工學碩士學位請求論文 산수유 (Cornus fructus) 추출물의 지방세포분화억제효과 2008 年 2 月仁荷大學校大學院生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 홍초롱

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지안 매
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1 저작자표시 - 비영리 - 동일조건변경허락 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 이차적저작물을작성할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 동일조건변경허락. 귀하가이저작물을개작, 변형또는가공했을경우에는, 이저작물과동일한이용허락조건하에서만배포할수있습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 工學碩士學位請求論文 산수유 (Cornus fructus) 추출물의 지방세포분화억제효과 2008 年 2 月仁荷大學校大學院生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 홍초롱

3 工學碩士學位請求論文 산수유 (Cornus fructus) 추출물의지방세포분화억제효과 Inhibitory Effect of Cori fructus ethanolic extracts on Adipogenesis in 3T3-L1 Preadipocytes 2008 年 2 月指導敎授許泰鍊이論文을工學碩士學位論文으로提出함仁荷大學校大學院生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 홍초롱

4 이論文을李潤美의碩士學位論文으로認定함 年 2 月主審副審委員 인 인 인

5 요 약 본연구는항비만효과를나타내는기능성식품및의약품소재개발을위한기초연구로서천연식물자원으로부터지방세포분화를억제하는물질을분리하기위하여문헌조사를통해대사성질환과관련있는 30여가지의한약재를선택한후지방분화억제효과를탐색하였으며, 가장높은억제효과를보인산수유를선정하여농도별중성지방생성정도및지방세포분화와관련된전사인자억제효과와세포증식억제효과에대해연구하였다. 문헌을통해선별된 30가지의한약재에서지방분화억제효과를탐색한결과산수유, 백출, 대황이 80% 이상의억제효과를가진것으로확인되었다. 그중가장높은저해효과를보인산수유의에탄올추출물을이용해전지방세포와지방세포에서의세포독성실험을한결과세포의수에영향을주지는않는다는것을확인하였다. 그후산수유의에탄올추출물의농도별억제효과를측정한결과 200 ppm 에서 89.35% 의높은효과를보였으며중성지방의함량을측정한결과 200 ppm 에서 38.74% 로분화되지않은실험군과비슷한정도의적은중성지방이생성된다는것을확인하였다. 전사인자수준에서의억제정도를확인하기위해 RT-PCR 을수행하여지방분화과정에서발현되는 C/EBP-α 와 PPAR-γ 의발현정도를확인

6 한결과산수유의에탄올추출물에의해 mrna 의발현이억제된다는것을확인하였다. 산수유의에탄올추출물은세포의수를감소시키데효과는없었지만지방세포의증식을억제하는효과가있다는것을확인하였다. 따라서산수유의에탄올추출물은항비만관련천연소재로서활용가능할것으로사료되었다.

7 ABSTRACT The present study was carried out to evaluate the inhibitory effect of traditional herbal medicine extracts on adipocyte differentiation (adipogenesis) in 3T3-L1 preadipocytes. To differentiate preadipocyte in adipocyte, confluent 3T3-L1 preadipocytes were treated with the hormone mixture (MDI) including isobutylme-thylxanthine (IBMX), dexamethasone, and insulin in the presence or absence of each extract (250 ppm). Baicalein (100 μm) was used as a positive control. The degrees of adipogenesis of 3T3-L1 cells were measured by Oil Red O staining extraction assays and TG contents assay, respectively. Among tested extracts, Corni fructus, Atractylodis macrocephalae, and Rheum undulatum significantly inhibited more than 80% the process of adipocyte differentiation in 3T3-L1 preadipocytes in a concentrationdependent manner, compared to the only MDI treated group. Furthermore, Corni fructus could inhibit adipocyte differentiation by suppress of the adipogenic transcription factor, C/EBPα (CAAT/enhancer binding protein) and PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor) by RT-PCR analysis. These results

8 suggested that Corni fructus inhibited adipogenesis and suppress the expression of adipogenic transcription factors. Therefore, the results of this study suggest that Corni fructus can prevent adipocyte differentiation and it can be used to good advantage in alternative phytochemical therapy of obesity.

