(72) 발명자 박종현 서울특별시 송파구 양재대로 1218, 올림픽선수촌아 파트 호 (방이동) 이영덕 경기도 남양주시 화도읍 녹촌로 87-29, 신창현두산 위브아파트 101동 1604호 이 발명을 지원한 국가연구개발사업 과제고유번호

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1 (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년10월04일 (51) 국제특허분류(Int. Cl.) C12N 1/20 ( ) A23C 9/12 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011년03월22일 심사청구일자 전체 청구항 수 : 총 5 항 2011년03월22일 (71) 출원인 주식회사 비피도 강원도 홍천군 홍천읍 농공단지길 (72) 발명자 박명수 경기도 부천시 소사구 심곡본동 태경삼익아파트 B동 603호 지근억 서울특별시 서초구 방배동 임광아파트 (뒷면에 계속) (74) 대리인 특허법인태동 (54) 발명의 명칭 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키에 대해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니 말리스 균주 (KFCC11506Р) 및 이를 이용한 식품 조성물 (57) 요 약 본 발명은 새롭게 분리한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)을 제공하는 데, 이의 배양 상등액은 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 생육 저해 효과를 나타내기 때 문에, 조제 분유 등의 식품에 첨가되어 사용될 수 있다. 대 표 도 - 도1-1 -

2 (72) 발명자 박종현 서울특별시 송파구 양재대로 1218, 올림픽선수촌아 파트 호 (방이동) 이영덕 경기도 남양주시 화도읍 녹촌로 87-29, 신창현두산 위브아파트 101동 1604호 이 발명을 지원한 국가연구개발사업 과제고유번호 SB010 부처명 농림수산식품부 연구사업명 농림기술개발사업 연구과제명 Bacteriophage와 유산균을 이용한 Enterobacter sakazakii 종합 제어법 주관기관 경원대학교 산학협력단 연구기간 ~ 이 발명을 지원한 국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 지식경제부 연구사업명 광역경제권 선도산업 육성사업 연구과제명 6년근 홍삼기반 생체 이용성 증진 면역조절 건강기능성 식품개발 주관기관 (주)비피도 연구기간 ~

3 특허청구의 범위 청구항 1 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P) 청구항 2 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양액 또는 그 건조 분말을 포함 하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물 청구항 3 제2항에 있어서, 상기 배양액은, 배양 후, 농축과정을 추가로 거쳐 농축된 것임을 특징으로 하는 식품 조성물 청구항 4 제2항에 있어서, 상기 식품은, 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 의해 오염이 발생하 는 식품인 것을 특징으로 하는 식품 조성물 청구항 5 제4항에 있어서, 상기 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 의해 오염이 발생하는 식품은, 조제 분유인 것을 특징으로 하는 식품 조성물 명 세 서 [0001] 기 술 분 야 본 발명은 병원성 균주인 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)및 이를 이용한 식품 조성물에 관한 것이다. [0002] 배 경 기 술 최근 엔테로박터(Enterobacter spp.)가 병원에서 많이 검출되어 그 중요성이 증대되었고, 새로운 병원 성균으로 규명되었는데, 항균물질에 대한 저항성이 크고, 새로운 항균물질에 대해 쉽게 저항성을 획득하는 것으 - 3 -

