제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 골다공증치료및예방용고효율흑삼제품개발 과제의보고서로제출합 니다 년 3 월 02 일 주관연구기관명 : 한국생명공학연구원 주관연구책임자 : 김보연 연 구 원 : 안종석 연 구 원 : 이상구 연 구 원 : 김종평 연 구 원 :

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1 발간등록번호 최종보고서 골다공증치료및예방용고효율흑삼제품개발 (Development of high potency ginseng products for therapeutic prevention of osteoporosis) 한국생명공학연구원 농림수산식품부

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 골다공증치료및예방용고효율흑삼제품개발 과제의보고서로제출합 니다 년 3 월 02 일 주관연구기관명 : 한국생명공학연구원 주관연구책임자 : 김보연 연 구 원 : 안종석 연 구 원 : 이상구 연 구 원 : 김종평 연 구 원 : 배은영 연 구 원 : 김경아 연 구 원 : 권오송 연 구 원 : 하룡 연 구 원 : 김선옥 연 구 원 : 장준필 협동연구기관명 : 배재대학교 협동연구책임자 : 이준원 참여기업 : 천년금산홍삼 참여기업대표 : 신현중

3 요약문 Ⅰ. 제목 골다공증치료및예방용고효율흑삼제품개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 골다공증은연령이많아지게됨에따라자연적으로나타나지만, 특히여성의경우폐경기등호르몬분비의이상에의해서도매우심화됨 남성의경우도여성보다는덜하나노화와함께대부분골다공이생기게되며질병이나면역계통의약화를통하여도젊은층에서도나타나는경우가있어, 골다공증치료제개발에관한연구는국내뿐만아니라전세계적으로도아무리강조해도지나치지않음 흑삼은우리나라에서강점을지니는정통식품이며, 흑삼이가지고있는생리활성물질의활성과섭취시장내흡수율을높이며신체의생리기능을높이고자하는연구가활발하게진행되고있으나흑삼가공식품을이용한생리적기능과생리물질에대한연구는미흡한상태이다 최근고조되고있는흑삼의구성성분들에대한과학적연구를통해흑삼의해외시장진출을이루어다시한번인삼종주국으로서한국의위상을높일필요성이큼 최근에등장하고있는흑삼등가공인삼의구성성분의변화와이들의효능에대해과학, 기술적분석이부족하여세계적으로도가장우수한한국의인삼임에도불구하고세계시장에서밀리고있는형편임. 더구나흑삼도그가공시간과방법등의차이에의해서도생리효능이월등히차이가나고있어, 고기능성인삼의제조공법의확립이필요하고이때생성되는각인삼성분의효과를분석하여이를토대로하여골다공치료용고기능인삼제품의개별인증화및해외수출이절실히필요함 Ⅲ. 연구개발내용및범위 (1) 흑삼의골다공증저해효과생리활성물질의분리및구조분석 -Creatine kinase assay법확립및저해물질탐색 -Cell-based TRAP 염색법과 in vitro TRAP 탐색법수립 -골다공증저해활성의흑삼성분구조분석 - 1 -

4 (2) 파골세포의발현양상과신호전달계연구 -Salubrinal을이용한 ER-stress와골다공증조절관계규명 -Tunicamycin을이용한파골세포성장저해활성규명 -Ginsenoside 화합물의파골세포분화저해활성규명 (3) 마우스골소실모델을이용한흑삼정제물질의특성연구 -난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델의확립 -난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2의효과분석 -난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델에서 salubrinal의효과분석 Ⅳ. 연구개발결과 ( 필요에따라제목을달리할수있음 ) (1) Creatine kinase assay법확립및저해물질탐색 In vitro에서 creatine kinase inhibitor screening system을확립하여흑삼을 fraction 별로효소활성을측정하였음 (2) Cell-based TRAP 염색법과 in vitro TRAP 탐색법수립쥐골수세포인 bone marrow cell을분리하여 M-CSF와 RANKL을처리하고분화시켜 TRAP staining을하여 multinuclear 파골세포 (osteoclast) 를조사하였음 (3) 골다공증저해활성의흑삼성분구조분석흑삼분획물을 TRAP를이용하여골다공증저해활성을분석한결과 13개의활성물질을분리하였고이중에서 3개종이사포닌계열인 Rg2, Rh1, Rd와분자량이일치하였고나머지 10개종은비사포닌계열물질일가능성도있음 (4) Salubrinal 을이용한 ER-stress 와골다공증조절관계규명 ER-stress 를통하여 CHOP 발현을유도하고그결과 NFATc1 과 Mitf 의발현이줄어골다공 증이저해됨을확인 (5) Tunicamycin 을이용한파골세포성장저해활성규명 ER-stress 유도물질인 tunicamycin 은파골세포사멸을유도함으써골다공증치료제로사용 - 2 -

5 될수있는가능성을제시함 (6) Ginsenoside 화합물의파골세포분화저해활성규명 Rg1 과는별도로, 인삼의 Rh2 성분이골다공증을저해함을파골세포분화과정의단백질발현 등을통해규명하였음 (7) 난자를제가한쥐를이용한골다공증동물모델의확립 마우스자궁에서난소를적출하여골다공증유발된 OVX 쥐를제작하는데성공하였음 (8) RANKL 을주입한골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2 의효과분석 골다공증쥐의 BMD( 골밀도 ) 를측정한결과 RANKL 에의해현저히감소된골밀도가 Rh2 에 의해다시매우회복됨을확인하였음 (9) RANKL을주입한골다공증동물모델에서 salubrinal의효과분석골다공증쥐의 BMD( 골밀도 ) 를측정한결과 RANKL에의해현저히감소된골밀도가 salubrinal에의해다시매우회복됨을확인하였음. 또한 CT로뼈의단면을촬영하여 BMD가 salubrinal에의해다시증가됨이확인되었음 Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 ( 필요에따라제목을달리할수있음 ) -국외논문 4편이게재되었고, 1편의논문이 Bone에투고중에있음 -3건의국내특허출원 -특허출원에이어흑삼의개별인증화를받을계획임 -참여기업인금산천년홍삼에서기술이전을받아향후 5년이내에사업화목표 - 3 -

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7 SUMMARY Ⅰ. Title Development of high potency black ginseng products for therapeutic prevention of osteoporosis Ⅱ. Objective and importance of research Osteoporosis is naturally occurring with age, particularly by hormonal imbalance after menopause in women Although less than in women cases, osteoporosis could be easily found in men with age and also in young people when disrupted by diseases and immunological disorders. Thus, R&D for anti-osteoposis therapeutics should be increased all over the world Black ginseng could be a representative medicinal food in Korea but investigation on its biophysical function and components is not progressively going on compared to its enormous value for human health Considering the current status of foreign countries actively investing on the research of ginseng, scientific investigation of the efficacy of ginseng would increase its value, requiring an extensive R&D to get highly innovated ginseng Through the scientific investigation on the components of ginseng, there could be another chance to export black ginseng, setting up the status of Korea as a world-leading country. Due to the lack of scientific investigation on the components and their efficacies of modified ginseng coming out recently, Korea ginseng has been inferior to foreign ones in world market although it is the best in the world. In addition, black ginseng showed different physiological effects depending on the manufacturing systems. Thus, high potency ginseng requires a tactic program for manufacturing, component analysis, leading to the individual authorization and export of ginseng

8 Ⅲ. Scope and content of research (1) Structural identification of black ginseng components having anti-antiosteoporosis activity -Establishment of creatine kinase assay and inhibitor screening -Establishment of cell-based TRAP and in vitro assay systems -Structural identification of anti-osteoporosis black ginseng components (2) Anti-osteoporosis effect of compounds -Effect of salubrinal on osteoporosis in relation with ER-stress -Effect of tunicamycin on osteoclast differentiation -Effect of ginsenoside on osteoclast differentiation (3) Charaterization of black ginseng components using OVX mouse model -Establishment of ovary-depleted mouse model (OVX) for osteoporosis -Analysis of ginsenoside Rh2 in RANKL-induced mouse model -Analysis of salubrinal in -RANKL-induced mouse model Ⅳ. Results (1) Establishment of creatine kinase assay and inhibitor screening -Established in vitro creatine kinase assay system and measured the inhibitory activity of black ginseng extracts fractionated (2) Establishment of cell-based TRAP and in vitro assay systems -Isolated mouse bone marrow cells to be treated with M-CSF and RANKL for their differentiation into multinuclear osteoclasts detectable by TRAP staining (3) Structural identification of anti-osteoporosis black ginseng components -TRAP screening of the black ginseng components identified 13 active compounds, amongst them three were co-incident with Rg2, Rh1, Rd in their molecular weight - 6 -

9 and the rest 10 expected to be different from saponins (4) Effect of salubrinal on osteoporosis in relation with ER-stress -Salubrianl was found to induce ER-stress and the subsequent CHOP expression, leading to the NFATc1 and Mitf expression and intervention of osteoporosis (5) Effect of tunicamycin on osteoclast differentiation -Tunicamycin, as an ER-stress inducer, could be utilized as anti-osteoporosis therapeutics by inducing osteoclast cell death (6) Effect of ginsenoside on osteoclast differentiation -Apart from Rg1, ginsenoside Rg2 inhibited expression of proteins concerned with osteoclast differention, leading to the down-regulation of osteoporosis (7) Establishment of ovary-depleted mouse model (OVX) for osteoporosis -Constructed OVX mouse depleted of ovary (8) Analysis of ginsenoside Rh2 in RANKL-induced mouse model -Rh2 recovered the BMD level in osteoporotic mouse treated with RANKL (9) Analysis of salubrinal in RANKL-induced mouse model -Salubrinal was found to recover the BMD level in osteoporotic mouse treated with RANKL and evidence by micro-ct analysis Ⅴ. Accomplishment and its application Plan -Four SCI(E) publications abroad, 1 under revision in Bone -Three patents -Black ginseng certification -Commercialization in 5 years by the accompanying company - 7 -

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11 CONTENTS Chapter 1. INTRODUCTION Chapter 2. STATE OF DOMESTIC AND FOREIGN ART 1. Foreign state 2. Domestic state Chapter 3. CONTENT AND RESULTS OF RESEARCH 1. Research contents and methods of the 1st year 2. Results of the 1st year 3. Research contents and methods of the 2nd year 4. Results of the 2nd year 5. Research contents and methods of the 3rd year 6. Results of the 3rd year Chapter 4. ACHIEVEMENT OF OBJECTIVE 1. Final goal of research 2. Annual research goal and contents 3. Achievement 4. Contribution to related fields Chapter 5. APPLICATION OF RESULTS Chapter 6. INFORMATION OF FOREIGN SCIENCE Chapter 7. REFERENCES - 9 -

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13 목 차 제 1 장 연구개발과제의개요 제 2 장 국내외기술개발현황 제 1 절해외인삼기술개발현황 제 2 절국내인삼기술개발현황 제 3 장 연구개발수행내용및결과 제1절제1차년도연구수행내용및방법제2절제1차년도연구내용및결과제3절제2차년도연구수행내용및방법제4절제2차년도연구내용및결과제5절제3차년도연구수행내용및방법제6절제3차년도연구내용및결과 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 제1절연구개발의최종목표제2절연차별연구개발의목표및내용제3절연구목표달성도제4절관련분야의기술발전에의기여도 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획 제 6 장 연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장 참고문헌

