 체내 로 들어 왔을 경우 잠복기는 보통 2~3일이며 주증세인 설사 양상에 따라 이질형 (dysenteric type), 콜레라형 (choleric type), 설사형 (diarrhea type)으로 나뉜다. 세균성 이질은 아직도 세계 도처에서 발생되며 설사질환으로 인한 전세계 연간 추정 사망자 285만명 가운데 세균성 이질로 인한 추정 사망자가 110만 명으로 보 고되고 있어 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 세균성 이질이 계속 유행하는 이유 중 하나는 소수의 세균만으로도 감염을 일으킬 수 있기 때문인데, S. dysenteriae 10~100개면 10~40%의 성인에게 감염을 일으킬 수 있으며 S. flexneri 2a는 개의 세균으로 25%가 발병하고 10 5 개의 세균으로 75%가 발병할 정도로 감 9

28 염력이 강하다. 전파 경로는 물이나 식품을 매개로 전파될 수 있는데, 선진화된 국가에서는 집단 급식이 세균성 이질 집단 발생의 주요 원인으로 알려져 있고, 우리나라 역시 1998 년 이후 급격히 증가된 세균성 이질의 집단발생의 주요원인으로 집단 급식이 보고 되고 있다 (국립보건연구원, 2005). 국내 먹는물 수질공정시험기준에 의하면, 샘물, 먹는샘물 및 먹는해양심층수에 존 재하는 쉬겔라를 분석하기 위하여 시험관법과 막여과법을 기술하고 있으며, 250 ml에서 불검출되도록 규정하고 있다 (환경부, 2007) 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringnes) 혐기성세균 중 Colstridium perfringens는 지표생물로 사용되고 있다. C. perfringens는 그람양성의 절대혐기성 간균으로 포자를 형성하는 특성을 지니고 있 으며, 주로 인간이나 동물의 배설물에서 발견된다. 오염된지 얼마되지 않은 수계에 는 대장균의 개체수가 C. perfringens보다 많지만, C. perfringens는 포자를 지니기 때문에 다른 분변성세균보다 훨씬 오래 생존할 수 있다. 따라서 C. perfringens는 오래전의 오염이나 간헐적인 오염을 나타내는 지표생물로 적당하다. 수계에서 C. perfringens의 분리 및 개체수는 포자의 내열성을 이용하여 측정한다 (안 등, 2009). 건강한 사람이나 동물의 장관 내, 토양, 하수 및 먼지 등 널리 자연계에 상재하고 있는 이 균은 독소의 종류와 양비 ( 量 比 )에 따라 A~E의 다섯 가지 독소형이 존재 한다. 그 중 A형 균이 대표적인 식중독 원인균이고, C형 균에 의한 것도 보고되고 있다. 발육최적온도는 일반세균보다 높은 43~47 이고, 세대시간은 10~12분으로 대단히 짧으며, 발육 ph 영역은 5.5~8.0 이다. 포자는 내열성이어서 100 에서 1~4 시간의 가열에서도 사멸되지 않으며, 난원형이고 균체의 끝에 가까운 곳에 생 긴다. 포도당이 풍부한 배지에서는 짧은 간균이 되며, 전분이 많은 배지에서는 형태 가 길어진다. 협막이 있으며, 특히 조직 검체에서 분리한 균에 많다. C. perfringens 의 집락은 일반적으로 백색이며, 혈액배지나 난황배지에 배양할 때 집락 주변에 용 혈대나 유백색 띠가 생긴다. 아황산염이 들어있는 배지에서는 아황산 환원 때문에 집락이 검게 된다. Clostridium perfringens 균은 1890년대에 영국, 독일, 프랑스에 서 각각 개별적으로 발견되었고, 임상재료에서 분리되는 클로스트리디움속 중에서 가장 많이 분리되는 균이다. 대부분의 C. perfringens 설사 질환은 오염된 육류의 섭취 후에 폭발적으로 발생 10

29 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 하는 경우가 많고 잠복기는 매우 짧아 6~22시간, 평균 12시간이다. 다량의 C. perfringens 균을 섭취한 경우에는 잠복기가 단축된다. 집단발병 시 살모넬라 장염 등의 감염형에 비하여 잠복기의 폭이 좁고, 환자는 단시간에 집중하여 발병한다. 주 요 증상은 설사와 복통이며, 설사는 수양성으로 1일 1~3 회인 경우가 많고, 드물 게는 점액변이나 혈액변이 배출되기도 한다. 구역질, 구토, 발열은 일부환자에서만 드물게 볼 수 있다. 환자는 일반적으로 가벼운 증세를 보이고, 통상 발병 후 6~24 시간이 지나면 회복된다. 음식물 이외의 원인에 의한 C. perfringens 설사는 산발적 으로 발생하며 증상 발현 기간이 길어 Campylobacter 또는 Salmonella 감염과 유 사한 임상 양상을 보인다. C. perfringens에 의한 식중독은 이 균이 일으키는 여러 가지 질병 중 가장 흔한 것으로, 보통 육류 식품에 그램당 10 5~6 개 이상의 C. perfringens가 오염된 식품을 섭취한 후, 장독소에 의해 일어난다 (국립보건연구원, 2005). C. perfringens를 수인성 오염의 지표세균으로 제시하는 이유는 3가지로 설명할 수 있다. 첫째, 지표생물은 소독제나 환경변화에 대하여 내성을 가져야 한다. C. perfringens은 이러한 관점에서 좋은 지표생물이다. 독성물질이 섞여있을지도 모를 시료나 염소 소독된 시료, 그리고 추운 겨울철의 시료에서는 대장균보다 더 좋은 지표생물로 간주된다. 둘째, 지표생물은 간편하고 신속하게 검출할 수 있어야 하고, 다른 종과 구별이 모호하지 않아야 한다. 이러한 점에서 C. perfringens는 sulfite를 포함한 한천배지에서 특이한 생장을 보임으로써 쉽게 검출이 가능하다. 셋째, 실험 실로 시료를 운반하는데 12시간 이상이 걸릴 때는 대장균군보다 더 좋은 지표생물 이 된다. C. perfringens는 특별한 장치 없이도 오래 시료를 보관하여도 수의 변화 가 적은 특징이 있다 (안 등, 2009) 바이러스 사람의 배설물에는 100 여종 이상의 바이러스가 있으며, 이들은 소아마비, 바이 러스성 장염, 간염 등의 질병을 대표적으로 일으킨다. 바이러스는 염소나 오존과 같 은 살균제에 대한 내성이 세균에 비해 강하여 세균성 지표생물이 기준 이하인 물에 서 종종 많은 바이러스가 검출되는 경우가 있으므로 식수의 지표생물로 사용할 필 요가 있다. 자연수계에서의 바이러스 개체수는 0.1~1 개체/L 정도이고 폐수에서도 0.1~1 개체/mL에 불과하여 바이러스를 검출하기 위해서는 특별한 농축과 정제과정 을 필요로 한다. 농축된 바이러스는 숙주가 되는 세포에 접종하여 바이러스성 세포 병변효과 (CPE)의 생성을 확인하거나, 분자생물학적 방법에 의해 검출한다. 바이러 11

