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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 37(), 44~4(200) DOI:.374/jkfn 유산간균인 Bacillus polyfermenticus KJS-2 의안정화 김강민 1 이진영 1 홍용근 2 이상길 1 강재선 1 1 인제대학교제약공학과 2 인제대학교물리치료학과 The Stabilization of Lactic Acid Bacteria, Bacillus polyfermenticus KJS-2 Kang Min Kim 1, Jin Young Lee 1, Yonggeun Hong 2, Sangkil Lee 1, and Jae Seon Kang 1 1 Dept. of Pharmaceutical Engineering and 2 Dept. of Physical Therapy, Inje University, Gimhae , Korea Abstract Bacillus polyfermenticus KJS-2 (Bp2) was isolated from Bispan R, a commercially available probiotics consisting of more than 4 strains. The objective of this study was to investigate the effect of three-layer coating on the stabilty of Bp2. Bp2 was microencapsulated with sodium alginate using an air atomizer. The Bp2 loaded pellets were also coated with HFP-chitosan and HPMCP for oral delivery system. When compared to the uncoated Bp2, the survival of the three-layer coated Bp2 increased to approximately 3% (p<0.01) in a 30% ethanol solution, 54% (p<0.05) in an artificial gastric juice (ph 2), and 53% (p<0.05) in the bile acid (ph 5). When coated beads were stored at 0 o C and 130 o C, Bp2 in coated beads was very stable (p<0.01) compared to uncoated Bp2. Key words: Bacillus polyfermenticus KJS-2, three-layer coating, alginate, stability 서론생균제 (probiotics) 란살아있는미생물공급원으로써장내균총의정상화는물론장내병원성미생물감염의예방, 콜레스테롤대사개선, 면역체계의정상화및 lactic acid 공급등을통한신체기능개선의목적으로사용된다 (1,2). 우수한생균제는소화기관및장내로도달할때까지생존력, 안정성및활성이유지되어야한다 (3). 이러한면에서여러생균제중유산균은유해미생물의억제, 설사방지, 장내의생존력의개선을통한산업적측면에서관심이증대되고있다. 또한식품을캡슐화시킴으로써여러질병예방은물론치료목적으로사용되어진다 (4). Terakado 는 1933년에몇가지내생포자를형성하는균주를공기중에서분리하였으며 (5) Bacillus polyfermenticus SCD(Bp SCD) 를포함한 4가지균주를혼합하여만든제제인 Bispan R 이현재의약품및동물용약품으로판매되고있다. Bp SCD는유전자수준과생화학적으로 Bacillus subtilis 와유사하며인공위액및인공담즙산에대한내성을가지고있으며장내유해균의증식을억제한다고보고되었다 (). 이 4가지균주중에서안정성과항균성이우수한 Bacillus polyfermenticus KJS-2(Bp2) 를선별하여본연구에사용하였다. 생균제는보관기간동안의온도와습도에의한안정성의문제와인체에섭취시에위액이나담즙산에의한생존력감소가산업화시킬때많은단점으로작용한다. 산업적으로이용하기위한생균제의 microencapsulation은여러방법이보고되었는데그중에서 sodium alginate를이용한 microencapsulation의기술이많이보고되었다 (7-9). Alginate 는여러종류의조류로부터추출한 D-mannuronic acid와 L-guluronic acid로이루어진선형의 copolymer이다 (). 이것이고형화가되기위해서는 Ca 2+, Mg 2+ 과같은 2가의이온들과결합이되어야하며특히 Ca 2+ 과친화성이우수하다. 하지만, 양이온과 phosphate, citrate 및 lactate에착화물을형성하여불안정한형태로유지된다 (11). 