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15 제 1 장 연구개발과제의개요 1. 골다공증치료효과에대한흑삼연구의필요성 인삼은우리나라를종주국으로하는대표적인의용식물로서, 삼국시대부터 1500여년동안우리나라의손꼽히는수출품이었으며, 고려, 조선시대에이르러는중국과일본등지에가장큰비중의무역상품으로각광을받아왔다. 1990년을정점으로우리나라인삼은과거 30% 에서최근 1% 도않되는해외시장율을나타내고있어인삼종주국이라는말이무색할정도이다. 스위스 ( 진사나 ), 미국 / 캐나다 ( 화기삼 ) 등의국가에서현재인삼세계시장을석권하고있는이유는이들이인삼에대한과학적결과를바탕으로접근하였기때문이며중국 ( 삼칠삼 ) 에서도최근정부의적극적지원하에인삼기초연구를수행하고있어한국에역수출하고있음. 따라서, 인삼의효능을과학적으로입증해야부가가치를높일수있고기존의효능을능가하는인삼의개발이필수적이다. 흑삼은기존의인삼 ( 홍삼 ) 을열처리로변형하여골다공증어제에더욱우수한활성을나타냄을확인되었고, 이흑삼의구성성분들에대한과학적연구를통해흑삼의해외시장진출을이루어다시한번인삼종주국으로서한국의위상을높이고자한다. 인삼의효능은다양한분야에서익히잘알려져있는데, 산후에몸이허약할때, 소아발육부전증, 여성의냉병, 기혈보호, 심신안정, 위장, 가래, 혈액순환, 암, 불면증, 협심증, 만성기관지염, 피부윤택, 식욕부진, 저혈압, 식은땀, 자궁내막염등매우많은종류의질병치료에효과적임인것으로현재치료제로사용을시도중이다. 그러나, 백삼, 홍삼, 그리고최근에등장하고있는흑삼등가공인삼의구성성분의변화와이들의효능에대해과학, 기술적분석이부족하여, 세계적으로도가장우수한한국의인삼임에도불구하고세계시장에서밀리고있는형편이다. 더구나흑삼도그가공시간과방법등의차이에의해서도생리효능이월등히차이가나고있어, 고기능성인삼의제조공법의확립이필요하고이때생성되는각인삼성분의효과를분석하여이를토대로하여고기능인삼제품의개별인증화및해외수출이절실히필요하다. 아직까지도국내외적으로흑삼을이용한연구는전무하여, 본연구를통하여국내농가소득증대의큰기여를할것으롤예상된다

16 2. 골다공증저해제개발의필요성의아무리강조해도지나치지않는다 골다공증은연령이많아지게됨에따라자연적으로나타나지만, 특히여성의경우폐경기등호르몬분비의이상에의해서도매우심화된다. 남성의경우도여성보다는덜하나노화와함께대부분골다공이생기게되며질병이나면역계통의약화를통하여도젊은층에서도나타나는경우가있다. 따라서, 골다공증치료제개발에관한연구는국내뿐만아니라전세계적으로도아무리강조해도지나치지않다. 3. 골소실질환이란 우리몸의골격계를유지하는가장단단한조직인뼈는중요한장기를보호하며, 조혈모세포를저장하여혈액세포들을공급하는신체내면역체계의중요한조직이다. 뼈는신체내에서계속해서 remodeling이이루어지는매우동적인상태를유지하고있는데, 뼈를만드는조골세포 (osteoblast) 와뼈를흡수하는파골세포 (osteoclast) 의균형속에서이루어진다. 그러나이들사이의균형이깨지면골질환을유발하게되는데, 특히파골세포의활성화는뼈를약화시키며이는많은골질환과밀접한관계가있다. 대표적인골소실질환중의하나인골다공증 (osteoporosis) 은폐경및노화에따른성 호르몬의변화로파골세포의활성이높아져정상적인뼈의리모델링과정이깨지게되어 발 병하게되며, 특히폐경기이후여성들에게서빈발한다. 이외에도갑상선기능항진, 부갑상선기능항진, 만성신부전, 장기간부신피질호르몬투여등의다양한요인에의하여발생한다. 이외에도파골세포의활성화에의해유발되는골질환들로는관절염, 치주질환, 골전이암등이있다. 4. 골소실질환보조식품및치료용소재로서흑삼소재의중요성 흑삼은우리나라에서강점을지니는정통식품이며, 흑삼이가지고있는생리활성물질의활 성과섭취시장내흡수율을높이며신체의생리기능을높이고자하는연구가활발하게진행되 고있으나흑삼가공식품을이용한생리적기능과생리물질에대한연구는미흡한상태이다

17 세계각국은이미천연물로부터활성물질을추출, 정제하여천연물신약및천연물유래의약품을개발하는연구를하고있으며, 천연물을바탕으로한신약및건강기능성제품의개발은미래바이오산업으로서중요한위치를차지하고있는실정이다. 그러나아직까지흑삼가공식품을이용한국내외의연구가미흡하며흑삼발효산물유래신약연구에있어서국제시장을선도하고발빠르게선점할필요성이인정된다. 5. 활성타겟으로서골질환의중요성과필요성 파골세포는 myeloid lineage의 hematopoietic precursors로부터분화되어골흡수를담당하는중요한골세포이다. 파골세포의분화는조골세포에서제공되는 macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) 와 tumor necrosis factor (TNF)-related activation-induced cytokine (TRANCE/RANKL) 에의해유도되며이물질은파골세포의분화에있어서필수적이므로신호전달체계에대한연구는매우중요하다고여겨지고있다. TRANCE/RANKL는그수용체인 RANK ( 또는 TRANCE receptor) 에결합하여파골세포의분화에필요한신호를전달하는데, 이에는여러중요한전사인자들이작용함이밝혀졌다. M-CSF와 TRANCE/RANKL의중요성은 in vitro 뿐만이아니라 in vivo 에서도밝혀졌는데, 이들의자연발생적돌연변이또는 knockout 생쥐는파골세포분화가억제됨으로인한심한골화석증을보여주고있다. TRANCE/RANKL는 NF-kB, JNK, ERK, p38 MAPK 등을 activation시킴으로써, 파골세포의분화및그세포의활성화와 survival에도중요한역할을하고있음이밝혀졌다. 파골세포분화에는 M-CSF와 TRANCE/RANKL외에도 PU.1, p50/p52, c-fos, Mitf 등의전사인자들이중요성이자연발생적돌연변이또는 knockout 생쥐들에의해밝혀졌다. 미국의경우이미 7-8백만명이골다공증에이미걸려있고 1,700만명이낮은골량으로골다공증에걸릴위험뿐만그로인한골절이개인적, 사회적인문제점이커지고있다. 골다공증등의파골세포에의한골대사질환에대한연구가전세계적으로활발히진행되고있으며연구에의한치료제개발로인한시장은실로막대하다고여겨진다. 본연구에서는파골세포 분화에있어서필수적인물질인 TRANCE/RANKL 에의해유도되는 파골세포의분화를억제 하는천연물유래저해재의개발에있다. 이러한활성타겟을중심으로하는연구를함으로서 파골세포에의한골대사질환치료제의개발에일조를하고자한다. 본연구주제는전세계적으

18 로도지금까지전혀연구되지않았던흑삼발효중에생기는새로운천연물소재를발굴해내 는연구로본연구의성공적인수행시파생되는산업적, 학문적인가치가매우높으리라사 료된다

19 제 2 장 국내외기술개발현황 제 1 절해외인삼기술개발현황 파골세포의활성화에따른골다공증같은골질환의치료제를개발하기위하여파골세포의분화를억제시키거나이들의활성도를떨어뜨려주는방법들이많이연구보고되고있다. 현재 TNF-a에대한항체를이용한방법, TRANCE/RANKL의작용을조절하는 RANK-Fc나 OPG 같은물질을이용한방법, 호르몬제제및활성화를억제하는 bisphosphonate 계열의물질들에대한많은연구와치료법들이개발또는실용화를위한연구들이진행중이다. 그러나아직도이들에의한치료법에는상당한문제점들이있어서보다효과적인치료법을개발하기위하여서는다양한각도에서의연구들을필요로하고있다. 에스트로젠은단핵세포로부터 IL-1의생성과조골세포로부터 IL-6의생성을억제하여파골세포의활성을억제하는것으로알려져있으나 10년이상치료군에서유방암과자궁내막암의위험이있는문제점이발견되었다. bisphosphonate 계열의물질들은흡수율이 1-5% 로낮으며, 소화기계부작용을나타내는부작용이발견되고있다. 이와같이현재개발, 판매되고있는골질환치료약물의경우정도의차이는있으나대부분부작용을갖고있다. 동양은역사적으로한약재를기반으로한전통치료기법이서양보다앞서있으므로최근이러한기술을이용하여천연물을기반으로한의약품개발에장점을갖고있다. 현재골다공증의세계시장규모는 2012년에는 370억불에이를것으로전망하고있다 ( 표 1). 그외에관절염, 치주질환, 골전이암등에관련된치료제시장을합친다면골질환관련세계시장규모는갈수록그규모가커지고있는상황이라고볼수있다. 제 2 절국내인삼기술개발현황 1. 국내인삼개발의연구현황 국내의소수의과대학과치과대학에서는파골세포의분화과정에대한연구, 골형성과정연 구, 그리고프로테오믹스활용기술을도입하고있는실정이다. 지난몇해동안동아제약, 유

20 < 표 1> 골다공증관련제품세계시장규모 ( 단위 : 억달러 ) 분류 1999 년 2000 년 2003 년 2006 년 2012 년 골다공증치료제 [ 근거 : 평균성장율을골다공증 15% 로계산하여예측된결과임. 한국산업기술재단, Technology Roadmap 생리활성정밀화학 (2002 년 )]

21 한양행, 동화약품등국내제약업체와한국한의학연구원등이새로운골다공증치료제개발을해오고있다. 한국화학연구원, ( 주 ) 오스코텍의연구진들이합성 chemical library로부터골다공증유효후보물질검색을진행하고있으나아직은괄목할만한화합물을제시하지않고있다. 특히국내의경우, 천연물의약품위주로신약을개발하고있으며, 참여기업들이다수인만큼머지않아천연물의약품시장이형성될것으로전망된다. 그러나국내에서흑삼을이용한골질환개선식품과치료제의연구는전혀이루어지지않고있다. 1998년인삼 당귀등순수생약재를원료로바르는조루증치료제 SS크림 을개발한연세대의대영동세브란스병원비뇨기과팀은홍삼이남성의성기능개선에효과적이라는임상결과를발표했음몇년전에한벤처기업에서 헤븐리진생 이라는상품명으로해외시장을목표로출시하였는데, 이는기존의인삼성분보다 4배이상의고농도의성분으로상품화된것임인삼약리효능은주로인삼사포닌에관한것으로중추신경계에대한작용, 뇌기능에대한작용, 항발암과항암작용, 면역기능조절작용, 항당뇨작용, 간기능강화작용, 심혈관장애개선작용, 혈압조절작용, 갱년기장애개선작용, 항스트레스와항피로작용, 항산화작용등이보고되었음흰쥐의혈청콜레스테롤및중성지방수준을감소와인삼의분획물들의간장내지방축적감소효과가보고되었음. 그러나인삼은부위별, 년근별및원료삼류에따라사포닌의함량이나조성이상이한것으로밝혀졌고, 추출용매의에탄올농도에따라서도엑스수율과사포닌함량도상이한것으로일부보고된바있음인삼의주요성분인사포닌은진세노사이드 (ginsenoside) 라부르는데다른식물에서발견되는사포닌과다른특이한구조뿐아니라그효능도차이가있음. 최근분리분석기술의발달에따라지금까지 30여종의인삼사포닌의화학구조가밝혀졌는데, 인삼사포닌은화학구조의특성에따라파낙사디올 (PD계), 파낙사트리올 (PT계), 올레안계사포닌으로구분하는데현재까지각각 19종, 10종, 1종의화합물이분리정제되었음. 식물계에존재하는대부분의사포닌은올레안계이고인삼사포닌은타식물계에거의존재하지않는 dammarane 계열의 triterpenoid 사포닌으로알려져있음. 프로토파낙사디올 (PD계) 는 Rb 1, Rb 2, Rc, Rd, Rg 3, Rh 2 로구성되어있는데 Ginsenosides 의주요약리작용은중추신계를비롯하여내분비계, 면역계, 대사계등에영향을미쳐신체기