30 스는 살아있는 생물에서만 증식을 하기 때문에 수중에서 증식해서는 안된다는 조건 에 가장 적합한 지표미생물이다. 또한 장기간에 걸쳐 생존이 가능하기 때문에 좋은 지표미생물이다 (안 등, 2009). 미국의 경우 음용수 수질기준 외에 CCL 3 (Contaminant Candidate List)을 발효 하여 상수원에서 미규제 유해 미생물을 제안하고 있다 (USEPA. 2009). CCL 3에 서는 Campylobacter jejuni, E. coli O157, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium, Salmonella enterica 및 Shigella sonnei 등 7 종의 세균과 원생동물인 Naegleria fowleri 등 총 12종의 유해미생물 중에 Adenovirus, Calicivirus, Enterovirus 및 Hepatitis A virus 등 4종의 바이러스가 포함되어 있다. WHO의 음용수 가이드라인에서는 Adenovirus, Enterovirus, Hepatitis A virus, Hepatitis E virus, Astrovirus, Norovirus, Sapovirus 및 Rotavirus 등 8종의 바이러스가 포함되어 있으며, 위락용수에는 Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Hepatitis A virus 및 Hepatitis E virus 등 5종의 바이 러스가 포함되어 있다. 또한 호주의 음용수 가이드라인에는 유해 미생물의 목록을 확보하여 관리하고 있는데, Adenovirus, Enterovirus, Hepatitis virus, Norwalk virus, Reovirus 및 para-rotavirus 등 7종의 바이러스가 유해미생물 목록에 포함 되어 관리되고 있다. 우리나라 환경부에서는 우선관리대상 목록 (PML) 을 설정하고 관리하기 위한 연구용역을 수행한 바 있으며, 이 목록에서는 Campylobacter jejuni, EHEC, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium, Salmonella spp., Shigella spp., Giardia, Norovirus, Enterovirus 및 Hepatitis A virus을 제안하였고, Helicobacter pylori, Clostridium, Vivirio spp., Leptosporidium, Cryptosporidium, Giardia, Naegleria fowleri, Acanthameoeba spp., 및 Rotavirus 등을 후보목록으로 제안하고 있다. 이들 중 Entrovirus (바이러스 표준시험법에 의한 총세포배양법 적용), Giardia 및 Cryptosporidium은 정수처리에 관한 기준 (환경부, 2008) 으로 상수원에서 관 리되고 있으며, Norovirus의 경우에는 환경부에서 지하수에 대하여, 식품의약품안전 청에서는 식품제조용수에 대하여 조사토록 표준시험방법을 제정하여 관리하고 있다 (국립환경과학원, 2007; 식품의약품안전청, 2008). 이를 정리하면, 물환경과 관련한 주요 바이러스 병원체로서는 Norovirus 및 Enterovirus가 공통적으로 포함되어 있 다. 이는 공통된 이들 바이러스가 물 환경 중 주요한 병원성 바이러스로 인식되고 있다고 보여진다. 12

31 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 엔테로바이러스 (Enterovirus) 엔테로바이러스는 positive sense ssrna virus로서 Picornavirus 과 (Family), Enterovirus 속 (Genus)에 속하며, 폴리오바이러스, 콕사키바이러스 A그룹, 콕사키 바이러스 B그룹, 에코바이러스 등을 일컫는데, 현재 약 70여종이 알려져 있다 (Berlin et al., 1993; Minor et al., 1994). 엔테로바이러스는 포유동물의 분변에서 배출된 후 하수, 처리수, 지표수 또는 지하수 등에 오염되어 경구 경로를 통해 인체 에 유입된 후 소화기계에 감염되는 장관계 바이러스 (enetric virus)이다 (Abbaszadegan et al., 1995). 엔테로바이러스는 전 세계적으로 분포하고 있고, 감 염률은 계절, 지리적 위치, 연령, 사회 경제적인 상태에 따라 매우 다양하게 나타난 다. 발병은 일 년 내내 일어나고 특히 온대지역에서는 여름과 가을에 발병률이 높 고, 열대지방에서는 연중 꾸준히 발생한다. 엔테로바이러스의 유행은 재감염에 의하 기 보다는 집단에 감수성이 있는 사람들 간의 신체적 접촉에 의하여 유행하고 바이 러스 감염자의 구강, 인후부 및 장에서 검출되며, 분비물 및 분변의 형태로 인체에 서 방출된다. 엔테로바이러스에 감염된 사람의 분변에는 1 g 당 약 10 6 ~10 9 개의 바이러스 입자가 존재하며 분변을 통하여 배출되어 직 간접적으로 음용수로 사용되 는 상수원수를 오염시키게 된다. 엔테로바이러스의 주된 전파는 분변-경구경로로 알려져 있다. 그러나 예외적으로 상기도 감염을 일으키는 콕사키바이러스 A21은 호흡기로 전파하는 반면에, 출혈성 결막염을 일으키는 엔테로바이러스 70은 어떤 매개물 (fomite)나 손으로 전파된다. 가족 내에 바이러스가 침입하면 감수성 있는(특이항체가 없는) 가족에게 이차 감염 을 시키는데, 이차감염의 검출률은 야생형 폴리오바이러스의 경우 90~100%, 콕사 키바이러스는 76%, 에코바이러스는 50% 이하로 보고되었다 (Lin et al, 2003). 에 코바이러스의 경우 이차 감염률이 낮은 이유는 대변으로만 짧은 시간동안 균이 분 비되기 때문에 이차 감염률이 낮다. 뉴욕시에서 4년 동안 가족대상 연구에서 291회 의 엔테로바이러스 감염이 있었고 그 중 6명만이 발진을 보인 것으로 보고되었다 (Lin et al, 2003). WHO 보고에 의하면 엔테로바이러스 감염의 3/4은 15세 이하에서 발생한다고 보 고되었다. 미국 뉴욕 로체스터에서 엔테로바이러스 감염빈도는 생후 1개월에 12.8%였고, 증상을 보이는 감염은 생후 2개월이 지나면서 감소하는 경향이 있는 것으로 보고되었다 (Melnick, 1984). 사회 경제적인 상태가 낮은 집단에서 감염의 빈도가 높은데 이것은 군집생활로 인한 위생상태가 좋지 않은 환경에서 대변에 의 한 오염의 기회가 높은 것과 관련이 있는 것으로 보고되었다 (Ho et al., 1999). 13

