융합유전자에의해발현되는 tyrosine kinase의높은활성에의해발생되는백혈병세포로서, 여러자극에대해상당히높은내성을가지고있다. 이질병은만성기에진단되고, 평균 2-3 년후에급성기로전환되어항백혈병복합요법에도불구하고수개월내에사망하는난치성혈액종양으로알려져있다 (αlamplin

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1 일상병리검사과악외 ^I: 저 134 면저 12 호, 42-46, 2002 만성골수성백혈병세포주에서 AS2Û3에 Bcr-Abl 융합유전자발현의변화 의한 안산 1 대학임상병리과 고대안암병원임상병리과 l 심문정 최현일 1 Arsenic Trioxide-Induced Bcr-Abl Fusion Oncogene Expression in the Chronic Myelogenous Leukemia Cell Line S 피 m, Moon Jeong., Choi, Hyun 11 1 Department 01 M edical Technology, Ansan College, Ansan, Korea DeJX1rtment 01 Cliniml Patholo, 양 " Korea Univeπ ity Mediml Center Anam Hospitα1, Seoul, Korea 1 Human chronic myelogenous leukemia(cml) is a malignacy of pluripotent hematopoietic cells caused by a dysregu1ated activity of the tyrosine kinase encoded by the chimeric bcr-abl oncogene. Arsenic trioxide(as203) has recently been demonstrated to be an effective inducer of apoptosis in patients with relapsed acute promyelocytic leukemia(apl) and in patients with APL in whom all-trans-retinoic acid and conventiona1 chemotherapy has failed. As203 induced apoptosis in NB4 cells, cloned from a relapsed patient with APL, by inducing loss of the PML/RAR α protein and by suppressing expression of the Bcl-2 protein. We have focused our studies on the effects of AS203 on the CML K562 cells and examined morphological changes of the cells undergoing apoptosis with electron microscopy. Next the bcr-abl rearrangement was not detected after treatment with concentrations more than 50 μ MjL As203 for 24 h. πùs result shows that As203 is a new promising antileukemic drug for treatment of CML and we needs to be investigated further. Key Words : CML, RT-PCR, Bcr-Abl, K562 cell, Apoptosis, As 서로 을함이밝혀진이래많은연구가되어왔다.9번과 22 번염색체의역전위결과 abl 유전자의 exon 2와 만성 골수성 백혈병 (CML) 은모든성숙단계의 bcr 유전자의 exon 2 또는 exon 3 이 결합되고이러 골수구계세포의증식과세포유전학적으로펼라델피아염색체를특징적으로나타내는조혈모세포질 한 bcr-abl 융합유전자는 8.5 Kb의 bcr-abl mrna를전사한다고알려졌다 (Shivelman et al., 1985). 사람 환으로 bcr-abl 융합유전자가발병에결정적인역할 만성 골수성백혈병세포주인 K562세포는 bcr-abl 42