22 능조절에다양한효과를미치는것으로밝혀졌음. 즉, Ginsenoside-Rb 1 는진통, cjlaus, 정신안정등중추신경계를억제하며 Ginsenoside-Rb 2 는평형장애개선작용, 콜레스테롤저하작용, DNA RNA 합성촉진작용, 항산화활성물질생성촉진작용, 부신피질호르몬분비촉진작용, 암독소홀몬에대한길항작용, 종양혈관신생억제작용, Plasmin 활성화에작용하는것으로알려져있음. Ginsenoside-Rc는중추억제작용을비롯하여, RNA 합성억제작용, 혈청단백합성촉진작용, 부신피질홀몬분비촉진작용, Plasmin 활성화작용을함이밝혀졌고, Ginsenoside-Rd는부신피질홀몬분비촉진, Ginsenoside-Rg 3 은혈소판응집억제작용, 히스타민유리및카테콜아민분비억제작용, 암의전이억제작용과 Ginsenoside-Rh 2 는암세포증식억제작용, 종양증식억제작용, 암세포의재분화유도작용등이밝혀져왔음. 이들성분들과가공인삼이우울증등에대한광범위한연구결과는보고된바가거의없음 2. 국내인삼산업의현황및문제점국내홍삼소비는늘어나고있지만 1990년을정점으로국제인삼시장에서시장점유율이뚜렷한하향세를보이고있음 ( 국내인삼의홍콩시장점유율은 1990년금액기준으로 22.9% 이었으나 2002년에는 9% 이하로급격히줄어들었음 ). 경쟁국에비해저렴한비용으로좋은원료삼을생산하고, 해외소비자들이좋아하는다양한신제품을개발하거나세계시장을향한마케팅이미진함. 인삼수출이중국과일본에대부분편중되어있으며, 대만, 일부동남아시아, 미국, 일부유럽국가에머무르고있음. 세계시장의흐름에부응하는다양한제품개발소홀파마톤사의 파마톤 과 진사나 와같이인삼소비의큰흐름이효능에기초한의약품이나건강기능성식품형태로전환되었지만 ( 우리나라 2002년총인삼수출액인 5,600만불의 2-3배정도인년간 1-2억불수출하고있음 ) 이러한의약품형태의고부가가치상품을개발못함인삼종주국으로서제조기술이우수하나과학적연구에의한뒷받침이부족해식품으로서의해외시장공략에실패하고있음인삼재배지의염류농도증가로각종생리장애가발생하자미국과오스트레일리아등지로떠나는인삼농가도늘어나고있음수삼, 백삼, 태극삼, 홍삼등인삼류에주로의존하고있고, 인삼제품으로서엑기스, 쵸코릿, 비타민, 인삼차등 100여가지제품출시되고있음

23 제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절 1 차년도연구수행내용및방법 연구범위 연구수행방법 ( 이론적 실험적접근방법 ) 구체적인내용 흑삼활성물질의정제및구조분석 흑삼활성물질의정제물의활성측정 파골세포의분화를저해하는생리활성물질의탐색, 파골세포의 TRAP 활성측정 흑삼활성물질의순수분리정제 순수정제물질의특성조사와구조분석 문헌조사및예비실험 MTT assay 에의한파골세포의증식측정 희석한농도를가지는물질분획을이용한저해활성재검증 TRAP assay -Celstaining -Invitroasay Creatin kinaseassay 확립및저해활성흑삼분획탐색 :Boneresorption 저해측정 흑삼의부탄올층에서활성확인 메탄올추출 BG-3-13 활성탁월 LC mass,hplc, NMR 등이용한구조분석 BG-3-13-H2 는 ginsenosiderg1 과구조매우유사하나이중결합하나가추가된신규물질로추정됨 BG-3-13-H2 는비만 / 당뇨및항암타겟인 AMPK 인산화유도활성부위와겹쳐골다공증저해가이들활성과관계있을것으로예상됨 인삼, 흑삼, 장뇌삼의비교분석확인 :3 종모두활성있으나흑삼, 장뇌삼이더우수한것으로보임 TRAP assay 를통해반복실험및확인각분획에포함된물질이실제로파골세포에독성이없고분화만을저해하는지를검증하기위해 MTT assay 를수행 2차년도이후에실시할 난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델의확립 을 1차년도에이미성공함 TRAP 결과를 Creatine kinase assay 를통해 2차확인 :Creatine kinase assay 는 bone resorption 과관계가있으나반드시파골세포형성과는관계가있다고보기어려움을본연구를통해확인됨 Salubrinal 을이용하여 ER-stress 와골다공증과의관계규명 : 세계최초규명

24 제 2 절 1 차년도연구결과 1. Enzyme based osteoclast inhibitor screening (creatine kinase assay) Osteoclast( 파골세포 ) 는골다공증이나 cancer cell metastasis 의주요원인으로잘알려져있다. Osteoclast를억제하는방법으로일반적으로 osteoclast 로분화되거나이에의한뼈세포침식을막는두가지방법이사용된다. 또한최근 RhoA GTPase 의 vacuolar ATPase 활성을조절하고 actin-ring을형성함에있어서 creatine kinase 가중요한역할을한다고알려져있고실제로 creatine kinase inhibitor 가중요한 osteoclast inhibitor 가될것임을제시했다. 이를바탕으로본연구에서는 in vitro에서 creatine kinase inhibitor screening system을확립했고흑삼을 fraction 별로효소활성을측정하였다 ( 그림 1). 이결과를바탕으로 TRAP assay를통한결과와비교하여상호일치성이어느정도있는지검토하고있다. 2. Cell-based TRAP staining and in vitro TRAP assay 쥐골수세포인 bone marrow cell 을분리하여 M-CSF 와 RANKL 을처리하고분화시켜 TRAP staining 을하여 multinuclear 파골세포 (osteoclast) 를조사하였다 ( 그림 2). 그림에 서처럼 ( 화살표 ) 파골세포로분화할때거대핵세포가형성됨을확인할수있었다. 3. 골다공증저해활성의흑삼성분구조분석흑삼농축액을핵산층, 부탄올층, 에틸아세테이트층으로분리하여 5ug/ml의농도로 DMSO 로희석하여 TRAP 활성을측정하였다 ( 그림 3). 그결과부탄올층에서 TRAP 활성저해가나타나므로메탄올로분획 (BG3) 을나누고정제를시도하였다. < 표1> 에서처럼 TRAP staining과동시에 TRAP assay를수행하여흑삼과다른약물들의효과를비교하였다. 흑삼을시기별로구입하여유기용매로추출하여골다공증저해도를측정하였다. 또한비교로 amentoflavone과심장병에효과적이라고알려진 resveratrol, ER-stress 조절물질인 honokiol, magnolol을처리하여그효과를비교하여보았다 ( 표 1)

25 percentage Con DMSO CK BG-3-1 BG-3-2 BG-3-3 BG-3-4 BG-3-5 BG-3-6 BG-3-7 BG-3-8 BG-3-13 BG-3-17 BG-3-18 BG-3- BG < 그림 1> 흑삼성분의 Creatine kinase assay 결과

26 Negative control positive < 그림 2> 쥐골수세포의 TRAP staining

27 < 그림 3> 흑삼분획물의골다공증저해효과 (TRAP assay)

28 < 표 1> 흑삼분획물과천연약물시료의골다공증저해활성비교 (TRAP assay) 이 름 Fraction(5ug/ml) 1 저해도 (%) 흑삼 #3 EtOAc 65 Hexane 76 EtOAc+DW 68 Amentoflavone 55 Resveratrol 25 Honokiol 0 Magnolol

29 표에서보는보와같이흑삼은각층에서고루골다공증저해효과를보이고있으며 amentoflavone 도어느정도좋은효과를나타내고있다. 반면에 resveratrol 이나 honokiol, magnolol 에서는거의효과 가없는것으로보이고있다. 흑삼유래분획으로부터 (BG3) 얻어진각물질이가지는 TRAP 활성을측정하였는데, BG3-12, 13, 22 의분획에서파골세포의 TRAP 활성을저해하는효과를보였다 ( 그림 4). 각분획에포함된물질이실제로파골세포에독성이없고분화만을저해하는지를검증하기위해 MTT assay를수행하였다 ( 그림 5). BG3-12, 13은독성이나타나지않았으나, 22의분획물은독성효과를나타냈으므로 12,13으로부터파골세포의분화를저해하는물질을탐색하기위하여아래와같이 HPLC를사용하고 TLC로정제하였다. 현재세포독성을보이지않는흑삼 BG-3 물질에대한이차검증실시흑삼으로부터활성물질을분리하기위해흑삼농축액을따뜻한물에용해시켜핵산, 에틸아세테이트, 부탄올로추출하였다. 추출한부탄올층을감압농축한후부탄올추출물 9.7g 을 RP18 column chromatography 를실시하여활성 fraction을얻었다. 이부분들을 TLC로전개하여 ginsenoside Rg1 과 Rg3의대조군과비교하였고 ( 그림 6, 7), 이는 Rg1과유사물질로추정되었다. 따라서활성 fraction F-13 으로부터 gradient aqueous acetonitrile 이동상으로 ODS-AM HPLC column을실시하여순수한활성물질 1종을분리하고기기분석을수행하였는데, 기기분석결과, BG-3는 ESI-MS결과, 분자량은 803 이었으며, 기존에존재하는 Ginsenoside Rg1의새로운유도체로확인되었다 ( 그림 8, 10, 11). 또한 fraction F-12도 Osteoclast differentiation 저해하는활성이있음을확인하여계속구조분석중에있다 ( 그림 7). 4. AMPK 인산화증진효과를나타내는성분구조분석흑삼의성분중골다공증저해활성을나타내는 F-13 중에서 BG-3-13은 AMPK 인산화활성도가지고있음이확인되어비슷한혹은동일물질로추정되고있다. 흑삼을추출하여 HPLC와 LC-Mass를거쳐그구성성분과구조를최종확인하였다 ( 그림 10, 11). BG-3-13 중에서도골다공증을저해하는한종류의물질은지방산인것으로나타나더이상진행을시키지않았으나다른한종류는비사포닌계열의물질로추정되고있는데, 일반적으로인삼에서는사포닌이생리활성을나타낸다고알려져있기때문에이새로운성분의구조분석을현재진행하고있으며따라서이의활성및구조가매우기대되고있다. 흑삼추출물의 main peak(bg-3-13) 을 LC-Mass로분석한결과 Rg1과분자량이비슷한것으로나타나조사를한결과흑삼의 main 지표물질은분자량이 803의물질로서 Rg1에서이중결합하나가떨어져나간유도체인것으로분석되고있으며이는아직까지학계에보고되지않은신규물질로추정되고있다

30 < 그림 4> 흑삼분획물의골다공증저해활성분석 (TRAP assay)

31 < 그림 5> 흑삼분획물의세포독성분석 (MTT assay)

32 BuOH extract of BG ( 9.7 g ) VLC (C18,4*12cm, 230g) MeOH/ (H 2 O stepwise gradient ) 100% H 2 O 10% MeOH 20%MeOH 40%MeOH 50%MeOH 60%MeOH 80%MeOH 100%MeOH Osteoclast inhibition AMPK BG-3-12 (60 mg), BG-3-13 (40 mg) Rg1 Rg3 TLC < 그림 6> 골다공저해활성흑삼구성성분의구조분석과정

33 BG-3-13 (40 mg) BG-3-12 (60 mg) HPLC, Capcell C18, 1.8ml/min, 203 nm, 60 20% ~ 24% CH 3 CN/ H 2 O 10% ~ 35% CH 3 CN/ H 2 O H1 H2 H3 H4 H1 H2 H3 < 그림 7> BG-3-12 와 BG-3-13 의구조분석

