Transcription

1 유전체 라이브러리 은행운영관리지침 (재)연구소재중앙센터

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3 머 리 말 생명연구자원은 막대한 시장 창출 잠재력을 보유한 성장동력으로서 세계 각국은 생명자원을 미래 산업의 핵심소재로 인식하여 치열한 자원확보 경쟁을 벌이는 한 편 국가적 종합관리 및 전략화를 추진하고 있습니다. 연구소재중앙센터를 비롯한 연구소재은행은 이러한 세계 정세에 발맞춰 생명연구 자원 등의 소재 확보를 적극 추진하고 있으며, 자원관리에 대한 인프라시스템을 구축하고 연구소재 및 연구소재은행의 표준화를 통해 소재의 신뢰성을 확보하여 국제적 인증을 획득하고자 노력하고 있습니다. 그러나 자원센터의 품질관리를 위 한 국내 지침은 미비하고, 또한 자원센터운영관리 교육은 전무한 실정입니다. 이 에 따라 연구소재중앙센터는 소재은행의 품질관리 업무절차의 표준화 및 품질경 영을 추구하고자 유럽생물자원센터협회 (CABRI, Common Access to Biological Resources and Information)에서 웹사이트를 통하여 제공하는 소재 분야별 자원 센터 운영관리 지침을 소개하고 이를 우리나라의 자원센터 운영에 적용하고자 이 지침서를 발간하였습니다. 지침서에는 자원센터의 일반운영지침, 기탁절차, 기탁소재의 유지 보관 및 분양에 관련한 내용이 소개되어 있습니다. 그러나 CABRI의 지침이 마련된 후 상당한 기 간이 지났고, CABRI의 지침은 유럽의 자원센터를 바탕으로 제작되었기 때문에 우리나라의 실정에 부합되지 않는 부분이 있을 수도 있습니다. 이러한 내용은 앞 으로 우리나라의 실정을 반영한 개정판을 발행하여 보완할 예정입니다. 이 지침서가 연구소재은행 및 기타 자원센터의 고품질 경영에 도움이 되길 바라 며 이번 지침서의 내용을 감수하여 주신 한국미생물학회, 한국식물학회, 한국세포 주연구재단 및 강원대 최장경 교수님께 감사드립니다. (재)연구소재중앙센터 센터장 이 연 희

4 목 차 제 1 장 서론과 일반 문서 1 서론 및 일반문서 3 제 2 장 새로운 기탁의 요청 및 운용 5 유전체 라이브러리의 기탁 및 등록 절차 순서도 7 제 3 장 기탁물의 보존 9 고밀도 그리드 YAC 필터의 제조 11 세포벽 제거 (spheroplasting)를 위한 YAC 세포 풀 제조 18 YAC pools 의 세포벽 제거 (Spheroplasting) 24 품질관리: YAC pools 의 PCR 29 고밀도 그리드 PAC/FUGU 필터의 생산 36 완충액, 용액과 시약 WELL YAC 라이브러리: 복제 58 YAC 클론의 4X4 글리세롤 플레이트 준비 WELL E. coli 라이브러리: 96-WELL 농축과 복제 69 제 4 장 분 양 75 PAC 풀과 클론에 대한 요청과 분양 77 cfugu 필터 세트와 클론에 대한 요청과 분양 81 YAC 클론에 대한 요청과 분양 83 DNA Agarose Pellets 의 구성 88

5 제 1 장 서론 및 일반문서 (GLI/1998/1)

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7 문서번호 GLI/1998/1 서론 및 일반문서 서론 HGMP는 유럽생물자원센터협회 (Common Access to Biological Resources and Information, 이하 CABRI) 소속 자원센터로서 그 서버를 통하여 자원목록을 제공한다. 이들 지침서에 기술된 실험절차들은 센터에서 사용되는 절차에 기초하여 작성하였다. 지침서의 각 부분은 다음과 같이 구성된다. 실험절차에 대한 순서도 실험 절차 기술 첨부문서 절차에 대한 참조분류코드는 다음 양식에 따른다. (분류기호/년도/장 번호/절차번호) 배양체 형태 유전체 라이브러리 동물 & 인간세포 세균, 고세균, 효모, 곰팡이 플라스미드 식물세포 식물바이러스 조서 약호 GLI AHC M PP PC PVC 3

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9 제 2 장 새로운 기탁의 요청 및 운용

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11 유전체 라이브러리의 기탁 및 등록 절차 순서도 7

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13 제 3 장 기탁물의 보존 (GLI/1998/3/1 ~ GLI/1998/3/13)

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15 문서번호 GLI/1998/3/1 고밀도 그리드 YAC 필터의 제조 목적 실험실에서의 DNA 제작과 교잡검사를 위해 나일론 필터상에서 YAC 클론을 고농도로 배양하기 위함. 계획 배양배지 위에 놓인 나일론 막에 YAC 클론 그리딩 26시간 동안 배양 세포벽 제거과정 (spheroplasting) 세포용해 중화 단백질 분해효소 (Proteinase K) 처리 필터 세척 건조와 굽기 UV 교차결합 실행계획 목/금 금/월 월/화/수 1. 배양배지를 사각 플레이트에 붓는다. 2. 나일론 막에 표기하고 배지 표면에 올려 놓는다. 3. Biomek 1000 또는 PBA 로봇을 사용한 클론의 그리딩 4. 16개의 microtitre 플레이트에서 유래한 총 1536개 클론을 4X4 배열로 필터 위에 그리딩 5. 그리드된 필터는 30 에서 26시간 동안 배양 화/수/목 6. 필터에 zymolyase를 처리하여 집락 세포벽 제거(spheroplasting) 수/목/금 7. 필터를 NaOH-NaCl 용액으로 처리하여 세포용해 완료 8. 필터를 Tris HCl-NaCl 용액에 담구어 중화 9. 필터를 단백질 분해 효소 (Proteinase K) 용액으로 처리 10. 필터를 Tris-HCl 용액으로 세척한 후, 공기 중에 건조시키고 80 로 구움 11. 마지막으로 필터를 UV로 조사하고 보관한다. 완충액, 시약 및 배지 500 μl의 앰피실린 (50 mg/ml stock)과 1.25 ml의 테트라싸이클린 (5 mg/ml stock)을 500 ml의 YPD 한천에 넣는다. 11

16 문서번호 GLI/1998/3/1 플레이트/필터 1개당 약 50 ml를 붓는다. 에탄올 SCE 완충액 ph 7.4: 1 M sorbitol, 20 mm EDTA, 10 mm Tris-HCl ph7.4, 14 mm β-mercaptoethanol (나중에 흄 후드에서 마지막에 첨가): 80~100 ml/tray. 사용 전에 zymolyase를 SCE에 첨가한다 (최종농도 0.5 mg/ml). 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl 용액: 80~100 ml/tray. 0.5 M Tris ph 7.4, 1.5 M NaCl 용액: 700 ml는 120개의 필터를 사용하기에 충분하다. 50 mm Tris ph 7.4, 0.15 M NaCl 용액: 1400 ml는 120개의 필터를 사용하기에 충분하다. 단백질 분해 효소 (Proteinase K): 사용 전에 600 ml의 상기용액에 첨가. (500 ug/ml proteinase K) 50 mm Tris ph 7.4: 700 ml는 120개의 필터를 사용하기에 충분하다. 주요 장비 멸균실 배지 제작실 무균 캐비닛 30 배양기 Biomek 1000 로봇 또는 PBA 로봇 Multi-pin 접종기 초음파 수조 37 진탕배양기 밸리댄서 (교반기) Hybaid(교잡) 오븐 UV-crosslinker 기타재료 뚜껑 있는 배양 트레이, (Dynatech): Biomek용 뚜껑 있는 배양 트레이, (Hybaid): PBA 로봇용 3 mm 필터 페이퍼, (Whatman) Edding 1800 펜 Hybond N +, (Amersham, 0.45 micron membranes, 7.8x11.9, 50/pack). 뚜껑 있는 방풍유리 트레이 (Perspex trays) 플라스틱 박스 피펫과 팁 12

17 문서번호 GLI/1998/3/1 멸균한 초자류 핀셋 세부방법 배지 붓기 앰피실린 (최종농도 50 mg/ml) 500 µl와 5 mg/ml 테트라싸이클린 (최종 농도 12.5 µg/ml) 1.25 ml를 각 500 ml가 녹아있는 YPD 한천 (가능하면 안전 캐비닛에서)에 첨가한다. 잘 섞이도록 여러 번 흔들어 준다. 평평한 표면 위에서 사각 플레이트 1개당 50 ml의 배지를 붓는다 (가능한 깨끗한 환경에서). 가만히 둔다. 뚜껑을 덮는다. 바로 세워 4 에서 냉장 보관한다. 필터에 표기 하기와 한천 플레이트 위치 정하기 Edding 1800 펜을 사용하여 각 필터의 좌측상단 가장자리에 표기 한다. 가능하면 필터의 짧은 변의 한쪽 가장자리에 가깝게 표기 해야 한다. 표기의 위치는 필터의 방향을 판단하기 위해 사용되며 집락 그리드의 position A1에 해당한다. 필터가 플레이트 1A-I에 붙여지면 1A-2G+ 로 표기 한다. 다른 필터들도 같은 방법으로 표기해야 한다. 플레이트를 배양하였을 때 오염되지 않게 하려면, 필터를 가능한 청결하게 유지해야 한다. 따라서 필터를 취급하는 핀셋은 에탄올에 담그고 화염멸균 한다. 에탄올 병을 닫고 불꽃에서 멀리 둔다. 멸균 핀셋을 사용하여 미리 준비된 플레이트 위에 표기된 필터를 올려 놓는다. 한천과 필터 사이에 기포가 없도록 한다. 기포는 핀셋으로 필터의 가장 자리를 천천히 들어올리고 한천 위에 필터를 다시 놓으면 제거할 수 있다. 그리딩 도구의 준비와 세척 BIOMEK/PBA *주의: 도구를 사용하지 않을 때는 핀의 손상을 막기 위해 에탄올 수조에 보관해야 한다. 도구를 사용하기 전에 모든 핀들이 곧게 뻗어 있는 지 조사해야 한다. 구부러진 핀을 사용하면 뒤범벅된 그리드가 만들어질 것이다. 구부러진 핀은 똑바로 펴거나 교체한다. 13

18 문서번호 GLI/1998/3/1 도구는 사용 전에 초음파로 세척해야 한다. 도구를 세척하기 위해 소량의 계면활성제와 3차 증류수를 초음파 수조의 상단선까지 채운다. 초음파 수조에 도구를 넣되, 전자기 부분은 젖지 않도록 한다. 수조의 스위치를 켠다. 타이머를 설정하고 10분 동안 초음파를 처리한다. 스위치를 켰을 때 수조에 손가락을 넣지 않도록 조심한다. 수조의 스위치를 끈다. 사이펀 펌프로 수조를 비운다. 3차 증류수를 같은 수준으로 다시 채운다. 2분 동안 초음파를 처리한다. 도구를 꺼내고 씽크대 위에서 에탄올을 충분히 분사한다. 건조 캐비닛 안에서 도구를 말린다 (약 10분간 또는 완전히 건조될 때까지). 필터 (Biomek 또는 PBA 로봇)상에서 집락의 그리딩 그리딩 할 microtitre 플레이트를 녹인다. 이것은 실온에서 약 1시간 정도 소요된다. Biomek 절차 Biomek에 그리딩 툴을 끼운다. 컴퓨터, 모니터, 디스크드라이브, Biomek과 flow hood의 스위치를 켠다. C:\ 에 cd\ biotest3 를 타이핑하고 RETURN 을 누른다. 도구이송매개변수(tool transfer parameter) 를 점검한다 (개별 유의사항 참조). grid 를 타이핑하고 RETURN 을 누른다. 로봇은 모터를 작동시키고, 화면에는 플레이트의 수와 그리드 형식, 만들어야 할 복사본 수 등의 매개변수에 대한 프롬프트(prompt) 가 나타날 것이다. 프롬프트 N 에는 1에서 6까지 필요한 복사본 수를 입력하고 (통상 6임), RETURN 을 누른다. 프롬프트 G 에는 그리드 형식을 2x2, 3x3, 또는 4x4 (YAC 라이브러리는 4X4 형식으로 그리딩 됨)로 입력하고, RETURN 을 누른다. 프롬프트 S 에는 각 복사본에 그리딩 할 master 플레이트의 수를 (통상 16) 입력하고, RETURN 을 누른다. Sterilization position 에는 wells의 2/3 가량 에탄올을 채운 (약 200ul) microtitre 플레이트를 장착한다. Plate position 에는 필터가 올려진 한천 플레이트를 놓는다. 플레이트가 제 위치에 정확히 놓였는지 미끄러지지는 않는지 확인한다. 만일 플레이트가 미끄러진다면 그리드는 뒤범벅이 될 것이다. 필터표기는 실험자의 왼쪽과 마주보는 쪽이어야 한다. 뚜껑을 제거한다. 14

19 문서번호 GLI/1998/3/1 RETURE을 누르면 로봇은 도구를 멸균할 것이다. 첫 번째 microtitre 플레이트를 제 위치 (예. 1A)에 놓는다. 플레이트를 놓으면 well A1이 실험자와 가장 가까운 왼편에 있게 된다. 뚜껑을 제거한다. 모든 뚜껑이 제거되고 모든 플레이트가 제 정확한 위치에 놓였는지 확인 한다. RETURN 을 누른다. 로봇은 이 플레이트에서 유래된 집락을 모든 필터 상의 position 1에 그리드 할 것이다. 로봇이 멈추면, 플레이트를 빼고 다음 플레이트로 교체한다(예. 1B). 뚜껑이 제거되었는지 확인할 것. RETURN 을 누른다. 로봇은 다음 세트의 세포를 필터 상의 position 2에 그리드 할 것이다. 프로그램이 완료되어 필터 위에 microtitre 플레이트 세트가 모두 그리딩 될 때까지 위 단계를 반복한다. 올바른 플레이트가 제 위치에 놓였는지, 뚜껑은 제거되었는지 항상 확인한다. 그리딩 후에는 각 핀이 올바른 위치로 그리딩 되는지, 접종액이 각 well로 이송되는지 확인하기 위하여 필터를 점검한다. 툴이 파손된 경우 만일 키보드로 입력이 필요한 상황이면 90 을 타이핑하고 RETURN 을 누른다. 그렇지 않을 경우에는 Biomek에서 EMERGENCY STOP 을 사용한다. 로봇의 스위치를 끄고 도구를 조사한다. 구부러진 핀을 펴거나 교체한다. 로봇의 전원을 켜고 다시 시작한다. 실험자가 성공적으로 그리드한 마지막 플레이트인 x에 해당하는 값을 fit tool propmpt 에서 A=x로 입력함으로써 중단시킨 곳으로부터 재개할 수 있다. 도구이송매개변수 를 바꾸기 위해 (만약 도구가 wells의 바닥에서 이동되지 않는다면) CHECK 을 타이핑하고 RETURN 을 누른다. Master 플레이트 위치에 빈 microtitre 플레이트를 놓는다. 설명서에 따라 X, Y, Z 값을 입력한다. 모든 핀은 well의 중앙에 있어야 하고, 툴이 플레이트에 위치할 때 약간 들려있어야 한다. PBA 절차 배양될 플레이트는 바로 세워 트레이에 3단 높이로 쌓는다. 트레이를 밀봉된 큰 플라스틱 백에 넣고, 테이프로 밀봉한 후, 30 배양기에 26시간 동안 둔다. 15

