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1 Glutathione Excellose handbook - Purification of GST fusion proteins - Looking for more detail Purification protocol? - Glutathione Excellose Spin Kit - Glutathione MiniExcellose - Glutathione Excellose

2 Introduction Glutathione Excellose 는 Excellose 에 reduced glutathione을고정화시킨것으로 GST (glutathione S-transferase) 가 glutathione과결합하는성질을이용하여정제하는방법으로 GST 융합단백질을정제하는데사용되는친화성크로마토그래피담체입니다. Glutathione Excellose 는정제목적및스케일에따라다양한형태로제공되고있습니다. 제품 사용목적 Binding capacity 제품용략 Cat. No. Glutathione Excellose Spin Kit 소량의배양액 (1 ml ~ 10 ml) 으로부터단백질을정제 단백질정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 75 mg/ spin column (final vol. of resin = 250 ml) 20 rxns 52 rxns AEx-GL-SK20 AEx-GL-SK50 Glutathione MiniExcellose 배양액 (20 ml ~ 100 ml) 으로부터단백질을정제 발현율이낮은단백질의정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 ~ 1 mg/ column 3 ml AEx-GL-M03 Glutathione Excellose 대량단백질의정제 300 mg/ resin ml 10 ml 50ml 100 ml AEx-GL-1 AEx-GL-2 AEx-GL-3

3 Flow Chart of Process using Glutathione Excellose Spin Kit Cell lysate GST Excellose Binding Washing Centrifuge Elution Pure GST fusion protein

4 Protocols of Glutathione Excellose Spin Kit 크로마토그래피중에서가장정제효율이높은흡착 (affinity) 크로마토그래피는근래에가장많이일반적으로사용되고있는정제방법입니다. 그러나높은순도의단백질을얻고자한다면한가지방법혹은일률적인방법으로는불가능합니다. 대부분의경우, 최적의정제법을확립하기위해서는다소의시행착오를염두에두고행해져야합니다. 본메뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 따라서정제하고자하는단백질을고순도로얻기위해서는정제조건의변화나다른정제시스템이도입되어지는것이바람직합니다. Preparation of the cell lysate 세포파쇄에앞서 SDS-PAGE 를통해정제하고자하는단백질의성질 ( 불용성단백질, 가용성단백질 ) 및단백질의발현율을확인합니다. 단백질의발현율이높은경우 (> 10 mg / liter) 에는원래배양액의 5X 로농축되어져야합니다. 다시말해서정제하고자하는단백질이발현율높은가용성단백질이라면 10 ml의배양액은 2 ml의 buffer* 를첨가하여 sonication 한후에원심분리를통해상등액을회수하면됩니다. 단백질의발현율이낮은경우 ( 2 ~ 5 mg/liter), 원래배양액의 20X 로더높은농축이필요합니다. * 메뉴얼에제공되는정제조건을이용할경우 equilibration buffer 를사용하시면됩니다. 만일정제하고자하는단백질용액과본메뉴얼에사용되는 equilibration buffer 가다르다면 1) 정제하고자하는단백질용액을 equilibration buffer 로바꾸거나혹은 2) equilibration buffer 를단백질용액과같은 buffer system 바꿔서사용하시면됩니다. ex) 단백질용액 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0 일경우 -1) 처음부터 cell 을다시키워서 buffer system 을맞출수도있고 dialysis 를이용하여 buffer 교환할수있습니다. 단백질용액 : PBS, ph 7.4 Equilibration buffer : PBS, ph 7.4 Elution buffer : Equilibration buffer + 10 mm reduced glutathione -2) 단백질용액 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0 Equilibration buffer : 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0 Elution buffer : Equilibration buffer + 10 mm reduced glutathione

5 배양 원심분리 (6,000 rpm, 15 min) Washing (50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph8.0) 원심분리 (6,000 rpm, 15 min) 상등액제거 상등액제거 세포파쇄 원심분리 (12,000 rpm, 20 min) 상등액회수 Pellet 제거 Filtering (0.22 mm) 단백질용액

6 Instrument and lab supplies Table top centrifuge, 1.5ml microtubes and microtube rack Buffers Washing Buffer : 20mM Tris-HCl, 0.2M NaCl, 1 mm EDTA, ph 7.4 Elution Buffer : Equilibration buffer + 10 mm maltose 1. Collection Tube에 Spin Column을끼운후마이크로튜브랙에놓습니다. 2. MBP Excellose 를잘흔들어섞은후 0.5 ml 씩컬럼에분주합니다 (final resin vol ml). - 정확한양을분주하고싶으시다면 microtube에 pipet을이용하여 0.25 ml의 D.W. 를첨가하여유성펜으로표시하고표시된만큼 MBP Excellose 를첨가하여 volume을맞추어사용하시면됩니다 X g ( 약 2,000 rpm) 에서 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 4. Washing Buffer를 0.5 ml 가한후 pipeting을통하여잘섞어줍니다. 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 5. Spin column에단백질용액을 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간상온에방치한후에 2분간원심분리합니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 5번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다. - 원심분리속도는매우중요합니다. 원심분리속도가너무높다면단백질용액과 resin이접촉하는시간이짧아져서 binding capacity가낮아질수있습니다. - 원심분리시간은단백질용액의농축된상태나점도에따라더많은시간이소요될수도있습니다. 6. 컬럼을통과한 flow-through fraction을마이크로튜브에옮겨둡니다. 7. Washing Buffer를 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간원심분리합니다 ( 필요시 2회더반복 ).