32 엔테로바이러스로 인한 질병의 임상증상은 매우 다양하며 그 심한 정도는 바이러 스의 형에 따라 다르고 연령과 반비례한다. 임상 발병 양상이 매우 다양하여 바이 러스 형에 따라 수족구병(hand, foot and mouth disease), herpangina, 급성 출혈결 막염, 호흡기 질환, 위장관 질환, 심근염과 심낭염, 신경계질환, 췌장염과 고환염, 근염과 관절염 및 신생아 질환 등으로 전신적 기관에 병변을 유발한다 (Cha, 2008). 국외의 임상사례를 보면 불가리아 (1975), 헝가리 (1978), 말레이시아 (1997), 그리고 타이완 (1998)에서 20명 이상이 엔테로바이러스 71 형에 감염되어 다양한 질병으로 사망하였다고 보고되었다 (Ho et al., 1999). 엔테로바이러스는 하수, 바닷물, 특히 강 또는 하천에서 다양한 타입의 엔테로바 이러스가 검출되는 것으로 알려져 있는데, 1994년 미국의 한 바닷가 주변 작은 수 영장에서 135명 중 물을 삼킨 34 명에게서 엔테로바이러스 감염이 되었다고 보고 된 사례가 있었다 (Kee et al, 1994). 또한 1998년 스위스의 karst지역의 약 3500명이 살고 있는 마을에서 대규모 장 염감염이 발생하였다. 전체 마을사람 중에서 50% 넘는 사람들에게서 장염증상이 보이는 사례가 보고되었는데 식수로 사용하는 정화조 펌프의 결함으로 인하여 오염 된 식수를 섭취하여 발생 하였다고 보고되었다. 이 지역의 물과 사람의 분변을 채 취하여 PCR방법으로 조사한 결과 높은 농도의 노로바이러스와 엔테로바이러스가 검출되었다 (Häfliger et al, 2000). 국내 환경 사례를 보면 2008년에 한국의 경기도 지역에서 팔당호, 한강수계, 임 진강, 한탄강, 기타하천 및 지하수 등을 취수원으로 하는 43개 정수장의 원수 57건 에 대하여 바이러스 분석을 실시한 결과 57건 중에 19건의 엔테로바이러스가 ICC-PCR 방법을 통하여 양성으로 보고되었다 (Kim et al, 2008). 이 외에도 급성 출형성 결막염은 엔테로바이러스 70 형, 콕사키바이러스 A24형, 콕사키바이러스 B3, 에코바이러스 6 과 7형이 원인이다. 국내의 경우 엔테로바이러 스에 의한 급성출형성 결막염이 7~8년 주기로 대유행을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 1974년, 1980년, 1987년, 1994년 및 2002년에 전국적으로 유행을 일으켰 다 (Cho et al, 2003). 지하수에서 바이러스가 검출된다는 것은 식수의 잠재적 감염원으로서 역할을 할 수 있고, 특히 영아, 노인, 그리고 면역기능 저하자가 감염될 경우 치명적인 합병증 으로 진행될 수 있기 때문에 수인성 바이러스에 대한 관리는 국민 보건의 안전성을 확보하는데 매우 중요하다고 할 수 있다. 14

33 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 노로바이러스 (Norovirus) 노로바이러스는 Caliciviridae과에 속하며, 27~30 nm 크기의 정 20면체의 바이 러스로서, 약 8.7 kb의 염기로 구성된 단일가닥의 RNA을 가지고 있다 (Schwab and Hurst, 2006). 그림 3. 노로바이러스의 genome 구성 노로바이러스의 전체 genome은 ORF1, ORF2, ORF3로 이루어지며, ORF1의 경 우 RdRp를 포함하는 비구조적 단백질을 암호화 하며, ORF2와 ORF3는 각각 VP1 과 VP2를 암호화 한다. 특히 캡시드 단백질을 이루는 VP1부위는 다시 S, P1 및 P2의 3가지의 domain으로 나누어진다 (kageyama et al., 2002). 노로바이러는 RNA-dependent RNA polymerase와 캡시드 단백질의 염기서열에 의해 5개의 genogroup (GI, GII, GIII, GIV, GV)으로 나누어지며, 이 중 GI, GII 및 GIV가 사 람에게서 발견되어 진다 (Lodder and Husman, 2004; Rosa et al., 2007). 사람 노로바이러스는 100개 이상의 바이러스주 (strain)가 있으나, 세포배양이나 적당한 동물 감염 모델이 없어 특성화에 어려움 (Schwab and Hurst, 2006)이 있 다. RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)에 의한 염기서열 분석 (sequencing)으로 바이러스를 특성화하고 다른 바이러스주와의 관련성을 이해 하는 주된 방법 (Jiang et al., 1993)으로 사용된다. RT-PCR에 의한 분석은 RdRp (Rosa et al., 2007; Gilgen et al., 1997; Maunula et al., 2005; Lodder and 15

34 Husman, 2004) 또는 캡시드 유전자 (Kageyama et al., 2002; Gilgen et al., 1997; Kim et al., 2005)를 분석하고, 계통분류학적 분석을 통해 노로바이러스를 분류하는데, Zheng 등 (2006)은 노로바이러스의 아미노산 서열을 근거로 노로바이 러스 GI을 8개의 클러스터 (cluster)로 GII는 17개의 클러스터로 분류되며, Kageyama 등 (2004)은 노로바이러스 GI을 14개의 유전형 (genotype)으로 GII는 17개의 유전형으로 분류된다. 물환경에서는 바이러스가 낮은 농도로 존재하기 때문 에 일반적으로 RT-PCR과 nested-pcr방법이 사용되고 있다 (국립환경과학 원,2010). 노로바이러스에 의한 식중독 증세는 오심(주요 증상), 구토, 복통, 설사, 발열로 어린이들에게 구토가 많이 나타나고, 어른들에게는 설사가 주로 나타난다 (Gwack et al., 2010). 감염 환자의 절반 이상은 구토를 동반하며 드물지만 노인이나 환자 등에서 심한 탈수현상으로 사망하는 경우도 있다. 잠복기는 24~48시간이며, 증상 은 발현 후 12~72시간 내 호전되는 것이 전형적이다 (Ryu et al., 2011). 감염 경 로가 매우 다양하여, 개인간의 접촉 감염, 분변-구강 감염, 에어로졸 감염과 오염 된 물과 음식을 통한 감염 등이 모두 가능하다 (Iritani et al., 2010). 바이러스의 변종 또한 다양하며, 어패류 오염이나 오염된 물로 인한 경우 2가지 이상의 변종 노로바이러스에 의한 동시 감염도 흔하다. 바이러스가 빠르게 확산되는 이유는 소 량으로 감염되기 때문에 미세 물방울, 의복이나 침구, 사람 대 사람의 전파, 그리고 주변 환경오염에 의한 감염이 쉽게 일어나며 가족이나 주변사람에 의한 2차 감염, 3차 감염도 많이 일어난다 (Navarro et al., 2005). 특히 학교, 병원 양로원 등에서 집단 급식이 최근 증가하면서 노로바이러스에 의한 집단 장염 사례가 지속적으로 보고되고 있다 (식품의약안전청, 2010). 미국, 유럽연합, 일본 및 호주 등의 선진국에서는 노로바이러스를 비롯한 병원성 미생물에 대한 관리 규정을 법규화하는 작업이 진행 중에 있으며, 미국은 이미 EPA를 통해 법제화가 시행된 상황이다. 그러나 선진국에서도 지하수의 노로바이러 스 오염과 환자 발생을 제외한 주변의 물리화학적 환경 요인을 연관하여 분석한 광 범위한 조사결과는 없으며, 이는 연관성 자체에 큰 의미를 두기 어려운 것과 조사 과정 자체의 어려움이 그 이유라고 할 수 있다. 노로바이러스에 의한 장염이 선진 국형 질병임을 감안하면, 지하수에 대한 관리기술 확보 및 광범위한 실태 조사는 매우 중요하다고 할 수 있다. 16