9 목차 요약 I Abstract III 목차 V LIST OF SCHEMES AND TABLES Ⅷ LIST OF FIGURES IX ABBREVIATIONS XI 1. 서론 1 2. 재료및방법 시료 시약 기기 한약재의선별 시료추출물의조제 세포배양 7

10 MTT assay 지방세포분화억제효과탐색 지방세포의분화유도와시료 Oil Red O st aining 산수유의지방분화억제효과 산수유의 Cell viability에미치는영향측정 산수유의농도별상대적지방생성량측정 TG assay RT- PCR 산수유의지방세포증식억제효과 결과및고찰 선별된한약재 가지한약재추출물이지방분화에미치는효과 산수유의에탄올추출물의세포독성 Oil Red O assay TG assay 산수유추출물이 mrna 발현에미치는영향 산수유추출물이세포증식에미치는영향 15

11 4. 결론 참고문헌 26

12 LIST OF SCHEMES AND TABLES Scheme 1. Preparation of ethanol extracts from Medicinal plants 11 Table1. Sequence of PPARγ, C/EBPα, GAPDH primer 16 Table 2. Selected 30 traditional herbal plants 17

13 LIST OF FIGURES Fig. 1. Effect of herbal plant ethanolic extracts on lipid accumulation of differentiated 3T3-L1 cells 18 Fig. 2. Inhibition of the lipid accumulation of Corni fructus, A. macrocephalae and R. undulatum on adipogenesis 20 Fig. 3. Effect of Corni fructus extract on viability of preadipocyte and mature adipocyte 21 Fig. 4. Effect of Corni fructus ethanolic extracts with different concentrations on lipid accumulation of differentiated 3T3-L1 cells using Oil red O staining 22 Fig. 5. Effect of Corni fructus ethanolic extracts with different concentrations on triglyceride contents in differentiated 3T3-L1 cells 23 Fig. 6. Effect of Corni fructus on expression of transcription factor, C/EBP-α and PPAR-γ during adipogenesis 24 Fig. 7. Effect of Corni fructus on cell proliferation of adipocyte. 2 5

14 ABBREVIATIONS Kg L M N mg min ml nm mm μl mg/ml g/mol ml/min O.D. ppm Kilogram(s) Liter(s) Mole(s) Normal(s) Miligram(s) Minute(s) Mililiter(s) Nanometer Milimole Microliter Miligram/ Miligram Gram/ Mole Mililiter/ Minute Optical Density part per million

15 1. 서론 비만은칼로리섭취가신체활동과성장에필요한에너지보다초과되어중성지방의형태로지방조직에과잉축적된열량불균형으로일어나며이것을비만증이라한다. 최근비만은대중적인관심에도불구하고점차증가하고있으며특히청소년과소아에서두드러진증가세를보이고이다. 이러한비만은고혈압, 고지혈증, 관절염, 당뇨병등주요성인병을유발시키므로더욱심각한질병요소로대두되고있다. 지방세포 (adipocyte) 는비만과밀접한관계를가지고있는생리적요소로서지방세포내의중성지방양이증가하거나지방세포의수가늘어나비만을유발하게된다. 세포내중성지방이증가하게되면운동이나식이를통하여축적된중성지방을분해할수있지만지방세포의숫자가증가하여비만이유발된경우에는생성된지방세포를파괴해야하므로치료에많은어려움이있다. 전구지방세포 (preadipocyte) 에서지방세포 (adipocyte) 로의분화 (adipogenesis) 는성장과정중특정호르몬의급작스러운양적변화와과잉영양공급에의해유발될수있으며이들지방세포분화유도인자에의해신체내특정부위에서지방세포분화가