20 문서번호 GLI/1998/3/1 필터의 처리 1 SCE 완충액 (14 mm β-mercaptoethanol과 500 µg/ml zymolyase이 포함된)에 적셔진 3 mm 페이퍼에 집락이 위로 향하도록 필터를 옮긴다. 사용 전에 zymolyase를 첨가하고 잘 섞는다. 각 트레이는 필터 12개를 수용한다. 3 mm과 필터 사이의 기포는 필터를 천천히 올렸다 내려 놓으면서 제거해야 한다. 뚜껑을 트레이 위에 올려놓고 밀착필름으로 감는다. 트레이를 큰 백에 넣어, 밀봉한 후 37 에서 하룻밤 배양한다. *주의: 이 과정은 β-mercaptoethanol의 노출을 최소화하기 위해 spheroplasting 벤치에서 수행해야 한다. 이러한 용도로 제작된 뚜껑이 있는 얇은 방풍유리로 된 트레이를 사용한다. 필터를 올려놓을 3 mm 페이퍼는 완충액으로 골고루 젖도록 하되, 과량의 용액은 부어 내어야 한다. 만약 페이퍼가 완충액에 떠 다니면 필터 위의 집락이 뒤섞일 것이다. 트레이와 3 mm 페이퍼 사이에 기포가 없도록 한다. 5 또는 10 ml 피펫을 사용하여 기포와 여분의 용액을 제거할 수 있다. 집락이 쉽게 오염되므로 핀셋을 사용하여 필터를 다루어야 한다 M NaOH와 1.5 M NaCl 혼합액에 적신 3 mm 페이퍼 위에 필터를 15분 동안 올려놓는다. 반드시 기포가 없도록 한다. 집락은 용액에 잠기면 탈색된다. 만약 15분 동안에도 탈색되지 않는 patchs (필터)가 있으면 필터를 들어올렸다 다시 내려놓는다. 3 필터를 물기가 없는 3 mm 페이퍼 시트로 옮기고 15분 동안 실온에서 건조한다. 이 단계는 좋은 필터를 얻는데 중요하다. 4 필터는 0.5 M Tris ph 7.4, 1.5 M NaCl 용액에 5분 동안 담가서 중화시킨다. 흔들지 않는다. 5 여분의 액체를 제거하기 위해서 겹겹이 쌓인 박스 위에 필터의 뒷면이 닿도록 핀셋을 사용하여 끌어놓고, 필터를 50 mm Tris ph 7.4, 0.15 M NaCl 용액으로 하나씩 옮겨 5분 동안 처리한다. 흔들지 않는다. 6 필터를 50 mm Tris ph 7.4, 0.15 M NaCl (500 ug/ml proteinase K가 포함된) 용액에 담가 37C에서 30-60분 동안 아주 천천히 교반한다. 7 필터를 50 mm Tris ph 7.4, 0.15 M NaCl 용액에 담그고, 밸리댄서를 사용하여 5분 동안 천천히 교반한다. 8 필터를 50 mm Tris ph 7.4 용액에 5분 동안 천천히 교반한다 mm Tris HCl ph 7.4 용액으로 한 번 더 세척한다. 10 여분의 액체와 파편을 제거하기 위해 겹겹이 쌓인 박스 위에 핀셋으로 필터의 뒷면을 끌어 3 mm 페이퍼에서 DNA 부분을 위로 향하게 하여 자연 건조한다. 건조가 다 되었을 때 필터가 말리지 않도록 3 mm 페이퍼의 두 번째 시트로 덮어준다 *주의. 만약 필터가 많이 젖어 있으면 집락이 3 mm 페이퍼에 붙을 수 있기 16

21 문서번호 GLI/1998/3/1 때문에 필터를 조심스럽게 떼어낸다). 11 필터를 80 하이브리드 오븐에 10분간 넣은 다음, 두 겹의 3 mm 페이퍼 사이에 놓는다. 12 UV crosslinker에서 필터에 있는 DNA를 3 mm 페이퍼 위에 올려놓고 UV로 13 조사한다. 스위치를 켠 후, 필터를 UV 기기 안에 넣는다. 최적의 CROSSLINK 를 선택하고 시작한다. Crosslink가 끝나면, 필터를 플라스틱 백에 넣어 4 에서 냉장 보관한다. 17

22 문서번호 GLI/1998/3/2 세포벽 제거(spheroplasting)를 위한 YAC 세포 풀 제조 1. 재료 수작업으로 스탬핑 (stamping) 할 경우: 살균된 둥근 배양접시 [Falcon 1058] PBA 로봇으로 스탬핑 할 경우: Hybrid colony picking 플레이트 [Hybaid HB CPP] 사용 SD 한천배지 앰피실린과 테트라싸이클린 (Standard Operating Procedure(SOP) GLS/07 참조) Hybond N + 페이퍼 [Amersham RPN119N] 가는 핀셋 메탄올 무수 알코올 세척용 병에 들어있는 70% 알코올 96-pin 'hedgehog' (96-well plate의 각 well에 맞도록 96개의 핀이 규칙적으로 박혀있고, 반대편에 손잡이가 달린 수동 스탬핑용 기구) 무균 25 ml 피펫 [Sterilin 40125] 무균 5 ml 피펫 [Falcon 7543] 무균 50 ml 튜브 [Falcon 2097] 무균 범용(universal) 튜브 [Sterilin 128A] 무균 blue plastic loops [Nunc ] 무균 TE [SOP GLS/07 참조] 장갑 (Microtouch) *모든 실험과정은 장갑을 착용하고 수행한다. 2 Pooling 체계 자원센터의 모든 YAC 라이브러리는 동일한 체계에 따라 합쳐지고 (pooling) 배포된다. 라이브러리는 8개 (ICRF, Lander mouse YAC) 또는 9개 (ICI)의 플레이트를 한 묶음으로 하여 나뉘어진다. 18

23 문서번호 GLI/1998/3/2 이들 8 또는 9개의 플레이트를 합친 (pooling) 것이 한 개의 1차 풀 (primary pool) 이 된다. 따라서, ICI는 40개, ICRF 27개, Lander mouse YACs은 50개의 1차 풀 로 구성된다. 사용자가 양성반응을 보이는 1차 풀 (positive-primary pool)을 동정하면, 센터는 2차 풀 (secondary pool) 을 제공하게 된다. 2차 풀 은 양성반응을 보인 1차 풀 을 구성하는 모든 플레이트를 합친 것과 이들 플레이트의 각각의 가로 열과 세로 행을 각기 합친 것으로 구성된다 ( 1차 풀 내 각 플레이트의 해당 열 (총 12개)과 행 (총 8개)을 각기 합치면 총 20개의 풀이 만들어진다.) 따라서, 사용자는 라이브러리의 종류 (ICRF/Lander mouse 또는 ICI)에 따라 총 28 또는 29개의 DNA 풀을 받게 된다. 이들 풀 중에서 적어도 세 개는 PCR 검사에서 양성반응을 보여야 한다: 1개는 양성클론이 포함된 플레이트를 결정하는 것이고, 2개는 양성클론이 포함된 열과 행을 결정하는 것이다. 모든 풀은 한천 블롭 (agarose blob) 속의 DNA 상태로 배포된다. 이들 블롭 을 만들기 위해서는 먼저 세포를 모아야 한다. (스크리닝법을 나타낸 모식도는 SOP의 끝부분에 제시되어 있다.) 3. 한천 플레이트 붓기 SD 한천이 들어있는 500 ml 병을 전자레인지에서 가열한다. 한천을 녹일 때 전자레인지 안에서 넘치지 않도록 주의한다. 녹인 한천은 배양 접시에 붓기 전까지 65C의 하이브리드 오븐에 보관한다. 한천이 식으면 플레이트로 붓기 직전에 500 µl 앰피실린 (50 mg/ml 농도)과 1.25 µl의 테트라싸이클린 (5 mg/ml 농도)을 500 ml 병에 넣는다. 500 ml의 한천은 약 10개의 둥근 배양접시 또는 14개의 Hybrid colony picking 플레이트에 부을 수 있는 양이다. 안전캐비닛 (무균 후드장치)을 열고 그 안에서 무균플레이트의 뚜껑을 열고 작업한다. 한천을 천천히 플레이트에 붓는다. 플레이트에 있는 기포를 용기 벽으로 밀어내기 위하여 멸균된 백금이를 사용한다. 한천을 굳히기 위해서 플레이트의 뚜껑을 닫기 전에 건조시킨다 (뚜껑을 너무 일찍 닫으면, 한천 표면에 응축수가 생성된다. 따라서 한천이 젖어 있으면 효모를 배양할 때 문제가 생길 수 있다). 플레이트를 밀착필름으로 감고 사용 전까지 뒤집어서 냉장 보관한다. 4. Hybond N 페이퍼 준비 19

24 문서번호 GLI/1998/3/2 YAC laminar flow 캐비닛인 후드에서 Hybond N 필터를 한천 위에 올려놓는다. 장갑을 착용한다. 끝이 평평하고, 파란색 손잡이가 달린 핀셋을 100% 알코올에 담그고 화염 멸균한다. 알코올과 화염은 후드의 반대쪽에 따로 떨어뜨려 놓아야 한다. 후드의 바닥을 70% 알코올로 분무하고 닦아내면 핀셋을 안전하게 둘 수 있다. 화염 멸균된 파란색 손잡이가 달린 핀셋으로 각 membrane을 집어서 Hybond colony picking; 플레이트 또는 배양접시의 배지표면에 올려 놓는다. Membrane은 한천과의 접촉면에 기포 없이 완전히 평평하게 놓아야 한다 (배양접시에 놓여 있을 때 가장자리가 말려 올라 갈 수 있으나, 이는 한천 상에 여유 공간이 있기 때문에 플레이트를 찍을 때 문제가 되지 않는다). 5. 플레이트의 수동 스탬핑 (stamping) (배양접시 사용) 실험자의 YAC working copy 플레이트를 녹인다. 각 배양 접시를 뒤집어 놓고 플레이트의 위쪽에 플레이트 번호를 적는다. 각각의 YAC 96-well 플레이트 하나 당 3개의 한천 플레이트가 필요할 것이다. 첫 번째 한천 플레이트 = 플레이트 풀 수집용 두 번째 한천 플레이트 = 모든 플레이트의 가로 열 수집용 세 번째 한천 플레이트 = 모든 플레이트의 세로 행 수집용 Hedgehog 를 메탄올 수조에 넣었다 꺼내어 화염 멸균한다. 메탄올과 화염은 후드 안에서 서로 반대편 가장자리에 두어야 함을 기억할 것. Hedgehog 를 서서히 식힌다. 좌측 상단에 well A1의 source 플레이트를 놓고, 상단에 정확한 플레이트 번호가 적힌 3개의 한천 플레이트를 준비한다. (플레이트 번호가 뒷면에 적혀서 좌우가 바뀐 거울 상으로 보일 것이므로, 실험자가 스탬핑 전에 꼭 확인한다.) Hedgehog 를 source 플레이트에 넣었다가, 첫 번째 한천 플레이트로 이동하여 핀이 membrane의 표면에 천천히 놓이게 한다. 다른 두 개의 플레이트도 같은 방법으로 반복한다. Hedgehog 를 무균수조에 넣었다가 꺼낸 후, 키친 타올에 찍어서 말리고, 이전처럼 메탄올 수조에 넣었다가 화염 멸균한다. 사용한 키친 타올은 버린다. 실험자는 다음 플레이트를 스탬핑하면 된다. 20

25 문서번호 GLI/1998/3/2 6. PBA 로봇을 사용하여 플레이트에 스탬핑 ( colony picking plate 의 한천 이용) GLI/1998/3/11. 에서 제시된 절차를 변형한 것으로, source 플레이트를 액상의 96-well 플레이트로 복사하는 것 대신 한천 플레이트상에 복사하는 것이다. 7. 한천 플레이트 배양 밀착필름으로 감싼 한천 플레이트를 뒤집어서 30 에서 2~3일 동안 배양한다. 한천 플레이트에 배양체가 자랐을 때, 세포 풀을 바로 수집하지 않을 경우에는, 4 에 보관할 수 있다. 8. 플레이트 풀 수집 사용 전에 깨끗이 정돈된 YAC 후드 안에서 작업한다. 1차 풀 에 해당하는 8개 또는 9개 플레이트 묶음의 첫 번째 한천 플레이트 세트를 수거하여 후드 안에 놓는다. 정확한 플레이트 수에 해당하는 무균 범용튜브 8개 (또는 9개)에 표시한다. 멸균된 25 ml 피펫을 사용하여 15 ml의 멸균 TE 용액을 각각의 한천 플레이트에 넣어준다. 새로운 25 ml 피펫을 사용하여 각 한천 플레이트에 있는 모든 세포들이 현탁 될 때까지 TE용액을 매우 천천히 섞어준다. 한천이 함께 수집되지 않도록 너무 심하게 섞지 않게 주의한다. 피펫으로 15 ml의 세포 현탁액을 번호가 정확하게 표시된 해당 범용튜브로 옮긴다. 각각의 플레이트마다 새로운 피펫을 사용해야 함을 기억한다. 해당 플레이트 묶음의 마무리 단계에 한천 플레이트로부터 얻은 세포 풀 이 담긴 8개 (또는 9개)의 범용튜브를 얻게 된다. 각 범용튜브마다 새로운 5 ml 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 5mL 취하여 50mL 무균 Falcon 튜브 하나에 모은다. 하나의 Falcon 튜브에 모아진 40 ml (또는 45 ml)의 세포 현탁액이 1차 세포 풀 이 된다. 튜브에 적절한 번호를 표시한다 (각 라이브러리는 1차 풀 의 번호부여체계가 다르다. 따라서, 특정 라이브러리를 다룰 때는 라이브러리의 세부사항에 대해 팀장과 상의한다) 정확하게 표시되고 날짜가 기입된 랙에 튜브를 꽂아 4 에 세포 풀 을 보관 한다. 21