35 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 표 2. 외국의 노로바이러스 관리 현황 국가 현 황 미국 ㆍGround Water Rule제정(2006년 11월) - 물 살균 장치의 경우 위해 바이러스의 99.99% 제거율 모니터링 실시 유럽연합 ㆍWater Framework Directive 제 17조(2005년 1월 1일) 일본 호주 ㆍ지하수 관리 : 수질오탁방지법 제15, 16, 17조 - 지하수 수질의 상시 감시 및 일반 공개 ㆍ 식품위생소육법으로 노로바이러스를 관리 - 환자 가검물과 굴에 대한 검사법 수재(일반 식품에 대한 검사법 미확립) ㆍ식품 중 노로바이러스 관리 규정 없음 ㆍ기본적으로 Codex 준수(식품 영업자의 HACCP을 준수 규정) - Standard of the Australian Food Standards Code 2006년도 미국 CDC (2009)에 의하면, 전체 확정된 식중독 사고의 40%가 노로 바이러스에 의한 것이며, 세균 (23%), 화학물질 (5%) 및 기생충 (1%) 순이었고 원인불명 (unknown)이 29%였다. 원인불명 중 높은 비율이 노로바이러스일 것으로 추정하고 있다. 또한 오염경로가 파악된 348건의 노로바이러스 발생 중 식품 매개 가 39%, 사람 대 사람의 접촉에 의한 원인이 12%, 수인성이 3%였으며, 원인불명 및 미확인이 46%를 차지하였다 (CDC, 2001). 일본에서 1998년부터 2003년까지 조사된 결과에 따르면, 노로바이러스 식중독 발생은 항상 1월에서 4월 사이에 가장 발생 빈도가 높은 뚜렷한 계절성을 보였다. 이는 우리나라를 포함한 대부분의 국가 에서 공통적으로 나타나는 경향이다. 미국의 경우 음용수에 의한 장염 발생 중 지 하수와 지표수의 비율은 87.5% 대 12.5%였으며 (CDC, 2008), 수돗물이나 판매되 는 병입수가 아닌 경우에 노로바이러스에 의한 장염을 일으킬 수 있는 주요 음용수 는 지하수라고 볼 수 있다. 환경에서 노로바이러스에 대한 연구는 많은 어려운 점을 내포하고 있다고 보여 진다. 인간 노로바이러스는 세포배양이 되지 않아 환경에서 노로바이러스의 생존은 잘 알려져 있지 않다 (Schwab and Hurst, 2006). 이는 노로바이러스를 연구하기 위해서는 대부분 유전자의 일부를 검출하는 방법을 이용하게 되나, 유전자의 검출 이 노로바이러스의 생존이나 감염성에 대한 확인이 불가능한, 분석 방법에서의 단 점을 가지고 있기 때문이라고 생각된다. 지원자를 대상으로 수행한 연구에서 노로 바이러스는 실온, ph 2.7에서 3시간 노출되었을 때도 감염성을 유지하는 것으로 알 려져 있으며, 염소에 매우 저항성이 있는 것으로 보고 (Schwab and Hurst, 2006; 17

36 Keswick et al., 1985)된 바 있으나, norwalk-like virus의 대체물 (surrogate)인 고양이 calicivirus (feline calicivirus)를 대상으로 한 염소 불활성화 연구 (Thurston-Enriquez et al., 2003)에서는 분산된 상태 (dispersed)에서의 고양이 칼리시바이러스는 99% 제거 소독능 (CT value)의 평가에서 미국 내 정수처리 시 일반적으로 적용되고 있는 유리잔류염소 농도 (1 mg/l)와 접촉시간 (60~237 분) 에서 불활성화가 되는 것으로 보고하였다. Shin과 Sobsey (2008)는 RT-PCR를 이 용하여 염소에 대한 노로바이러스의 불활성화에 대하여 보고하였는데, 정제 (purified)되거나 분산 (dispersed)된 노로바이러스의 불활성화는 MS2 coliphage와 유사하였으며, poliovirus 1 의 불활성화율이나, 미국의 Surface Water Treatment Rule에서 제시한 불활성화율 보다 낮아 적절한 정수처리 시 충분하게 제거되는 것 으로 보고하였다. 국내의 경우, 2008년에 환경부에 의해 전국의 지하수 300여 곳을 대상으로 하는 노로바이러스 오염 실태를 조사한 바 있다. 더불어 국립환경과학원 (2010)에서는 지하수에서 노로바이러스를 관리하기 위하여 지하수 중 노로바이러스 관리 매뉴 얼 을 제작하여 지하수 관리자에게 노로바이러스 관리를 위한 정보를 제공하고 있 다. 이 등 (2008)은 서울시 6개 원수 및 왕숙천에 대한 노로바이러스 GI과 GII를 대상으로 PCR과 semi-nested PCR를 수행하고, 클로닝과 염기서열 분석을 통해 얻어진 염기서열을 검색하여 노로바이러스 분포를 확인한 결과, 노로바이러스 GII 는 GI에 비하여 빈번하게 검출되고 있었으며, 계절적으로는 수온이 낮았던 시기에 노로바이러스 GI 및 GII 모두 빈번하게 검출되었고, 왕숙천은 잠재적인 노로바이러 스 오염원으로 작용할 수 있는 것으로 보고하였다. 또한 검출된 노로바이러스 GI 및 GII 염기서열을 계통분류학적으로 분석한 결과, 노로바이러스 GI 유전자는 3개 의 다른 유전자형의 클러스터 (GI-5 Musgrov-GBR 1989, GI-6 Hesse-DEU 1988, GI-4 Chiba-JPN 2000)로 분류되었고, 주요한 유전자형은 GI-5 Musgrov-GBR 1989와 유사한 바이러스주였으며, 노로바이러스 GII 유전자는 7개 의 클러스터 (GII-2 Melksham-GBR 1994, GII-3 Toronto-CAN 1993, GII-4 Bristol-GBR 1993, GII-5 Hillingd-GBR 1990, GII-13 Faytvill-USA 1998, GII-14 M7-USA 1999, GII-17 CSE1-USA 2002)로 분류되어, 한강과 왕숙천에 서 다양한 노로바이러스가 검출되고 있음을 보고하였다. 또한 2008년에 보고된 한 국의 일부 강물에서 검출된 사람 노로바이러스의 유전적 다양성에 대한 연구에서는 2002년과 2003년 사이에 산본강, 화정강, 안산강 및 시흥강에서 다양한 노로바이 러스의 유전자형이 검출 (Lee and Kim, 2008)되었으며, 2008년 동안 강수기 (6 월~8월)와 갈수기 (11월~12월)에 2번에 걸친 전국적인 규모의 지하수 중 노로바 18