16 일어날수있다. 또한지방세포의크기는한계가있으므로과잉에너지를섭취할때에너지를신속히저장하기위해서지방세포수의증가가일어나게된다. 지방세포의분화과정은일생을통해지방전구세포에서지방세포로지속적으로전환되는데, hormonal induction 과같은많은외부자극과복잡한유전자발현조절과정을통하여일어난다. 지방세포분화가유도되는동안 PPARγ, C/EBP family, ADD1/SREBP1 등의전사인자들의발현이증가하게된다. 이들전사인자들은상호전사를유도함으로써지방세포분화를유도하는것으로알려져있다. 3T3-L1 세포주는 3T3 쥐배아의섬유아세포로부터유래된전지방세포주로써비만이나대사성질환연구에가장많이사용되고있다. 이세포주는단층배양을하는동안적절한호르몬변화를유도하면지방세포로분화하여지방세포의형태적, 생화학적특징을띠게된다. 현재시판되고있는비만치료제는대부분이중추신경계에작용하여식욕을억제시키거나지방의소화를억제해체외로배출하는역할을하고있다. 하지만부작용으로서불면증, 두통, 혈압상승등이보고되어있고일부는향정신성의약품으로

17 분류되어있기도하다. 그럼에도불구하고급격하게증가하는 비만을치료하기위해합성의약품유래의비만치료제의수요가 빠른속도로늘어나는실정이다. 이러한상황에서오랜기간동안식품과약재로사용되어오며 그안전성을인정받고있는식용및약용작물로부터의비만 치료제탐색은비만의다양한원인에근거하여활발히진행되고 있다. 그중한가지인항비만소재탐색의표적이될수있는 지방세포분화를저해하는물질에대한연구는합병증이나부작용의위험없이기능성식품및치료제개발의밑바탕이될것이라예상된다. 산수유 (Cornus fructus) 는층층나무과의낙엽교목인산수유나무 (Cornus officinalis Siebold et Zucc.) 의열매로서산채황, 홍조피, royal jelly 등으로불리운다. 산수유열매에는결정성유기산, 몰식자산, 사과산, 포도산등이있으며열매껍질에는이리도이드배당체인 Morroniside, Loganin 등이포함되어있다. 약리실험결과뚜렷한이뇨작용과함께일시적인혈압강하작용, 항암작용, 항균작용등이있으며단백질의소화를돕는다고알려져있다. 본연구는항비만효과를나타내는기능성식품및의약품소재

18 개발을위한기초연구로서천연식물자원으로부터지방세포 분화를억제하는물질을분리하기위하여문헌조사를통해 대사성질환과관련있는 30 여가지의한약재를선택한후지방 분화억제효과를탐색하였으며, 가장높은억제효과를보인 산수유를선정하여농도별중성지방생성정도및지방세포 분화와관련된전사인자억제효과와세포증식억제효과에 대해연구하였다.

19 2. 재료및방법 2.1. 시료본실험에사용한 30종의한약재는서울경동시장약재도매상가에서원산지를확인한후구입하였으며, 모든원료는건조및마쇄하여사용하였다 시약 MTT,TRIzol reagent, DMSO(dimethy sulfoxide), dexamethasone, isobutylmethylxantine, oil red o, free-glycerol reagent 등은 Sigma 사 (St Louis, USA) 제품을 DMEM(Dulbeco s Modified Eagle s Medium), FBS(Fetal bovine serum), penicillin-streptomycin, BCS(Bovine calf serum), Insulin 은 Gibco 제품을 Maximum RT-PCR kit 는 intron 사제품을, Brdu proliferation assay kit 는 invitrogen 사제품을, 그외의시약과용매는일급또는특급을사용하였다 기기 사용기기로는에탄올추출물제조를위해진공회전농축기

20 (EYELA, Japan) 를사용하였고, 흡광도측정을위하여 Microplate Reader(Bio-Red Model 550) 를사용하였다.