7 - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충부합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을모아둡니다. 9. Elution Buffer를 0.3 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어 2분간상온에방치한후에원심분리합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량의 buffer를첨가하여 pipeting으로충분히섞어준후원심분리합니다. 10. 컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. 11. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

8 Protocols of Glutathione MiniExcellose Before starting 메뉴얼에제공되는 MBP Miniexcellose 방법은원심분리기대신중력을이용한다는부분만다를뿐앞서설명한 MBP Excellose Spin Kit 사용방법과유사합니다. 본메뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 그렇기때문에사용자의단백질결합특성에따라정제조건이달라질수도있습니다. Composition of Glutathione MiniExcellose Column cap Excellose resin End cap Frits Test tube Buffers Washing Buffer : PBS, ph 7.4 Elution Buffer : Washing buffer + 10 mm reduced glutathione 1. Column cap과보존액을제거하고 equilibration buffer 6 ml을가합니다. 2. End cap을제거하고컬럼을 test tube와연결하여랙에고정합니다. - 제품에첨가된 test tube들은컬럼과연결시압력이걸리는것을막기위하여 tube 위쪽에작은구멍이뚫어져있습니다. 3. Washing buffer 6 ml을컬럼에분주합니다. 4. 중력에의하여모아진 equilibration buffer를버립니다. 5. 3, 4 단계를한번더반복합니다. 6. 컬럼에단백질샘플을가하고컬럼을통과한 flow-through fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 6번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다.

9 7. 컬럼을새 tube와연결한후, Washing buffer 6 ml 를가합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충부합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 9. Elution Buffer를 3 ml 가하고컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량의 buffer를첨가하여 elution 합니다. - tube 위쪽에작은구멍이뚫어져있는관계로 eluate를보관할때는새로운 tube로옮겨서보관해주시기바랍니다. 10. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

10 Protocols of Glutathione Excellose Batch protocol Instrument and lab supplies column, LC system Buffers Washing Buffer : PBS, ph 7.4 Elution Buffer : Equilibration buffer + 10 mm reduced glutathione 1. 필요한양만큼의 resin을메스실린더를이용해분주합니다. 2. Resin 안에있는기포를충분히제거합니다 (degasing). 3. Glutathione Excellose 를기포가들어가지않도록컬럼안쪽에유리막대를대고천천히유리막대를따라흘리도록합니다. 4. Resin이충분히가라앉으면 LC system과연결합니다. 5. Packing한 resin에 resin volume의 3 ~ 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 6. Equilibration Buffer를 resin volume의 5배정도를흘려 resin을충분히평형화시킵니다. 7. Column에단백질용액을가하여 resin과단백질용액이결합되도록합니다. - Packing한 resin volume의 binding capacity를고려하여적절한단백질용액을 loading 합니다. 8. Equilibration Buffer를 resin volume의 5배정도로흘려결합하지않은단백질과 contaminant protein을제거합니다. 9. Elution Buffer를 resin volume의 2배정도흘려줍니다. 10. Column을통과한 fractions은 SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

11 Regeneration & storage 1. Packing한 resin에 resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 2. Column에 resin volume의 5배정도의 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, ph 8.5 용액을흘려줍니다. 3. 다시 resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 4. Column에다시 resin volume의 5배정도의 100 mm sodium acetate, 0.5 M NaCl, ph 4.5 용액을흘려줍니다. 5. 다시 resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 6. 곧바로사용하기위해서는 equilibration buffer를흘려 resin을충분히평형화시킨후정제실험을진행합니다. 만일장기간보관할시에는 20% ethanol 용액을흘려미생물로부터 resin을보호합니다,

12 Troubleshooting guide 단백질이 Glutathione Excellose 와결합하지않는경우 1) GST tag 의존재유무확인 sequencing 을통해 sequence 확인및 reading frame 체크한다. 2) GST tag 의 glutathione bindig 부분이단백질구조상안으로숨은경우 3) 결합조건이적합하지않은경우 소량의 denaturants 나 detergents 를첨가하여정제과정을수행한다. 모든용액과 buffer 의 ph 가같은지확인 (resin 을평형화시킨 buffer 와단백질용액의 ph 가다른경우결합이일어나지않으며 aggregation 이발생할수도있음 ) 한다. 단백질이 washing 과정중에용출되는경우 1) Buffer 의문제적합한 ph 인지확인한다. 2) GST tag 의 glutathione bindig 부분의일부분이단백질구조상안으로숨은경우 소량의 denaturants 나 detergents 를첨가하여정제과정을수행한다. 정제과정중단백질이침전되는경우 1) 온도문제정제과정중온도가너무낮은경우에발생할수있으며상온에서다시실험을수행한다. 단백질이 elution 과정중에용출되지않는경우 1) Elution 조건확인 Glutathione 의농도나 salts 의농도를높인다. 단백질이 elution 과정중에다른많은 contaminant protein 과함께용출된경우 1) 단백질들간의 interaction 문제 ~ 20 mm b-mercaptoethanol 을첨가하여 S-S 결합을약화시킨다. Salts 혹은 detergent 의농도를높여준다. Washing 단계에서 buffer 에 ethanol 이나 glycerol 을첨가해서 washing 을수행한다.

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