37 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 이러스 오염실태 조사 결과 강수기에 300개 지점 중 65개 지점 (21.7%)에서 검출 되었고, 갈수기에는 300개 지점 중 52개 지점 (17.3%)에서 검출 (Lee, et al., 2011)되었다는 보고도 있다. 또한 2009년의 보고에 의하면 관개용수로 사용되는 지하수에서 엔테로바이러스 및 아데노바이러스가 검출되었으며, 관개용수를 사용한 시금치, 양배추, 치커리 등에서는 아데노바이러스와 노로바이러스가 검출되어 상호 연관성을 파악 (Cheong et al., 2009)하고자 하였다. 핀란드의 경우 Kukkula 등 (1999) 조사한 음용수에 기인한 바이러스성 위장관염 발생 연구에서, 미처리수, 처리수 및 4개의 수돗물에서 노로바이러스 유전자가 검출 되었으며, 검출원인으로는 부적절한 염소처리에 의한 것으로 보고하였다. 일본의 경 우 Haramoto 등 (2004)이 14개월 동안 98개의 수돗물을 조사한 결과 노로바이러 스 GI 유전자는 4 (4.1%)개의 시료에서, GII 유전자는 7 (7.1%)개의 시료에서 양 성이었던 것으로 보고하였다. 네덜란드의 경우, 1998년 11월부터 1999년 4월까지 네덜란드 2개의 강에서 조사된 연구 (Lodder and Husman, 2004)에 의하면, 노로 바이러스는 4~4,900 PDU (PCR-detectable units)의 범위로 나타났으며, 노로바 이러스 GII-4가 가장 우세한 것으로 보고하였다. 싱가포르의 경우, 환경과 임상에 서의 노로바이러스에 대한 역학조사를 수행하기 위해 환경의 경우 3개의 강, 3개의 수로 및 1개의 강어귀를 선정하였고, 임상의 경우 학교 및 양로원에서 발생한 지점 을 선정하였다. 그 결과 환경에 분포하는 노로바이러스는 GI 및 GII 유전자그룹이 혼합된 다양한 유전자형이 분포하였으며, 임상에 분포하는 노로바이러스는 전 세계 적으로 유행하는 GII-4 유전자형만이 검출되었다 (Aw et al., 2009)고 보고하였 다. 미국의 경우 노로바이러스에 의한 식중독 발생사례가 1998년 59건을 시작으로, 1999년 109건, 2000년 176건으로 해마다 발생건수가 급증하고 있으며, 가까운 일 본도 1998년부터 노로바이러스에 의한 식중독 발생건수가 매년 증가하고 있는 추 세이다. CDC (Center for Disease Control, 2007)는 2006년 10월부터 12월까지 미국 내에서 5건 이상 급성위장관염 발생을 보고한 24개 주에서 총 1,316건의 위 장관염이 발생하였으며, 882건 (29%)이 노로바이러스로 확정되었음을 보고하였다. 이들 연구들은 노로바이러스가 물을 매개로 한 바이러스 중 가장 문제가 되는 바 이러스이며, 특히 환자의 분변, 오염된 식품과 물 등을 통해 전염되며 모든 연령층 에서 장염을 일으킬 수 있다는 점에서 국가기관에서 물을 관리하는 것은 매우 중요 한 문제라고 제시하고 있다. 19

38 제 2장 연구사업 목적 및 내용 2.1 연구사업의 목적 및 범위 최근 구제역 바이러스의 확산으로 인하여 전국에 기하급수적으로 증가한 가축 매 몰지 주변의 지하수에 대하여 국민건강보호를 위한 바이러스 및 세균 등 병원성 미 생물에 대한 조사를 실시하고, 지하수에 대한 사후 관리 방안을 마련하고자 하였다. 지하수의 병원성 미생물 조사는 부실이 우려되는 매몰지에 대하여 해빙기 이전 및 강우기 등 2회에 걸친 조사를 실시하였으며, 통계학적 분석을 통하여 병원성 미생 물의 분포에 따른 관련성을 파악하고자 하였다. 연구대상지역은 가축 매몰지를 중심으로 시료채취가 가능한 경우의 매몰지 유출 수를 포함한 300 m 이내의 지하수 1,000개 지점을 선정하였으며, 분원성대장균군, 대장균, 살모넬라, 쉬겔라, 클로스트리디움 및 대장균 O157:H7 등 6종의 지표 및 병원성 세균과 노로바이러스 및 엔테로바이러스 등 2종의 바이러스를 선정하여 분 석하였다. 또한 본 조사에 참여하는 기관에 대해서는 세균과 바이러스 분석에 대한 정도관 리를 실시하여 분석결과에 대한 균질성과 분석의 정확성을 확보하고자 하였다. 더 불어 현장조사항목과 기후 및 주변 환경 여건 등을 조사하여, 병원성 미생물의 분 포와 관련된 물리화학적 요인과 주변 환경적 요인 등을 검토하고자 하였다. 2.2 연구사업의 내용 국내 가축 매몰지 주변 병원성 미생물 조사 연구의 내용은 다음과 같다 조사지점의 선정 조사지점은 경상북도, 경기도, 강원도 등 상수원이 위치한 지역 중 상수원 상류에 매몰지가 위치하여 먹는물의 오염이 우려되는 지점을 포함한 상수원 상류지역 매몰 지 주변 지하수 300개 지점과 부실매몰로 인해 오염이 우려되는 지하수 700개 지 점 등 총 1,000개 지점의 지하수를 선정하였고, 시료수는 총 2,003개 이었다 조사대상 매몰지의 시료채취 선정된 바이러스 분석용 시료의 경우에는 국립환경과학원에서 고시한 지하수 중 20

39 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 노로바이러스 분석지침 및 바이러스 표준분석방법 에서 규정한 시료채취방법에 따 라 시료를 채취하였다. 세균시료의 경우에는 먹는물 공정시험기준 에서 명시한 시료채취방법에 따라 무 균채수병을 이용하여 오염이 되지 않도록 시료를 채취하였다. 시료채취 시 매몰지 및 지하수 주변 사진과 시료채취 기록부 및 특이사항을 기재 하여 정리하고, 바이러스 관련 규정에 따라 지하수의 수온, ph, 탁도 및 잔류염소 등 현장항목을 측정한 후 일지에 기록하고 연구책임자와 국립환경과학원으로 보고 하였다. 시료채취에 따른 구제역 확산 방지를 위하여 시료채취 차량은 매몰지 조사차량임 을 표지하고, 매몰지 출입 시 차량방역을 철저히 준수하였다. 더불어 시료채취자는 1회용 방제복을 착용하는 등 시료채취 및 차량이동에 따른 구제역 오염을 예방하였 다. 채취된 시료는 먹는물 공정시험기준 및 바이러스 표준분석방법 에서 제시한 시 료운반시간을 준수하며, 시료운반시간을 단축하기 위하여 전담기관을 통해 시료를 채취하며, 채취된 시료의 보관 및 운반은 아이스박스 등 저온을 유지하여 운반하였 다. 시료채취 전담기관은 시료를 신속하게 운반하기 위하여 택배, 퀵서비스 및 고속 버스 등을 이용하였고, 시료의 변질을 최대한 방지하기 위한 조치를 취하였다 병원성 미생물의 분석 바이러스의 경우 국립환경과학원에서 고시한 지하수 중 노로바이러스 분석지침 및 바이러스 표준분석방법 을 준용한 유전자분석 방법에 따라 분석하였다. 세균항 목은 먹는물 공정시험기준 에 따라 분석하되, 클로스트리디움 및 대장균 O157:H7 과 같이 명시되지 않은 항목에 대해서는 식품의약품안전청의 식품공전 등을 참고하 여 국립환경과학원에서 선정한 분석방법에 따라 분석하였다. 미생물의 분석은 시료가 분석기관에 도착한 후 즉시 분석에 착수하고 분석결과 양성으로 판정된 것은 즉시 국립환경과학원으로 그 결과를 보고하였고양성시료를 정도관리 팀으로 송부하여 교차점검을 실시하였다. 또한 염기서열 분석결과에서 최종 양성으로 검출된 시료는 동일한 지점에 대해 다시 시료를 채취하여 재분석 실시하고, 바이러스 시료의 경우 탈리 농축 후 분석에 들어가기 전에 농축된 시료의 일부(약 2 ml)를 지정된 정도관리담당팀 및 국립환경과학원으로 송부하고, 분석기관 은 분석하고 남은 시료에 대해 분석결과 보고 및 정도관리 후 국립환경과학원의 지시가 있을 때 까지 시료에 따라 저온 또는 냉동 보관하였다. 21