4 로 알려져 있다. 이 속의 세균 중에서 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아그로 메란스(E. agglomerans), 엔테로박터 크로아카에(E. cloacae), 엔테로박터 사카자키(E. sakazakii)가 주로 병 원성을 유발하는데, 그 중에서도 특히 엔테로박터 사카자키(E. sakazakii)는 신생아에게 치명적인 질병을 유발 시키는 균이다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] 최근에는 엔테로박터 사카자키(E. sakazakii)를 새롭게 크로노박터 속(Cronobacter spp.)으로 분류하였 는데, 혼선을 방지하기 위해 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}로 병용 키로 하였다. 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}는 치즈, 육류, 야채, 곡물, 허브, 향신료를 포함한 식품에 널리 분포되어 있는데, 일반식품 중 특히 영?유아식품에서 이 세균의 제어 연구 는 현재 국내에서 거의 이루어진 바 없고, 전 세계적으로도 매우 적은 실정이다. 우리나라의 모유 수유율은 직장여성의 증가와 여성들의 몸매 관리 열풍으로 매년 큰 폭으로 감소하고 있는데, 이로 말미암아 분유 등의 영아식품에 대한 주의 깊은 품질관리 및 안전성 관리가 요구되고 있다. 그런데, 최근 국내에 시판 중인 조제분유를 대상으로 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 분리 및 특성을 분석한 실험 결과에 따르면, 조제분유 내에 이 병원 성 균주가 존재하는 것으로 나타나 큰 반향을 불러일으켰다. 이 병원성 세균은 뇌수막염을 불러일으키고, 더 나아가 뇌수종, 전신마비, 신경계 미발달 등 심한 신경학적 후유증까지 유발하고 있다. 또한, 괴사성 소장결장 염을 가진 신생아들에 대한 연구에 따르면, 환자의 29%에서 공통적으로 이 병원성 세균이 발견되었다는 보고도 있다. 따라서, 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}가 식품을 오염시키 거나 식품 내에서 증식되는 것을 방지할 필요가 있는데, 항생제를 식품에 첨가할 수는 없어 그 대안을 찾아야 할 필요성이 크다. 한편, 박테리오신은 미생물이 생산하는 항균성 단백질(antimicrobial polypeptide)로서, 인체 내 흡수 시 단백가수분해효소에 의해 분해되어 인체 내에 축적되지 않기 때문에 인체에 매우 안전한 특징이 있고, 항균 범주가 다양하여 응용목적에 따른 조합적용(combinatorial application)이 가능한 장점이 있다. 또한, 단백질이 라는 특성상 유전자의 조작에 의해 산업적 수요에 합당한 분자특성 및 생산특성으로의 전환이 매우 용이하고, 주요 생산균이 젖산균 등으로서, 인체에 안전한 GRAS(Generally Regarded As Safe)균인 특성이 있다. 따라서, 상기와 같은 박테리오신 또는 그 박테리오신을 생산하는 균주를 이용하여 현재 큰 문제를 일으 키고 있는 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}를 제어할 수 있는 방안을 개발한다면 매우 효과적인 방안이 될 수 있을 것이다. 발명의 내용 [0010] 해결하려는 과제 이에 본 발명은 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대 해 길항능이 있는 신규의 미생물을 분리하고, 이의 이용 방안을 제공하는데 그 목적이 있다. [0011] [0012] [0013] 과제의 해결 수단 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)를 제공한다. 상기 균주는 유아의 분변으로부터 분리되었는데, 하기의 실험 결과에 의하면, 배양액 또는 그 건조분말을 엔테 로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 처리했을 때 길항능이 확인되었다. 이 는 상기 균주가 박테리오신 또는 박테리오신 유사 물질을 배양액 중으로 분비하여 엔테로박터(크로노박터) 사카 자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능을 나타내는 것으로 추론할 수 있었다. 한편, 본 발명은 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대 - 4 -

5 해 길항능이 있는 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양액 또는 그 건조 분말을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다. 이때, 배양액은 바람직하게 농축과정을 추 가로 거쳐 농축된 것일 수도 있다. 또한, 상기 식품은 병원성 균주인 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 의해 오염이 발생하는 식품이 그 대상 식품으로 적합할 수 있다. 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 의해 오염이 빈번하게 발생하는 식 품에 적용을 하였을 경우 그 적용 효과가 두드러지기 때문이다. 하지만, 이론적으로는 모든 식품에 대해 병원성 균의 감염 우려가 있기 때문에 식품의 종류를 반드시 상기의 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 의해 오염이 발생하는 식품으로 한정하는 것은 아니고, 일 예로 상 기 식품은 조제 분유일 수 있다. [0014] 하기 본 발명의 실험에 의하면 실제 식품 모델에서도 본 발명 균주 배양액의 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대한 저해능이 유지된 것으로 확인되었는데, 식품에 첨가될 때는 식 품의 제형에 따라, 액상 또는 분말상의 다양한 형태로 첨가될 수 있다. [0015] [0016] 발명의 효과 본 발명에서 새롭게 분리한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양 상등액은 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 생육저해 효과를 나타낸다. 본 발명 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양 상등액은 건조 등의 후 가공 과정을 거쳐 조제 분유 등의 식품에 첨가되어 사용될 수 있는데, 실제 식품 모델인 조제 분유에 첨가한 결과, 유효하게 저해능을 유지함이 확인되었다. [0017] 도면의 간단한 설명 도 1은 본 발명에서 분리된 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양 상등액에 의한 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 생육저해 결과를 보여준다. A: 2-1 희석 배양 상등액, B; 2-2 희석 배양 상등액, C: 2-3 희석 배양 상등액. 도 2는 실제 식품 모델(조제 분유)에서의 생육 저해 효과 확인 결과이다. [0018] 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위 가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다. [0019] [0020] 실시예 1: 후보 균주들로부터 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대해 길항능이 가장 우수한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 분리 유아 분변으로부터 후보군인 비피도박테리움 균주 18종을 분리하였다. 분리된 비피도박테리움 균주들의 엔테로 박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대한 저해 효과를 확인하였는데, 그 중 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8의 길항능이 가장 우수하여 이 균주를 한국미생물보 존센터에 2011년 3월 7일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC11506P를 부여받았다. [0021] [0022] [0023] 실시예 2: 상기에서 분리된 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 엔테로 박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대한 길항 작용 확인 상기에서 분리한 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 엔테로박터(크로 노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}에 대한 길항능을 확인하고자 하였다. 먼저, 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)를 대수기까지 배양한 후, 배양 - 5 -