21 2.4. 한약재의선별 30가지한약제의선정은식약청에서한약조제지침서로지정하고있는동의보감, 방약합편, 향약집성방, 경약전서, 의학입문, 제중신편, 광제비급, 동의수세보원, 본초강목, 약성가로부터선별하였다. 비만과연관된대사성질환이나고지혈증등의효능을선별기준으로삼았다 시료추출물의조제건조및마쇄한시료 50g에에탄올 (95% EtOH, 시약용 1급 ) 을가하여실온에서 24시간동안방치하고여과하여, 다시잔사에에탄올을가하여침지한후여과하는과정을 3회반복하여실행하였다 (Scheme 1). 얻은여액은 45 수욕상에서진공회전농축기 (EYELA, Japan) 로감압농축한후건조하여냉장보관하며에탄올추출물시료로사용하였다 세포배양 3T3-L1 세포주를 American type culture collection에서구입하여 사용하였다. 세포는 10% 의불활성화시킨 FBS, 1% 의 penicillinstreptomycin을 첨가한 DMEM 배지에서 37, 5% CO 2 에서 배양하였다

22 2.7. MTT assay 지방세포분화억제효과탐색을위한시료처리농도결정을하기위해 96 well plate에서 MTT assay를수행하였다. 각시료를처리한세포주를 24hr 배양후 MTT 용액 20ul를첨가하여 4시간반응시킨후세포에 DMSO 200ul를넣어 pipetting해준다음 546nm에서 microplater reader로흡광도를측정하였다 지방세포분화억제효과탐색 지방세포의분화유도와시료 3T3-L1 를 10% FBS 가첨가된 DMEM 배지에서배양시켜 confluent 한상태되면분화유도를시작했다. 분화시작 시점을 D-0 라볼때 10% FBS, 1%penicillin/streptomycin, 1μg/ml insulin, 1μM dexamethasone, 0.5mM isobutylmetylxantine 이 포함된 DMEM 배지로배양했다. 2 일후 D+2 가되면 10% FBS, 1%penicillin/streptomycin, 1μg/ml insulin 가포함된 DMEM 배지로교체하고다시 2 일후 (D+4) 10% FBS, 1%penicillin /streptomycin 이포함된 DMEM 배지로바꿔준다. 그후 분화가종료될때까지 3 일간더배양한다. 분화를시키지 않는그룹은 10% BCS, 1%penicillin/streptomycin 이포함된

23 배지로동일하게바꿔준다. 시료는분화배지첨가시매번 같은농도로처리해준다 Oil Red O staining 분화가최종적으로종료된후 PBS로배양접시를 3회세척 하고 3.7% 의 formalin으로 15분간세포를고정시킨후 60% isopropanol로 2회세척한다. 고정된세포가완전히마르면 oil red o 염색용액을 3ml 넣어 1시간염색을한다. 염색이종료되면 염색액을제거후 3차증류수로 3회세척후완전히말려현미경 관찰을 한다. 염료의 추출을 위해서는 isopropanol을 이용하며 540nm에서 흡광도를 측정하여 상대적인 지방의 생성 정도를 확인한다 2.9. 산수유의지방분화억제효과 산수유의 Cell viability에미치는영향측정 (MTT assay) 세포생존성과세포독성은 MTT assay를이용하여 96 well plate에서수행하였다 MTT 용액을 20ul를첨가하여 4시간가량반응시킨후세포에 DMSO 200ul를넣어 pipeting해준다음흡광도는 546nm에서 microplater reader로측정하였다.

