Cell Culture Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) From Isolation to Serum-Free Medium Vascular endothelial cells의 in vitro cultivation은 norm

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1 [ 특집기획 ] Cell Culture Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) From Isolation to Serum-Free Medium Genomics Advances in Stealth RNAi Design for RNA interference SuperScript Plus Direct and indirect cdna Labeling System Proteomics A Tool to Enhance your protein profile-zoom IEF FRACTIONATOR

2 Cell Culture Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) From Isolation to Serum-Free Medium Vascular endothelial cells의 in vitro cultivation은 normal and pathological states의 vascular endothelial cell physiology의유용한모델이되어왔습니다. 그러나, 현재까지대부분 serum-supplemented media (Ref.1) 를사용하여고농도의 animal sera가야기하는 lot-to-lot variation, 불특정성분에의한의도하지않은효과와가격변동등의어려움이있었습니다. 또한 therapeutic applications을위한 endothelial cell research 에서는 serum의존재가작지않은걸림돌이되기도합니다 (Ref. 2, 3. 4). GIBCO 의 Human Endothelial Serum Free Medium (Human Endothelial-SFM, GIBCO Cat. No ) 은처음부터 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) 의증식을위해개발되었습니다 (Ref. 5, 6). 이배지로 primary isolation부터 15 passages 이상의증식이가능합니다. Human Endothelial-SFM에서배양된 HUVEC은고유의 morphology인 cobblestone 형태를나타내며, Factor Ⅷ-related antigen, UEA-1 lectin binding, uptake of Dil-acetylated LDL, vitamin and IL-1a-induced ICAM-1 expression등의 endothelial specific markers를모두유지하게됩니다. 또한 camp와 prostacyclin signal transduction systems도확인이되었습니다. Human Endothelial-SFM에 human recombinant basic fibroblast growth factor (hrbfgf) 와 human recombinant epidermal growth factor (hregf) 를넣어서 HUVEC을배양하였을때의증식속도는 Medium 199에 acidic FGF, heparin과 20% FBS를넣어서배양하였을때와유사합니다. SFM에서 human endothelial cells을배양할때의기본적인절차는다음과같습니다. Preparation and Use of Growth and Attachment Factors Attachment Factor : Human plasma fibronectin (GIBCO Cat. No ) 을멸균된증류수에녹여 1 mg/ml의 stock solution을준비합니다. ( 완전히녹는데상온에서약 30분이걸리므로, vortex나 heating 또는 filtering하지마십시오.) 멸균된 polypropylene vials에분주하여 -70 에보관하시고얼렸다녹이는과정의반복을피하십시오. Primary culture시 cell attachment와 spreading을돕기위하여 fibronectin 20 ug/ml의농도로배양플라스크를 pretreatment합니다. Subculture시에는배양플라스크안에있는배지에 10 ug/ml의농도로 fibronectin을직접첨가하여 complete medium을만들어사용하고, media change시에는추가로 fibronectin을첨가하실필요가없습니다. Growth Factor : Human recombinant basic FGF (GIBCO Cat. No ) 를 1% human serum albumin을포함한 Dulbecco s Phosphate Buffered Saline (DPBS, GIBCO Cat. No ) 에녹여 2 ug/ml의 stock solution을준비합니다. 마찬가지로 filtering이필요하지않으며, 멸균된 polypropylene vials에분주하여 -70 에보관하시고얼렸다녹이는과정의반복을피하십시오. Growth Factor : Human recombinant EGF (GIBCO Cat. No ) 를 bfgf와동일한방법으로 2 ug/ml의 stock solution을준비합니다. Isolation and Establishment of Primary Cultures HUVEC의 isolation method는 Jaffe et al의 reference (Ref. 7) 로가장널리알려져있습니다. 간략히서술한다면, 먼저 untraumatized umbilical cord segments를 1 % Penicillin- Streptomycin (GIBCO Cat. No ) 을포함한배지로혈액세포를여러번씻어냅니다. 또한, 25 cm2배양플라스틱을 20 ug/ml fibronectin을포함한 3ml의 endothelial-sfm로 1시간동안 preincubation하여준비합니다. 0.1% Collagenase (GIBCO Cat. No ) 를포함한따뜻한배지로 Umbilical veins을 25분간 incubation한후, 50ml의배지로어느정도세포외기질이녹아내린 cords를양끝에서골고루씻어내립니다. 모아진세포현탁액을 2 회원심분리하여 wash out한후, cell pellet을 2ml의 endothelial- SFM로 resuspending하여준비한배양플라스틱에넣어줍니다. 총 5ml의배지에 20 ng/ml bfgf, 10 ng/ml EGF, 1% Penicillin-Streptomycin 을첨가한 complete medium으로 5% CO2 incubator에서배양합니다. 처음 24시간후, DPBS로 adherent blood cells을 wash하여주고, 그다음부터는 2-3일간격으로 media change합니다. 이때, HUVEC은 antibiotics에매우민감하므로 primary culture의 48-72시간후에반드시제거하여주어야합니다 Volume 15 KDR Process 5