2 융합유전자에의해발현되는 tyrosine kinase의높은활성에의해발생되는백혈병세포로서, 여러자극에대해상당히높은내성을가지고있다. 이질병은만성기에진단되고, 평균 2-3 년후에급성기로전환되어항백혈병복합요법에도불구하고수개월내에사망하는난치성혈액종양으로알려져있다 (αlamplin RE et al., 1985; Kanta낀 ian 뻐-1 et al., 1987). Arsenic trioxide (As 203) 는최근재발된급성전골수성백혈병치료에있어서좋은효과를보였음을보고한바있는데, 특히골수기능억저l 및기타독성이적은장점이있으며, 1 차치료에저항성이있거나재발된급성전골수성백혈병 (APL, AML-M3) 환자들에게서좋은효과를보였다. As203 의 APL에대한항암작용은 mrna와단백질합성단계에서 bcl-2 유전자표현의하향조절 (Chen GQ et al., 1996) 과 PML-RARα 융합유전자의퇴화유도와연관되어세포아포토시스 (apoptosis) 를유발함으로써나타난다고알려졌다 (Shao W et al., 1998). 아포토시스 (apoptosis) 는특히외부자극에대한세포내부에이미존재하는일련의프로그램에의해세포가사멸하는과정을의미하는데, 이때주로관찰할수있는것은 DNA 분절, 세포의형태학적인변화와세포주기의변화등이다. 아포토시스시의형태학적변화는전자현미경을통해서관찰할수있는데, 핵막주위로핵염색질이농축되기시작하면서핵막과세포막이수포를형성하고마지막에는남아있는핵이분절되어막으로둘러싸인특이적인 apoptotic body를형성하면서떨어져나가게된다. (Wyllie AH et al., 1980; Allen TD, 1987). 이에본연구에서는 t (9;22) 과 bcr-abl 융합유전자를가진 K562 세포에서 As20 3 에의한전자현미경적형태의변화와 RT-PCR을이용하여 bcr-abl 융합유전자표현정도의변화를관찰하고자한다. K562 세포를 10% FBS (Gibco BRL, USA) 가포함된 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 성장배지로 37t, 5% C02 항온항습기 (NAPCO 6001, USA) 에배양하였으 며, 음성대조균주로는 human myelomonocytic leukemia 세포주인 U937 세포를사용하였다. 2. 전자현미경을이용한세포의형태변화관찰 정상적으로 24 시간배양한세포에아무것도처리 하지않은대조군과 10μM 과 20μM As20 3 (Si 맑 la, USA) 를 24 시간동안처리한실험꾼을 400Xg 로 4 0 C 에서 10 분간원심분리하여모으고여기에 PBS 에녹 인 2.5 % glutaldehyde 로 2 시간고정하였다. 0.1 M caocodylate buffer (ph 7.4) 로세척후, 2% osmium tetroxide 로후고정하고세척, 탈수과정을거친후치 환을하고, Polybed 812 를이용하여포매를하였다. 포매과정이끝나면열중합과정을거친후, 박절을 하고 uranyl acetate 와 lead citrate 를이용하여이중전 자염색을하였다. 그리고나서 JEM 1200 EX- II 전 자현미경 (JEOL, Japa 띠을사용하여관찰하였다. ι ~ 3. Primer Maurer 등의방법을일부변형한 primer 를사용하 여 nested PCR 을시행하였다 (Table 1). RNA 존재여 부를확인하기위한내부대조로정상 abl 유전자를 이용하였다. 일차 PCR 에서는 bcr-abl 의바깥쪽 primer 를, 다 (Fig. 1). 이차 PCR 에서는안쪽 primer 를사용하였 Table 1. Sequences of primers Primεrs Sεquencε 1. 세포배양 ll. 재료및밤법 Al ATC TGC CTG AAG CTG GTG GGC T 3' A2 5 AGT GAA GCC GCT CGT TGG AAC TCC AA 3 A3 TGA TTA TAG CCT AAG ACC CGG A 3' A4 ATC TCC ACT GGC CAC AAA ATC AT A CA γ Bl 5 GAA GTG TTT CAG AAG CTT CTC C 3 B2 5 TGG AGC TGC AGA TGC TGA CCA ACT CG 3 만성골수성백혈병환자의골수세포에서유래된 43

3 RT -PCR of major bcr-abl rearrangement mrrers 랴옮뿌 # 않 excn b1 I ι 어 I a2 I 혀메 ] 반응종료후 PCR 산물을 2 % agarose gel 에서 기영동하여 band 를확인하였다. 전 RT-PCR of normal c-abl as intemal RNA control A1 f.2 M þ C-abl a1 I a2 I 려 a4 ill. 결 과 1. 전자현미경을통한세포형태변화관찰 Fig. 1. The locations of the primers used for RT-PCR test of bcr-abl reaπangement. 4. mrna 추출 K562 세포에 As 203 를각각 , 100, 250 μ MJL 첨가하고, 24 시간배양한후 PBS 로 2 회세척하고, 모은세포에서 RNAzol B RNA isolation system (TEL-TEST, USA) 을이용하여 mrna 를추출하였다. (c) 전자현미경을통해세포의형태학적인변화를관 찰하기위해 10 μm과 20 μm As 를 24 시간동 안처리한것을확인한결과, 대조균파는다르게 As 2 03 에 의해유도되는아포토시스과정을확인할 수있었다. 