24 산수유의농도별상대적지방생성량측정 30가지한약재의 oil red o assay를수행한후가장효과가좋았던산수유에대해서각농도별상대적지방함량을측정을위해 oil red o 염색을다시수행하였다 TG assay Tris/EDTA를이용하여세포를분해한후원심분리하여상등액 80μL에 120μL free-glycerol reagent를상온에서반응시킨후 590nm에서흡광도를측정한다. Glycerol을표준용액으로사용하여중성지방의함량을측정하고 brad-ford 단백질정량법을이용하여세포상등액내의단백질함량을측정해비교한다 RT-PCR RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) 을사용하여산수유에탄올추출물의농도별 mrna 상에서의지방분화관련전사인자의발현정도를확인하였다. Cell을배양후 1ml의 TRIzol reagent을넣어 pipeting 해준뒤 1.5ml tube에모았다. 여기에 chloroform 200ul를넣고 RT에서 5분간방치한다음 12,000rpm에서 15분간원심분리해준다. 상층액을제거한뒤 isopropyl alcohol을

25 0.6ml첨가 5분간 RT에서방치한다. 다시 12,000rpm에서 15분간원심분리하여상층액을제거하고 0.8ml 75% Ethanol (in DEPC water) 를첨가하였다. 12,000rpm에서원심분리후상층액을제거건조하여 DEPC water를 30ul 첨가한후 Spectrophotometer 를사용하여 260nm/280nm에서의흡광도를측정하였다. RT-PCR Premix에 primer 20pmole/ul(sense primer, anti-sense primer) 과 Template, DEPC water를사용하여최종부피가 20ul이되도록조절하여다음과같은조건으로 RT-PCR 을실시하였다. cdna 합성 45, 30분 denaturation 94, 5분 denaturation 94, 5분 annealing 55~50, 1분 elongation 72, 2분을 25 cycles한다음, final elongation step을 72 에서 5분간수행하였다. RT-PCR의생성물은 1% agarose gel을사용하여 100v에서 30분간전기영동하여 UV에서관찰하였다. 각 primer의염기서열은 Table 2에나타내었다 산수유의지방세포증식억제효과 (BrdU proliferation assay) 세포증식에미치는영향을알아보기위해 BrdU proliferation assay kit를이용하여반응시킨뒤형광현미경으로사진촬영을하였다.

26 Medicinal plants dried crushed weighted Powder (50g) + 95% ethanol extracted for 24h filtrated Repeated of 3 times Supernatant Residue evaporated in vacuum (45 ) Extracts Scheme 1. Preparation of ethanol extracts from Medicinal plants

27 3. 결과및고찰 3.1. 선별된한약재 문헌을통해선별한 30 가지의한약재는 table 2. 에나타내었다 가지한약재추출물이지방분화에미치는효과 30종의한약재에탄올추출물에대하여지방분화억제효과를검색하기위해 Oil Red O assay를수행하였다. 산수유 (1), 백출 (6), 대황 (19) 이각각 87.11%, 87.02%, 82.42% 로높은억제효과를타나내었으며이한약재추출물들은지방분화를억제시킨다고알려져있는 baicalin과비교하여서도더높은억제효과를나타냈다 (figure 1). 반면솔잎 (23), 상엽 (26), 상심자 (21) 등은각각 -4.44%, %, % 로지방분화를더욱유도시키는것으로확인되었다 산수유의에탄올추출물의세포독성한약재추출물의지방분화억제효과탐색에서가장효과가좋았던산수유추출물을선택하여농도별실험을진행하기위해전지방세포상태와분화가완료된지방세포에서 MTT assay를수행하여세포독성을측정하였다. Esculin 이나 Guggusterone

28 등이분화된지방세포의수를줄이는효과가있다고알려져있지만그와비교하여산수유추출물은낮은농도는물론높은농도에서도지방세포의수를줄이는데에효과를보이지않았다 (figure 3) Oil Red O assay 세포에독성을주지않는 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm 에서산수유추출물을이용하여다시한번 Oil-red O assay를수행하였다. 그결과각각농도에서 89.35%, 88.06%, 74.17%, 22.24% 로 200 ppm 에서 50 ppm 까지는매우높은지방분화억제효과를보였다 (figure 4). 특히스크리닝에서 250 ppm의농도를사용하였을때 (87.11%) 보다 200ppm에서더높은억제효과를확인할수있었다 TG assay 산수유추출물을처리하였을때생성되는지방세포내의중성지방을정량하기위해 TG assay를수행한결과산수유추출물을처리하지않은경우 μg/ml인반면산수유의에탄올추출물을 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm 처리한실험군은각각 μg/ml, μg/ml, μg/ml로지방분화를유도하지않은