이것을보완하고자 polylysine, polyvinylamine 및 chitosan 등을이용하여 polymer 코팅을하였을때 alginate capsule의안정성이유지되었다. Bovine serum albumin(bsa) 을 1차로 alginate로코팅후 chitosan으로 2차코팅하였을경우인공위액및인공담즙산에대한 BSA의안정성이증가되었음을보고하였다 (12). Chitosan 은 glycosaminoglycan과유사한 polysaccharide이며독성이없고생분해성을가지고있으며낮은 ph에서도안정하여경구용제제로사용되고있다 (13). 또한, hydroxypropyl methylcellulose phthalate(hpmcp) 는 Corresponding author. Phone: , Fax:

2 유산간균인 Bacillus polyfermenticus KJS-2 의안정화 45 산성조건에서는잘방출되지않고 ph 7.2 이상의알카리용액에서방출이잘되는장용성코팅제제로서의사용이효과적이라고보고되었다 (14). 본연구에서는 Bp2를 pan coating 방법을이용하여 alginate-ca 2+ 코팅을실시하였고다음단계로 soluble chitosan 과 HPMCP 29을이용하여코팅을실시하여 3중 coating 하여고온및에탄올에서의안정성을조사한결과를보고하고자한다. 재료및방법균주및배양조건본연구에서사용된 Bacillus polyfermenticus KJS-2 KCCM 79P(Bp2) 는일본 TOA제약에서상업적으로판매되고있는 Bispan 으로부터분리하여 3 4회계대배양하여활성화하였으며 % glycerol stock법으로 -0 o C에서보존하였고한달에 1회씩계대배양하여사용하였다. 배양배지는내생포자를완전히형성시키기위하여 Cazemier 등 (15) 과 Oomes 등 (1) 의내생포자형성배지를변형하여만든고체배지를사용하였으며이배지에서 37 o C로 4일간배양한다음동결건조후사용하였다. 포자형성고체배지의조성은다음과같다. 1.3% nutrient broth, 0.051% MgSO 4 7H 2O, 0.097% KCl, 0.02% CaCl 2 2H 2O, 0.003% MnSO 4 H 2O, % FeSO 4 7H 2O, % skim milk, 1.5% agar. Bacillus polyfermenticus KJS-2의미세캡슐화동결건조된 2 CFU/g을함유하는 Bp2 5 g을 1% lactic acid, 1% Tween-0 0 ml에혼합한뒤 2% sodium alginate(qingdao Jiaonan Bright Moon Seaweed Industrial Co., Ltd., China) 1 L에재혼합하였다. 이현탁액은공기분무식장치 (Jounjin tech Co., Ltd., Korea) 를이용하여 0.1 M CaCl 2 용액에분무하고완전한겔상태를만들기위하여 30 분동안저온에서방치하였다. 미세캡슐화된 alginate beads 는멸균수로씻어낸후시험에사용하였다. Chitosan 및 HPMCP 에의한 alginate bead 의코팅 Alginate bead는멸균된 0.1% HFP-Chitosan(Jakwang Co., Ltd., Korea) 용액에넣은후코팅을위하여 orbital shaker에서 0 rpm, 30분동안유지하였다. Chitosan 으로코팅된 beads 는여과기로여과한후동결건조하여실험에사용하였다. 동결건조된 beads 는 3차코팅을위하여 4% HPMCP 29(Shin-Etsu chemical Co. Ltd., Japan) solution을소량씩넣으면서혼합한후건조하였고, HPMCP 29으로코팅된 beads는 0 o C에서송풍건조하여검체로사용하였다 (3중코팅된 Bp2). 레이저입도분석기 (particle size analyzer) 를이용한 bead의분석 3중코팅된 Bp2의입자크기를분석하기위하여레이저입 도분석기 (PSA, 90 Plus, Brookhaven Instruments Co., USA) 및분말의형태를관찰하기위해서전계방출주사전자현미경 (Field Emission Scanning Electron Microscope, S-4300 SE, HITACHI, Japan) 을이용하여관찰하였다. 균수의측정 3중코팅된 Bp2의총균수는다음과같이측정하였다. mm potassium phosphate 용액 (ph 7.2) 에 2차, 3차코팅된 chitosan 과 HPMCP를녹여제거하고 55 mm sodium citrate(ph 7.4) 를이용하여 1차코팅된 sodium alginate를녹여제거하였다. 0.1% peptone 용액으로 배씩연속적으로희석하여 tryptic soy agar(tsa, Difco, USA) 배지에 0.1 ml 씩분주하여도말한뒤최적온도인 37 o C에서배양하여콜로니형성단위 (colony forming unit, CFU) 를측정한후총코팅된균수를계산하였다. 