3 Cell Culture Establishment of Secondary Cultures HUVEC의 media change는 2-3일, subculturing은 1:2의비율로 4-5일간격으로시행합니다. 이때, HUVEC은 SFM에서 proteolytic enzymes 에또한민감하므로, 0.05% Trypsin-EDTA (GIBCO Cat. No ) 로 10-20초만처리하여원심분리후얻은 cell pellet을 SFM으로 2-3회추가로 wash out할것을권합니다. 마지막으로, SFM에서세포의부착은배양플라스크의종류에도민감하므로, 세포분주전에플라스크를 DPBS로 wash하여주면고른세포의부착에도움이될것입니다. Secondary culture부터는 Human Endothelial-SFM에 10ug/ml fibronectin, 20ng/ml bfgf, 10ng/ml EGF를포함한 complete medium을사용하며, media change는 50% 만을제거한후 fresh complete medium을 50% 추가할것을권장합니다. Cryopreservaion을위해 2-3 x 10 6 cells/ml을준비하고, 7.5% DMSO와 92.5% Human Endothelial-SFM(50% fresh medium, 50% conditioned medium) 을사용하여 slow freezing합니다. A B FIGURE 1. Phase contrast microscopy of endothelial cells cultured in Human Endothelial-SFM. Panel A. Normal cobblestone morphology (inset: serum-supplemented Medium 199). Panel B. Capillary-like tube structures (inset: serum-supplemented Medium 199). References 1. Gimbrone, M.A. Culture of Vascular Endothelium. Progress in Hemostasis and Thrombosis 3:1-28 (1976) 2. Jayme, D.W., Epstein, D.A., and Conrad, D.R. Fetal Bovine Serum Alternatives. Nature 334: (1988) 3. Rosa, M.D. Serum Substitutes: Is there a solution BioPharm 2: (1989) 4. Gorfien, S., Spector, A., DeLuca, D., and Weiss, S. Growth and Physiological Functions of Vascular Endothelial Cells in a New- Serum Free Medium (SFM). Exprimental Cell Research 206: (1993) 5. Battista, P.J., Bowen, H.J., and Gorfien, S.F. A Serum-Free Culture of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Focus 17: (1995) 6. Soderland, C., Veres, J.S., and Battista, P.J. Serum-Free Culture of Human Endothelial Cells for Leukocyte Adhesion Application. Focus 17: (1995) 7. Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., and Minick, C.R. Culture of Human Endothelial Cells Derived From Umbilical Veins : Identification by Morphological and Immunological Criteria. Journal of Clinical Investigation 52: (1973) 6 KDR Process Volume 15