29 실험군과비슷한정도의중성지방생성보였다 (figure 5) 산수유추출물이 mrna 발현에미치는영향산수유추출물이지방분화진행중발현되는전사인자인 C/EBP-α 와 PPAR-γ에미치는영향을알아보기위해 RT- PCR을수행한결과전사인자의발현량이 PPAR-γ는 41.2%, C/EBP-α는 75.88% 감소하는것으로확인되었다 (figure 6) 산수유추출물이세포증식에미치는영향산수유의에탄올추출물이지방세포의증식에미치는영향을알아보기위해 BrdU assay를수행한결과산수유의에탄올추출물을처리한그룹에서높은증식억제효과를확인할수있었다 (figure 7).

30 Table1. Sequence of primer PPARγ, C/EBPα, GAPDH primer. Sequence PPARγ C/EBPα GAPDH (forward): 5-ACC ACT CGC ATT CCT TTG AC-3 (reward):5-tca GCG GGA AGG ACT TTA TG-3 (forward): 5-ATG GAG TCG GCC GAC TTC TAC-3 (reward): 5-CAGGAACTCGTCGTTGAAGGC-3 (forward):5-aactttggcattgtggaagggc-3 (reward): 5-GACACA TTGGGGGTAGGAACAC-3 (Bioneer, Korea).

31 Table 2. Selected 30 traditional herbal plants Sample number Korean name Scientific name Used part 1 산수유 Cornus officinalis Sieb.et Zucc. fruit 2 반하 Pinellia ternata Breit root 3 백작약 Paeonia lactiflora Pall. root 4 진피 Citrus unshiu Markovich pericarp 5 오미자 Schisandra chinensis Baill. fruit 6 백출 Atractylodes japonica Koidz. root 7 상지 Morus alba L. bark 8 하수오 Polygonum multiflorum Thunb. root 9 황금 Scutellaria baicalensis Georgi root 10 차즈기 Perillae folium leaves 11 산사 Crataegus pinnatifida Bunge fruit 12 황기 Astragalus membranaceus Bunge root 13 길경 Platycodon grandiflorum A. DC. root 14 희첨 Siegesbeckia glabrescens Makino leaves 15 의이인 Coix lachrymajobi fruit 16 홍화 Cathamus tinctorius flower

32 Sample number Korean name Scientific name Used part 17 마황 Ephedra sinica stem 18 택사 Alisma orientale root 19 대황 Rheum undulatum stem&root 20 적소두 Phasealus angularis fruit 21 상심자 Mrus alba L. fruit 22 감초 Glycyrrizae radix root 23 솔잎 Pinus densiflora leaves 24 시엽 Diospyros kaki Thunb leaves 25 인진 Atemisia capillaris thunb leaves 26 상엽 Mrus alba L. leaves 27 비파엽 Eriobotrya japonica Lin leaves 28 상지 Mrus alba L. stem 29 죽엽 Phyllostachysis folium leaves 30 결명자 Cssia toral L. fruit

33 Fig. 1. Effect of herbal plant ethanolic extracts on lipid accumulation of differentiated 3T3-L1 cells using Oil red O staining. Preadipocytes were treated with no additives (control) or

34 in the presence of each reagent (250 ppm), and the accumulation of lipid droplets was detected using Oil red O staining. 1 Baicalin was used as a positive control. 2 Inhibitory rate (%) was defined as follows: [(sample O.D. control O.D.)/(MDI O.D. Control O.D.)] 100

35 Fig. 2. Inhibition of the lipid accumulation of Corni fructus, A. macrocephalae and R. undulatum on adipogenesis of MDI hormone mixture induced 3T3-L1 preadipocytes by Oil red O staining. (A) MDI-treated group, (B) Corni fructus-mdi treated group, (C) A. macrocephalae-mdi treated group, (D) R. undulatum-mdi treated group. Treated contents of each sample was 250 ppm.