34 Relative Abundance Relative Absorbance Time (min) Relative Abundance m/z < 그림 8> LC Mass 에의한흑삼골다공증저해활성성분분석

35 pampk - AICAR :BG :BG :BG :BG < 그림 9> BG-3-13 성분들의 AMPK 인산화유도활성

36 f:\kribb\...\ginsenoside rg3_15-60% ?? 11:29:21 RT: SM: 5G Rb Rc Rg3 흑삼 Re Rg Time (min) NL: 1.24E8 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS BG-3-13-H2_15-60% NL: 1.21E8 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS ginsenoside re_15-60% NL: 4.45E7 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS ginsenoside rg1_15-60% NL: 1.21E8 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS ginsenoside rb1_15-60% NL: 1.25E8 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS ginsenoside rc_15-60% NL: 7.22E7 Base Peak F: - c ESI sid=10.00 Full ms [ ] MS ginsenoside rg3_15-60% Relative Abundance m/z NL: 3.55E7 BG-3-13-H2_15-60%# RT: AV: 20 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] NL: 8.17E7 ginsenoside re_15-60%# RT: AV: 10 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] NL: 2.76E7 ginsenoside rg1_15-60%# RT: AV: 10 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] NL: 9.88E7 ginsenoside rb1_15-60%#356 RT: 9.12 AV: 1 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] NL: 1.58E8 ginsenoside rc_15-60%#358 RT: 9.33 AV: 1 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] NL: 3.68E6 ginsenoside rg3_15-60%#383 RT: 9.93 AV: 1 F: - c ESI sid=10.00 Ful ms [ ] < 그림 10> 흑삼구성성분의골다공증저해및 AMPK 인산화유도활성 분획의 LC-Mass 결과

37 OH OH OH OH O O OH O OH OH OH O OH OH HO HO O O OH O O OH HO OH HO OH OH OH Ginsenoside Rg1 (MW 801) BG-3-13-H2 (MW 803) < 그림 11> AMPK 인산화유도및골다공증저해효과를가지는흑삼 BG-3-13 구성성분의분자구조및 Rg1 의구조비교

38 5. Salubrinal을이용한 ER-stress와골다공증조절관계규명 UPR protein CHOP negatively regulates osteoclastogenesis 소포체스트레스 (Endoplasmic reticulum stress, ER stress)-related unfolded protein response(upr) 는많은질병과 cellular signal 에관여하는것으로알려져있다. 하지만 osteoclast 의형성과작용에있어서의 UPR protein 들의역할은거의알려져있지않고있다. 본연구에서는대표적인 UPR protein 인 CHOP를초점에두고이 protein 이 osteoclast 의형성에주는역할에대해서중점적으로연구를수행한결과 CHOP protein 이 transcribtion factor 들의조절을통해 osteoclast 형성을저애한다는결론을얻었고아울러 eif2 alpha-chop signal 의 inducer 인 salubrinal 이 osteoclast 의형성을억제함을규명함으로써 CHOP이 osteoclast inhibitor 치료제개발의새로운타겟임을최초로입증하였다. ( 그림 12) 에서와같이 293T cell에서 oscar promoter assay를통해서 osteoclast 의형성에있어서의주요한전사인자인 NFATc1 과 Mitf 의활성이 chop를발현시킴으로인해서줄어든다는사실을확인했다. 또한 ( 그림 13) 에서는실제로 eif2 alpha-chop inducer 인 salubrinal을처리했을때 mrna levlel에서 CHOP 발현이증가되였고 multi-nuclei osteoclast 가농도별로줄어든다는것을확인하였다. 이는 ER stress 가 osteoclast 형성과연관된다는사실을첨으로밝혀냄과동시에 CHOP protein 이 osteoclast 저해제를찾음에있어서새로운타겟이될수있다는것을밝혀냄으로써의중요한의미가있다. 6. 난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델의확립각 4마리의쥐를사용하여난자를제거하기전에몸무게를측정하고마취제는 ketamine mg/kg/ xylazine 5-10mg/kg 을 IP로쥐에주사하였다. 마취된쥐의정중선을절개하여, 복부지방밑에위치한자궁에서 Y자로나누어진수란관을따라그끝에위치한분홍색의난소를적출제거하였다. 6주후에쥐를 sacrifice시켜난자제거를확인하였다. 아래그림과같이수란관의무게와크기가난자를제거한 OVX 쥐 (negative control) 에서현저하게낮아짐을확인할수있었다 ( 그림 14). 쥐의뒷다리종아리부위를절개하고살을제거한후에난자를제거한쥐와 (OVX) Sham (control) 쥐의 trabecular bone에대하여 microct를이용하여측정하였다. BMD 측정프로

39 그램에서뼈의 top과 bottom을기준으로잡고그범위내에존재하는뼈의범위와 trabecular bone의두께와 bone사이의공간넓이그리고개수를측정하였다. MicroCT 촬영결과아래의그림과같이 coronal 부위의 BV (bone volume), 두께, 개수가난자를제거한쥐에서현저하게감소했다 ( 그림 15). 따라서, 골다공증모델의확립하고 TRAP 저해활성을나타내는흑삼순수정제물질의동물실험에대한예비실험을 2차년도에서수행할계획이다

40 oscar-luc oscar-luc NFATc Chop(ng) Mitf Chop(ng) < 그림 12> CHOP 에의한 NFAT 와 MTF 발현의저해활성

41 MCSF only MCSF+RANKL Sal 3uM Sal 6uM Sal 12.5uM sal MCSF RANKL CaK TRAP 160 OSCAR 140 TRAP positive osteoclast MCSF RANKL salubrinal - - 3mM 6mM 12mM NFAT GRP78 chop ATF4 GAPDH < 그림 13> Salubrinal 을이용한 ER-stress 와골다공증조절관계규명

42 Sham OVX < 그림 14> OVX 마우스와정상마우스에서의난자크기비교

43 Top Bottom Sham OVX Sham OVX BV(bone volume)/tv 16.52% 9.63 % Tb.Th (trabecular thickness) 45.6um 32.6 um Tb.Sp (trabecular separation) 242.7um 332.4um Tb. N (trabecular number) 3.6 um 2.5um < 그림 15> OVX 마우스와정상마우스에서의 trabecular bone 의비교

44 제 3 절 2 차년도연구수행내용및방법 연구범위 연구수행방법 ( 이론적 실험적접근방법 ) ER-stress 유발하는 Tunicamycin 을 이용한파골세포성장 저해활성연구 구체적인내용 Tunicamycin 은파골세포의성장을저해하는것으로보임 단백질전사조절인자인 EIF2a가 ER-stress에의한골다공증에주요인임이확인됨 TRAP assay를통해반복실험및확인 마우스를이용하여 1차확인, 현재 2차반복중 활성물질의골다공증 Ginsenoside 화합물의저해기전연구파골세포와조골세포분화영향연구 Salubrinal의 ER-stress 관련파골세포분화저해기전규명 9 종류의 Ginsenoside 화합물이파골세포의분화에미치는영향을 TRAP assay로조사 ginsenoside Rh2 는파골세포의독성없이분화만저해함을확인 ER-stress의 key factor인 EIF2a 조절물질인 salubrinal이파골세포분화를억제함을규명함 파골세포의발현 양상과신호전달계 연구 골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2 의효과연구 3차년도이후에실시할골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2 의효과를 2차년도에시작함 난소를제거한동물실험에서난소관이ginsenoside Rh2 를처리한동물에서정상수준으로돌아옴을확인, 차후실험에서긍정적인연구결과를확인함 제 4 절 2 차년도연구결과 1. Tunicamycin을이용한파골세포성장저해활성규명소포체스트레스 (Endoplasmic reticulum stress, ER stress)-related unfolded protein response(upr) 는 ER에 unfolded protein이과량축적되었을때 ER chaperone의발현증

45 가, 새로운단백질의생성억제, misfolded protein의제거등을통한 protein quality control 을담당하며많은질병과 cellular signal 에관여하는것으로알려져있다. 그러나 UPR이 ER stress에대응하는세포의항상성조절에실패하였을경우에는세포사멸이유도된다. HEK293 cell에서 tunicamycin 등을처리하여지속적인 ER stress를유발시킨후세종류 UPR 센서의활성지속시간을관찰한결과, IRE1의활성은 8시간내에감소하고 ATF6의활성은 20시간정도만지속된반면, PERK의활성은 30시간이후에도지속되는차이를나타내었다. 이는지속적인 ER stress 상황에서 IRE1 활성의감소가세포의사멸과관련이있음을보여주고있다. (IRE1 Signaling Affects Cell Fate During the Unfolded Protein Response, Science, 9, November 2007: ) 하지만 osteoclast의형성과작용에있어서의 Tunicamycin과 UPR protein 들의역할은거의알려져있지않고있다. 본연구에서는 Tunicamycin을파골세포에처리하여파골세포의사멸을유도한다는결론을얻었다. 그림 1에서와같이파골세포분화저해활성을측정하였다. 그결과 Tunicamycin 농도에따라 TRAP 활성이감소함을확인하였으며, 이결과는파골세포의사멸에따른성장저해임을 MTT assay에의해확인하였다. 골다공증에서파골세포의분화저해를통한치료방법뿐만아니라세포사멸을유도하여치료하는방법도유효함으로차후에 Tunicamycin에의한파골세포사멸에미치는분자신호전달체계연구와동물실험을통해새로운치료제로서의가능성을밝혀냄으로써중요한의미가있다. 2. Ginsenoside 화합물의파골세포분화저해활성규명 Ginsenoside 화합물은인삼의생리학적혹은약리학적유효성분으로널리알려져있으며, Ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg2, Rg3, F1 등이있다. 현재 Ginsenoside 화합물은중추신경억제작용, 단백질합성촉진작용, 부신피질호르몬분비촉진작용, 형소판응집억제작용, 면역증강작용등의다양한효능을발휘하는것으로얼려져있다. 흑삼또는삼에존재하는 Ginsenoside 화합물이가지는골다공증억제제의효능을검사하기위하여상기화합물에대한 TRAP 저해활성을측정하고 MTT assay를수행하였다

46 ( 그림 1) Tunicamycin 에의한파골세포분화저해와세포사멸

47 ( 표1) ginsenoside 화합물 1 ginsenoside F1 2 ginsenoside Rg1 3 ginsenoside Rh2 4 ginsenoside Rd 5 ginsenoside Rh1 6 ginsenoside Rg2 7 ginsenoside Rb2 8 ginsenoside Rb3 9 ginsenoside Rh2-45 -

48 ( 그림 2) Ginsenoside 화합물의파골세포분화저해활성과세포성장

49 ( 그림 3) ginsenoside Rh2 의파골세포분화에있어서 RNA 발현영향조사

50 ( 그림 2) 와같이모든 ginsenoside 화합물은파골세포에서세포사멸을나타내지않았으며, ginsenoside Rh2 10 ug/ml에서약 50% 의파골세포분화저해활성을보여주고있다. 골세포는 M-CSF와 RANKL 두가지중요한사이토카인에의해조혈모세포에서파골세포로분화된다. 조골세포에서분비되는 RANKL은 Mitf, PU.1 그리고 NFATc1과같은전사인자들의발현과활성을유도하여파골세포의분화를촉진시킨다고알려져있다. 파골세포분화의중요전사인자인 NFATc1과 OSCAR의발현에작용하는신호전달계조사를위해 RT-PCR 방법을이용하여조사하였다. RANKL은 RANK에결함하고 NFATc1의발현을증가시키고뒤이어 TRAP와 OSCAR의발현이뒤따른다. ginsenoside Rh2 은 RANKL만을처리한파골세포와비교하였을때 NFATc1, OSCAR, TRAP 그리고 RANK의발현을감소시킨다. ( 그림3) 조골세포가분비하는 TRANCE에의해파골세포의분화가촉진된다고보고된바있다. 생리활성물질이 TRANCE의파골세포분화촉진작용을저해하는중요도를측정할수있는하나의지표를제시할수있다. 또한, 실제로사람의인체내에서는조골세포와파골세포의균형있는분화과정이중요하므로상기와같은최적합 in vitro 모델은천연물유래저해제의항골질환에적합한모델이다. 추후에동물모델을이용한연구에있어서도적합한동물모델을선택하는데중요한지표를제공한다. 따라서, ginsenoside Rh2 가조골세포의분화에미치는영향을조사하였다. 그림 4에서와같이 ginsenoside Rh2 는조골세포의분화에영향을주지않았고파골세포의분화에만영향을준다. 파골세포의분화에영향을주는골다공증치료제의가능성을확인하였다. 3. 난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2 의효과이미 1차년도에서동물모델을확립하였고, 2차년도에서는동물모델에서 ginsenoside Rh2 의골다공증저해효과를검증하기시작하였고 3차년도에는마무리할계획이다. 각 6마리의쥐를사용하여난자를제거하기전에몸무게를측정하고마취제는 ketamine mg/kg/ xylazine 5-10mg/kg 을 IP로쥐에주사하였다. 마취된쥐의정중선을절개하여, 복부지방밑에위치한자궁에서 Y자로나누어진수란관을따라그끝에위치한분홍색의난소를적출제거하였다. 6주후에쥐를 sacrifice시켜난자제거를확인하였다