에탄올처리에의한 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus 3중코팅된 Bp2 를 0.1 g을취하여 30% 에탄올용액에 4시간처리하고각각을 1 ml씩취하여멸균된 0.1% peptone 용액으로 배씩계열희석하여 TSA 배지에 0.1 ml씩분주하여도말한뒤최적온도인 37 o C에서배양하여 CFU를측정한후총균수를계산하였다. 대조군으로는코팅하지않은내생포자균을이용하였다 ( 코팅처리하지않은 Bp2). 0 o C 용액으로처리한 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus 3중코팅된 Bp2를 0.1 g을취하여 0 o C의끓는물에 5분, 분, 15분씩처리하고각각을 1 ml씩취하여멸균된 0.1% peptone 용액으로 배씩계열희석하여 TSA 배지에 0.1 ml씩분주하여도말한뒤최적온도인 37 o C에서배양하여 CFU를측정한후총균수를계산하였다. 대조군으로는코팅처리하지않은 Bp2을이용하였다. 130 o C 증기로처리한 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus Tunnel 방식의 convey belt상에서이동하면서 130 o C 수증기를이용하여 5분간멸균처리를하였다. 코팅된균주를시중의 pellets 형태의일반사료에흡착시켜건조후실험에사용하였다. 대조군으로는코팅처리하지않은 Bp2와 1차코팅에사용한 sodium alginate의사용량을 1/로줄여코팅한것을사용하였다 ( 완전히코팅되지않은 Bp2). 인공위액및인공담즙산에대한 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus KJS-2의안정성인공위액은 1 N HCl을사용하여 ph 2로조절한 tryptic soy broth(tsb) 를사용하였다. 3중코팅된 Bp2 1 g을 ph 2로조절된 TSB(20 ml) 에넣은뒤 4시간후총균수를측정하였다. 인공담즙산은 0.% oxgall(ph 5) 이첨가된배지를

3 4 김강민 이진영 홍용근 이상길 강재선 제조하여사용하였다. ph 2로조절된 TSB(20 ml) 에 3중코팅된 Bp2 1 g을넣은뒤 4시간후인공담즙산배지에다시옮겨 1시간처리후용액에서일정량을취하여희석방법에의하여총균수를측정하였다. 통계분석통계학적유의성을판단하기위하여코팅처리하지않은 Bp2, 완전히코팅처리하지않은 Bp2와 3중코팅된 Bp2 사이의유의수준 p<0.01와 p<0.05로 t-test를이용하여통계분석을시행하였다. 결과및고찰 Bacillus polyfermenticus KJS-2의미세캡슐화온도에잘견딜수있도록 Bp2의 endospore를증식용배지에서만들어사용하였으며 sodium alginate를사용하여 1차코팅미세캡슐을제조하였다. Beads 를레이저입도분석기및전계방출주사전자현미경으로측정하였을경우약 15±2 μm의입도크기를나타내었다 (Fig. 1, 2). 또한사용된 lactic acid는산성조건을유지함으로써 endospore의안정성을높이고자하였으며, 2차코팅물질로서 chitosan을사용한것은 1차코팅물질인 alginate와의친화성이높음을이용한것으로 alginate와의가교결합으로더욱견고한 bead를제조할목적으로사용하였다. 3차로 HPMCP를사용한것은 HPMCP가 ph 이하에서는녹지않는성질을이용한것으로 ph 이하에서코팅된 bead 가용해하지않게하기위하여장용성코팅재료인 HPMCP를사용하였다. 이것은위를통과할때안정성을유지할수있게사용된것이다. 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus KJS-2의에탄올에대한안정성식품첨가제로많이이용되는에탄올에대한안정성여부를조사할목적으로 3중코팅 beads 의안정성에대하여시험하였다. 코팅처리하지않은 Bp2(2±0.0 CFU/g) 와 3 Fig. 2. Field emission scanning electron microscope micrograph of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS-2. 중코팅된 Bp2(5±0.0 9 CFU/g) 를 30% ethanol 용액에 4시간처리후 배씩계열희석하여도말하였을경우코팅처리하지않은 Bp2의생존율은 3%(±0.0 CFU/g) 이었고 3중코팅된 Bp2는 %(3.3±0.0 9 CFU/g) 이었다 (Fig. 3, p<0.01). 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus KJS-2 의 0 o C 에대한안정성대부분의유산균은 40 o C이상의온도에서급격히사멸되기때문에제형의공정에서사멸율의개선에대한개발을하여야한다. 