36 Fig. 3. Effect of Corni fructus extract on viability of preadipocyte (A) and mature adipocyte (B) by MTT assay.

37 relative lipid contents(%) MDI 200ppm 100ppm 50ppm 25ppm Fig. 4. Effect of Corni fructus ethanolic extracts with different concentrations on lipid accumulation of differentiated 3T3-L1 cells using Oil red O staining. Preadipocytes were treated with no additives (control) or in the presence of each concentration reagent (25, 50, 100, and 200 ppm), and the accumulation of lipid droplets was detected using Oil red O staining.

38 70 60 TG contents(ug/ml) CON MDI Fig. 5. Effect of Corni fructus ethanolic extracts with different concentrations on triglyceride contents in differentiated 3T3-L1 cells. Preadipocytes were treated with no additives (control) or in the presence of each concentration reagent (25, 50, 100, and 200 ppm).

39 Fig. 6. Effect of Corni fructus on expression of transcription factor, C/EBP-α and PPAR-γ during adipogenesis

40 MDI 200ppm Fig. 4. Inhibition of NO production 100ppm 50ppm Fig. 7. Effect of Corni fructus on cell proliferation of adipocyte.

41 4. 결론 항비만효과가있는기능성식품및의약품소재의개발을 위하여한약재로부터지방세포분화를억제하는물질을 탐색하였고다음과같은결론을내릴수있었다. 1. 문헌을통해선별된 30 가지의한약재에서지방분화억제효과 를탐색한결과산수유, 백출, 대황이 80% 이상의억제효과를가 진것으로확인되었다. 2. 가장높은저해효과를보인산수유의에탄올추출물을이용해 전지방세포와지방세포에서의세포독성실험을한결과세포의 수에영향을주지는않는다는것을확인하였다. 3. 산수유의에탄올추출물의농도별억제효과를측정한결과 200 ppm 에서 89.35% 의높은효과를보였으며중성지방의함량을측정한결과 200 ppm 에서 38.74% 로분화되지않은실험군과비슷한정도의적은중성지방이생성된다는것을확인하였다.. 3. RT-PCR 을수행하여 C/EBP-α 와 PPAR-γ 의발현정도를확인한결과산수유의에탄올추출물에의해 mrna 의발현정도가억제된다는것을확인하였다. 4. 산수유의에탄올추출물은세포의숫자를감소시키데효과는없 었지만지방세포의증식을억제하는효과가있다는것을확인하 였다.

42 5. 참고문헌 1. Bruno F. Adipogenesis: Cellular and molecular aspects. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 19: (2005) 2. Cho HJ, Park JY, Lee HW, Lee YS, Kim JB. Regulation of adipocyte differentiation and insulin action with rapamycin. Biochem Biophys Res Commun. 321: (2004) 3. Choi SI, Park SR, Heo TR. Inhibitory Effect of Astrgali Radix on Matrix Degradation on Human Articular Catilage. J Microbiol Biotechnol.15: (2005) 4. Coherd RM, Lyle RE, McGhee RE. Molecular regulation of adipocyte differentiation. Annu Rev Cell & Dev bio. 10: 3-10 (1999) 5. Cousin W, Dani C, Peraldi P. Inhibition of anti-adipogenic Hedgehog signaling pathway by cycloplamine does not trigger adipocyte differentiation.biochem Biophys Res Commun. 349: (2006)