51 ( 그림 4) 조골세포분화에서 ginsenoside Rh2 의효과

52 ( 그림 5) 난소절제쥐, sham 쥐그리고 ginsenoside Rh2 투입한쥐의수란관의무게

53 < 그림5> 와같이수란관의무게와크기가난자를제거한 OVX 쥐 (negative control) 에서현저하게낮아짐을확인할수있었다. 또한 ginsenoside Rh2 시료를주입한골다공증모델쥐의수란관의쥐에서정상쥐 (Sham) 의수란관과비슷한크기로재생되었음을확인하였다. 쥐의뒷다리종아리부위를절개하고살을제거한후에난자를제거한쥐와 (OVX) Sham 쥐의 trabecular bone에대하여 microct를이용하여 BV (bone volume), 두께, 개수를측정할계획이다. 4. salubrinal을이용한파골세포성장저해활성규명 Salubrinal 은 ER stress 억제제로서 eif2 의탈인산화를막아줌으로써 protein translation 을조절해주는작용으로그메카니즘이잘알려져있다. ER stress 는노화나여러가지대사증후군에많이관여되여있고새로운치료타겟으로많이부상하고있다. 우리는이러한 signal 에관여하는 salubrinal 이골대사증에관여를하는지알아보기위해상기화합물에대한 TRAP staining 을통해서 osteoclast formation을 counting 했고 MTT assay 를통해서세포독성을확인하였다. < 그림6> 에서보여주듯이 5μM 에서부터 osteoclast 분화를효율적으로억제하는것을발견하였다. 또한세포독성을체크해본결과 20μM까지농도를높였어도세포독성은보여지지않았다. 이는 salubrinal 이세포독성이아닌 specific 하게 osteoclast 의분화를억제한다는것을증명해준다. 이러한 salubrinal 이과연어떤메카니즘으로작용을하는지알아보기위해 RANKL signal 에대한연구를진행하였다. RANKL (Receptor Activator for Nuclear Factor κ B Ligand), 또는 TNF-related activation-induced cytokine (TRANCE) 로도알려져있는데 TNF- superfamily 에속한다. 이 signal 이자극을받으면 MAPK signal 을포함한다양한 cellular signal 을통해전사인자인 c-fos의상향조절을유도하고이는그하위전사조절인자인 NFATc1 의발현을유도한다. NFATc1 은골대사관련한가장중요한조절인자로서 Ostoeclast 분화와활성에관여한여러가지 factor (OSCAR, TRAP... 등 ) 의발현을조절함으로써골대사증후군치료제의중요한타겟으로거론되고있다. 우리는우선 salubrinal 이어떤경로를차단하는지알아보기위해 PCR 을통해서관련유전자의발현정도를측정하였다. < 그림7> 에서보여주듯이 osteoclastogensis 의주요인자인 OSCAR 와 TRAP은 RANKL 처리후 time-dependent 하게증가하는양상을보여줬고이는 salubrinal 의처리로인해서 significant 하게감소되는양상을확인하였다

54 A RANKL salubrinal(μm) B C < 그림 6> Salubrinal 에의한파골세포분화저해및세포독성에의영향

55 < 그림 7> Salubrianl 에의한 OSCAR 와 TRAP 발현

56 < 그림 8> Salubrinal 에의한 c- 랜와 NFATc1 발현

57 < 그림 9> Salubrinal 에의한단백질발현저해활성

58 OSCAR 와 TRAP 은모두 Osteoclast 분화에중요한역할을하는단백질로서이들모두 transcription level에서 NFATc1 의조절을받는다. 그러므로 salubrinal이이러한 OSCAR, TRAP의상위조절인자인 NFATc1 과 c-fos 의발현을관측하였다. < 그림8> 에서보여주듯이 transcription level 에서의 NFATc1 유전자의발현은 RANKL 에의해서증가되고역시 salubrinal 에의해서감소되는것을확인했지만 RANKL stimulation 에의해서증가된 c-fos 유전자는 salubrinal에의해서영향을받지않는다는것을확인하였다. 다음 protein level에서위의현상을확인하기위해 western blotting analysis 를수행하였다. 결과에서보여주듯이 TRAP, NFATc1 의 expression level 은 salubrinal 에의해서 time-dependent 하게감쇠되지만그상위조절인자인 c-fos 은큰영향을받지않는다는것을확인하였다 ( 그림9). 이는 salubrinal 이 RANKL branch 에서 c-fos 의 down-stream 에작용한다는결론을말해준다. Salubrinal 은 eif2 를 phosphorylation 시키는메카니즘으로잘알려져있다. 또한 eif2 가 phosphorylation 이되면 global 한 protein translation 에관여한다. 아울러 salubrinal 이 eif2 를통한 NFATc1 의 protein translation 에영향을주는게아닌지하는가설을염두에두고추가실험진행중이다. 뿐만아니라 c-fos 는발현이된후 phosphorylation 을거쳐서 c-jun 이나다른 partner 랑 complex 를형성해야지만활성을잘발휘한다. 또한 NFATc1 도 phosphorylation 을통해서 nucleus translocation 여부가결정이된다. protein phosphatase inhibitor 로서 salubrinal 이이러한 modification 을통해서위와같은패턴을유도할가능성도배제하지못한다. Salubrinal 의확실한 mechanism 을밝혀내기위한실험은계속진행중이다

59 제 5 절 3 차년도연구수행내용및방법 연구범위활성물질구조최종및파골세포분화억제규명 연구수행방법 ( 이론적 실험적접근방법 ) 흑삼추출물에서 분리된 13 종의물질에 대해구조분석 GinsenosideRh2 의 파골세포분화억제 기전규명 RANKL 을주입한쥐 동물모델에서 salubrinal 의효과 분석 구체적인내용 3종의사포닌계열물질이각각 Rg2,Gh1, Rd 로추정되고있으나나머지물질들은지금까지의사포닌계열과는다른구조를가질가능성이있음 약 1개월정도내에모든구조분석이완료될것으로예상됨 Rh2 가 TRAP assay 에서 RANKL 에의한파골세포분화를저해하였음 ginsenosiderh2 는파골세포의독성없이분화만저해함을확인 Rh2 는골다공증의마커인 TRAP,OSCAR, NFATc1,c-fos 의발현을감소시켰음 Rh2 는 MAPK 단백질중에서 ERK 인산화를선택적으로억제하였고,NF-kB 활성화경로도영향을주어 ERK-NF-kB 체계에저해활성을보이고있음 RANKL 처리에의해골밀도가낮아지나 salubrinal 은이를억제하여골밀도가다시증가하였음 Salubrinal 의연구결과를 J.Immunology 에투고준비중 파골세포의발현 양상과신호전달계 연구 골다공증동물모델에서 ginsenosiderh2 의효과연구 RANKL 을주입한골다공증동물모델에서 ginsenosiderh2 의효과를입증함 난소를제거한동물실험에서 ginsenoside Rh2 를처리한경우골밀도가정상수준으로돌아옴을확인

60 제 6 절 3 차년도연구결과 1. 흑삼성분구조분석을위한재료및방법 1 실험재료흑삼으로부터골다공증억제활성물질을분리정제하기위한시료는 ( 주 ) 흑삼코리아로부터제공받은구증구포고려흑장삼정제품 480g을사용하였다. 2 시료추출물조제액상형태의고려흑장삼정 ( 이후흑삼이라표기 ) 480g을약 40 의미지근한증류수에녹인다음이것을분액깔때기를이용하여그림1과같은과정을통해극성이다른유기용매를사용하여각각의용매분획추출물을제조하였다. 즉, 물에녹인흑삼용액을분액추출에사용할용매중극성이가장낮은 n-hexane부터차례로추출하였다. 먼저흑삼에포함된지방산과같은가장극성이낮은물질을추출해내기위하여 n-hexane과물로분액추출하여 n-hexane 추출물을제조하고, 남은물층에에틸아세테이트 (EtOAc) 를가하여 3회추출하여상층의에틸아세테이트추출분획을얻었다. 하층의물분획을다시부탄올 (BuOH) 을첨가하여같은방법으로추출하여부탄올추출분획을제조하였다. 제조된용매추출분획에대하여마우스파골세포분화억제활성측정하였으며 ( 그림 1, 표 1), 이들중강한활성을나타내는 EtOAC 추출물, BuOH 추출물및물추출분획중수삼으로부터구증구포의흑삼의제조과정중에서주로극성물질이비극성물질로전환되는특성을고려하여이들분획중인삼으로부터흑삼의제조과정에서새로생성되었을가능성이높은가장비극성부분인 EtOAC 추출물에대한활성물질의분리정제를실시하였다. 3 파골세포분화억제활성물질의분리흑삼의 EtOAC 추출물로부터활성물질의분리및정제는실리카겔칼럼크로마토그래피, 역상칼럼크로마토그래피, 순상 TLC, 역상 TLC 및 HPLC 등을이용하여순수분리정제하였다. 이때각분리정제단계마다얻어진분획들에대하여마우스파골세포분화억제활성을측정하여활성분획을확인하는과정을거치는 activity-guided fractionation에따라분리정제를수행하였다

61 < 그림 1> 흑삼추출물로부터각각의용매추출분획의제조

62 < 표 1> 흑삼의유기용매추출물의마우스파골세포분화억제활성 n-hexane 추출물 EtOAc 추출물 BuOH 추출물물층 활성도

63 2. 파골세포분화실험방법 1 mouse 뒤다리중 tibia 와 femur 부분을잘라내고근육조직을발라낸뒤 1ml 주사기로골수를채취한다. 2 5ml red-blood cell rising buffer 로세포를잘섞은뒤상온에서 10분간방치한다 rpm에서 5분돌린후 MCSF 30ng/ml 들어있는 MEM 배지에넣고 petri-dish 에서 3 일간배양한다. 4 3일뒤바닥에붙어있는세포들만 cell dissociation solution으로모아서 1000rpm에서 5분동안원심분리기에서돌린후분화유도를시작한다. 5 MCSF 30ng/ml, RANKL 25ng/ml 넣고다시 3일동안 incubator에서키운다. 6 3~4일지나배지를버리고 TRAP staining 을진행하고분화된 osteoclast를 counting 3. 흑삼의 EtOAC 추출물로부터마우스파골세포분화억제활성물질의분리흑삼 EtOAC 추출물로부터마우스파골세포분화억제활성물질의분리는 ( 그림2) 와같은과정을통하여실시하였다. 먼저 EtOAC 추출물 5.76g을소량의메탄올에용해한다음이것을 30% 메탄올을용매로한역상의 ODS resin이충진된 open 칼럼 (45mm I.d. x 215mm) 에로딩한다음 30% 메탄올부터 100% 메탄올까지점진적으로메탄올함량을높인용매로용출하는역상 ODS 칼럼크로마토그래피를실시하였다. 그결과얻어진각분획들을실리카겔 TLC ( 클로로포름 : 메탄올 = 5:1) 를실시한후황산발색을하여확인하였으며 ( 그림3), 아울러이들분획들의마우스파골세포분화억제활성을측정하여활성분획을확인하였다 ( 그림4, 그림5). 그결과 TLC 상에서분리되어나타나는물질들은 UV lamp 하에서는물질의스팟이전혀보이지않았으나, 황산발색에의해서는확연하게나타나보였다. 이로미루어이들활성물질들은발색단이없는물질로서인삼의주성분인 ginsenoside 중비극성화합물일가능성이있는것으로추정되었다. 따라서이후분리정제과정에서 TLC분석에의한활성물질의확인은황산발색을통해확인하였다. 또한각분획에대한파골세포분화억제활성을측정한결과역상칼럼크로마토그래피의결과앞부분의분획 (Fr. 0) 에서는활성이전혀나타나지않았으며, 활성을나타내는분획들은주로뒷부분의분획들이었다. 활성평가결과및 TLC 결과를토대로활성분획들을크게 4개의분획 (Fr. 1A, Fr. 1B, Fr. 2, Fr. 3) 으로나누었으며, 이들분획들에대하여그림 2와같은과정을통해흑삼으로부터마우스파골세포분화억제활성물질들을분리정제하였다