26 문서번호 GLI/1998/3/2 9. Super-rows의 수집 8개 또는 9개의 플레이트 모두에서 가로 열을 수집하여 함께 모을 것이므로 이를 super-rows 라 부른다. 이 작업은 실험실 무균 실험대에서 행하며, 실험대는 사용하기 전에 70% 알코올로 철저히 닦아야 한다. 범용튜브 20 개에 1차 풀 번호 (xx)-1 부터 1차 풀 번호 (xx)-20 까지 각각 표시 한다. 25 ml 멸균 피펫을 사용하여 1번 튜브부터 8번 튜브까지 멸균된 TE 용액 15 ml씩 채운다. 이들은 super-rows 제조용으로 사용된다. 25 ml 멸균 피펫을 사용하여 9번 튜브부터 20번 튜브까지 멸균된 TE 용액을 10 ml씩 채운다. 이들은 super-columns 제조용으로 사용한다. 8개 (또는 9개)로 구성된 두 번째 한천 플레이트 세트를 준비한다. 상단에 번호가 매겨진 플레이트가 모두 정확히 놓였는지 확인한다. 멸균 blue loop를 사용하여 1번 플레이트의 가로 열 A 전체를 천천히 훑어 모은 세포를 TE 용액이 들어있는 xx-1 으로 표시된 범용튜브에 옮겨 담는다. 이미 수집이 끝난 플레이트는 실험대의 다른 곳에 둔다 (수집이 끝난 플레이트와 그렇지 않은 플레이트가 깔끔히 구분될 수 있도록 함.). 앞서 사용한 blue loop를 교환하지 말고 2번 플레이트의 가로 열 A 전체를 수집하여 튜브 xx-1 에 집어넣는다. 모든 플레이트를 대상으로 이 과정을 수행한다. 최종적으로 8개 (또는 9개)의 플레이트로부터 모든 가로 열 A의 세포를 수집하여 튜브 xx-1 에 모으게 된다. 튜브 xx-1 의 뚜껑을 닫고 다른 랙에 옮겨둔다. 튜브 xx-2 의 뚜껑을 열고 새로운 멸균 loop를 사용하여 8개 (또는 9개) 플레이트의 모든 가로 열 B를 수집한다. 튜브 xx-8 에 모든 가로 열 Hs를 수집 할 때까지 위와 같은 방식으로 계속 한다. 한천 플레이트 전체로부터 가로 열을 모두 훑은 후에 플레이트를 폐기한다. 10. Super-cloumns의 수집 8개 (또는 9개)의 세 번째 한천 플레이트를 준비한다. 상단에 번호가 매겨진 플레이트가 모두 정확히 놓였는지 확인한다. 멸균 blue loop를 사용하여 1번 플레이트의 가세로 행 1 전체를 천천히 훑어 모은 세포를 TE 용액이 들어있는 xx-9 로 표시된 범용튜브에 옮겨 담는다. 이미 수집이 끝난 플레이트는 실험대의 다른 곳에 둔다 (수집이 끝난 플레이트와 그렇지 않은 플레이트가 깔끔히 구분될 수 있도록 함). 22

27 문서번호 GLI/1998/3/2 앞서 사용한 blue loop를 교환하지 않고 2번 플레이트의 세로 행 1 전체를 수집하여 튜브 xx-9 에 넣는다. 모든 플레이트를 대상으로 이 과정을 수행한다. 최종적으로 8개 (또는 9개) 플레이트로부터 모든 세로 행 1의 세포를 수집하여 튜브 xx-9 에 모으게 된다. 튜브 xx-9 의 뚜껑을 닫아 다른 랙에 옮겨둔다. 튜브 xx-10 의 뚜껑을 열고 새로운 멸균 loop를 사용하여 8개 (또는 9개) 플레이트의 모든 세로 행 2를 수집한다. 튜브 xx-20 에 세로 행 12를 모두 수집할 때까지 위와 같은 방식으로 계속 한다. 한천 플레이트 전체로부터 세로 행을 모두 훑은 후에 플레이트를 폐기한다. 세포 풀 이 들어있는 모든 튜브는 세포벽을 제거하기 전까지 4C에 보관 가능하다. 경험에 의하면 세포 풀 은 4 에서 12개월 또는 18개월 보관한 후에도 여전히 DNA 한천 블롭 생산에 사용할 수 있었다. *추신: stack 의 다른 이름은 block 이다. Lander mouse YAC 라이브러리는 50 블록으로 나뉘어져 B1부터 B50까지로 표시되어 있다 (B=block). 23

28 문서번호 GLI/1998/3/3 YAC pools 의 세포벽 제거 (Spheroplasting) 1. 실험 재료 고압멸균된 500 ml, 250 ml, 100 ml 짜리 Duran병 고압멸균된 1.5 ml Sarstedt 튜브 또는 15 ml conical Falcon 튜브 효모 풀 50 µl 눈금선이 표시된 Sarstedt 튜브 고압멸균된 유리 파스퇴르 피펫이 달린 진공 시스템 무균 bijou병 또는 일반 튜브 Eppendorf 0.5 ml combitip과 분주기 플라스틱 계량 용기 (대형) 플라스틱 약숟가락 70% 알코올 50 ml Falcon 튜브 37 진탕배양기 46 수조 5 mm EDTA, ph 8 [용액에 대한 표준프로토콜 참조] Zymolyase, 100 Tablet [ICN #320931] β-mercaptoethanol 저융점 아가로즈 [Gibco 5517UB] 세포벽 제거 (스페로플라스팅) 용액 [표준프로토콜 GLS/07 참조] YLS [표준프로토콜 GLS/07 참조] 전자레인지 (Toshiba, ER-8730) 50 ml Falcon 튜브의 녹색 망 뚜껑 2. 용액 세포벽 제거 용액 x40 = 40개 (2차 풀, µl/블롭) x20 = 20개 (2차 40 µl/ 블롭) = 4 x 10개 (1차 50 = 4 x 5개 (1차 50 µl/ µl/블롭) 블롭) 세포벽 제거 500 ml 250 ml 24

29 문서번호 GLI/1998/3/3 Zymolyase 100T 50 mg 25 mg β -mercaptoethanol 500 µl 250 µl 2% 아가로스 저융점 아가로스 1 g 0.5 g 세포벽 제거 용액 50 ml 25 ml β -mercaptoethanol 50 µl 25 µl *주의: 다른 수의 풀을 블롭으로 만들 때는, 두 용액의 용량을 조정해야 한다. 3. 방법 *실험하는 동안 장갑을 철저히 착용한다. *모든 팁 (tip), 병, 피펫 등을 멸균한다. 세포 침전물 준비 *1차 풀: 15 ml Falcon conical 튜브에 세포 침전물 200 µl 필요 *2차 풀: 1.5 ml Sarstedt 튜브에 세포 침전물 50 µl 필요 1 4 저온 캐비닛에서 필요한 세포 풀을 꺼낸다. 2 눈금 표시된 1.5 ml Sarstedt 튜브에 완벽하게 현탁시킨 세포 1.6 ml을 P100의 피펫으로 옮기거나, 눈금 표시된 15 ml Falcon 튜브에 9.6~11 ml를 옮긴다. Sarstedt 튜브를 미량원심분리기로 13,000 rpm으로 1분간 원심분리한다 µl 용량이 눈금 표시되어 있는 Sarstedt 튜브를 똑바로 세워서 침전물의 용량을 확인한다. 각 튜브에서 상층액을 조심스럽게 뽑아내기 위해서 멸균된 유리 피펫이 달린 진공시스템을 이용한다. 실제 세포를 건드리지 않는 것이 중요하다. 사용하지 않을 때는 파스퇴르 피펫을 여분의 깨끗한 50 ml Falcon 튜브에 놓는다. 4 침전물의 용량을 측정하여 각각 튜브에 세포 침전물이 약 50 µl가 되는 데 필요한 효모 현탁액의 용량을 결정한다. 이러한 추가적인 용량은 일반적으로 Sarstedt 튜브에서 0.4~0.8 ml 범위이다. 5 1차 풀을 위해서 사용되었던 15 ml 튜브의 측면에 눈금 표시가 되어서 200 µl 표시를 보기 편하다. Sorvall T6000B 실험대용 원심분리기로 적당한 bucket adapter를 사용하여 2,700 rpm (설정 5)에서 4분간 이들 튜브를 원심분리한다. 만약 첫 원심분리로 필요한 세포 침전물이 200 µl가 안되면 위의 50 µl 시료와 같이 보다 더 많은 세포 현탁액을 가해야만 한다. 6 일단 필요한 세포 침전물 용량이 확보되면, 튜브는 그 다음날 사용 하기 위하여 4 냉장고에 보관한다. 상층액은 하룻밤 동안 세포의 상부에 남게 25

30 문서번호 GLI/1998/3/3 7 된다. 용액준비 1 수조에 충분한 물이 있는지 점검한 후에 46 로 켠다. 2 다음과 같이 필요한 양의 세포벽 제거 용액 과 2% 아가로스를 만든다. 세포벽 제거 용액 2% 아가로스 필요량을 선택한다. 만약 250 ml만 필요하다면 멸균된 250 ml Duran병에 정확한 양을 붓는다. 500 ml이 필요하다면 멸균 피펫을 이용하여 500 ml 표시에 용량을 맞춘다. Zymolyase를 계량하여 그 용액에 조심스럽게 넣는다. Zymolyase는 즉시 녹지 않으므로 녹을 때까지 서서히 교반시켜야만 한다. β-mercaptoethanol은 흄 후드에서 첨가한다. Zymolyase와 β-mercaptoethanol을 추가할 필요가 없는 보관용 병들과 혼동하지 않기 위해서 병에 명확히 표기 한다. 이제 막 준비한 것이 아닌 보관용 병에서 멸균된 피펫으로 세포벽 제거용액 을 필요량만큼 무균의 100 ml Duran병에 분주한다. 병의 바깥면에 마크펜으로 용액의 수준을 표시한다. 저융점 아가로스를 계량해서 병에 넣고 혼합한다. 뚜껑을 열어서 전자레인지에 아가로스를 놓고, 설정 3으로 1분간 처리한다. 아가로스가 녹을 때까지 이를 반복한다. 혼합액이 끓어 넘치지 않도록 주의한다. 녹았을 때 그 병을 적색의 고무로 된 핫핸드 로 집어서 β- mercaptoethanol을 가하기 위해서 흄후드로 가져간다. 실험실로 돌아 와서 그 병의 측면에 용량표시를 확인하고 필요하다면 멸균된 피펫으로 세포벽 제거용액 을 정확한 수준까지 채운다. 46 수조에 아가로스를 넣고 병이 뜨지 않도록 뚜껑 위에 적색의 납으로 만든 추 (lead weight)를 올려놓는다. 세포의 세포벽 제거 1 앞서 언급한 바와 같이 세포 현탁액이 담긴 튜브를 원심분리한다. 세포 펠릿을 건드리지 않도록 조심스럽게 상층액을 뽑아낸다. 1차 pool을 만들기 위해서 세포벽제거 용액 (zymolyase와 β-mercaptoethanol이 첨가된 것) 1 ml를 각각 1.5 ml 튜브에 넣거나 4 ml를 각각 15 ml 튜브에 넣는다. 각 시료에 대해서 2 병이 뜨지 않도록 주의하면서 멸균된 bijou병 (2차 pool용) 또는 멸균된 일반병 (1차 pools용)을 46C 수조에 넣는다. 멸균 팁 또는 멸균된 5 ml 피펫을 사용하여 아가로스 1 ml (또는 4 ml)를 그 병에 넣는다. 이 26

31 문서번호 GLI/1998/3/3 팁/피펫을 교환하지 않고, 세포현탁액을 혼합해서 아가로스에 넣어 잘 섞는다. 3 계량 용기 (250 ml 크기)를 얼음통 안의 얼음에 놓는다. 현재 사용 중인 풀 번호의 정확한 표기가 붙어있는 계량 용기의 가장자리에 표시 한다. 4 분주기에 0.5 ml combitip을 끼우고 1차 풀에는 5를 설정하고 2차 풀에는 4를 설정한다. combitip에 세포 아가로스 혼합액을 채우고, 냉각된 계량 용기 위에 blob을 분주한다. blob이 서로 가까워서 섞이지 않도록 한다. 모두 분주하기 전에 세포 아가로스 혼합액을 combitip에 수 회 채운다. 각 1차 풀에서는 2개의 계량 용기를 필요로 한다. 5 계량 용기를 얼음에서 실험대로 옮기고, 다음 시료를 준비한다. 항상 새 팁/피펫/combitips을 사용하는 것을 기억하면서 각 세포 풀은 2-5번째까지의 단계를 반복한다. 6 한천 덩어리 는 4 에서 30분 또는 실온에서 1시간 동안 냉각한다. 7 멸균 피펫으로 각 계량 용기에 세포벽제거 용액 (zymolyase와 β- mercaptoethanol이 첨가된 것) 10 ml를 넣는다. 1차 pool을 준비하는 데 총 40 ml (계량 용기 당 20 ml)가 필요하다. 8 각각의 풀을 다룰 때마다 70% 알코올로 소독하고 물기를 닦아 낸 플라스틱 약숟가락을 사용하여 '한천 블럽 을 부드럽게 떼어내어 무균의 눈금 표시된 50 ml Falcon 튜브에 넣는다. 각 2차 풀은 세포벽제거 용액 10 ml 가 들어있는 50 ml Falcon 튜브에 넣고, 각 1차 풀은 세포벽제거 용액 40 ml가 들어있는 50 ml Falcon 튜브에 넣는다. 9 모든 튜브를 폴리스틸렌 랙에 놓는다. 37 진탕배양기에 랙을 45도 각도로 고정되게 테이프로 감아 놓는다. 140 rpm으로 설정하고 37 에서 2시간 동안 진탕 배양을 한다. 세포의 용해 1 두 개의 녹색 망 뚜껑을 멸균된 3차 증류수가 담긴 비이커에 넣는다. 2 각 50 ml Falcon 튜브의 윗부분을 떼어내고, 녹색 망 뚜껑을 잠근 후, 세포벽제거 용액 을 큰 비이커로 빼낸다. 녹색 망 뚜껑에 남아있는 '한천 덩어리'를 완전히 없애기 위해 실험대에서 튜브를 거세게 친다. 세정하기 위해 녹색 망 뚜껑을 물속으로 넣는다. 두 개의 뚜껑을 번갈아 사용한다. Falcon 튜브 위에 뚜껑을 살짝 올려놓고, 그 튜브를 폴리스틸렌 랙에 다시 놓는다. 3 모든 튜브에서 세포벽제거 용액 이 빠져 나왔을 때, lysis 완충액인 YLS 10 ml를 멸균 피펫으로 각 튜브 (1차 pool용 40 ml)에 넣는다. 튜브간에 피펫을 교체할 필요는 없다. 그 피펫은 튜브의 측면에 부착되어 있는 모든 '한천 블롭'을 완충액으로 밀어 내리는 데 이용할 수 있다. 모든 뚜껑을 27