비록 endospore 로구성된경우에도고온에서의사멸이예상되어 3차코팅과의비교시험을수행함으로써온도에대한안정성을조사하였다. 코팅처리하지않은 Bp2(2±0.0 CFU/g) 와 3중코팅된 Bp2(5±0.0 9 CFU/g) 를각각끓는물에 5분, 분, 15분처리한후계열 * Fig. 1. Particle size distribution curve of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS Fig. 3. Stability of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS-2 in 30% ethanol solution. 1, cell number of uncoated Bp2; 2, cell number of uncoated Bp2 treated with alcohol; 3, cell number of three-layer coated Bp2; 4, cell number of three-layer coated Bp2 treated with alcohol.

4 유산간균인 Bacillus polyfermenticus KJS-2 의안정화 * * * Uncoated Bp2 Three-layer coated Bp Min Fig. 4. Stability of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS-2 at 0 o C. 희석하여도말하였을경우, 코팅처리하지않은 Bp2의생존율은 5분처리시 4.1%(.2±0.15 CFU/g), 분처리시 3.7%(7.3±0.0 CFU/g), 15분처리시 3.2%(.4± 0.0 CFU/g) 이었고 3중코팅된 Bp2는 5분처리시 7%(3.±0.0 9 CFU/g), 분처리시 70%(3.5± CFU/g), 15분처리시 %(3.4± CFU/g) 이었다 (Fig. 4, p<0.01). 처리시간의경과에따라생존율은코팅처리하지않은 Bp2와 3중코팅된 Bp2에서모두감소하였지만코팅처리하지않은 Bp2의경우에는 4% 이하의낮은생존율을보였으나 3중코팅된 Bp2에서는약 70% 내외의생존율을나타내었다. 이것은유사균주인 Bp SCD를 3중코팅하였을경우 0 o C에서의안정성이코팅처리하지않은 Bp SCD보다증대됨과일치하는결론을얻었다 (17). 이는고온처리를하는식품및의약품제조시에사용할수있는유산균으로 3중코팅된것이이용될수있을것이다. 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus KJS-2의 130 o C 에대한안정성코팅처리하지않은 Bp2(2±0.0 CFU/g) 를이용하여실험을수행하였을경우에생존력은약 1%( 약 1.2± 0.15 CFU/g) 를나타낸반면에완전히코팅처리하지않은 Bp2(5±0.2 9 CFU/g) 의경우에는 %( 약 5±0.3 CFU/g) 내외의생존력을보였다. 3중코팅된 Bp2 (5±0.0 9 CFU/g) 의경우에는 99%( 약 4.9± CFU/g) 의생존력을보였다 (Fig. 5, p<0.01). 즉, 대조군중코팅처리하지않은 Bp2의내생포자는생존율이약 1% 이었으나 1차코팅이완전하지못할경우에도최대 % 까지증가되었고본연구에서사용된 sodium alginate 농도에서 99% 까지의대단히높은생존율을나타내었다. 이결과는 3중코팅된 Bp SCD를이용하여 130 o C에서 5분처리시에생존율이 % 미만인것과비교하면코팅양이매우중요하다는것을알수있었다 ( 데이터미제시 ). 순간고온처리나고형의식품및동물용사료등에서의멸균조건은 130 o C 증기멸균을실시하는것이일반적이며, 유산균의 3중코팅에 Fig. 5. Stability of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS-2 at 130 o C. 1, cell number of uncoated Bp2; 2, cell number uncoated Bp2 treated at 130 o C; 3, cell number of incompletely coated Bp2; 4, cell number of incompletely coated Bp2 treated at 130 o C; 5, cell number of three-layer coated Bp2;, cell number of three-layer coated Bp2 treated at 130 o C. 의한안정화로이분야에서도유산균이이용될수있는기술을제공할수있음을보여주고있다. 3중코팅된 Bacillus polyfermenticus KJS-2 의인공위액및인공담즙산에대한안정성생균제들의위액, 담즙산등에대한안정성을높이기위한 sodium alginate를통한생균제의 microencapsulation에대한많은연구가보고되었다 (,17). 