40 2.2.4 정도관리 국가적 연구사업의 중요성을 인식하고 균질한 결과를 도출하기 위한 정도관리를 수행하였다. 세균과 바이러스에 대한 정도관리기관을 강원대학교와 가톨릭대학교로 각각 지정하고, 정도관리기관의 주관 하에 정도관리를 실시하였다. 분석의 정확도를 높이기 위해 지정된 정도관리 담당기관에서는 분석에 이용되는 시약 및 배지 등을 통일하여 사용하였고, 지정된 각각 항목의 분석방법에 따라 분석절차를 준수하였다. 정도관리팀은 모든 분석기관에 대한 정도관리를 책임지고, 사업기간 중 최소 2회 이상의 세균 및 바이러스의 양성 및 음성표준시료를 제작하여 모든 분석기관에 송부한 후 정도관리를 실시하였다.또한 모든 바이러스 양성시료에 대한 확인 작업과 전체 시료 2,003개에 대한 10%의 시료를 무작위로 표본 추출하여 재분석을 실시하 였다 최종분석결과의 평가 조사가 완료된 후 모든 분석결과를 취합 정리하여 매몰지 주변의 오염원특성, 이화학적 분석결과 및 지하수 관정의 특성 등의 물리화학적 요인과 주변환경 요인의 관계를 종합적으로 검토하고, 통계학적 방법 등을 이용하여 가축매몰지 주변의 병원 성미생물 오염현황을 분석 및 평가하였다. 질병관리본부, 식약청 및 보건소 등에 접수된 통계자료 등을 활용하여 가축매몰지 주변의 2011년 이전의 질병발생 현황과 2011년 이후의 질병발생 현황 자료를 비교 분석하고, 가축 매몰이후 지하수 등의 오염을 통한 질병 발생 가능성을 평가하였다. 또한 시료채취 및 분석결과와 함께 가축매몰지 주변 지하수의 병원성미생물 오염 현황 특성 및 매몰지 주변의 질병발생 특이동향에 대한 평가 결과를 기술하고, 외국 의 사례를 참고하여 향후 가축매몰지에 대한 미생물학적 및 환경보건학적 관리 방안에 대한 대책을 제시하였다. 22

41 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 2.3 연구팀의 구성 및 추진체계 가축 매몰지 주변 국내 지하수에서 병원성 미생물의 분포를 조사하기 위하여 한 국미생물학회와 대한바이러스학회의 주관으로 수행하였다. 연구책임자는 총괄로서 조사 연구의 모든 과정을 관리 및 감독하였다. 시료채취 는 전담기관인 (주)쎄니젠에서 각 지점에서 시료를 채취하고 각 분석기관으로 송부 하였다. 세균 및 바이러스 분석은 가톨릭대 등 9개 기관에서 수행하였다. 세균과 바이러스 분석은 정도관리 및 교차분석을 통하여 연구결과의 정확성을 확보하였다. 매몰지 주변 지하수의 병원성 미생물 조사 연구팀의 구성과 역할은 다음과 같다. 23

42 총괄책임자 강원대학교 안 태 석 - 연구과제 총괄 - 세균 정도관리 가톨릭대학교 백 순 영 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 - 병원성 바이러스 정도관리 경희대학교 정 용 석 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 (주) 세니젠 건국대학교 박 정 웅 이 중 복 - 시료채취 전담 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 - 주변환경 조사 부산대학교 장 경 립 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 서울대학교 고 광 표 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 한국수자원공사 이 규 철 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 DK EcoV 환경미생물연구소 이 옥 재 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 (주) 바이오니아 이 병 기 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 (주) 아워홈 이 수 미 - 병원성 세균 및 바이러스 분석 그림 4. 연구팀의 구성 및 추진 체계도 24

43 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 제 3장 연구 방법 3.1 시료채취 시료의 채취는 (주)쎄니젠이 전담하였으며, 세균분석용 시료와 바이러스 분석용 시료를 각각 채취하여, 분석기관으로 운반하였다. 조사 시기는 2~4월에 강원도 66개소, 경기도 683개소, 경북 207개소 및 충남북 47개소 등 1,003개 지점을 대상으로 1차 조사를 실시하였으며, 2차 조사는 7~11월에 강원도 246개소, 경기도 448개소, 경상도 190개소, 충청도 92개소 및 전라도 24개 소 등 1,000개소를 대상으로 하였다. 시료채취와 함께 채수지점의 관정 정보, 침출수 정보 및 현장기록 사진 등 현장 특성을 조사하기 위하여 별도의 매립지 지하수 병원성 미생물 조사용 채수조사표를 작성하여 시료채취와 더불어 현장에서 작성함으로서, 채수지점에 대한 특성을 취합 하였다 (표 3) 세균분석용 시료 세균분석용 시료는 먹는물 수질공정 시험기준 (환경부, 2010)에 따라 채수하였 다. 미생물 시험용 시료를 채취 할 때에는 멸균된 시료용기를 사용하여 무균적으로 시료를 채취하고, 미생물 시료 보존시간내에 분석기관으로 운반하여 분석하였다. 잔류염소를 함유한 시료를 채취할 때에는 시료채취 전에 멸균된 시료채취용기에 멸균한 치오황산나트륨용액을 최종농도 0.03%(w/v) 되도록 투여하였으며, 수도꼭 지로 연결된 지하수는 수도꼭지를 화염멸균 한 후 수도꼭지를 틀어 2~3분간 흘려보 내고 탁도가 안정되면 시료를 채취하였다. 25

44 표 3. 매몰지 지하수 조사 현장을 위한 채수조사료 매립 지역 채수 조사표 시 설 명 : 조 사 일 : 시설 주소 : 매립 축종 : 매 립 수 : 채수일 일기현황 : 강우(설)량 : 시료 번호 : 조 사 자 : 구분 분류 항목 내용 비고 관정 매몰지와의 거리 용량 심도 개공 시기 설치 시기 폐수 시설 관정 매립 시설 정보 송유관 오염원유무 정화조 화장실 축사 이용시설 용도 위치 위치 침출수 상태 배출구 개공/설치 시기 침출수 주거 시설 정보 기타 시설 주변상황 하천 유무 오염원 유무 관정 입구 (원) 매몰지 (원) 현장 관정 입구 (근) 매몰지 (근) 사진 관정 관정 (원) 매립지역 현황판 (원) 자료 관정 (근) 현황판 (근) 기타 시설 기타 시설 기타 기록 사항 1. 오염원 유무 항목 : 지하수의 수질 보전등에 관한 규칙 제 4조에 따른다. 작성자 소속: 직급: 성명: (인) 확인자 연락처: 소속: 직급: 성명: (인) 26