32 문서번호 GLI/1998/3/3 단단히 잠근다. *주의. 만약 YLS가 낮은 외부온도 때문에 침전되면, 37 로 데워 다시 녹인다. 4 이전과 같이 37 에서 30~60분 동안 기울여서 배양한다. 5 튜브를 비우고, 1~3번째 단계와 같이, 새 YLS로 교체하여, 37 에서 하룻밤 동안 기울여 배양한다. 6 다음날 아침, 5번째 단계를 반복하고, 새 YLS로 교체하여 37 에서 2시간 동안 기울여 배양한다. 아가로스 펠릿 ( 한천 블롭 ) 보관 1 이전과 같이 녹색망 뚜껑을 통해 최종 YLS 세정액을 버린다. 2 오염되지 않도록 하기 위해 멸균 피펫을 사용해서 무균의 눈금 표지된 일반 튜브 (2차 풀용 한천 블롭 ) 또는 50 ml Falcon 튜브 (1차 풀용 한천 블롭 )에 5 mm EDTA를 가한다. 일반 튜브에는 10 ml를 그리고 Falcon 튜브에는 40 ml를 가한다. 3 각각의 풀을 다룰 때마다 70% 알코올로 소독하고 물기 없이 닦아 낸 플라스틱 spatula를 사용하여 부드럽게 떼어 내어 5 mm EDTA가 채워진 튜브에 넣는다. 4 정확하게 표기된 랙에 놓은 한천 블롭 을 4 냉장보관한다. 28

33 문서번호 GLI/1998/3/4 품질 관리: YAC pools 의 PCR *주의: 아래에 제시된 유전자 증폭 과정 (Polymerase Chain Reaction, PCR)은 한 예로 제시된 것이므로 다른 프라이머를 사용하는 경우 각 실험조건은 변경되어야 할 것이다. 1 필요한 프라이머의 정확한 농도 (이것은 총 인간 게놈 DNA상의 여러 농도를 이용함으로써 결정된다. 그러므로 최적 농도를 결정하는 것) 2 PCR 혼합액에서 필요한 마그네슘 (Mg 2+ )의 정확한 최적 농도 3 PCR기기에 프로그램 될 변성, 풀림과 합성단계에서 요구되는 온도 4 PCR이 hot start (Taq polymerase는 초기 변성단계 후에 첨가된다)인지 시작단계에 Taq polymerase가 master mix와 함께 첨가되는 cold start 인지를 결정 5 겔 상태에서 증폭된 산물의 크기에 따라 PCR 산물을 보기 위해 필요한 아가로스의 퍼센트 농도 (증폭된 산물은 PCR반응에 의해서 새롭게 합성된 DNA이다.) 6 DNA marker의 분자량은 증폭된 산물의 크기에 따라 적절히 선택된다. 실험자가 PCR을 통해 새로운 배치의 DNA 아가로스 펠릿을 검사하는 것이 필요한 이유는 그것이 바로 실험자가 하려 하는 것이기 때문이다. 그래서 새 펠릿을 만든 후, 특히 펠릿을 만들때 사용된 cell pool이 오래되었다면 새 펠릿을 검사해야 한다. 예시 1 PCR 예시 양성 클론 ICI 11B-G10 프라이머 쌍 5071 agc aac aca tat cag ggg c 5072 tgt agg ttg acc tta agg c 산물크기 350bp (base pairs) 1. 실험재료 PCR전에 펠릿을 세정하기 위한 50 ml Falcon 튜브 1X TE (표준 프로토콜 GLS/07 참조) 아가로스 펠릿: 1차 풀 11 (구 '플러그(plugs)'), 1차 풀 11 (새 '펠릿') 과 2차 풀 '펠릿' 11/7 65 수조 얼음통에 담긴 얼음 Perkin Elmer PCR 튜브, 뚜껑과 틀 29

34 문서번호 GLI/1998/3/4 무균 마이크로튜브 무균 피펫 팁 Eppendorf 피펫 튜브 위의 PCR 뚜껑을 덮기 위한 롤러 2 mm dntps [라이브러리 PCR 상자, -20 보관] 15 mm Mg 완충액 [ " " ] PCR 시약 프라이머 5071 프라이머 5072 멸균된 3차 증류수 0.51mg/mL: 4 냉장 보관] 0.59mg/mL: 4 냉장 보관] 양성 대조구: 인간 게놈 DNA [라이브러리 PCR 상자, -20 보관] 음성 대조구: 효모 DNA [라이브러리 PCR 상자, -20 보관] Perkin Elmer Cetus: #YAC 2 프로그램 79 2% 아가로스 (전기영동 등급: Gibco # ) 전자레인지 (Toshiba ER-8730) 1X TBE (10X stock TBE [National Diagnostics #EC-860]을 3차 증류수로 1/10로 희석함) Ethidium bromide 1 mg/ml stock Gel loading buffer = 15% Ficoll (용매: 1X TE) + bromophenol blue DNA marker VI Biorad 미니 sub DNA cell 전원공급장치 ( Gene power supply ) GPS 200/400 UV 조명기와 사진장치 2. 방법 실험 하는 동안에 장갑을 착용한다. 아가로스 펠릿의 세정 *펠릿에 축적될 수 있는 방해물질을 제거하기 위해서 펠릿을 세정해야만 한다. *May Tassabehjis 박사의 프로토콜을 사용한다. 1 각 펠릿을 표지된 무균의 50 ml Falcon 튜브에 각각 넣은 다음, 1X TE 용액 30 ml 가한다. 2 한번 세정하는 데 적어도 1시간 정도로 하여 완충액을 두 번 교체하면서 실온에서 흔들어준다. 3 4 에서 새 TE 용액에 넣어 하룻밤 방치한다. 30

35 문서번호 GLI/1998/3/4 아가로스 펠릿 녹이기 1 세정된 펠릿을 표지된 무균의 1.5 ml 미량튜브에 놓는다. 2 Microtube를 폴리스틸렌 부표에 끼워 65 수조에서 10~15분 동안 녹인다. PCR 반응 설정 1 얼음통에 얼음을 채운다 냉동고안의 PCR 상자에서 필요한 시약 (Taq은 제외)을 꺼내서 녹인다: dntps, Mg 2+ 완충액, 인간 게놈 DNA과 효모 DNA. 가능한 빨리 녹여 얼음 위에 놓는다. 3 primer 희석액 만들기: 멸균된 3차 증류수로 20배로 희석함 예) 무균의 표지된 미량튜브에 190 µl 멸균수와 10 µl 프라이머를 넣어, 얼음 위에 둔다. Master mix 만들기 각 PCR 반응 용량 12개 master mix를 만들 용량 (항상 시료 수 보다 많게 만든다.) 2.5 µl 2 mm dntps 30 µl 2.5 µl 15 mm Mg 완충액 30 µl 1 µl primer /20 12 µl 1 µl primer /20 12 µl 8 µl 무균 3차 증류수 96 µl 1 Master mix가 담긴 무균 미량튜브에 표기를 하고, 얼음 위에 튜브를 꽂은 채로 무균 팁을 사용하여 정확한 양의 시약을 조심스럽게 가한다. 2 그리고 나서 dntps와 Mg 완충액 저장용 튜브를 다시 얼리고, primer stock은 4 냉장고에 다시 넣어둔다. 실험자의 시료 세팅 번호 시료 멸균된 3차 증류수 (µl) 시료 (µl) 1 공백 (물) 인간 게놈 DNA 효모 게놈 DNA 구 펠릿 구 펠릿

36 문서번호 GLI/1998/3/4 6 구 펠릿 새 펠릿 새 펠릿 새 펠릿 SRxSC 펠릿 11/ 위에 지지덮개로 고정된 PCR 튜브를 Perkin Elmer 랙에 꽂아, 얼음 위에 둔다. 2 3차 증류수를 튜브에 가한다. 3 각각 녹은 아가로스 펠릿을 수조에서 꺼내어 해당 튜브에 적정량을 가한다. 4 인간 게놈 DNA와 효모 DNA는 해당 튜브에 넣는다. 5 각 튜브에는 시료 5 µl가 있을 것이다. 각 튜브에 master mix 15 µl를 가한다. 6 가로 줄의 튜브 위에 스트립 뚜껑을 놓고 누른 다음, 각각의 캡을 단단히 고정하기 위한 특수 cap sealer를 씌운다 (만약 뚜껑이 잘 잠기지 않으면 thermal cycler [PCR 기기]의 고온에 의해 시료가 증발된다.) 실험대 위의 PCR rack 에서 뚜껑을 단단히 끼우는 것이 훨씬 수월하며, 뚜껑을 다 씌우고 나면 튜브를 즉시 얼음에 다시 박아 둔다. 7 이 PCR법은 'hot start'를 채택한 것이므로 Taq 희석액은 지금 만든다. 최종 용량 25 µl를 만들려면 각 튜브에는 Taq 희석액 5 µl이 필요하므로, 튜브 당 0.2 µl의 Taq이 필요하다. Taq 을 -20 에서 꺼낸다. 효소가 글리세롤 속에 보존되어 있기 때문에 동결된 고체가 아니다. 그러나 튜브에 Taq이 아주 적은 양 있고 매우 비싸기 때문에 튜브 내의 모든 효소가 바닥에 모이게 하기 위하여 소형원심분리기에서 아주 짧게 돌려주는 것이 유용하다. 얼음 위에서 Taq 2.4 µl를 무균 3차 증류수 57.6 µl에 첨가한다. 진한 글리세롤이 물과 자유롭게 섞일 수 있도록 잘 혼합한다. PCR의 초기 변성단계가 끝난 후에 튜브에 첨가할 수 있도록 얼음 위에 튜브를 놓는다. 중요한 점은 가능한 한 짧은 시간 동안 Taq이 냉동고 밖에 있어야 한다는 것이므로, 희석액을 만들자마자 곧 바로 재동결 한다. PCR 기기 필요한 PCR 프로그램 94, 5 min 94, 1 min/52, 1 min/72, 1 min (30회 반복) 72, 10 min PCR Cetus YAC2 프로그램 79 1 사용 30분 전에 PCR기기 [YAC2]를 켠다. 32

37 문서번호 GLI/1998/3/4 2 PCR 튜브가 꽂혀있는 얼음 통과 Taq을 PCR 기기 쪽으로 옮긴다. 또한 두 번째 뚜껑 스트립 과 끝에 Gilson microtip tip 을 꽂은 0.05 ml combitip도 준비한다. 분주기는 5로 설정한다 (5 µl씩 분주됨). 3 Run 을 선택하여 PCR기기를 작동시키고, 용량을 25 µl로 설정하고 엔터 키를 누르면, 뚜껑을 닫고 잠그라 는 메시지가 나온 후에 PCR 프로그램이 시작될 것이다. 4 온도가 80 에 도달될 때, 덮개를 열고 갈색의 틀에서 PCR 트레이를 꺼내서 기기에 넣고, 덮개를 닫고 다시 잠근다. 프로그램이 94 까지 도달하게 되고, 5분간 시간을 잰다. 5 10초 전에, Pause 를 누른다. 덮개를 열고 PCR 튜브에서 뚜껑들을 연다. Taq 희석액을 combitip에 채우고 각 튜브에 5 µl씩 넣는다. 각 튜브가 잘 혼합되었는지 확인한다. 새 뚜껑으로 교체하고, 완전히 닫히도록 cap sealer 를 사용한다. 6 덮개를 닫고 다시 잠그고, 프로그램을 다시 시작하기 위해 RUN 을 누른다. 7 PCR 종료 시 플레이트를 꺼내고, 기기를 끈다. 아가로스 겔 전기영동 아가로스 겔상에서 전기영동을 한 PCR 산물을 확인하기 위해서 DNA를 ethidium bromide로 염색하고, UV로 관찰한다. 1 깨끗한 지 확인한 후에 가장 작은 크기 겔 트레이의 막히지 않은 양쪽 가장자리를 멸균 테이프로 막는다. 테이프의 끝을 말아두면 나중에 제거하기가 보다 쉽다. 2 평평한 실험대 위에 겔 트레이를 올려놓고 13개의 홈 (well)이 있는 콤 (comb) 을 겔 트레이 위에 꽂으면, 콤 이 겔 위쪽에서 약 1/4 정도 아래에 위치하게 된다. 3 아가로스 1 g을 계량하여 1XTBE 완충액 50 ml를 담은 100 ml 병에 넣는다. 혼합한다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지를 3 에 설정 하여 1분간 수 회 작동한다. 4 약간 식히고 ethidium bromide 25 µl를 가한다. 5 겔 트레이에 붓고 굳힌다. 6 겔이 굳으면 겔 가장자리의 테이프를 벗기고 겔을 기기 안쪽 바닥 위에 놓는다. 콤 을 천천히 뺀다. 홈이 겔의 위쪽으로 향하게 하고, 빨간 (양극) 전극을 실험자에 가까운 쪽에 위치하게 한다. 1X TBE 용액을 겔이 완전히 잠길 때까지 붓는다. 플라스틱 파스퇴르를 이용하여 ethidium bromide 150 µl를 완충액에 넣고 혼합한다. 7 각 PCR 튜브에 겔 loading buffer 7 µl를 넣는다. 8 첫 번째 홈은 비워두고, 각각의 홈에 PCR 혼합액 12 µl를 넣는다. 12 µl를 33

38 문서번호 GLI/1998/3/4 넣기 전에 피펫을 사용하여 loading buffer와 혼합한다. 10개의 PCR 반응액 모두를 홈에 넣을 때까지 계속한다. 9 홈 1번과 12번에 DNA marker VI를 5 µl 넣는다. 10 덮개를 닫고, 전극을 전원공급장치에 연결한다. 빨간 도선 (red lead)이 빨간 단자 (red terminal)에, 검은 도선 (black lead)은 검은 단자 (black terminal)에 제대로 연결되었는지 항상 확인한다. 11 전원공급장치의 앞 뒤에 있는 스위치를 켜고 80 V가 되도록 전압을 맞춘다. 12 수 분 후에 시료가 정상적인 방향 (실험자 쪽, 겔의 중심쪽)으로 이동하는지 확인한다. 13 전기영동을 1.5~2시간 동안 수행한다. (그러나 너무 길게 하여 앞부분이 겔을 빠져나가지 않도록 한다.) 14 끝나면 겔을 꺼내기 전에 전원을 끈다. *주의: ethidium bromide은 강력한 돌연변이 유발물질이기 때문에 ethidium bromide와 접촉한 물품들은 매우 조심스럽게 처리해야만 한다. 고형물 (예, 팁)은 소각을 위해 용기 안에 두어야만 하고, 반면에 액체는 안전한 처리를 위해서 표기된 원통형의 큰 병에 조심스럽게 부어야만 한다. 겔 사진찍기 전기영동 탱크에서 겔을 조심스럽게 꺼내서 플라스틱 샌드위치 상자 덮개 위에 놓고 암실로 옮긴다. *주의: 암실에서 UV transilluminator로 작업하는 동안에 보호대를 착용해야 한다. UV는 눈에 매우 치명적이어서 항상 눈을 보호해야 한다. 1 Viglen 모니터를 켠다. 2 Mitsubishi 모니터를 켠다. 3 video copy processor (전원 스위치)를 켠다. 4 UV transilluminator를 켠다. 5 (장갑착용) 겔을 즉각 transilluminator 위에 카메라 아래에 똑바로 올려 놓는다 (겔은 플라스틱의 겔 형성 트레이에서 꺼내야만 한다). 6 화면에서 이미지를 얻기 위해서 마우스를 클릭한다. 7 화면상에 전체 이미지를 담기 위해 카메라의 높이를 조정한다. 8 뚜렷하고 밝은 이미지를 얻기 위해서 초점과 선명도를 조정한다. 9 이미지를 결정하기 위해 마우스를 클릭하고 선을 제거한다. 10 사진을 얻기 위해 인쇄를 누른다. 11 사용 후에는 transilluminator에 묻어 있는 완충액을 깨끗이 닦는다. 34