64 < 그림 2> 흑삼에틸아세테이트추출물로부터마우스파골세포분화억제활성물질의분리과정

65 < 그림 3> 흑삼 EtOAc 추출물분획의 ODS open 칼럼크로마토그래피실시후얻은분획들의 실리카겔 TLC 결과. ( 전개용매 ; 클로로포름 : 메탄올 5:1, 황산 5% 발색 )

66 < 그림 4> 마우스파골세포분화억제활성평가

67 < 그림 5> 흑삼 EtOAc 추출물분획의 ODS open 칼럼크로마토그래피실시후얻은분획들의 마우스파골세포분화억제활성평가결과

68 먼저 Fr. 1B 분획 1.26g을 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를실시하여활성분획 1.07g을모았다. 활성분획의실리카겔 TLC를실시하여활성물질들의프로파일을확인후클로로포름 : 메탄올 (C:M) 10:1에서 1:1까지용매의극성을올리면서실리카겔칼럼크로마토그래피를실시하였다. 이렇게하여얻어진각분획들에대하여실리카겔 TLC (C:M 5:1) 를하여 TLC 결과 ( 그림 6) 를토대로 BG-I A 부터 BG-I F 까지 6개의분획으로나누어각각모았다. 이들중활성이우수한 BG-IB와 BG-I E 분획에대하여 ODS-HPLC 분석을실시하여이들분획의 HPLC 프로파일을확인하였다. 이때 HPLC 분석조건은표 2와같으며, 향후활성물질의분리정제과정에서실시한모든 HPLC 분석실험은표2와같은조건에서실시하여각활성물질들간의 retention time (RT) 을비교하였다. 이들 HPLC 분석결과를바탕으로각분획들에대하여분취용 HPLC 칼럼 (Cosmosil 5C18 MS-II, 20x250mm) 을사용하여 HPLC 분취를수행하였다. BG-I E 분획에대하여 HPLC 분석결과 ( 그림 7) 를바탕으로 70% 메탄올을용매로하여 ODS-HPLC 분취 ( 칼럼 ; Cosmosil 20x150mm, 5μ, Flow rate; 7.0 ml/min, UV 210nm) 를수행하였다. 이로부터 RT 16.4분에서순수하게분리된활성화합물 BG-A (123mg) 과 RT 19.14분에서 BG-B (152mg) 을각각얻었다. BG-IB 분획에대해서 HPLC 분석결과 ( 그림 8) 를참고로 65% 메탄올을용매로하는 ODS-HPLC 분취를수행하여순수하게분리된 4개의 화합물 BG-H (65mg, RT 53.55min), BG-I (3mg, RT 42.99min), BG-J (3mg, RT 27.60min), BG-K (8mg, RT 40.24min) 를얻었다. 분획 Fr.2 (1.87g) 을메탄올을용출용매로하여 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피를실시하여활성분획 1.02g을모았다. 활성분획의실리카겔 TLC를실시하여활성물질들의 TLC 프로파일을확인하였으며 ( 그림 9), 분획물을다시클로로포름 : 메탄올 (C:M) 15:1에서 1:1까지용매의극성을올리면서실리카겔칼럼크로마토그래피를실시하였다. 칼럼크로마토그래피후얻어진각분획들에대하여실리카겔 TLC (C:M 5:1) 를하여그결과로부터각분획들을나누었으며, 이들중BG-II D 와 BG-II G 두개의활성분획에대하여.ODS-HPLC 분석을실시하였다 ( 그림 11). BG-II D 분획을 ODS-HPLC 분취 ( 용매 ; 75% 메탄올, 유속 ; 7.0 ml/min) 를행하여 활성화합물 BG-C (23mg) 와 BG-D (76mg) 을각각분리하였다. BG-II G 분획으로부터는 ODS-HPLC 분취 ( 용매 ; 70% 메탄올, 유속 ; 7.0 ml/min) 를행하여활성화합물 BG-E (15mg), BG-F (11mg) 및 BG-G (30mg) 세개의화합물을순수분리하였다

69 < 그림 6> 흑삼 Fr. 1B 분획의 Sephadex LH-20 칼럼크로마토그래피후얻은활성분획물 의실리카겔칼럼크로마토그래피실시후의실리카겔 TLC 결과. ( 전개용매 ; 클로로포름 : 메탄 올 4:1, 황산 5% 발색 )

70 < 표 2> HPLC 분석조건 Column YMC 5C18-AR-II (4.6 x 250mm) Gradient Mobile phase Flow rate Detector Injection volume Time (min) Acetonitrile (%) H 2 O (%) ml/min Photodiode Array Detector and UV 210nm 10μl

71 < 그림 7> BG-I E 분획의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

72 < 그림 8> BG-I E 분획의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

73 < 그림 9> 흑삼 BG-II D 분획의실리카겔 TLC 분석결과. ( 전개용매 ; 클로로포름 : 메탄올 4:1, 황 산 5% 발색 )

74 < 그림 10> BG-II D 분획의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

75 < 그림 11> BG-II G 분획의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

76 흑삼 EtOAc 추출물의역상칼럼크로마토그래피분획물중가장비극성분획인 Fr.3 (1.92g) 을메탄올에녹는부분과녹지않는부분으로나누었다. 메탄올에용해되지않는부분중일부를 HPLC 분석을실시한결과 ( 그림 12) 순도 95% 이상임을확인하였으며, 따라서더이상의정제를하지않고구조분석을위한 NMR 및 Mass 분석시료로사용하였다. 메탄올에녹는부분을실리카겔칼럼크로마토그래피를실시하여메탄올-클로로포름 15:1부터 1:1 용매로용출한후활성분획을모아 HPLC 분석을실시한후 ( 그림 13) HPLC로분취하여활성화합물 BG-M (8.3 mg) 을분리하였다. 4. 마우스파골세포분화억제활성물질의규명흑삼의 EtOAc 추출물로부터순수분리정제된 13종의활성화합물들에대한규명을위하여 NMR 및 Mass spectrometer를이용한기기분석을실시하였다. 먼저 1H 및 13C NMR 분석결과이들화합물은 ginsenoside 화합물들인것으로추정되었다. 따라서 NMR 및 Mass 분석과함께인삼의 ginsenoside 표준물질의 HPLC 분석을실시하여흑삼에서분리한활성화합물들의 HPLC 분석결과와비교분석하였다. 먼저각화합물들은흰색의분말형태로서 UV-Visible 스펙트럼에서특이한광흡수파장을나타내지않았으며표준화합물과대조한후상이한화합물에대한자세한구조분석은다양한 1-D 및 2-D NMR 분석과 Mass 분석및물리화학적성질의규명을통해이루어졌다. Ginsenoside 표준화합물 Rg1, Rg2, Rb2, Rb3, Rg1, Rg2, Rd, Ck, F1, 및 protopanaxadiol 등 10종의화합물에대한역상 ODS HPLC 분석 ( 분석조건은표 2 참조 ) 을실시하여그림 14와같은 HPLC 프로파일을얻었다. 흑삼으로부터분리한활성화합물 13종에대한 HPLC 프로파일또한표준화합물과같은조건에서 HPLC를실시하여그림 15와같은 HPLC 프로파일을얻었다. Ginsenoside 표준물질과흑삼으로부터분리된화합물들의 HPLC 분석프로파일을비교한결과를 ( 표3) 에나타내었다. 분리된 13종의화합물중표준물질과매우유사한 HPLC retention time(rt) 을나타내는화합물은 BG-A, BG-B 및 BG-M 세화합물이었다. 즉, BG-A의 RT는 15.03분으로 ginsenoside Rg2의 15.04분과, BG-B 화합물의 RT는 15.67분으로서 ginsenoside Rd의 15.66분과거의일치하였다. BG-M 화합물의 RT 15.39분역시 ginsenoside Rh1의 15.38분과같아, HPLC 분석결과 13종의화합물중이들세화합물이외에는 RT에서큰차이를보여대표적인 ginsenoside와는다른종류의화합물로추정되었다

77 < 그림 12> Fr.3 의메탄올가용성분획의 ODS-HPLC 분석프로파일

78 < 그림 13> Fr.3 의메탄올불용성분획의 ODS-HPLC 분석프로파일

79 < 그림 14> Ginsenoside 표준화합물의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

80 < 그림 15> 분리된화합물의 ODS-HPLC 분석프로파일 ( 분석조건표 2 참조 )

81 < 표 3> Ginsenoside 표준화합물및흑삼으로부터분리된화합물들의 HPLC 분석결과 R.T(min) Reference compounds isolated compounds 9.63 Rg Rb2, Rb Rg2 BG-A Rh1 BG-M Rd BG-B F BG-E BG-F BG-G BG-K BG-I BG-H protopanaxadiol BG-J Ck Rh2-79 -

82 흑삼의 EtOAc 추출물로부터순수분리정제된활성화합물들에대한화학구조규명을위하여 NMR 및 Mass spectrometer를이용한기기분석을실시하였다. BG-A 화합물은흰색의분말로얻어졌으며, UV 스펙트럼에서는특정한파장의흡수를나타내지않고 203nm에서만 end absorption을나타냄으로써 ginsenoside 화합물과같이 UV-Vis. 영역의빛을흡수할수있는발색단을갖지않는화합물임을알수있었다. 본화합물의 ESI-MS 분석결과 ( 그림 16, 표 4) [M+Na] + ion peak가 m/z 776.7에서, [M-H] - ion peak가 m/z 752.8에서관측되어본화합물의분자량은 754로추정되었다. 이는 HPLC 분석 결과동일한 RT 를나타낸 ginsenoside Rg2 (C 42 H 72 O 13, 분자량 785) 와는분자량이다르게 나타나서서로다른화합물인것으로확인되었다. 특히, BG-A 화합물의 1 H ( 그림 17) 및 13 C-NMR ( 그림 18) 스펙트럼은전형적인 ginsenoside 의 NMR 스펙트럼를보였다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 δ Η 4.34에서 1개의당에서유래한 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 8개의 methyl proton이 δ Η 에서각각관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼을분석한결과 δc 16.1, 17.0, 17.6, 17.7, 17.9, 25.9, 26.5, 34.4에서 8개의 methyl 탄소, δc 105.4에서당분자 1개에서유래한 anomeric carbon이관측됨으로써본화합물은 1개의당분자를포함한화합물임을알수있었으며, DEPT 스펙트럼 ( 그림 19) 분석결과 8개의 CH 3, 9개의 CH 2, 13개의 CH 및 6개의 4급탄소를포함하는 36개의탄소로구성된 ginsenoside임을알수있었다. 본화합물의정확한구조분석을위하여 COSY, TOCSY 및 HMBC 등다양한 2D NMR 분석을실시하여분석중에있다. BG-B 화합물도흰색의분말로얻어졌으며, UV 스펙트럼에서는특정한파장의흡수를나타내지않고 203 nm에서만 end absorption을나타냄으로써 BG-A 화합물과유사한성질을나타내는 ginsenoside 화합물임을알수있었다. 본화합물의 ESI-MS 분석결과 ( 그림 20, 표 4) m/z 662.9에서 [M+Na] + ion peak가, m/z 639.0에서 [M-H] - ion peak가각각관측되어본화합물의분자량은 640으로추정되었다. 이는 HPLC 분석결과동일한 RT를나타낸 ginsenoside Rd (C 48 H 82 O 18, 분자량 947) 와는분자량이크게다르게나타남으로써서로상이한화합물인것으로확인되었다. BG-A 화합물의 1 H ( 그림 21) 및 13 C-NMR ( 그림 22) 스펙트럼은 BG-A 화합물의그것들과매우유사한 ginsenoside의 NMR 스펙트럼를보였다