생균제로서의특징은물론식품용생균제로서가져야할여러가지특징중음식물이위를통하여십이지장에서장까지도달할때의생존율이높아야한다는것이다. 다음에서는 Bp2가생균제로서의특성을확인하고장까지도달하기위한높은생존율을위하여 endospore를형성시켜인공위액및인공담즙산에서안정성을검토하고 endospore를형성시킨균을이용, 코팅하여인공위액및인공담즙산에서의안정성을비교하였다. 코팅처 * * Fig.. Stability of the three-layer coated Bacillus polyfermenticus KJS-2 at gastric juice and bile acid. 1, cell number of three-layer coated Bp2; 2, cell number of three-layer coated Bp2 treated at gastric juice; 3, cell number of three-layer coated Bp2 treated at bile acid; 4, cell number of uncoated Bp2; 5, cell number of uncoated Bp2 treated at gastric juice;, cell number of uncoated Bp2 treated at bile acid. * p<0.05. *

5 4 김강민 이진영 홍용근 이상길 강재선 리하지않은 Bp2(2±0.0 CFU/g) 와 3중코팅된 Bp2 (5±0.0 9 CFU/g) 를각각인공위액에 4시간처리한후계열희석하여도말하였을경우, 코팅처리하지않은 Bp2의생존율은 42%(.3± CFU/g) 이었고 3중코팅된 Bp2는 9%(4.± CFU/g) 이었다. 인공위액에서 4 시간처리후인공담즙산용액에 1시간처리하였을경우는코팅처리하지않은 Bp2의생존율은 41%(.1± CFU/g) 이었고 3중코팅된 Bp2는 94%(4.7±0.0 9 CFU/ g) 이었다 (Fig., p<0.05). 이것은유사균주인 Bp SCD의 3중코팅에의한인공위액및인공담즙산에대한 1시간처리후의안정성이 0% 및 90% 에비해 Bp2는보다높은 90% 이상의안정성이나타났음을확인할수있었다 (17,1). 요 유산균인 Bp2를 3중코팅으로미세캡슐화시켜에탄올, 온도, 인공위액및인공담즙산에대한안정성을검토하였다. 코팅된 bead의크기는약 15 μm로나타났으며코팅된 Bp2 의내생포자의온도에대한내성에서는 0 o C 끓는물에서 5분간방치하였을경우생존률이 7%, 분에서 70%, 15분에서 % 로나타났으며 130 o C 증기에서는코팅처리하지않은 Bp2는 1% 의생존율에비해코팅을하였을시 99% 의높은생존율을보였다. 위액및담즙산에대한안정성에서는코팅처리하지않은 Bp2는 42%, 41% 에비해 3중코팅된 Bp2 는 9%, 94% 로아주높은생존율을보였다. 이것은 alginate, chitosan 및 HPMCP를이용한코팅방법은 Bp2에대한높은안정성을제공하였고 alginate의양을적절히사용함으로써 Bp2의미세캡슐화로안정성이증대되었다고볼수있다. 또한에탄올에대한생존율을증가시킴으로써식품첨가제로사용할수있음을나타내었다. 이기술을적용할경우 3중코팅된생균제 Bp2는산업적으로확대되고있는 pellet형사료에도사용할수있어서그효용성이높다고사료된다. 약 감사의글 이논문은 2005년도인제대학교학술연구조성비보조에의하여수행되었으며이에감사를드립니다. 문 1. Fuller R Probiotics in man and animals. J Appl Bacterio : Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, Isolauri E, Moreau MC, Roberfroid M, Rowland I Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr 0: Gilliland SE Acidophilus milk products: a review of 헌 potential benefits to consumers. J Dairy Sci 72: Park, BG, Lee JH, Shin HK, Lee JH, Chang PS Optimization of conditions for the double layer microencapsulation of lactic acid bacteria. Korean J Food Sci Technol 3: Lee KH, Jun KD, Kim WS, Paik HD Partial characterization of polyfermenticin SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus polyfermenticus. Lett Appl Microbiol 32: Park KY, Jung HY, Woo KL, Jun KD, Kang JS, Paik HD Effects of Bacillus polyfermenticus SCD administration on fecal microflora and putrefactive metabolites in healthy adults. J Microbiol Biotechnol 12: Bregni C, Degrossi J, Garcia R, Lamas MC, Firenstein R, D'Aquino M Alginate microspheres of Bacillus subtilis. Ars Pharmaceutica 41: Sultana K, Godward G, Reynolds N, Arumugaswamy R, Peiris P, Kailasapathy K Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. Int J Food Microbiol 2: Koo SM, Cho YE, Huh CS, Baek YJ, Park JY Improvement of the stability of Lactobacillus casei YIT 901 by microencapsulation using alginate and chitosan. J Microbiol Biotechnol 11: Remunan-Lopez C, Bodmeier R Mechanical, water uptake and permeability properties of crosslinked chitosan glutamate and alginate films. J Controlled Release 44: Yoo IK, Seong GH, Chang HN, Park JK Encapsulation of Lactobacillus casei cells in liquid-core alginate microcapsules for lactic acid production. Enzyme Microbiol Technol 19: Hari PR, Chandy T, Sharma CP Chitosan/calciumalginate beads for oral delivery of insulin. J Appl Polymer Sci 59: Muzzarelli R, Baldassarre V, Conto F, Ferrara P, Biagini G, Gazzanelli G, Vasi V. 19. Biological activity of chitosan: ultrastructural study. Biometerials 9: Kim MS, Kim JS, Kang SH, Yoo YH, Lee SB, Park JS, Woo JS, Hwang SJ Influence of water soluble additives and HPMCP on drug release from Surelease-coated pellets containing tamsulosin hydrochloride. Arch Pharm Res 30: Cazemier AE, Wagenaars SFM, Steeg PET Effect of sporulation and recovery medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli. J Appl Microbiol 90: Oomes SJCM, van Zuijlen ACM, Hehenkamp JO, Witsenboer H, Van der Vossen JMBM, Brul S The characterisation of Bacillus spores occurring in the manufacturing of (low acid) canned products. Int J Food Microbiol 120: Lee JO, Jun KD, Kang JS, Lee JH Increased stability of Bacillus polyfermenticus SCD in low ph, high temperature and high glucose concentration via three layer coating. Korean J Biotechnol Bioeng 19: Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H The influence of coating materials on some properties of alginate beads and survivability of microencapsulated probiotic bacteria. Int Dairy J 14: (200 년 5 월 21 일접수 ; 200 년 7 월 23 일채택 )