39 문서번호 GLI/1998/3/4 예제 2 양성 클론 ICI 11D-A12 PCR 예시: 프라이머 쌍 6175 ctt tga aga tgc tcc caa tg 6176 tca ctc ata gga ggg caa ac 산물크기 164bp (base pairs) 아래의 사항을 제외하고 위의 예시와 같이 정확히 진행한다: 필요한 PCR 프로그램 94, 5 min 94, 1 min/56, 1 min/74, 1 min (30회 반복) 74, 10 min PCR Cetus YAC2 프로그램 82 산물이 예시 1보다 작은 경우 2.5% 아가로스 겔 만든다. DNA marker set V를 사용한다. 35

40 문서번호 GLI/1998/3/7 고밀도 그리드 PAU/FUGU 필터의 생산 1. 실험재료 한천평판배지용 Bioassay 플레이트 [Nunc for PBA][Q-tray for Qbot] LB 한천평판배지 Kanamycin (25 mg/ml stock) Hybond N nylon membranes [Amersham NK 특별주문 22.2 cm x 22.2 cm] 핀셋 (끝이 무딘 것) 필터에 표기할 수 있는 연필 장갑 (Microtouch 또는 분말이 없는 것) 그리딩용 PBA 로봇 핀 그리딩 헤드(gridding head) 또는 Qbot 핀 그리딩 헤드 70%와 100% 알코올 colony picking 플레이트 [Hybaid HB CPP] 일정크기로 잘라 멸균한 3 mm 종이 장갑 (Microtouch 또는 분말이 없는 것) 밀착필름 37 배양기 실험용 방풍유리 트레이 [Perspex trays] 방풍유리 트레이 크기로 자른 3 mm 종이 샌드위치 상자 핀셋 (가늘고 끝이 뾰쪽한 것) 타이머 10% SDS 0.5 M NaOH/1.5 M NaCl 0.5 M Tris ph 7.4/1.5 M NaCl 50 mm Tris ph 7.4/0.15 M NaCl 2xSSC/0.1% SDS 2xSSC 50 mm Tris ph 7.4 교반틀 (X 2) 36

41 문서번호 GLI/1998/3/7 UV crosslinker 보관용 플라스틱 봉지 (지퍼락) 2. 한천 평판배지 붓기 PBA 다음 월요일과 화요일에 그리딩을 진행하려면 30개의 한천 평판배지를 금요일에 붓는다. 다음 수요일과 목요일에 그리딩를 진행하려면 30개의 한천 평판배지를 화요일 오후에 붓는다. 전자레인지 처리를 하지 않기 위해서 금요일과 화요일에 뜨거운 상태로 한천배지 (8~10 리터)를 주문한다. (실제로 5리터만 필요하지만, 만약 고압 멸균기 사용에 문제가 있다면 전자레인지로 처리될 수 있는 양만큼씩 한천 배지를 저장하는 것이 좋을 것이다.) Qbot 그리딩할 때마다 24개의 플레이트가 필요하다. PBA 한천배지를 주문한다. 한번에 24개 또는 48개를 붓는다. 이 경우에 그리딩하는 사람은 그 작업하는 동안에 다음날 작업을 위해 플레이트를 붓고 필터를 얹을 시간이 있다. 만약 한천배지가 굳기 전에 배지 제조처로부터 한천배지를 받았다면, 병을 65C hybrid 오븐에 즉시 넣는다. 그렇지 않으면 500 ml의 LB 한천배지 병을 전자레인지에 넣는다. 한천배지가 전자레인지 속에서 넘치지 않도록 한다. 녹인 한천배지를 부을 때까지 65 hybrid 오븐에 보관한다. 붓기 전에 한천배지가 식으면 PAC필터용은 kanamycin 500 µl, cfugu 필터용은 kanamycin 600 µl를 각각의 병에 첨가한다. 2개의 500 ml 병으로 7개의 Bioassay 플레이트를 부을 수 있다. PBA 그리딩 작업에서는 15개 플레이트가 매일 그리딩되고, Qbot 작업에서는 하루에 24개 플레이트를 사용한다. PBA에서는 Nunc사의 Bioassay 플레이트가 필요하고, Qbot에서는 Genetix사의 Q-트레이가 필요하다. 정면 개폐식 무균 캐비닛 (무균 후드) 안에서만 무균의 Bioassay 플레이트를 열고, 후드는 사용하기 전에 알코올을 분무해 두어야 한다. 무균의 50 ml Falcon 튜브를 이용하여 각 플레이트에 150 ml의 한천배지를 천천히 붓는다. 한천배지가 굳기 시작하기 전에 무균의 루프 또는 무균 팁을 사용하여 배양 접시 측면으로 모든 기포를 밀어낸다. 37

42 문서번호 GLI/1998/3/7 한천배지를 굳힌 후, 뚜껑을 다시 덮기 전에 건조시킨다. (만약 뚜껑을 너무 일찍 닫으면 많은 응축수가 한천배지 위에 생긴다. 이것은 그리딩하는 데 너무 많은 물이 필터에 남아있게 한다. 뚜껑을 덮자마자 뒤집어 놓는다.) 문제가 있을 때 사용하기 위하여 여분으로 1~2개의 플레이트를 매번 추가해서 붓는다. 플레이트는 밀착필름으로 감고 뒤집어서 다음 사용 전까지 냉장고에 보관한다. 3. Hybond N 페이퍼 놓기 한천배지 위에 Hybond N 필터를 놓기 위해서 층류 ( laminar flow ) 캐비닛인 후드에서 작업 한다. 장갑을 착용한다. 끝이 평평하고 파란색 손잡이가 있는 핀셋을 100% 알코올에 살짝 담그어 소독하고 물기를 닦아낸다. 후드 바닥은 70% 알코올로 분무하고 닦았기 때문에 바닥에 핀셋을 놓아도 안전하다. 만일 장갑이 분말이 없는 것이라면 장갑 낀 손으로 필터를 잡아 한천배지 위에 놓아도 된다. Membrane은 항상 표기하여 한천배지 위에 놓고, 한천배지 3개를 한 배치 (batch)로 밀착필름으로 감아둔다. Membrane의 뒷면의 한 끝을 들어 올려서 좌측 가장자리 상단에서부터 아래쪽으로 연필로 표시한다. 각 membrane을 들어올려서 한천배지 표면 위에 놓기 위해서 화염으로 멸균한 청색의 손잡이가 있는 핀셋을 사용한다. Membrane은 밑면에 기포가 없이 반드시 평평하게 놓여져야만 한다. Membrane의 한쪽 모서리를 핀셋으로 잡은 후 대각선의 반대편 모서리가 한천배지에 닿게 하여 비스듬히 내려놓는다. Membrane을 한천배지의 중앙에 즉, 각 가장자리로부터 동일한 거리로 떨어진 정방형으로 놓는 것이 중요하다. 실습을 거치면 좀더 수월해질 것인데, 첫 시도에 정확하게 membrane을 내려놓지 못할 경우, 동일한 membrane을 다시 들어올려서 재시도한다. 마음을 편안히 유지한다. (만약 어려우면, 휴식을 취하고 멀찍이 떨어져 있다가 심호흡한 후 다시 시도한다.) 밑면에서 membrane을 점검한다. 즉 membrane과 한천배지 사이에 기포가 없는지를 확인하는 것이 중요하다. (만약 기포가 있으면 집락이 한천배지와 접촉하지 못하고 영양분이 없어서 성장하지 못한다.) 플레이트는 다음 사용 전까지 밀착필름으로 감아 뒤집어서 4 에 보관한다. Membrane은 통상 이 단계에서만 3개의 평판배지에 올려 놓는다. 그래서 그리딩을 아침에 처음 시작할 수 있게 된다. 그리딩 작업이 시작되면 나머지 필터를 한천배지 위에 놓는다. 38

43 문서번호 GLI/1998/3/7 플레이트가 그리드된 날짜와 함께 사용된 membrane의 묶음번호 (batch number)와 그리드된 필터의 총 수를 필터 생산 명부 에 기록한다. 4. 표지 PAC=세트당 필터 7개, cfugu= 큰 필터 4개 + 작은 필터 1개 PAC 1 플레이트 1-48 cfugu 1 플레이트 1-48 PAC 2 플레이트 cfugu 2 플레이트 PAC 3 플레이트 cfugu 3 플레이트 PAC 4 플레이트 cfugu 4 플레이트 PAC 5 플레이트 cfugu 5 플레이트 PAC 6 플레이트 PAC 7 플레이트 (33개 플레이트만) (PAC 라이브러리에서는 174, 175, 176, 284, 285와 311로 표기된 플레이트는 없다.) (cfugu 라이브러리에서는 97~100까지 표기된 플레이트는 없다.) 이들 위치는 그리딩하는 동안 빈 무균 플레이트로 대체된다. 5. PBA 로봇을 사용한 그리딩 냉동고에서 라이브러리의 그리드 복사본과 함께 그리딩할 384 well 플레이트를 꺼낸다. PAC = L56 cfugu = L49 그리딩을 하기 전에 완전히 해동시키기 위해 냉동 플레이트를 알코올로 닦은 실험대 위에 놓는다. 그리딩 하기 전에 4 냉장고에서 꺼낸 15개의 한천평판배지를 뒤집어서 실온이 되게 한다. (플레이트가 따뜻해지면 응축수가 생길 것이다. 이것이 membrane 위에 있어서는 안 된다. 그러므로 반드시 뒤집어 놓아야 한다.) 384 핀 PBA tool 을 70% 알코올로 분무하고 건조 캐비닛 안에 놓는다. PBA 로봇을 켠다. 컴퓨터, 로봇, 조절된 공기 공급이 모두 켜 있음을 확인한다. 윈도우를 시작 하기 위해 개시-화면 에서 1을 선택한다. Form Program Manager 화면에서, PBA Flexys Bioassay Gridder 를 선택한다. (마우스로 더블 클릭한다.) Tool head 가 움직일 것이다. 마우스를 FILE 에 고정하여 하이라이트 를 준다. 39

44 문서번호 GLI/1998/3/7 NEWPAC 프로그램 (48개의 입고 (input) 플레이트가 있는 PAC와 Fugu의 모든 필터를 대상으로 할 경우). 예외) 1 PAC 7 필터. 평판배지가 33개뿐이므로, NEWPAC33 프로그램을 대신 선택. 2 cfugu 5 필터. 이것들은 작은 필터 위에 그리드한다. 끝부분을 참조. 384핀 툴 을 건조 캐비닛에서 꺼내어 식힌 후 로봇 팔에 조심스럽게 장착한다. 툴을 안전하게 장착하기 위하여, 툴을 뒤쪽으로 바로 민 다음, 지지클립을 가로질러서 민다. 툴이 정확하게 끼워지면 툴의 정면이 로봇 팔과 같은 평면으로 맞추어진다. 로봇이 견고한 Bioassay 플레이트 지지대에 장착되었는지 확인한다. x x x x x x x x x 필터 1 필터 2 필터 3 플레이트 1 플레이트 2 플레이트 3 플레이트 4 플레이트 5 Heater 플레이트 6 플레이트 7 플레이트 8 플레이트 9 플레이트 10 EtOH colony picking 플레이트 를 EtOH 위치에 놓고, 96% 에탄올로 상단 바로 아래까지 채운다. 알코올의 깊이가 중요하다. 트레이 속에 들어가 있는 핀 전체가 잠기도록 알코올을 채운다. 플레이트가 홈이 파인 고정위치에 놓이면, 단단하게 끼워지는 것이 중요 하므로 고정위치에 놓은 후 매번 체크한다. 만약 플레이트가 느슨하면 그리드 머리부분이 멀리 벗어나고, 그 핀은 정확히 구멍 안에 들어가지 않는다. 알코올 수조의 경우도 마찬가지이므로 확실하게 장착하도록 한다. 각 3개의 필터가 그리드 되고 난 후에 알코올을 교체한다. 실험하는 내내 장갑을 착용한다. 70% 알코올로 그리더 안에 LHS 상의 검은 플라스틱 부분을 분무한다. 이 부분에 플라스틱 뚜껑이 놓이므로 깨끗해야 한다. 한천 Bioassasy 플레이트 를 세 곳의 고정위치에 놓되 홈에 확실히 놓이도록 세심한 주의를 기울인다. 표기는 반드시 LHS 위에 되어야 한다. 5개를 한 묶음으로 쌓기 전에 384 well source 플레이트 위를 말린다. 그래서 그리딩 작업을 하는 동안, 매번 5개 플레이트로 된 2개의 그룹을 40