83 < 그림 16> BG-A 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

84 < 표 4> 흑삼으로부터분리한마우스파골세포분화억제활성화합물의 ESI-MS 분석결과 Compound MS [M +Na] +,m/z MS [M -H] -,m/z 분자량 A B C D E F G K M

85 < 그림 17> BG-A 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

86 < 그림 18> BG-A 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

87 < 그림 19> BG-A 화합물의 DEPT 스펙트럼 (CD 3 OD)

88 1 H-NMR 스펙트럼에서는 BG-A와마찬가지로 δ Η 4.34에서 1개의 glucose로추정되는당에서유래한 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 8개의 methyl proton이 δ Η 에서각각관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼을분석한결과 δc 16.6, 17.8, 18.1, 18.2, 18.4, 22.8, 26.4 및 31.9에서 8개의 methyl 탄소, δc 106.0에서 1개의 anomeric carbon이관측됨으로써본화합물은 glucose로추정되는 1개의당분자를포함하는화합물임을알수있었으며, DEPT 스펙트럼분석결과 8개의 CH 3, 8개의 CH 2, 13개의 CH 및 5개의 4급탄소를포함하는총 34개의탄소로구성된 ginsenoside임을알수있었다. COSY, HMQC, TOCSY 및 HMBC 등다양한 2D NMR 분석을실시하여정확한화학구조를분석BG-C 화합물도역시흰색의분말로얻어졌으며, UV 스펙트럼에서도 203 nm에서만 end absorption을나타냄으로써 BG-A 및 BG-B 화합물과매우유사한성질을나타내는 ginsenoside 화합물임을알수있었다. 본화합물의 ESI-MS 분석결과 ( 그림 23, 표 4) m/z 645에서 [M+Na] + ion peak가, m/z 621에서 [M-H] - ion peak가각각관측되어그분자량은 622로추정되었다. BG-C 화합물의 1 H ( 그림 24) 및 13 C-NMR ( 그림 25) 스펙트럼은 BG-A 및 BG-B 화합물과매우유사한 1개 의당을지닌 ginsenoside 의 NMR 스펙트럼를보였다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 BG-A 및 BG-B에서와같이 δ Η 4.34에서 glucose로추정되는당에서유래한 1개의 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 7개의 methyl proton이 δ Η 0.93, 0.98,, 0.99, 1.12, 1.32, 1.61 및 1.67에서각각관측되었다. BG-C 화합물은 BG-A 화합물과비교하였을때 methyl기가 1개적은반면, δ Η 2.56 (1H, m) 및 4.68 (1H, s) 에서 methine 탄소가새롭게관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼에서는 δc 16.1, 17.0, 17.5, 17.8, 18.0, 25.9, 및 31.4에서 7개의 methyl 탄소가관측되었고, δc 105.6에서 1개의 anomeric carbon이관측되었다. 따라서 BG-C 화합물은 glucose로추정되는 1개의당분자를포함하는총 35개의탄소로구성된 ginsenoside임을알수있었다. BG-D 화합물또한흰색의분말로얻어졌으며 203 nm에서만 UV end absorption을나타내는특성을나타내었다. ESI-MS 분석결과 ( 그림 23, 표 4) BJ-D 화합물은 m/z 643.8에서 [M+Na] + ion peak가, m/z 619.9에서 [M-H] - ion peak가각각나타내어그분자량은 621 임을알수있었다. 1 H ( 그림 27) 및 13 C-NMR ( 그림 28) 스펙트럼은 BG-A 및 BG-B 화합물과매우유사한 1개의당을지닌 ginsenoside의 NMR 스펙트럼를보였다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 δ Η 4.34에서 1개의 anomeric proton 시그널이관측되었으며, δ Η 0.93에서 1.66 사이에서 9개의 methyl proton이각각관측되었다

89 < 그림 20> BG-B 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

90 < 그림 21> BG-B 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

91 < 그림 22> BG-B 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

92 < 그림 23> BG-C 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

93 < 그림 24> BG-C 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

94 < 그림 25> BG-C 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

95 BJ-A 와비교하였을때 BJ-D 의 1 H-NMR 스펙트럼에서는 δ Η 2.58, 2.66 및 5.07 에서각 각 1 개의씩 3 개의 methine proton 시그널이새롭게관측되었고 1 개의 methyl 시그널이더 관측된반면, BJ-A 에서관측되었던 δ Η 3.54 의 methine signal 이관측되지않았다. 13 C-NMR 스펙트럼에서도 9개의 methyl 탄소가 δc 12.9, 16.1, 17.0, 17.5, 17.8, 17.9, 25.8, 27.9 및 31.4에서관측되었다. 또한 1개의 anomeric carbon 시그널이 δc 105.5에서관측되었다. 이로부터 BG-D 화합물은 1개의당분자를포함하고있는총 30개의탄소로구성된분자량 621의 ginsenoside임을알수있었다. BG-E 화합물도역시흰색의분말의성상을나타내었으며, 203 nm에서만 end absorption 을나타내는 UV 스펙트럼을보였다. BG-E 화합물의 ESI-MS 분석결과 ( 그림 29, 표 4) m/z 791.8에서 [M+Na] + ion peak가, m/z 767.9에서 [M-H] - ion peak가각각관측되어그분자량은 769로추정되었다. BG-E 화합물의 1 H ( 그림 30) 및 13 C-NMR ( 그림 31) 스펙트럼역 시 1 개의당을지닌 ginsenoside 의특징적인 NMR 스펙트럼를보였다. 1 H-NMR 스펙트럼에 서 δ Η 4.63에서 1개의 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 9개의 methyl proton이 δ Η 0.92에서 1.67 사이에서관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼에서는 δc 17.1, 17.3, 17.33, 17.8, 18.0, 25.9, 27.8, 31.9 및 34.9에서총 9개의 methyl 탄소가관측되었고, δc 101.6에서 anomeric carbon이관측되었다. 이로부터 BG-E 화합물은 1개의당분자를포함하는총 37개의탄소로구성된분자량 769인 ginsenoside임을알수있었다. BG-F 화합물도흰색분말의성상으로서 203 nm의 end absorption만을나타내는 UV 스펙트럼을보였으며, ESI-MS 분석결과 ( 그림 32, 표 4) [M+Na] + ion peak가 m/z 823.8에서, [M-H] - ion peak가 m/z 799.9에서각각관측되어분자량이 801임을알수있었다. BG-F 화합물의 1 H-NMR ( 그림 33) 스펙트럼은역시 1개의당을지닌 ginsenoside의특징적인 NMR 스펙트럼을보였으며, BG-E와매우유사하였다. 즉, 1 H-NMR 스펙트럼에서 δ Η 4.63 에서 1개의 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 8개의 methyl proton이 δ Η 0.92에서 1.69 사이에서관측되었다. BG-E 화합물은 1개의당분자를포함하는분자량 801인 ginsenoside임을알수있었다

96 < 그림 26> BG-D 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

97 < 그림 27> BG-D 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

98 < 그림 28> BG-D 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

99 < 그림 29> BG-E 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

100 < 그림 30> BG-E 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

101 < 그림 31> BG-E 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

102 < 그림 32> BG-F 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

103 < 그림 33> BG-F 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

104 BG-G 화합물은흰색의분말로얻어졌으며, UV 스펙트럼역시 203 nm에서만 end absorption을나타내었다. BG-G의 ESI-MS 스펙트럼분석결과 ( 그림 32, 표 4) [M+Na] + ion peak가 m/z 791.8에서, [M-H] - ion peak가 m/z 767.9에서관측되어본화합물의분자량은 769로서 BG-E와같았다. BG-A 화합물의 1 H ( 그림 33) 및 13 C-NMR ( 그림 34) 스펙트럼은 BG-E 및 BG-F 화합물과매우유사한양상을보이는 ginsenoside의 NMR 스펙트럼를 나타내었다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 δ Η 4.63 에서 1 개의당에서유래한 anomeric proton 시그널이관측되었으며, 9개의 methyl proton이 δ Η 에서각각관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼및 DEPT 스펙트럼 ( 그림 35) 분석결과에서는 δc 12.9, 17.1, 17.3, 17.3, 17.8, 17.8, 18.0, 25.8 및 31.9에서 9개의 methyl 탄소, δc 27.5, 27.9, 29.4, 32.3, 33.5, 40.3, 46.3 및 63.1에서총 8개의 CH 2 탄소, δc 51.0, 51.2, 61.4, 69.6, 71.9, 72.2, 72.4, 74.0, 74.9, , 79.1, 79.7, 101.6, 101.6, 및 124.6에서총 16개의 CH 탄소가관측되었으며, 사급탄소는 6개가관측되어총 39개탄소시그널이관측되었다. 한편, δc 101.6에서 2개의 anomeric carbon이관측되어 BG-G 화합물은 2개의당분자를함유한분자량 769의 ginsenoside 임을알수있었다. 흰색의분말로얻어진 BG-L 화합물역시 UV 스펙트럼역시 203 nm에서만 end absorption을나타내었다. BG-L 화합물의 1 H ( 그림 35) 및 13 C-NMR ( 그림 36) 스펙트럼역 시전형적인 ginsenoside 의 NMR 스펙트럼를나타내었다. 1 H-NMR 스펙트럼에서는 δ Η 4.42 (1H, d) 및 4.66 (1H, d) 에서 2 개의 anomeric proton 시그널이관측되었으며, δ Η 에서 8 개의 methyl proton 이관측되었다. 13 C-NMR 스펙트럼및 DEPT 스펙트럼 ( 그림 37) 분석결과에서도 8 개의 methyl 탄소, 10 개의 CH 2 탄소, 17 개의 CH 탄소, 사급탄소는 7 개가 관측되어총 42 개탄소시그널이관측되었다. 한편, δc 와 에서 2 개의 anomeric carbon 이관측되어 BG-L 화합물은 2 개의당분자를함유한 ginsenoside 임을알수있었다. 현재까지구조가규명된 BG-A, BG-L, BG-C 의구조는 ( 그림 38) 에나타내었다

105 < 그림 32> BG-G 화합물의 ESI-MS 스펙트럼

106 < 그림 33> BG-G 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

107 < 그림 34> BG-G 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

108 < 그림 35> BG-L 화합물의 1 H-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 400 MHz)

109 < 그림 36> BG-L 화합물의 13 C-NMR 스펙트럼 (CD 3 OD, 100 MHz)

110 < 그림 37> BG-L 화합물의 DEPT 스펙트럼 (CD 3 OD)