45 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 바이러스 분석용 시료의 채취 바이러스 분석용 시료의 채취는 지하수 중 노로바이러스 분석지침 (국립환경과학원, 2007) 및 바이러스 표준시험방법 (국립환경연구원, 2002) 에 따라 채취하였다. 지하수의 수도꼭지가 설치된 경우에는 채취할 배출구에 시료여과장치를 연결하 여, 여과장치의 수압이 30 PSI 정도가 되도록 한 후 약 20 gal (76 L) 정도의 물 을 흘려보낸 다음 시료의 ph, 온도, 탁도를 현장에서 측정하였다. 수도꼭지가 설치 되지 않은 경우에는 양수기를 사용하여 시료를 채취하였다. 탁도 및 ph 등 시료의 조건에 따라 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 필요시 부가장치를 연 결하고 시료를 채취하였다. 시료의 ph가 8이상일 때는 ph 조절을 위한 부가장치 를 연결하고 0.1M 염산 용액을 주입하여 시료의 ph가 6.5~7.5가 되도록 조절하여 바이러스를 채취하였다. 바이러스 분석을 위한 시료의 양은 500 L 이상으로 하였으 며, 바이러스 채취용 필터는 10 인치의 1 MDS 필터를 이용하였다. 시료 채취 후 필터하우징은 멸균된 플라스틱 백에 넣어 아이스박스에 담고 냉장상태로 운반하였 다. 그림 5. 시료여과장치 모식도 27

46 그림 6. 바이러스 시료채취 28

47 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 그림 7. 가축매몰지 주변 전경 29

48 3.2 분석방법 현장항목 수소이온농도는 먹는물 수질공정 시험기준 ES a 의 유리전극법 (환경부, 2011)을 적용하였으며, 분석에 사용된 ph meter는 Lutron ph-208 (Taiwan)이었다. 수온은 ph meter에 부착된 온도계를 사용하여 측정하였다. 탁도는 먹는물 수질공정 시험기준 ES a 을 적용 (환경부, 2011)하였으며, Hanna HI93703 (Korea)을 이용하여 측정하고, NTU (Nephelometric Turbidity Units) 로 표기하였다. 잔류염소량은 먹는물 수질공정 시험기준 ES 의 잔류염소-DPA 발색법을 적용 하여 측정하였다 (환경부, 2011). N,N-디에틸-p-페니렌디아민황산염 (DPD, N,N-diethyl-p-phenylenediamine sulfate)으로 발색하여 Hanna HI95701C (Korea) 잔류염소계를 이용하여 측정하였으며, 측정된 잔류염소량을 mg/l로 표기하였다 세균 분원성대장균군 (Fecal coliform) 분원성 대장균군은 먹는물 수질공정 시험기준 ES 의 총대장균균-효소발 색법 (환경부, 2011)을 변형하여 사용하였다. 검사의 정확도와 재현성을 위하여 상 품화된 배지인 Colilert (IDEXX, USA)을 사용하여 분석하였으며, 배양온도를 로 변경하여 배양 (Yakub et al., 2002; Ko et al., 2008)하였다. 시료병에 적절히 혼합된 시료 100 ml를 넣은 후 Colilert 시약을 완전히 녹을 때 까지 혼합하였다. 시료를 Quantitray에 넣은 후 밀봉하여 44.5 에서 24시간 배양 후 노란색이 나타난 well의 수를 측정하여 IDEXX사에서 제공한 MPN 표에 비교하 여 정량하고 MPN/100mL로 표기하였다. 결과 판독 시 모든 well에서 음성이 나타 나면 불검출로 표기하였다 대장균 (Esherichia coli) 대장균은 먹는물 수질공정 시험기준 ES 의 총대장균균-효소발색법 (환 30

49 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 경부, 2011)을 준용하여 분석하였다. 검사의 정확도와 재현성을 위하여 상품화된 배지인 Colilert (IDEXX, USA)을 사용하여 분석하였다. 시료병에 적절히 혼합된 시료 100 ml를 넣은 후 Colilert 시약을 완전히 녹을 때 까지 혼합하였다. 시료를 Quantitray에 넣은 후 밀봉하여 35 에서 24시간 배양 후 노란색이 나타난 경우, UV 항에서 관찰하여 형광 발생 유무를 측정하여 IDEXX사 에서 제공한 MPN 표에 비교하여 정량하고 MPN/100mL로 표기하였다. 결과 판독 시 모든 well에서 형광이 나타나지 않으면 불검출로 표기하였다 병원성 대장균 O157:H7 (Eschrichia coli O157:H7) 병원성 대장균 O157:H7은 식품공전 (식품의약품안전청, 2008) 중 병원성대장균 분석법과 먹는물 수질공정시험기준의 총대장균군-막여과법 (환경부, 2011)을 변경 하여 사용하였다. 시료 250 ml를 여과공 0.4 um, 지름 47 mm의 세균여과용 여과막에 여과한 후 10 ml 의 mec 배지에 넣고 35~37 에서 24±2시간 증균배양하였다. 이 후 증균배양액을 cefixime (0.05 ug/l) 및 potassium tellurite(2.5 ug/ml)가 첨가된 MacConkey sorbitol 한천배지에 접종하여 35~37 에서 18~24시간 배양하였으며, sorbitol을 분해하지 않는 3개 이상의 무색집락 또는 구별이 불분명한 집락을 취하여 EMB 한 천배지에 접종하고 35~37 에서 24±2시간 배양한 후, 녹색의 금속성 광택이 확인 된 집락은 확인시험을 실시하였다. 확인시험은 EMB 한천배지에서 녹색의 금속성 광택을 보이는 집락을 보통한천배지 (nutrient agar)에 옮겨 35~37 에서 18~24시간 배양 후 API20E 진단키트를 사용하여 동정하거나, E. coli O157 latex test 키트 (Oxoid 또는 이와 동등 이상)를 사용하여 실시 하였다. 확인시험결과 대장균으로 동정되거나, 대장균 O157로 판정되면 혈청형 시험을 수행하였 다. 혈청형 시험은 대장균으로 확인 동정된 균을 O157 항혈청을 사용하여 혈청형을 재결정 하고, O157이 확인된 균은 H7의 혈청형시험을 하여 최종 결과를 판정하였다. 혈청학적 시 험은 항혈청 제작사에서 제공한 방법에 따랐다 살모넬라 (Salmonella) 먹는물 수질공정시험법 ES 살모넬라-막여과법 (환경부, 2011)을 변형 하여 분석하였다. 시료 250 ml을 공경 0.45 um, 직경 47 mm의 멸균된 멤브레인 31