45 문서번호 GLI/1998/3/7 탈착하고 그 다음 5개 플레이트로 된 2개의 그룹을 장착하는 방식으로 원본 (source) 플레이트를 교체한다. 플레이트 1~5번과 플레이트 6-10번이 정확한 위치에 있는지를 확인하면서 처음 10개의 플레이트는 그리더 위에 놓는다. (위의 그림 참조) 오른쪽에서 왼쪽으로 옮아가면서 3개의 Bioassay 한천 플레이트 의 뚜껑을 벗겨 왼쪽 편 (LHS) 위의 검은 플라스틱 부분 위에 쌓아 둔다. 오른쪽에서 왼쪽으로 옮겨가며 왼쪽 편 위의 검은 플라스틱 부분에 뚜껑을 쌓으면서 384 well 원본 플레이트 에서 뚜껑을 벗긴다. (오른쪽에서 왼쪽으로 옮겨가는 것이 무균상태가 아닌 실험자의 팔과 손이 열린 플레이트 위에서 움직이는 것을 최소화한다. 일단 뚜껑이 열린 플레이트는 오염되지 않도록 한다.) 만약 이 단계에서 원본 플레이트 well 위에 물기가 있으면 그만한 크기로 자른 무균의 3 mm 종이로 천천히 닦아내야만 한다. 모든 것이 준비되면 - 그리딩를 시작한다. (상자를 클릭한다.) - 그리딩 시작화면에 Bioassay 플레이트 패치 1, spot 번호 1, 필터 번호 1이 나타나야 한다. - 화면에 제대로 표시되면 OK를 클릭한다. 그리딩 시작 후 10분이 좀 지나 그리딩이 끝나면, 더 많은 플레이트를 올려 놓는다. 그리더 위의 뚜껑을 10개의 플레이트에 조심스럽게 다시 올려 놓는다. (이번에는 왼쪽에서 오른쪽으로 옮겨가면서) 플레이트 10개를 탈착하여 실험대 위에 쌓아두는데, 이렇게 함으로써 이 플레이트들은 이미 그리딩된 것임을 명확히 할 수 있다. 그 다음 10개 플레이트를 올려놓는다. 이 플레이트가 그 다음 순서에 해당하는 것이며 정확한 위치에 장착되도록 세심한 주의를 기울인다. 뚜껑을 벗기고 로봇 문을 닫고 플레이트 교체를 위한 프롬프트 상자 (prompt box) 내의 OK를 클릭한다. 그리딩은 다시 시작된다. 각 10개 플레이트로 구성된 묶음의 마지막 묶음에 그리딩이 끝나는 시점에는 단지 8개 플레이트로만 구성된 최종 묶음에 도달하기 전에 원본 플레이트 를 교체해야 한다. 이 묶음은 로봇 위에 1번에서 8번까지의 위치에만 원본 플레이트를 장착해야 한다. 모든 48 원본 플레이트가 그리딩되었을 때, 처음 3개 필터를 준비한다. Bioassay 플레이트 의 뚜껑을 다시 덮어 플레이트를 로봇에서 꺼낸다. 플레이트를 밀착필름으로 싸서 4 에 보관한다. 다음 차례의 Bioassay 플레이트 3개를 그리더에 올려놓고, 그리드 작업을 다시 시작한다. 총 15개 플레이트를 처리하는 데 5번의 완전한 그리드 작업이 이루어진다. 41

46 문서번호 GLI/1998/3/7 그리딩 후에 원본 플레이트를 냉동고 트레이에 다시 놓고, 냉동고의 빈 선반 위에 놓는다. 다음날 이들 얼린 트레이를 그리딩 냉동고의 정확한 위치로 옮겨 놓는다. 일과가 끝날 무렵 (가능한 한 늦게) 플레이트를 37 배양기에 둔다. 플레이트 3개를 한 묶음으로 배양하고, 밀착필름으로 감아 뒤집어 두어야만 한다. 배양은 12시간이어야 하는데, 밤새 (overnight) 배양은 12시간 보다 더 길므로, 다음 날 아침에 제일 먼저 배양기에서 꺼낸다. 프로그램과 윈도우를 종료함으로써 PBA를 끈다. 그리더, 컴퓨터, 공기 공급을 조절하는 화면과 벽 스위치에 히터를 끈다. 6. Tool head 의 초음파 처리 로봇에서 384 핀 툴 을 조심스럽게 분리하여 툴용 플라스틱 물통에 넣은 채로 초음파처리용 수조로 옮긴다. 수조를 증류수로 눈금선까지 채운 후 한 방울 또는 소량의 계면활성제 (Decon 90)를 가한다. 조심스럽게 그 도구를 집게에 물리고 안전하게 죄어졌는지 확인한 후 핀의 축이 잠길 때까지 (그러나 핀의 머리부분은 제외) 도구를 초음파 수조 안으로 내려놓는다. 핀은 바닥에 닿지 않아야 한다. 그리고 나서 오른쪽 편 (RHS) 전면 바닥에 있는 수조의 스위치를 켠다. 시계 아이콘을 우선 누르고, 10 을 입력한 후 최종적으로 수치의 좌측에 있는 아이콘 (원 안에 수직선이 그려진 것)을 눌러 작동시간을 10분으로 설정 한다. 초음파 처리 중일 경우 오렌지색 표시등이 켜진다. 초음파처리기의 수조 속에 손을 넣지 말 것! 10분이 지난 후 수조의 스위치를 끄고, 툴을 들어올린 후 물을 비운다. 물을 퍼 올리거나, 사이펀을 이용해서 물을 빼고, 종이타월로 물기를 닦아낸다. 그리고 나서 수조에 증류수만 채우고 툴을 넣어 또 다시 10분 동안 초음파처리를 한다. 마무리 단계에서 수조의 스위치를 끄고, 툴 을 들어낸다. 과량의 물을 없애기 위해서 툴 을 매우 조심스럽게 흔든다. 그리고 싱크대 위에서 세척병에 든 무수 알코올로 툴 을 흠뻑 적신다. 도구를 다시 흔들고 로봇에 장착하여 하룻밤 동안 말린다. 7. cfugu 5 필터 그리딩 큰 필터 위에 그리딩이 종료되면 cfugu 라이브러리 플레이트 3개가 남는다. 이들 플레이트는 colony picking 플레이트 위의 작은 Hybond N+ 필터에 그리딩된다. 42

47 문서번호 GLI/1998/3/7 그리딩하는 데 소요되는 시간이 짧기 때문에 cfugu 5는 cfugu 4와 같은 날 한다. 16개의 colony picking 플레이트 는 Bioassay 플레이트 와 동일한 배지로 만들어지나 플레이트 당 50 ml로 구성된다. 작은 필터를 사용하고, 큰 필터와 같은 방식으로 왼쪽 편 위에 표기한다. PBA에서 solid bioassay base 플레이트 를 빼내고, gridding support base 플레이트 로 교체한다. PBA 프로그램은 PBA Flexys Gridder 를, 파일은 fugusmal 을 선택한다. 로봇배열은 다음과 같다. Source 플레이트 필터가 놓인 한천 플레이트 Heater EtOH 3개의 원본 플레이트를 랙으로 옮긴다. 플레이트를 랙에 완전히 고정하는 것이 중요하다. 랙이 로봇의 왼쪽 편에 놓일 때, 모든 플레이트가 정확히 놓여졌는지 눈높이로 살펴 확인한다. 부정확하게 놓여진 플레이트는 정확한 위치에 놓인 것보다 더 높다. Hybond membrane 이 있는 첫 번째 8개의 destination 플레이트를 두 번째 랙에 장착한다. 이들 colony picking 플레이트 는 96-well 플레이트보다 더 크고 랙 안으로 훨씬 더 단단하게 고정된다. 그러나 그것들은 완전히 랙에 위치하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 그리딩하는 동안 움직일 수 있어, 필터의 그리딩 양상이 아주 제멋대로 될 수도 있다. 트레이에서 뚜껑을 조심스럽게 벗겨 로봇의 왼쪽 편 위의 검은 플라스틱 받침대에 놓는다. 멀리 떨어져 있는 플레이트부터 시작하여 뚜껑을 벗김 으로써 실험자의 팔이 열린 플레이트 위를 지나가는 일이 없게 한다 (그리딩 후에는 역순으로 뚜껑을 닫는다). 한천용 플레이트에서 뚜껑을 벗긴다. 문을 닫는다. 프로그램을 시작한다. 처음 8개 플레이트가 그리딩 된 후에 뚜껑을 다시 덮고 나서 이들 플레이트를 치우고, 그 다음 8개 한천배지를 옮겨 놓고 뚜껑을 벗기고, 로봇 문을 닫고 그리딩 프로그램을 다시 시작한다. 16개 한천평판배지를 뒤집어서 큰 필터처럼 정확히 밀착필름으로 감은 채로 배양한다. 43

48 문서번호 GLI/1998/3/7 각 그리딩 날짜를 PBA 그리더 면에 고정된 기록 시트에 기록한다. 각 그리딩 날짜, 필터 세트, 그리드된 필터 번호와 HYBOND membrane 배치 번호를 필터 레코드 북에 기록한다. 8. 이중 스팟 그리드 디자인 (double spotting gridding design) 실험자가 생산한 모든 큰 필터는 이중으로 스팟된다. 이는 모든 플레이트가 필터 위에서 두 번씩 스팟 됨을 의미한다. 그래서 사용자는 항상 양성 혼성화 신호를 나타내는 두 개의 스팟을 얻는다. 이것의 목적은 양성이면 확실한 양성으로 두 개의 스팟이 매우 선명하게 나타나도록 하는 데 있고, 그리드 배열은 각 이중 스팟이 다른 방향성을 나타내게 한다. 그래서 사용자가 양성 클론을 정확하게 동정하기 매우 수월하게 해 준다. 스팟형식은 다음과 같다 불시에 형식이 지워지는 소프트웨어 상의 결함이 초래될 수 있으므로, PBA NEWPAC 프로그램 에서 그리드 배열을 변경하는 것은 물론 체크하는 시도도 하지 않도록 한다. 9. QBOT 로봇을 이용한 그리딩 Genetix Qbot를 사용한 그리딩은 PBA 그리더와 똑같은 원리를 따른다. 주요한 차이점은 다음 날을 위해 플레이트를 붓고 필터를 준비할 수 있는 여유를 주면서 24개 필터를 하루에 그리딩할 수 있다는 것이다. 원본 플레이트를 녹인다. 플레이트가 녹는 동안 로봇 바닥 위에 70% 알코올을 분무하고 깨끗이 닦는다. Linear drive runner 를 깨끗이 한다. 에탄올 수조에 96% 에탄올을 강모 수준 바로 아래까지 채운다. 10. Loading the hotels 원본 플레이트가 서서히 녹으면 뚜껑 위를 닦는다. 만약 뚜껑이 젖어 있으면 lid lifter 의 작동이 어렵게 된다. 호텔을 다음과 같이 장착한다. 44

49 문서번호 GLI/1998/3/7 플레이트들은 well A1에 끼워 넣되, 열린 호텔의 정면을 향하고 표기가 보이도록 한다. 플레이트가 정확한 순서로 놓여졌는지 확인한다. Hotel 1 Hotel Qbot 바닥의 레이아웃 ** ** ** Alcohol Brush bath Heater ** ** ** ** ** ** 플레이트 ** ** ** Holder Sucker A1 A1 Hotel 2 Hotel 1 45

50 문서번호 GLI/1998/3/7 FRONT OF QBOT Computer Q 트레이는 필터가 올려진 상태로 위에 보인 것과 같이 놓는다. Q 트레이들은 Qbot의 바닥에 있는 볼트 (스터드)로 서로 밀착되어 고정된다. 그리딩을 시작하기 전에 뚜껑을 제거한다. 필터 표시인 ** 이 정확한 위치에 있는지 확인한다 (실험자가 Qbot의 왼쪽 편에 서서 Q 트레이를 놓을 때, 그것들을 실험자로부터 가장 멀리 떨어진 필터 위로 놓는다). Qbot를 깨끗이 하고 설정하는 데 15분 걸린다. 12. Qbot 시작 벽에 있는 압축기의 스위치를 켠다. 스위치를 켜면 압축기의 압력은 6과 8을 나타내고, 로봇의 압력 게이지에는 80을 나타내야만 한다. Qbot의 왼쪽 편 정면 위에 적색과 황색 버튼을 가볍게 친다. 이로써 컴퓨터가 켜진다. (Qbot 안쪽의 이 버튼 위에 resting stage에서 0 0 2를 나타내야만 하는 디지털 화면이 있다.) C:\> 프롬프트에서 win 을 입력한다. Program Manager에서 Genetix Qbot 용 윈도우를 연다 그리딩을 위해 Genetix Gridder를 선택하고 OK를 클릭한다. "드라이브 초기화 주 전원이 켜져 있는지 확인하라" 는 메시지가 나타난다. 녹색 버튼 1번 스위치를 켠다 - 로봇 위에 있는 지시용 판넬에 불이 켜진다. 0번: 전원을 켠다. 로봇 작동 OK를 클릭한다. 모든 문이 닫혀있는지 확인하라 는 도움말이 나타난다. (문이 열려있으면 로봇이 작동하지 않는다.) 그리고 나서 "Genetix sign on" 화면이 다음과 같이 나타난다. - 그리딩 번호 (Gridding number) - 실험자 라이브러리 (Operator Library) - 필터 번호 (Filter number) - 복사본 번호 (Replica number) - Head 형태 (Head type) 46

51 문서번호 GLI/1998/3/7 진행하기 위해서 그리딩 상자를 작성하고 클릭한다. 화면상에 "Gridding Routine Set-up"이 나타난다. - 스팟하는 head 형태 입력 (용수철 형태, sprung) - 스팟 형식: 4x4로 변경 - 필터 총수: 12 - 스팟 형식 당 필드 수: 6 - 스팟 당 stamp수: 1 - 가능한 복제형태: X Start-up 설정 - 스팟팅 할 첫 번째 플레이트 1 - 스팟팅 할 첫 번째 필드 1 - 스팟팅 할 첫 번째 패턴 1 - 스팟팅 할 첫 번째 필터 1 멸균설정 - 수조에서 반복 횟수 3 - 건조기에서 시간 8 - 건조 후 기다림 0 추가 사항: - 호텔 이용시 할 수 있는 플레이트 Stacker X 그리딩 속도: 빠름 필터에 그리딩 핀 맞추기 이것은 변경 없음 (no change) 으로 해야만 한다. (이것은 이미 config. Option에 설정되어 있기 때문이다.) Q 트레이당 150 ml 한천배지의 경우 Z축은 1075에 설정되어야만 한다. 준비가 되면 "Run"을 클릭한다. "집게가 작동 중인지 확인하라"는 메시지가 나타나면, OK 를 클릭한다. Head 부분을 맞춘다. - Head 부분을 actuator unit (로봇팔) 상의 빈 케이스(holster)로 밀어 넣고 (나비 모양의) 수나사를 조여서 (과다하게 조이지는 말고) 고정한다. 작동이 시작될 것이다. - 그리고 약 2시간 35분 걸린다. 첫 작동 마무리 단계에서 Q 트레이에 뚜껑을 다시 올려 놓고 Q 트레이를 치운다. Q 트레이의 두 번째 배치를 장착하고 그것들의 뚜껑을 벗긴다. 두 번째 작동이 시작되기 전에 수조 안의 96% 알코올을 교체한다. 13. 그리딩 작동의 마지막 부분 Close 를 클릭하고 Genetix Sign on 화면을 중지한다. 로봇 10의 빨강 버튼을 눌러서 스위치를 끈다. 47