핵 내 염색질이핵막주위로농축되고 세포수축과세포질내 공포형성이 관찰되었다 (Fig. 2). (A) / 배, \ 5. cdna 으 합성 cdna 는약 10μ6 의 RNA 를가열한후, 5X RT buffer 4 μq, 333 μ M random primer 2 따, 35 Ujμ4 inhibitor 0.5 따, 20 Uj 따 reverse transcriptase 0.5 μ, 200 μm dntp 2 μ, DW 1 μ6를넣어총량이 20 따가되도록하여 37 0 C 에서 1 시간, 95 0 C 에서 5 분간반응시켜제조하였다. 6. Nested cdna PCR Fig. 2. Electron micrographs of K562 cells treated with AS 20 3 πle cells were treated with the control vehicle (A), 10 μ M As203 for 24 h (B), 20 μ M As203 for 24 h (C), stained with uranyl acetate and lead citrate, and analyzed under an electron microscope (X 4,α)()). cdna 합성후일차 PCR 반응은 10 pm primer mix2 μq, 10X PCR buffer 5 μ, 200 μ M dntp 2 μ-e, 2 Ujμ Taq polymerase 0.5 μ6 에 cdna 10 따를혼합하여 50 μ로 94 0 C 1 분, 61 t 1 분으로 26 cycle 을시행한후 72 0 C 에 7분간두고종료하였다. 이차 PCR은일차 PCR의산물 1 μp 에, 일차 PCR과동일한조성에 10 mm dntp 1 μv 만추가하고 94 0 C 1 분, 68 0 C 1 분에 30 cycle을시행한후 72 0 C 에서 7분간두고종료하였다. 2. Bcr-Abl 융합유전자의변화 RT-PCR 결과 K562 세포에서는음성대조군인 U937세포에비해 305 bp의위치의 band로양성을보였으며, As μM 첨가 24시간후에관찰한결과같은위치의양성 band가보였으나처음 As 203을처리하지않은대조군에비해넓어졌으며, 50μM 첨가후부터는보이지않아 bcr-abl 융합유전자가소설되었음을알수있었다 (Fig. 3). 44

4 M 찰할수가있었다. As203 가 APL 세포주에서아포토 시스억제자 (apoptosis inhibitor) 인 bcl-2 를 mrna 와 단백질단계에서둘다효과적으로하향조절할수 305 bp-' 105 bp-' Fig. 3. RT-PCR results of bcr-abl rearrangment. Lane 1: K562 contzrol; Lane 2: As μ M; Lane 3: 50 μ M; Lane 4: 100 μ M; Lane 5: 250 μ M; Lane 6: U937 cell (negative); Lanes 7-12: Intemal controls for Lane 1-6; respectively; M: molecular weight marker; 있는것으로알려져왔다 (Zhu J et al., 1997). 이에반해 CML 세포주에선아직까지 As20 3 에대한 bcrabl 융합유전자의발현의변화에관한보고가없는실정이며, 이에본연구에서살펴본결과의미있게감소, 소설됨을관찰하였으며, 아포토시스와관련해 DNA 분절이나, caspase의활성, bcl-2 의발현등계속적인연구의진행이필요하리라사료된다. N. 고화E v. 결로 만성골수성백혈병 (CML) 은모든성숙단계의골 항암기전에관한연구는세포학, 유전학및분자 생물학의발전과병행되어발전되어새로운기전이밝혀져왔다. 또한암의병태생리를토대로새로운항암물질의발견과항암제의임상적응용을시도하였다. 따라서동서의학의공동연구로소개된 AS 2 03 의항암작용은현대의학적인방법으로그가전을밝힐필요가있으며, 특히 APL에있어서는 ATRA 분화요법의문제점이발생한후더욱관심이높아졌으며, 실제임상연구까지도시행된단계이다 (Chen Z et al., 2001: Huang SY et al, 2(00). 수구계세포의증식과세포유전학적으로펼라델피아염색체를특징적으로나타내는조혈모세포질환으로특징적인 t(9;22) 및 bcr-abl 융합유전자의발현이병태생리의중심이되는것으로밝혀졌으며, 이에대해 CML의치료제로서의가능성을살펴보고자 K562 세포주를이용하여 As 203 에의한전자현미경적형태변화를살펴본결과아포토시스로진행중인세포의형태학적변화를관찰하였다. 또한 bcrabl 융합유전자의발현변화를 RT-PCR 방법을통해 유핵세포의아포토시스 (apoptosis) 의 병태생리는 살펴본결과매우의미있게약물의양에따라감소 세포증식과세포사멸사이의균형을유지하여조직 또는소설됨을관찰하여앞으로의 CML 에대한 내 항상성을유지하는데중요한파정으로, 유전적 As203 의 항암기전을밝히는데기초자료가될것이 으로손상받은서l 포의제거나, 개제방어기작, 배발 며, 세포의 apoptosis 와관련된다른기전에대해서 생과정파종양이나자가면역병, 바이러스감염등의 도지속적언연구가펼요하리라사료된다. 