50 필터에 여과한 후, 필터를 Selenite 증균배지에 넣어 37 에서 18~24시간 배양 하 였다. 이후 배양액을 Bismuth sulfate 한천 선택배지에 획선 접종하고, 37 에서 48시간 배양한 후, 생성된 집락 중 가장자리에 하얀 얇은 테를 두른 검고 반짝이는 콜로니를 살모넬라 추정시험의 양성으로 판정하고, 3개 이상의 집락을 취하여 확인 시험을 수행하였다. 전형적인 양성집락이 없고 녹색집락이 생성되었을 경우에도 3 개 이상의 집락을 취하여 확인시험을 수행하였다. 생화학적 확인시험은 추정시험에서 양성으로 판정된 집락을 순수 분리하여 TSA (tryptic soy agar) 또는 보통한천배지(nutrient agar)에 획선접종하고 37 에 서 18~24시간 배양하였으며, 형성된 집락은 API 20E kit을 사용하여 동정을 실시 하고, 살모넬라속으로 동정되면 살모넬라균 양성으로 판정하였다 쉬겔라 (Shigella) 먹는물 수질공정시험법 ES 쉬겔라 막여과법 시험관법 (환경부, 2011) 을 변형하여 분석하였다. 시료 250 ml을 공경 0.45 um, 직경 47 mm의 멸균 멤브 레인 필터에 여과한 후, 필터를 Selenite 증균배지에 넣어 37 에서 18~24시간 배 양 하였다. 배양액을 XLD 한천 선택배지에 획선 접종하고, 35 에서 24시간 배양 하여 붉은색 집락을 쉬겔라 추정시험의 양성으로 판정하고, 3개 이상의 집락을 취 하여 확인시험을 실시하였다. 생화학적 확인시험은 추정시험에서 양성으로 판정된 집락을 순수 분리하여 TSA (tryptic soy agar) 또는 보통한천배지 (nutrient agar)에 획선접종하고, 37 에서 18~24시간 배양하였다. 형성된 집락은 API 20E kit을 사용하여 동정을 실시 하고, 쉬겔라속으로 동정되면 쉬겔라균 양성으로 판정하였다 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 식품공전의 클로스트리디움 퍼프린젠스 정량시험법 (식품의약품안전청, 2008)과 먹는물 수질공정시험법 ES 아황산환원혐기성포자형성균 및 막여과법을 혼합 변형하여 사용하였다. 시료 100 ml을 여과공 0.4 um, 지름 47 mm의 세균여과용 여과막 2매에 각각 여과 한 후, 무균적으로 TSC 한천배지에 기포가 발생하지 않도록 올려놓고 35~37 에서 24±2 시간 혐기자(anaerobic jar) 또는 혐기성 챔버(anaerobic chamber)에서 혐기 배 양하였다. 전형적인 검은색 집락 및 직경 2 mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주 32

51 2011_가축 매몰지 주변 지하수 병원성미생물 조사-최종.hwp 변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 불투명한 환을 가지는 황회색의 집락을 선별 하여 각 집락수를 계수하였다. 계수한 평판에서 전형적인 집락이 5개 이하인 경우에는 모든 집락을, 5개 이상의 경 우에는 5개의 집락을 선별하여 보통한천배지(nutrient agar)에 획선 접종하고 35~37 에서 18~24 시간 혐기배양함과 동시에 보통한천배지를 35~37 에서 18~24시간 호기 배양하여 균의 비발육을 확인하였다. 이 때 분리된 집락이 호기성상태에서 발육하면 음 성으로 판정하고, 호기적 조건에서 성장을 하지 않으며, 혐기적 조건에서만 성장하는 집 락을 대상으로 API20A 키트를 이용하여 제작사에서 제공한 방법으로 동정을 실시하였 다. 해당 희석배수에 사용된 각 평판내의 집락수를 측정하여 합한 다음 사용한 평 판수로 나누어 평판당 평균집락수를 구하여 여기에 해당 희석배수를 곱한 수치를 클로스트리디움 퍼프린젠스의 수로 구하였으며, 균수가 100 이상일 때에는 높은 단위 숫자로 부터 3단계 이하는 사사오입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 그 이하를 0으로 한 수치를 100 ml중의 세균수로 하고, 세균수가 100 미만일 때에는 소수점 이 하는 버린 수치를 100 ml중의 세균수로 표기하였다 바이러스 바이러스 시료의 전처리 1) 바이러스 탈리 냉장된 상태로 도착한 필터는 시료채취 시작시간으로부터 72시간 이내에 탈리과 정을 수행하였다. 필터가 들어 있는 필터하우징의 유입구와 배출구를 탈리용 튜브 로 연결하고, 1.5% beef extract 완충액 (ph 9.5) 500-1,000 ml를 주입하였으며, 1분간 탈리액을 흡착 시킨 후 멸균된 비이커에 탈리액을 수집하는 탈리 단계의 과 정을 2회 반복하였다. 1 M 염산 용액으로 탈리용액의 ph를 7.0~7.5 사이로 조절 하고 다음 과정에 사용하였다. 2) 유기응집 농축과정(유기응집) 탈리액이 담긴 비이커에 교반막대를 넣고 1 M 염산 용액으로 ph를 3.5±0.1로 맞춘 다음 30분 이상 천천히 섞어 주었다. 침전물이 생기면 소고기엑스 탈리액을 원심분리용 용기에 옮겨 담아 원심분리 (2,500 x g, 15분, 4 )를 하였다. 원심분 리 후, 상층액을 버리고 침전물을 0.15 M 인산1수소나트륨용액 20~30 ml (ph 33

52 9.0~9.5)로 녹여 재부유시켰다. 재부유된 용액을 다시 원심분리 (4,000~10,000 x g, 10분, 4 )한 후, 침전물은 버리고 상층액을 모아 ph를 7.0~7.5로 맞추어 주었 으며, 미생물오염을 방지하기 위해 상층액을 0.2 um porosity 멸균용 필터로 여과 하여 최종 농축액 (FCS=final concentrated sample)을 제작하고 바이러스 분석용 으로 사용하였다. 3) 유전자의 추출 바이러스 RNA의 분리는 Viral RNA Mini kits (Qiagen, Germany)를 사용하여 제작사에서 제공한 방법에 따라 수행하였다. Carrier RNA을 포함한 560 ul의 Buffer AVL을 1.5 ml tube에 넣은 후, 시료 100~140 ul을 넣고 15초 동안 혼합 (pulse-vortex)하였다. 실온에서 10분 동안 정치한 후 가볍게 spin-down 하였으며, ethanol (96-100%) 560 ul을 넣고 15초 동안 혼합한 후 다시 spin-down 하였다. 혼합된 시료를 QIAamp Mini spin column 에 넣은 다음, 6,000 xg에서 1분 동안 원심분리하는 RNA 흡착단계를 수행하였다. 여기에 Buffer AW1 500 ul을 넣고, 6,000 xg에서 1분 동안 원심분리하였다. QIAamp spin column을 새로운 2 ml tube에 옮긴 후 Buffer AW2 500 ul을 넣어 주었으며, 20,000 xg에서 3분 동안 원심분리 하였다. 다시 QIAamp spin column을 최대속도로 1분간 원심분리 한 후, 1.5 ml tube에 QIAamp spin column을 옮겨, Buffer AVE 약 60 ul을 주입하고 1분 동안 정치하였으며, 6,000 xg에서 1분 동안 원심분리하여 viral RNA을 얻었다. 얻어진 RNA는 즉시 사용하지 않을 시 -70 에 보관하였다 엔테로바이러스 (Enterovirus) 엔테로바이러스는 지하수 중 노로바이러스 분석지침 (국립환경과학원, 2007) 과, Reynolds 등 (2001)의 논문을 혼합변형하여 RT-PCR과 semi-nested PCR 과정을 수행하는 유전자 분석법으로 분석하였다. 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)은 시료로부터 RNA를 분리한 후, 표적 유전자 에 대해 특이적으로 제작된 primer (표 4) 와 Verso 1-step RT-PCR Hot-start kit (ABgene AB-1455/B, Thermo science, USA)을 사용하여 수행하였다. RT-PCR 반응은 50 에서 15분간 역전사 과정을 수행하였으며, 95 에서 15분 동 안 변성한 후, 94 30초, 60 45초, 72 1분 동안 30회 반복한 다음 72 에서 10 분간 연장하고 4 에 정치하였다. RT-PCR 반응을 위한 반응액이 조성은 viral RNA 34

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