43 6. Eun JS, Suh ES, So JN, Oh SH. Effext of Baicalin on the Differentiation of 3T3-L1 Cells. J Pharm Soc Korea. 38: (1994) 7. Guo X, Liao K. Analysis of gene expression profile during 3T3-L1 preadipocyte differentiation. Gene. 251: (2000) 8. Hassan M, Yazidi CE, Landrier JF, Lairon D, Margotat A, Amiot MJ. Phloretin enhances adipocyte differentiation and adiponectin expression in 3T3-L1 cells. Biochem Biophys Res Commun. 361: (2007) 9. Heikkinen S, Auwerx J, Argmann CA. PPARγ in human and mouse physiology. Biochim Biophys Acta. 1771: (2007.) 10. Hsu JH, Wu YC, Liu IM, Cheng JT. Release of acetylcholine to raise insulin secretion in Wistar rats by oleanolicacid, one of the active principles contained in Cornus officinalis. Neurosci Lett. 404: (2006) 11. Huiqin X, Jian S, Hong L, Yan S, Lihua L, Min W. Morroniside and loganin extracted from Cornus officinalis have protective effects on rat mesangial cell proliferation exposed to advanced glycation end products by preventing oxidative stress. Can J Physiol Pharmacol. 84: (2006)

44 12. Kim MJ, Kim YG, Chung JH, Kim JW, Kim HK. The Effect of Caffeine on 3T3-L1 Adipocyte Differentiation : A Nutrigenomical Approach. Korean J Nutr. 38: (2005) 13. Kim YD, Kim HK, Kim KJ. Analysis of Nutritional Compound of Cornus officianalis. J Korean Soc Food Sci Nutr 32: (2003) 14. Kim YJ, Kim BH, Lee SY, Kim MS, Park CS, Rhee MS, Lee KH, Kim DS Screening of Medicinal Plants for Development of Functional Food Ingredients with Anti-Obesity. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 49: Lu RH, Li Y, Zhang LJ, Yang GS Effects of baicalein on the proliferation and differentiation of porcine preadipocytes. Chin J Biotechnol. 22: MacDougald OA and Lane MD Transcriptional regulation of gene expression during adipocyte differentiation. Annu Rev Biochem. 64: Moon HS, Guo DD, Song HH, Kim IY, Jin HL, Kim YK Regulation of adipocyte differentiation by PEGylated all-trans retinoic acid; reduced cytotoxicity and attenuated lipid accumulation, Journal of Nutritional Biochemistry. 18:

45 감사의글 이논문을마지막으로대학원생활을마무리하게되었습니다. 되돌아보면힘들기도했던시간들이지만의욕만앞서던저에게지도와격려를해주셨던지도교수님이신허태련교수님, 선배이기이전에선생님이되어주셨던최수임박사님, 그리고셋이함께이기에뭐든할수있었던창호오빠, 혜성이에게진심으로감사를드립니다. 그리고학부 4년의시간과대학원 2년까지, 생물공학이라는학문의길에서늘뜻깊은가르침으로이끌어주셨던허병기교수님, 구윤모교수님, 김은기교수님, 김동일교수님, 소재성교수님, 윤현식교수님, 이철균교수님, 김응수교수님께도고개숙여감사드립니다. 거친파도를타며힘든실험을함께했던정우, 영민, 하민, 승호그리고희원이에게고마운마음과이제새로운출발앞에서모두잘되리라파이팅을보냅니다. 그리고우리들마을식구들성미언니, 지윤이, 나미언니, 부영오빠, 이해인회장님, 짧은시간이었지만힘들때마다큰위로였습니다. 고맙습니다. 모르는것, 모자란것, 난처한것많은저에게더많이알려주시고도와주셨던향복언니, 영범오빠, 재동오빠정말감사했고동물세포배양에노하우를전수해주신용수오빠잊지않겠습니다. 그리고무뚝뚝한첫째딸늘마음으로아끼고보듬어주시는사랑하는아빠, 엄마정말감사합니다. 이제는이감사하는마음을갚아가기위해서더욱열심히삶의향기를찾아나서겠습니다. 2남 132호생물기능성소재실험실 forever!

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工學碩士學位請求論文 산수유 (Cornus fructus) 추출물의 지방세포분화억제효과 2008 年 2 月 仁荷大學校大學院 生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 홍초롱

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