병의진전을조점하는데나타나고있다. 아포토시 스는세포사중괴사 (necrosis) 과정과대별되는과정 으로, 세포고사개시동안은여러종류의 proapoptic, antiapoptic 단백질의발현이조절되며, 이에따라서 caspase 가활성화되고세포수축, 세포막수축, 염색질응축, DNA 분절현상이야기되며, 후반기에는 apoptic body를형성하여세포는파괴된다고알려져있다 (Ellis HM et al., 1986; Wyllie AH., et 씨 1980). 본연구에서전자현미경을통하여 AS 처라시아포토시스로진행중인세포의형태학적인변화를관 잠고문흰 1. A11en TD. U1trastructural aspects of cell death. In perspective on mammalian cell death. Oxford University Press. Oxford. p35-65, Champlin RE, Golde DW. Chronic myelogenous leukemia recent advances. Blood 65: ,

5 3. Chen GQ, 감 lu J, Shi XG. In vitro studies on cell 버 ar and molecular mechanism arsenic σioxide in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As203 induces NB4 cell apoptosis with down regu1ation of bcl-2 expression and modulation of PML-RAR α proteins. Blood 88: , Chen Z, Chen GQ, Shen ZX, αlen SJ, Wang ZY. Treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic compounds. In.vitro and in vivo studies. Semin Hematol 38:26-36, Ellis HM, Horvitz HR. Genetic control of programmed cell death in the nematode. C elegans Cell 44: , Huang SY, Yang CH, Chen YC. Arsenic trioxide thrapy for relapsed acute promyelocytic leukemia: an useful salvage therapy. Leukemia and Lymphoma 38: , 2아R 7. Kanta때 ian HM, Keating MJ, Talpaz M, Walters RS, Smith TL, Cork A, McCredie KB, Freireich EJ. αrronic myelogenous leukemia in blast crisis. Analysis of 242 patients. Am J Med 83: , 8. Maurer J, Janssen JW, Thiel E, van Denderen J, Ludwig WD, Aydemir U, Heinze B, Fonatsch C, Harbott J, Reiter A. Detection of chlmeric BCR-ABL genes in acute lymphoblastic leukaemia by the polymerase chain reaction. Lancet 4;337(8749): , Shao W, Fenelli M, Ferrara M. Arsenic trioxide as a inducer of apoptosis and loss of PML-RAR α protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst 90: , Shivelman E, Lifshitz B, Gale RP, Canaani E. Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukemia. Nature 315: , Wyllie AH, Kerr JF, Currie AR. Cell death: πle significance of apoptosis. Int Rev Cytol 68: , 강lU J, Koken Ml삐1:, Quignon F, αlelbi-alix MK, Degos L, Wang ZY, Chen Z. Arsenic-induced PML targeting onto nuclear bodies: Implications for the treatment of acute promyelocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci 94: ,

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