6 상등액을 회수하고, 2-1, 2-2, 2-3 로 순차 희석하여 희석된 배양 상등액을 준비하였다. 그 후, 희석된 배양 상등 액을 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 배양시 첨가하여 그 저해능을 조사하였다. [0024] 그 결과는 도 1과 같았는데, 배양 상등액이 첨가되지 않은 경우, 시간의 경과에 따라 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 생육이 활발하게 일어나는 반면, 배양 상등액을 첨가하였을 경우에는 2-1, 2-2 의 희석 샘플에서 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 생육을 18시간 동안 저해하는 것으로 나타났다. [0025] [0026] [0027] 실시예 3: 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P) 배양 상등액의 동결건조물 에 의한 길항작용 확인 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis) BF8 (KFCC11506P)의 배양 상등액을 ph 7.0으로 조정한 후 동결 건조를 수행하고, 이를 1g/mL에 농도로 현탁한 후 단계별로 희석해서 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 저해 효과를 확인하고자 하였다. 생육 저해를 확인한 결과, 약 40mg/mL의 농도에서 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 생육이 저해됨을 확인하였으며, 이때 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 생존력(viability)을 DFI 아가 배지에 도말하여 확인한 결과, 6시간 이후에도 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}가 검출되지 않았다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 실시예 4: 식품 모델(조제 분유)에서 길항 작용 확인 실시예 1에서 분리된 균주의 배양액이 실제 식품 모델(조제 분유)에서 길항작용을 보이는지를 확인하고자 하였 다. 준비된 조제 분유에 상기 실시예 3에서 수득한 동결 건조물을 혼합하고, 엔테로박터(크로노박터) 사카자키 {Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}의 저해 효과를 확인하였다. 그 결과, 동결 건조물 미첨가 조제 분유에서는 엔테로박터(크로노박터) 사카자키{Enterobacter(Cronobacter) sakazakii}가 6시간 이후, 약 7 log CFU/mL 수준으로 증가하였으나, 동결 건조물을 혼합한 경우, 초기 균수인 4 log CFU/mL수준이 유지되는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 이와 같은 결과는 실제 식품 모델에서도 본 발명의 분리 균주에 의한 길항능이 유지됨을 확인시켜 주는 매우 의 미 있는 결과이다. [0033] 수탁번호 기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국내) 수탁번호 : KFCC11506P 수탁일자 :

7 도면 도면1 도면2-7 -

많이 이용하는 라면,햄버그,과자,탄산음료등은 무서운 병을 유발하고 비만의 원인 식품 이다. 8,등겨에 흘려 보낸 영양을 되 찾을 수 있다. 도정과정에서 등겨에 흘려 보낸 영양 많은 쌀눈과 쌀껍질의 영양을 등겨를 물에 우러나게하여 장시간 물에 담가 두어 영양을 되 찾는다

많이 이용하는 라면,햄버그,과자,탄산음료등은 무서운 병을 유발하고 비만의 원인 식품 이다. 8,등겨에 흘려 보낸 영양을 되 찾을 수 있다. 도정과정에서 등겨에 흘려 보낸 영양 많은 쌀눈과 쌀껍질의 영양을 등겨를 물에 우러나게하여 장시간 물에 담가 두어 영양을 되 찾는다 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개실용신안공보(U) A23L 1/307 (2006.01) C02F 1/68 (2006.01) (21) 출원번호 20-2011-0002850 (22) 출원일자 2011년04월05일 심사청구일자 2011년04월05일 (11) 공개번호 20-2011-0004312 (43) 공개일자 2011년05월03일

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