111 < 그림 38> BG-A, L, C 화합물의구조

112 5. 흑삼성분 ginsenoside Rh2의파골세포분화저해기전규명 osteoclastogenesis 는여러가지질병을유발한다. 류마티즘관절염, bone metastasis, Paget's disease 그리고골다공증등은모두지나친 osteoclastogenesis 의진행으로인해발병하게된다. 이러한 osteoclastogenesis 는주요하게 RANKL signal 에의해서조절되고그로인해서 RANKL signal 을타겟으로하는물질들은상술한질병에효과적으로씌일수있을거라주목받고있다. 따라서본연구의취지는 osteoclastogenesis 을타겟으로하는 small molecule을흑삼이라는약용식물에서찾아내서그메카니즘을밝혀내려는데있다. ginsenoside Rh2 는대표적인 ginseng 의주요약효성분이다. 이번연구에서우리는 ginsenoside Rh2 가 osteoclast 의분화를효과적으로억제하는것을관찰할수있었다 ( 그림1). Bone marrow 세포에서 MCSF 와 RANKL 을처리하여서파골세포분화를유도하였고 ginsenoside Rh2 를농도의존적으로처리하였더니파골세포의분화가효과적으로억제되는것을확인하였다. 이러한 ginsenoside Rh2 의파골세포분화억제효과가 cell cytotoxicity 를동반하는것인지알아보기위해 cell viability assay 를진행하였다 ( 그림 2). 그림에서확인할수있는바와같이 ginsenoside Rh2 는 osteoclast 분화과정중비교적높은농도에서까지도어떠한세포독성도나타내지않았다. 이는 ginsenoside Rh2 가으로세포독성이아닌 osteoclast 의분화를특이적으로억제한다는사실을입증하여준다. 뿐만아니라 osteoclast 의두가지마커인 OSCAR 와 TRAP 도 ginsenoside Rh2 에의 해 transcriptional level 에서 time-dependent 하게감소된다는사실을확인할수있었다 ( 그림 3). 이러한결과들은 ginsenoside Rh2가 RANKL 에의한 osteoclast 의분화를 time-dependent 하게효과적으로억제한다는것을보여주었다. 다음 osteoclast 분화와관련된여러가지전사인자와 marker 들의발현상황을알아보았다. osteoclast 분화에서결정적인영향을주는전사인자 NFATc1 과 c-fos 의발현이 transcriptional level 에서효과적으로억제되는것을 realtime-pcr 을통해서확인할수있었다 ( 그림 4). 다음 western 을통해서단백질발현정도를검측해본결과역시단백질발현도 ginsenoside Rh2 에의해서 time- dose- dependent 하게억제된다는사실을확인할수있었다 ( 그림 5)

113 < 그림 1> Ginsenoside Rh2 의파골세포저해효과

114 < 그림 2> Rh2 의세포독성에미치는영향

115 < 그림 3> Effect of Rh2 on TRAP and OSCAR expression

116 < 그림 4> Effect of Rh2 on NFATc1 and c-fos expression

117 < 그림 5> Effect of Rh2 on protein level related with osteoporosis

118 다음 ginsenoside Rh2 에의해서 RANKL signal 이억제되는메카니즘이어떤경로를 통한것인지알아보기위해 MAPK pathway를체크해보았다 ( 그림 6). ( 그림6) 에서확인할수있듯이 ginsenoside Rh2 는 specific 하게 ERK 의인산화레벨에만변화를주었을뿐다른 MAPK 맴버인 p38, JNK 의인산화에는아무런영향도주지않는다는것을확인할수있었다. NF-kappa B 는잘알려진바와같이 osteoclast의분화에굉장히중요한역할을한다. Ginsenoside Rh2가 RANKL 에의한 NF-kappa B 경로에어떤영향을주는지알아보기위해먼저 I kappa B alpha 의 phosphorylation을확인해보았다 ( 그림 7). 그림에서확인할수있듯이 I kappa B alpha 의인산화가 ginsenoside Rh2에의해부분적으로억제가되고 I kappa B 의단백질양은어느정도 recover 가된다는사실을확인할수있었다. 다음실제로 NF- kappa B의 DNA binding activity 가영향을받았는지알아보기위해 EMSA analysis 를진행하였다 ( 그림 8). 그림에서확인할수있듯이 NF kappa B 의 DNA binding activity 가 ginsenoside Rh2 에의해서억제된다는것을증명할수있었다. 다음확인을위해 NF kappa 의실질적인타겟 gene들의발현양을확인해보았다 ( 그림 9-10). 예상했던바와같이 NF kappa B 의두타겟인 TNF-alpha와 ICAM-1 모두가 ginsenoside Rh2에의해서영향을받는다는것을확인할수있었다. 이러한모든결과들은 ginsenoside Rh2가사실은 ERK의 phoaphorylaiton과 NF kappa 의활성화를억제하는메카니즘을통해 osteoclast의분화를억제한다는사실을확인할수있게해주었다. 다음 in vivo에서 ginsenoside Rh2 의효과를확인하기위해 mouse bone loss 모델에 ginsenoside Rh2를처리하고결과를 PET를통해서확인해보았다 ( 그림 11). RANKL에의해서감소되었던뼈밀도가 ginsenoside Rh2를처리함으로인해서 recover 된다는사실을확인할수있었다. 다음더욱정밀한분석을하기위해마이크로 CT 분석을진행하였다 ( 그림 12). 그림에서확인할수있듯이 ginsenoside Rh2는 RANKL에의한 bone loss를 significant 하게회복시켰다. 이러한모든결과로부터우리는홍삼의주요약효성분인 ginsenoside Rh2 가 ERK 와 NF kappa B signal 경로를통해 osteoclast 의분화를억제하고그효과는동물모델에서도유효하다는사실을확인할수있었고 ginsenoside Rh2 를강력한 osteoporosis 의치료제후보라고주장할수있게되었다

119 < 그림 6> Effect of Rh2 on MAPK signaling

120 < 그림 7> Effect of Rh2 on IkBa phosphorylation and degradation

121 < 그림 8> EMSA analysis for Rh2 effect on NF-kB

122 < 그림 9> Effect of Rh2 on TNFa expression

123 < 그림 10> Effect of Rh2 on ICAM-1 expression

124 < 그림 11> Effect of Rh2 on bone density

125 < 그림 12> Effect of Rh2 on trabecular form

126 < 표 1> OVX 마우스에서의 Rh2 의 trabecular form 에미치는효과

127 6. 난자를제거한쥐를이용한골다공증동물모델에서흑삼분획의효과 1차년도에이미흑삼농축액을핵산층, 부탄올층, 에틸아세테이트층으로분리하여 5ug/ml 의농도로 DMSO로희석하여 TRAP 활성을측정하였다. 그결과부탄올층에서 TRAP 활성저해가나타나므로메탄올로분획 (BG3) 을나누고정제를시도하였다. 그결과 BG3-12, 13, 22의분획에서파골세포의 TRAP 활성을저해하는효과를보였다. 3차년도에는각분획에포함된물질이실제로파골세포에독성이없고분화만을저해하는지를검증하기위해 MTT assay를수행하였으며그결과 BG-22 분획만이독성이나타났다. BG3-12, 13 분획에대하여난소를제거한골다공증모델에서그효과를검증하였다. 각 4마리의쥐를사용하여난자를제거하기전에몸무게를측정하고마취제는 ketamine mg/kg/ xylazine 5-10mg/kg 을 IP로쥐에주사하였다. 마취된쥐의정중선을절개하여, 복부지방밑에위치한자궁에서 Y자로나누어진수란관을따라그끝에위치한분홍색의난소를적출제거하였다. 6주후에쥐를 sacrifice시켜난자제거를확인하였다. 쥐의뒷다리종아리부위를절개하고살을제거한후에난자를제거한쥐와 (OVX) Sham (control) 쥐의 trabecular bone에대하여 microct를이용하여측정하였다. BMD 측정프로그램에서뼈의 top과 bottom을기준으로잡고그범위내에존재하는뼈의범위와 trabecular bone의두께와 bone사이의공간넓이그리고개수를측정하였다. MicroCT 촬영결과아래의그림과같이 coronal 부위의 BV (bone volume), 두께, 개수가난자를제거한쥐에서현저하게감소하였으나 BG3-12과 13의분획을주입한동물모델에서는 sham control 쥐의 BMD로돌아옴을확인하였다. 따라서난소절제한동물모델에서흑삼의분획이골다공증예방과치료에효과가있음을입증하였다. 7. RANKL을주입한쥐를이용한골다공증동물모델에서 ginsenoside Rh2 의효과 RANKL을주입한동물모델은난소를제거한동물모델을이용하는경우와달리짧은기간에효능물의항골다공증효과를확인할수있으며, 파골세포의분화를활성화시키는데중요한물질인 RANKL에대하여특이적인저해활성을직접확인할수있는방법이다. 아래 ( 그림 1) 과같이각 6마리의쥐를사용하여 RANKL을복강에주입하고동시에 ginsenoside Rh2 시료를주입하였다

128 < 그림 1> 동물모델에서의 Rh2 처리스케줄

129 쥐의뒷다리종아리부위를절개하고살을제거한후에 pdexa를이용하여 BMD를측정한결과 RANKL 단독으로주입한쥐의 BMD는현저하게감소하였으나 RANKL과 Rh2동시에주입한쥐의 BMD는 RANKL을주입하지않은 contol 쥐의 BMD 수준으로복귀하였다. 이결과를다시확인하기위하여같은시료를 uct로 BMD를측정하고뼈의단면을사진촬영하였다. 그결과 pdexa와같은결과를얻을수있었다 ( 그림 2). 8. RANKL을주입한쥐를이용한골다공증동물모델에서 salubrinal의효과 Salubrinal 은 ER-stress 억제제로서 eif2 의탈인산화를막아줌으로써 protein translation 을조절해주는작용으로그메카니즘이잘알려져있다. ER-stress 는노화나여러가지대사증후군에많이관여되여있고새로운치료타겟으로많이부상하고있다. 2차년도에서의연구결과 transcription level에서의 NFATc1 유전자의발현은 RANKL에 의해서증가되고역시 salubrinal 에의해서감소되는것을확인했지만 RANKL stimulation 에 의해서증가된 c-fos 유전자는 salubrinal에의해서영향을받지않는다는것을확인하였다. Ginsenoside Rh2의실험과동일하게각 6마리의쥐를사용하여 RANKL을복강에주입하고동시에 salubrinal 시료를주입하였다. 쥐의뒷다리종아리부위를절개하고살을제거한후에 pdexa를이용하여 BMD를측정한결과 RANKL 단독으로주입한쥐의 BMD는현저하게감소하였으나 RANKL과 Rh2동시에주입한쥐의 BMD는 RANKL을주입하지않은 control 쥐의 BMD 수준으로복귀하였다 ( 그림 3). 이결과를다시확인하기위하여같은시료를 uct로 BMD를측정하고뼈의단면을사진촬영하였다. 그결과 pdexa와같은결과를얻을수있었다 ( 그림 4)

130 < 그림 2> 마우스동물모델에서 Rh2 의골다공증저해효과분석

131 < 그림 3> Rh2 의 RANKL 에의한골밀도에미치는영향

132 < 그림 4> Rh2 의골다공증치료및회복에미치는영향

133 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연구개발의최종목표 가. 연구개발의최종목표및주요내용본연구는항골질환신소재관련제품을개발하는것을목표로, 흑삼추출물에서얻어지는새로운파골세포저해재의개발로새로운고부가골대사질환개선가공식품과치료제의개발을하고자한다. 흑삼추출물로부터유래한순수정제생리활성물질을 in vitro상에서파골세포저해효과들을검증파골세포의발현양상과신호전달계조사파골세포와조골세포의동시배양에서중요생리활성물질들의영향조사마우스골소실모델을이용한흑삼발효정제물질의특성조사 나. 과제별 ( 세부 협동 ) 연구개발의목표및내용 -제 1협동과제흑삼의골다공증저해효과생리활성물질의분리및구조분석유효지표물질의유도체합성에의한효능증진및대량합성흑삼가공식품의골다공증저해효과개별인증화를위한과학적효능확립 - 제 2 협동과제 파골세포의발현양상과신호전달계연구 마우스골소실모델을이용한흑삼정제물질의특성연구

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