52 문서번호 GLI/1998/3/7 큰 빨강과 노랑 스위치를 끈다. 벽에 있는 압축기 스위치를 끈다. 소독한 수조를 꺼내고 알코올을 비운 다음 수조와 솔을 1/100 표백제 희석액에 적어도 한 시간 정도 담근다. 물로 헹구고 70% 알코올에 15분 동안 담근다. 물기를 빼고 건조 시킨다. 필터: PBA 그리드 된 필터와 동일하게 배양하고 처리한다. 14. 필터 처리공정 배양기에서 15개 또는 24개의 한천 배지를 꺼낸다. 배치 단위로 필터를 처리하되 PBA는 8개와 7개로 된 배치로 처리하고 Qbot 그리딩은 8개로 된 3개 묶음으로 처리한다. 만일 날씨가 따뜻하면 처음의 배치를 처리하는 동안에 처리하지 않은 필터를 4 에 두는 것이 좋다. (그렇지 않으면 배지가 필터에서 계속 성장하게 된다). 15개의 필터를 처리하기 위해서는 0.5 M NaOH/1.5 M NaCl 용액 1 L 를 만들고, 25개의 필터를 처리하기 위해서는 2 L를 만든다. 처리과정에서 필터를 집락 주변의 맨 위에 놓는다. 전 단계 동안 장갑을 착용해야 하며, 항상 가는 집게를 사용하여 필터의 가장자리를 집는다. 어떠한 집락도 필터에서 씻겨 나오는 일이 없도록 세심한 주의를 기울인다. (이를 위해서) 그리드된 집락이 없는 가장자리 부분을 사용 하여 모서리 부분을 잡는다. 소매커버(토시)와 함께 실험복을 착용한다 (또는 소매를 걷어 올린다) % SDS 4분 크기에 맞게 자른 3 mm 페이퍼를 큰 방풍유리 트레이 에 놓는다. SDS를 첨가하여 3 mm 페이퍼를 완전히 적신다. 과잉의 SDS는 기울여서 버린다. 과량을 기울 여서 버린 후에 3 mm 페이퍼가 평평한지 확인하기 위하여 5 ml 플라스틱 피펫으로 3 mm 페이퍼를 굴린다. 3 mm 페이퍼를 골고루 적시는 것이 중요하다 - 그러나 너무 젖거나 또는 너무 마르지 않아야 하는 것도 중요하다. 연습으로만 정확한 물기 정도를 판단할 수 있다. 과도한 젖음 = 집락이 혼합되어 dulux 형태를 생성한다. 과도한 건조 = 집락이 막에 결합되지 않는다. 이 단계에서 집락 바르기를 중지하고 E. coli를 용해 시킨다. 4개의 방풍유리 트레이가 필요하다. 집게를 사용하여 대각선으로 모서리를 잡고 membrane을 배지에서 들어올려 기포가 생기지 않도록 주의하면서 젖은 3 mm 페이퍼에 올려 놓는다. 이 과정이 끝났을 때, SDS는 계면활성제로서 실제로 더 많은 기포를 생성할 수 있기 때문에 정말 상태가 좋아 보이지 않을 때 다시 놓기 위해 48

53 문서번호 GLI/1998/3/7 membrane을 꺼낸다. 가능한 한 가장 짧은 시간 안에 8개의 membrane들을 다 올려 놓을 수 있도록 효과적으로 작업한다. 마지막 membrane을 처리할 때 시간 측정을 시작한다. 2. 블로팅 M NaOH /1.5 M NaCl 10분 4. 20분 동안 공 기 중에 건조 그 다음 방풍유리 트레이에 옮기기 위하여 membrane을 떼어낼 때, 깨끗하게 잘 건조된 3 mm 페이퍼에 membrane을 잠깐 올려 놓아 과량의 SDS를 빨아 들임 으로써 다음 단계에 기포 발생을 줄인다. 1 단계에서 기술한 바와 동일하게 0.5 M NaOH/1.5M NaCl용액에 적신 3 mm 페이퍼를 4개의 방풍유리 트레이 에 놓는다. SDS에서 각 membrane을 꺼내서 블로팅 한 후 NaOH/HCl용액 트레이로 옮긴다. 이 단계에서 E. coli 세포가 용해되고 DNA가 (성공적인 교잡을 위하여 필요한) 단일 가닥 형태로 변형된다. 마지막 membrane이 처리될 때 시간 측정을 시작한다. 3 mm 페이퍼 각 membrane을 꺼내어 깨끗이 건조된 3 mm 페이퍼에 놓는다. 이 단계는 DNA가 membrane에 고정되는 것을 도와준다. (필요하다면 이 단계에서 membrane은 10분보다 더 오랫동안 방치될 수 있다) 실습을 거치면 첫 번째 배치의 필터가 4번째 단계 (첫 번째 공기건조)에 도달할 때, 다음 배치의 필터를 처리할 수 있다. 이렇게 하면 오전 11시 30분까지 15개 필터를 처리할 수 있게 된다. 두 개의 큰 샌드위치 상자를 준비하고 아래와 같이 표기한다. 상자 M Tris ph 7.4/1.5 M NaCl 50 mm Tris ph 7.4/ 0.15 M NaCl 2xSSC 상자 M Tris ph 7.4/1.5 M NaCl 2X SSC/0.1% SDS 50 mm Tris ph 7.4 지금부터 실험자는 필터를 박스1 박스2 박스1 등으로 옮긴다. 일반적으로 8개의 배치들 안에서 모든 이동이 이루어 진다. 각 완충액은 매번 1 L가 필요하다. Membrane 당 최소 100 ml가 필요하다 M Tris ph 7.4/ 1.5 M NaCl 5분 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 3 mm 페이퍼에서 각 membrane을 들어 올려 상자 1에 놓는다. 또한 이 과정으로 DNA가 membrane에 49

54 문서번호 GLI/1998/3/7 고정되고 NaOH가 중화 된다 M Tris ph 7.4/1.5 M NaCl 5분 mm Tris ph 7.4/0.15 M NaCl 5분 8. 2xSSC/0.1% SDS 5 분 흔들어주기 9. 2xSSC 5 분 흔들 어주기 mm Tris ph 7.4 5분 흔들 어주기 11. 하룻밤 동안 공기 건조 12. 교차 결합 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 각 membrane을 상자 1에서 꺼내 상자 2에 놓는다. 이것은 1/10 희석된 중화용액이다. 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 상자 2에서 membrane을 꺼내 상자 1에 놓는다. 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 각 membrane을 상자 1에서 꺼내 상자 2에 놓는다. 필터를 부드럽게 흔들기 위하여 샌드위치 상자를 rocking platform 에 놓는다. SCC 세척으로 필터 상의 비특이적 배경이 감소된다. 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 각 membrane을 상자 2에서 꺼내 상자 1에 놓는다. 필터를 천천히 흔들어 주기 위해서 샌드위치 상자를 rocking platform 에 놓는다. 각 membrane이 완전히 잠긴 것을 확인하면서, 각 membrane을 상자 1에서 꺼내 상자 2에 놓는다. 필터를 천천히 흔들어 주기 위해서 샌드위치 상자를 rocking platform 에 놓는다. 각 필터를 꺼내서 깨끗이 건조된 3 mm 종이에 놓는다. 끝으로 먼지가 필터에 묻지 않도록 3 mm 종이 한 장을 덮어준다 (그러나 이를 행하기 전에 필터가 건조한지 확인할 것). 각 필터를 각각 교차 결합기에 놓는다. 최적 을 선택하고 시작을 누른다. 교차 결합은 DNA가 membrane에 결합하는 마지막 단계이다. 필터를 깨끗한 지퍼락 플라스틱 봉지에 보관한다. 필터 번호와 날짜, 필터의 QA 코드를 적어 둔다. 이 코드는 필터 기록부 (record book)에 등록되어야만 한다. 15. 용액 제조 10% SDS 100 g SDS /1 L 3차 증류수 [SDS 무게를 측정할 때 세심한 주의가 필요하다. 마스크를 착용하고 비이커 위를 밀착 필름으로 덮어서 교반하여 녹인다] SDS = Sodium Dodecyl Sulphate 또는 Sodium Lauryl Sulphate 50

55 문서번호 GLI/1998/3/7 0.5 M NaOH/1.5 M NaCl NaOH NaCl 20 g 87.7 g /1 L 3차 증류수 실험하는 날에 새로 만들어서 준비한다. 0.5 M Tris ph 7.4/1.5 M NaCl NaCl Tris g 303 g 3차 증류수를 3L 첨가 하고 HCl로 ph를 7.4로 맞춘다. 최종 용량을 3차 증류수로 5 L가 되게 만든다. 50 mm Tris ph 7.4/ 0.15 M NaCl 이것은 위의 완충용액을 10배 희석한 것이다. 20xSSC Tri Sodium Citrate 88.2 g NaCl g 3차 증류수로 1 L가 되게 한다. 교반하면서 녹이고 멸균한다. 2xSSC/0.1% SDS 100 ml of 20xSSC 10 ml of 10% SDS 3차 증류수로 1 L가 되게 한다. 2xSSC 1 L of 20xSSC 3차 증류수로 1 L가 되게 한다. 1 M Tris/HCl ph 7.4 Tris g 3차 증류수 700 ml을 가한다. 진한 염산으로 ph 7.4를 맞춘다. 최종 용량을 1 L로 한다. 멸균한다. 50 mm Tris/HCl ph 7.4 이것은 위의 완충용액을 1/20으로 희석한 것이다 [= 1M stock 250 ml ml 3차 증류수 최종 용량 5 L를 만든다] 51

56 문서번호 GLI/1998/3/7 16. 필터 생산 기록 유지와 세트의 완성 만들어진 모든 필터에 대한 기록을 보관한다 따라서, 만약 사용자가 특정 필터 세트를 사용하다가 문제가 발생하면, 기록을 살펴보고 무엇이 잘못되었는지에 대한 어떤 실마리가 있다면 확인할 수 있다. 필터를 취급할 때에는 장갑을 착용한다. 한 배치의 필터가 교차결합되면 봉지 외면에 필터배치번호와 필터번호 (즉, Fugu 3)를 표시하여 지퍼락 백에 보관한다. 검은 기록부의 필터 제작 이라는 첫 부분에 세부사항을 기록한다. 필터 세트의 구성 이는 두 부분으로 구성된다. 1 좋지 않은 필터와 좋은 필터를 분류하기 위해서 교차결합시킨 후에 새롭게 생산된 필터를 검사한다. 2 좋은 필터를 모아 담아 완전한 세트를 구성한다. 좋은 필터와 좋지 않은 필터의 분류 좋은 (OK) 필터인지 좋지 않은 (NSG) 필터인지 확정하기 위하여 봉지에서 필터를 꺼내어 세심히 조사한다. 좋은필터 좋지않은필터 좋은 필터는 각각의 위치에서 16개의 개별적인 스팟이 나타나야 한다. 각 16개의 스팟 위치는 사각형으로 보인다. 전반적으로 필터는 매우 평평하고 고르게 보인다. 대부분의 필터는 빛을 낸다. 그러나 흐릿한 것일지라도 스팟이 명확히 보이면 사용가능 하다. 실험 당일 일찍 필터를 빛에 비추어 측면에서 살피는 것이 가장 좋은 필터 검사법이다. 16개의 스팟이 깔끔한 사각형 안에 명확히 보이지 않지만, 집락이 유착되어 사각형 의 가장자리는 고르지 않다 (과도한 NaOH 처리 단계로 인함). 필터의 한 개 이상의 가장자리에 그리드가 없다 아주 작은 부분이 아닌, 필터를 가로질러 스친 자국, 줄무늬, 긁힌 자국이 있는 것(통상 소매가 필터를 훑어서 발생) 스팟 몇 개가 완전히 없어져 (단지 2-3개 사각형만 소실된 경우처럼 그 손상부위가 작으면 수용할 수 있다.) 그리딩 부분이 기운 것 같이 고르지 않거나, 스팟이 소실되어 불규칙한 부위가 있는 것 (처리 과정 동안 생긴 기포 때문이거나, bioassay plate 가 PBA 그리더에 직각으로 놓이지 않았기 때문으로 - 52

57 문서번호 GLI/1998/3/7 이러한 문제는 필터의 가장자리에서 나타난다.) 필터를 가로질러 흐릿한 부위가 있는 것 (처리 전이나 처리 중에 액체방울이 떨어져 있었기 때문) 필터를 좋은 것과 좋지 않은 것으로 구분한다. 그리고 이 수를 기록부에 기록한다. 일반적으로 좋은 필터와 좋지 않은 필터를 서로 뒷면을 댄 상태에서 2장의 3 mm 페이퍼 사이에 끼워 지퍼락 봉지에 다시 보관한다. 위쪽의 3 mm 페이퍼에 좋음 (good) 이란 표기와 좋은 필터의 숫자를 명확히 표기하고, 봉지의 밑면에 위치하는 3 mm 페이퍼에 좋지 않음 (NSG) 이란 표기와 좋지 않은 필터의 숫자를 기록한다. 이처럼 모든 필터를 기록한다. 세트 구성하기 좋은 필터만 사용한다. PAC 라이브러리 = 필터 1~7, Fugu 라이브러리 = 필터 1~5 (5 는 작음) 제작 할 수 있는 완전한 세트의 개수는 사용 가능한 좋은 필터 중 가장 적은 개수의 필터로 결정된다. 만들어지는 세트의 개수에 따라서 크기에 맞게 자른 3 mm 페이퍼를 펼쳐둔다. 3 mm 페이퍼에 필터 세트의 번호를 표시한다. 이 필터 세트의 번호는 기록부에 기재된 번호 다름의 연속적인 번호를 사용하도록 결정된다. PAC 세트는 문자 P로 시작하고 Fugu 세트는 문자 F로 시작한다. 필터를 쌓아 올릴 각 꾸러미 (pile)에 첫 번째 필터를 놓는다 (예, PAC1) 그리고 기록부의 필터세트 라는 해당 부분에 사용된 각 필터의 배치번호 (batch number)를 기록한다. 각 꾸러미에 그 다음의 필터를 놓는다 (예, PAC2) 그리고 다시 각 필터의 배치번호를 기록한다. 완전한 세트가 만들어질 때까지 계속 진행한다. 각 세트를 지퍼락 봉지에 넣고, 필터 세트 번호를 표시한다. 세트를 저장하기 전에 그룹의 또 다른 실험자는 각 세트 별로 필터의 개수가 정확한 지, 중복된 필터가 없는 완전한 세트인지 반드시 검사해야 한다. 개별 필터가 들어있는 몇 개의 봉지에는 여전히 좋은 필터가 남아있다. 봉지 표기에 좋은 필터의 개수를 정정한다. 세트에는 없으나, 남아 있는 좋은 필터의 개수를 별도의 기록지에 기록하여 보관하면, 다음에 어떤 필터를 그리드할 것인지 결정하는 데 수월하다. 필터는 지퍼락 봉지에 넣어 4 에 보관한다. 발송 필터를 배포할 때에는 필터생산장부 (Filter Production Bool) 의 발송 기록 란에 기록한다. 즉, 발송 날짜, 청구서 번호, 사용자 이름, 필터 세트 번호를 기입한다. 53

58 문서번호 GLI/1998/3/9 완충액, 용액과 시약 1. 앰피실린 (Ampicillin) 50 mg/ml 저장용액 5 g Ampicillin di-sodium salt (Sigma A 9518) [4C에 분말 보관] 100 ml 3차 증류수로 용해 교반하여 녹인다. 두 개의 큰 Buchner 깔대기를 부착한 진공펌프를 사용하여 0.2 µm 필터 (100 ml 용)로 여과한다. 무균상태를 유지한다. 한 개는 무균 50 ml Falcon 튜브 (튜브 표기: Ampicillin, 50 mg/ml와 날짜)에 50 ml 분주하고 나머지는 마이크로 피펫 (Gilson P1000)으로 무균의 1.5 ml Sarstedt 튜브 100개에 500 µl씩 분주한다 모든 튜브의 뚜껑에 A로 표시한다. -20C에서 동결하여 보관한다. 1/1000로 희석하여 사용한다. 즉 배지 500 ml 당 분취액 500 µl를 넣어 최종농도가 50 µg/ml가 되게 한다. 앰피실린은 YAC 라이브러리 배양용으로 사용되는 모든 액체배지와 한천배지에 첨가된다. 2. 테트라싸이클린 (Tetracycline) 5 mg/ml 저장용액 500 mg Chlortetracycline (Sigma C4881) [분말은 -20C에 보관]을 50 ml 3차 증류수와 50 ml 99% 알코올 (즉 50% 알코올)에 녹인다. 교반하여 녹인다. 여과하지 않는다 (50% 알코올이 용액을 소독한다.) ml combitip을 5 번으로 설정하여 1.25 ml씩 50개의 무균 1.5 ml Sarstedt 튜브에 분주한다. 모든 튜브의 뚜껑에 T로 표시한다. 잔여분은 무균의 50 ml Falcon 튜브에 보관한다. (튜브 표지: 테트라싸이클린, 5 mg/ml와 날짜) 1/400 배 희석하여 사용한다. 즉 배지 500 ml 당 1.25 ml를 넣어 최종농도가 12.5 µg/ml 가 되게 한다. 테트라사이클린은 YAC 라이브러리 배양용으로 사용하는 모든 액체배지와 한천배지에 첨가된다. 54

59 문서번호 GLI/1998/3/9 3. 가나마이신 (Kanamycin) 25 mg/ml 저장용액 2.5 g Kanamycin monosulfate (Sigma K1377)를 100 ml 3차 증류수에 녹인다 (분말은 -20 에 보관). 교반하여 녹인다. 두 개의 큰 Buchner 깔대기를 부착한 진공펌프를 사용하여 0.2 µm 필터 (100 ml 용)로 여과한다. 무균상태를 유지한다. 7 ml Bijou 튜브 (Kanamycin, 25 mg/ml와 날짜 표기) 15개에 5 ml씩 분주하고, 마이크로 피펫 (Gilson P1000)으로 무균의 1.5 ml Sarstedt 튜브 50개에 500 µl씩 분주한다. 모든 튜브의 뚜껑에 K로 표시한다. -20 에서 동결 보관한다. PAC 라이브러리용 cfugu 라이브러리용 1/1000 배 희석하여 사용한다. 즉, 배지 500 ml당 500 µl를 가하여 최종농도 25 µlg/ml로 제조한다. 1/833 배 희석하여 사용한다. 즉, 배지 500 ml당 600 µl를 가하여 최종농도 30 µg/ml로 제조한다. 가나마이신은 E. coli를 사용하여 제조한 PAC와 cfugu 라이브러리 배양용으로 사용하는 모든 액체배지와 한천배지에 첨가된다 M EDTA, ph 8.0 EDTA (Ethylenediaminetetra-acetic acid disodium salt) g을 3차 증류수 900 ml에 녹인다. 자석막대 (magnetic stirring bar)를 사용하여 교반기로 혼합하고, 완충액에 ph 전극을 넣은 채 ph 8.0으로 안정될 때까지 고형의 수산화 나트륨 펠릿을 천천히 가한다. (NaOH를 가하면 ph가 내려간다. 이로 인해 EDTA가 더 녹아 ph는 다시 올라간다. 따라서, 용액이 맑아지고 ph가 안정될 때까지 계속 해야만 한다.) 1 L 짜리 실린더를 이용하여 3차 증류수로 부피를 1 L로 맞춘다. 미리 표시해 둔 Duran병에 붓고, 사용 전에 멸균한다. 5. 1m Tris/HCl, ph 7.4 또는 8.0 Tris (Tris(Hydroxymethyl)Aminomethane) 또는 (TRIZMA Base) g을 3차 증류수 900 ml에 녹인다. 교반기 위에서 자석 막대기로 혼합하고 완충액 속에 ph 전극을 넣고 ph 55

60 문서번호 GLI/1998/3/9 8.0으로 안정될 때까지 파스퇴르 피펫으로 진한 염산을 떨어뜨려 ph가 7.4 또는 8로 안정될 때까지 계속해서 ph를 기록하면서 서서히 가한다. *주의: Tris는 특별한 ph전극을 필요로 한다. 진한 염산을 첨가할 때는 보안경을 착용한다.). ph가 맞으면 3차 증류수로 부피를 1 L로 맞춘다. 미리 표시해 둔 Duran병에 붓고, 사용 전에 멸균한다 x TE, ph 8 [TE = Tris/EDTA] 1X TE 10 mm Tris 1 mm EDTA ph 8 1 L 짜리 실린더에 3차 증류수 약 800 ml 를 붓는다. 피펫으로 1M Tris/HCl (ph 8.0) 10 ml와 0.5 M EDTA 2 ml (ph8.0)을 첨가한다. 3차 증류수로 부피가 1 L 되게 맞추고 혼합한다. 미리 표시해 둔 Duran병에 붓고, 사용 전에 멸균한다. 7. 5mM EDTA, ph 8.0 멸균된 3차 증류수 1 L에 0.5 M EDTA (ph 8)를 10 ml 가한다. 8. 스페로플라스팅 용액 1 M Sorbitol 20 mm EDTA 10 mm Tris/HCl ph L의 경우, 3차 증류수 4 L에 Sorbitol 911 g을 넣고 녹인다. (물을 교반하면서 sorbitol을 서서히 가하는 것이 가장 용이하다.) 0.5 M EDTA (ph 8) 200 ml를 가한다. 1 M Tris/HCl (Ph 7.4) 50 ml를 가한다. 비이커에 5 L 표시까지 채우고 완전히 혼합되도록 교반한다. 500 ml Duran 병 10개에 조심스럽게 붓는다. 병에 표기를 하고, 날짜를 적고 사용 전에 멸균한다. 9. YLS 1% Lithium dodecyl sulphate (Sigma L4632) 100 mm EDTA 10 mm Tris/HCl 56

61 문서번호 GLI/1998/3/9 [2 L의 경우] 장갑과 안면 보호구를 착용한다. LDS (Lithium dodecyl sulphate = Docecyl lithium sulfate = Lauryl sulfate, Lithium salt) 20 g을 측량용 용기에 조심스럽게 측량한다. 분말이 날리지 않도록 2 L 비이커에 조심스럽게 넣는다. 밀착필름으로 비이커를 덮어서 실험실로 옮겨 놓는다. 3차 증류수 1 L를 가하고, 밀착 필름으로 비이커를 덮어서 교반하여 녹인다. LDS가 다 녹았을 때 안면 보호대를 벗는 것이 안전하다. 0.5 M EDTA (ph 8) 400 ml를 가한다. 1 M Tris/HCl (ph 8) 20 ml를 가한다. 2 L 짜리 실린더에 붓고, 3차 증류수를 부어 2 L가 되도록 조정한다. 혼합하기 위하여 실린더 위를 새 밀착 필름으로 덮는다. 두 개의 큰 Buchner 깔대기를 부착한 진공펌프를 사용하여 0.2 µm 필터 (500 ml 용)로 여과한다. 제조한 각 2 L 용액당 4개의 필터가 필요하다. 실온에 보관한다. 70% 알코올 [1 L경우] 99% 알코올: 알코올 700 ml + 3차 증류수 300 ml 36% 알코올: 알코올 730 ml + 3차 증류수 270 ml 57

62 문서번호 GLI/1998/3/11 96 well YAC 라이브러리: 복제 1. 실험 재료 96-well 플레이트: Falcon # 3072 (flat-bottomed) 액체배지(broth) - CEPH MegaYAC 라이브러리용은 YPD, ICI와 ICRF 라이브러리용은 SD 앰피실린 (제조방법 참조 GLI/1998/3/7) 테트라싸이클린 (제조방법 참조 GLI/1998/3/7) 멸균된 500mL Duran 병에 들어있는 200 ml 글리세롤. Well-주입기 (Labsystems #831) well-주입을 위한 멸균 튜브 카세트 초음파 파쇄기 Decon (계면활성제) 100% 알코올이 담겨있는 세척병 70% 알코올 Hybaid사의 그리더 소독을 위한 집락 선별 플레이트 수작업 복제 시 필요 배지 : SD 또는 YPD 한천 + amp + tet 배양접시 (Falcon #1058) Hybond N 필터 (RPN119N) 'Hedgehog' (96 prong replicating tool) 2. 플레이트 표시 다음 코드에 따라서 색깔 네임펜으로 배양접시에 표시한다: - 그리딩용은 파란색 - 작업용은 검은색 - 백업용은 빨간색 - 보존용은 녹색 (단 매우 드물게 필요한 것) 플레이트들은 뚜껑과 플레이트 밑바닥의 오른쪽에 모두 표시할 것 다음과 같은 양식으로 뚜껑에 표시 할 것 코드/날짜/플레이트 번호 각 라이브러리를 위해 쓰이는 코드는 - ICI - RA - ICRF - ICRF - CEPH - M 3. 플레이트 채우기 58

63 문서번호 GLI/1998/3/11 금요일: 표시된 플레이트 90개 (45 플레이트의 복사본 2개씩)를 채우기 위해 Yac 후드 안에서 well-filler를 사용한다. 각 well에 YPD + amp + tet 을 120 µl씩 채운다. 플레이트 well은 랩으로 싸거나 플라스틱 백에 넣어 주말 동안 4C에 보관 한다. 튜빙 (tubing)은 멸균한다. 4. 둘째 주 월요일: 45 플레이트 각각의 복사본 2개를 만들기 위해 그리더를 사용한다. 1 툴에 96 fat 핀을 장착한다. 툴 머리 부분 (=실험자의 반대방향에 잠김 손잡이가 있는 4개의 구멍 (4 hole)으로 이루어진 각 세트의 왼편 최상단 부분의 정확한 위치에 핀이 놓였는지 확인하고, 3차 증류수에 약한 세정제를 넣고 초음파 처리한다. 100% 알코올에 넣어 흔들고 털어낸 후, 건조 캐비닛에서 말린다. 실험자는 툴을 장착하기 전에 먼저 툴을 건조시켜야 한다. 뜨거우니 주의하라! 2 CEPH Mega-Yac 원본 플레이트를 냉동고에서 꺼낸다. 백업용 플레이트를 사용하며, YAC 후드로 옮긴 후 플레이트 봉합제를 제거한다. 3 플레이트가 녹는 동안 툴을 그리더에 장착하고, 소위 rep96x2.rep라 불리는 pre-set 프로그램을 선택한다. 4 빈 96-well 플레이트를 장착하고 70% 알코올로 알코올 수조를 채운다. 원본 플레이트 대상 플레이트 1 1-G 3-G 2 1-W 3-W 3 2-G 4-G 4 2-W 4-W Heater EtOH 실험자가 원하는 대로 정확하게 되고 있는지 검사하기 위하여 프로그램을 시작한다. 5 모든 것이 제대로 작동하여 만족스러우면, 첫 번째 4개의 원본 플레이트와 복사할 플레이트를 제 위치에 장착한다. 내려놓았던 뚜껑을 가급적 신속히 닫아 멸균상태가 유지되도록 노력한다. 6 복제를 시작한다. 플레이트 1 복사 1 에서 시작되는지 확인한다. 7 복제가 종료되면 바로 교체할 수 있도록 준비하여 다음 트레이를 장착한다. 59

64 문서번호 GLI/1998/3/11 8 모든 복사가 마무리되면 YAC 후드에서 플레이트를 새로운 봉합제로 봉한 후, 원본 플레이트를 백업용 냉동고에 다시 넣는다. 9 복제된 모든 플레이트를 트레이에 놓고, 멸균 증류수의 트레이와 함께 커다란 노란색 백을 덮어 30 에서 배양한다. 10 툴을 탈착하여 알코올 수조에 내려 놓는다. 수요일: 플레이트 교반기를 사용하여 배양 중인 모든 플레이트는 잘 섞어 준 다음, 30 배양기에 다시 넣어 둔다. 목요일: 다음 주를 위해 플레이트에 표시한다 그리딩용은 파란색, 작업용은 검은색을 사용한다. 어떤 플레이트에 어떤 색깔을 표시할 지에 대해서는 목록을 참조한다. 표기 613~810 포함(= 80 플레이트) 금요일 1 미리 표기해 둔 80개의 플레이트를 채우기 위하여 Yac 후드에서 wellfiller를 사용한다. 각 well에 YPD + amp + tet 을 120 µl씩 채운다. 플레이트 well은 랩으로 싸거나 플라스틱 백에 넣고 4C로 주말 동안 보관 한다. Yac 후드를 켜둔 채 후드 안의 well-filler를 둔다. 그러나 먼저 멸균 증류수로 튜빙을 헹군다. 2 월요일에 복제한 플레이트 88개를 꺼낸다. (가능하면 오후까지는 그대로 방치한다). YPD 배지를 첨가하여 500 ml로 맞추어서, 필요한 양의 40% 글리세롤 병을 제조한다. 그런 다음 각 병에 amp + tet 을 첨가한다. 500 ml 병 3개를 제조한다. 3 균이 잘 성장 했는지 플레이트를 확인한다. 각 플레이트를 잘 흔들어 주고 40% 글리세롤을 각 well에 120 µl씩 넣어준다. 글리세롤을 첨가하기 전에 즉시 흔들어 줌으로써 세포들이 가라앉지 않도록 한다. 4 플레이트를 해당 냉동고에 정확히 즉, 그리딩한 플레이트는 그리딩 복사본을 두는 냉동고에 넣어 냉동한다. 그런 다음 새 플레이트와 교체하기 위해 복제가 끝난 오래된 플레이트를 버린다 (멸균을 위한 파란색 백). 실험자가 새 플레이트로 교체함으로써 모든 영역에서 영역당 8개의 플레이트가 채워졌는지 확인한다. 5. 셋째 주 월요일: 금요일에 채웠던 80개 플레이트들의 복사본 하나를 만들기 위해 그리더를 사용한다. 60