4 Advances in Stealth TM RNAi Design for RNA interference Michaeline Bunting Mason Brooks, Carmina Catuar, Miro Dudas, Kristin Wiederholt, Daniel Duan, Feng Liang, and Peter Welch Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA ABSTRACT RNA interference(rnai) 는다양한 Mammalian cell과모든생물체의 Sequence specific gene silencing을매개하는강력한연구방법이다. 좋은 RNAi 결과를얻기위해서는특징적인 RNAi molecule과뛰어난효과를나타낼수있는설계가필요하다. 화학적으로변형되어합성된 dsrna인 Stealth TM RNAi는변형하지않은 sirna에비해높은안정성과특이성을가지고있다. 어느유전자에도적용되는 Stealth TM RNAi를만들기위하여, Invitogen사는높은효율성을가지는 BLOCK-iT RNAi designer를계발하였다. 기능이확인된 1000개의 Stealth TM RNAi가특정적이고고효율의 Stealth TM RNAi를가능하게해준다. 이러한특징들은 human genome에서확인된대부분의 Stealth TM RNAi sequence와함께 BLOCK-iT RNAi design algorithm안에첨가되어통합되었다. (www.invitrogen.com/rnaiexpress). 새로구성된 Stealth TM Select RNAi는 A549 Cell에서고효율의 gene silencing을매개한다. INTRODUCTION RNA interference(rnai) 는생리학과병리학적과정을포함한유전자와유전자군을밝히기위한효율적인실험방법이다 [1]. 동물세포에서효과적인 RNAi실험을하기위한방법중하나는 short interfering dsrna(sirna) 를직접주입시키는것이다. sirna의한가닥은 RNA-Induced Silencing Complex(RISC) 와결합하여, 완전한 Target RNAs를 site-specific하게분해하게된다 [2]. 각각의 Target RNA는세포내의 endonuclease에의한 RISC 분열로인해빠르게분해되어효과적으로기능을제거하게된다. 또한 RNAi는 Target RNAs의발현을효과적으로저해하게되는데, gene-silencing은종종 non-specific 또는 off-target effect로인하여부정확한결과를가져온다. 이러한특징은화학적인변형과원하지않은작용을저해하는과정에서최대의 RNAi효과를얻을수있는전략적인방법을만들게하였다. Stealth TM RNAi는화학적으로변형된 25nt의 Blunt end dsrna로서, serum에안정되고, sense strand가매개하는 off-target effect를저해할뿐아니라, stress response pathway의비특이적인유전자발현을억제하는기능을가지고있다. 결론적으로이러한화학적변형은 in vitro와 in vivo에서효과적이고정확한 RNAi결과를가져오게되는것이다. Gene-silencing을매개하는 sirna와 Stealth TM RNAi의효율성과특이성은 target site 선택에따라달라진다. Target gene과밝혀진 transcripts 의확실한유전자비교분석은 RNAi design에결정적인작용을한다. 그이유는 sirna와부합하는연속적인 11개의 Sequence를포함한유전자에서비특이적인 silencing일어날수있기때문이다 [3]. 진보되고향상된고효율의 RNAi sequence는효율적인 sirna와그렇지않은 sirna의 sequence분석을통하여최근계발되고있다. 본문은높은효율성증가와 off-target effect의감소로인하여진보된 Stealth TM RNAi에대해서술하고자한다. MATERIALS AND METHODS Stealth TM RNAi Stealth TM RNAi는 BLOCK-IT TM RNAi designer(http://rnaidesigner.invitrogen.com) 에서 design할수있다 Volume 15 KDR Process 7

5 pscreen-it TM Vector Preparation 각각의 Ultimate ORF entry clone으로부터얻어진 DNA는 PureLink 96 HQ Plasmid Miniprep Kit를이용하여분리하고, Hochest dye 로정량하였다. pscreen-it TM expression vector는 Gateway recombination technology를이용하여각각에상응하는 Ultimate ORF entry clone과 pscreen-it TM /lacz-gw/dest vector로만들어졌다. LR reaction product는증폭을하기위해 Mach-T1 E.coli에 transformation하였고, 증폭된 plasmid DNA는 PureLink 96 HQ Plasmid Miniprep Kit를이용하여분리한후, Hochest dye로정량하였다. 발현된모든 plasmid 를확인하기위하여 Forward: (5 -ATTGGTGGCGACGACTCCTG-3 ) 와 Reverse:(5 -ACCCGTGCGTTTTATTCTGTC-3 ) sequencing primer 를이용하였다. pscreen-it TM Target Screening Analysis GripTite 293 MSR cells은 600ug/ml Geneticin과 0.1mM NEAA, 10% FBS를포함한 DMEM으로배양하였다. Stealth TM RNAi는 96well plate 의 Grip Tite 293 MSR cell로확인하였고 transfection은다음과같이수행하였다. 최종 volume 100ul 안에 0.5ul Lipofectamin 2000, 0.2pmol Stealth TM RNAi, 80ng pef1a-emerald vector와 20ng pscreen-it TM expression vector를넣어 Transfection하였다. 배지는각각 3~5시간 37 도에서배양한후에바꿔주었고, Transfection후약 24시간뒤에 Media를제거하고, Mg2+ 와 Ca2+ 가포함된 HBSS 100ul로교체해주었다. Emerald protein 발현확인을위하여 HBSS를 100ul cell lysis buffer로교체한후세포는최소30분동안 -70 에서냉동시켰다 Reporter Detection Emerald L64F GFP fluorescence는 black side wall plate의단층세포를이용하여확인하였다. Growth media의 fluorescence molecule을제가하기위해 Media를 Mg2+ 와 Ca2+ 가포함된 HBSS로교체하였다. 세포내형광은 (495nm filter와 487nm Excitation을사용하여 506nm에서 detect하였다.) 형광측량은 SpectraMax Gemini EM plate reader(molecular Divice) 를사용하여확인하였다. 동결된모든세포 sample은약30분동안상온에서해동하였고, 일부를덜어내어 lacz/galactosidase Quantitation Kit(Molecular Probe, F- 2905) 를사용하여 β-glactosidaso활성을측정하였다. 형광측정은 435nm filter와 390nm Excitation을사용하여 448nm에서 detect하였다. A549 Transfection and qpcr Analysis 50nM Stealth TM RNAi는 A549 cell에 Lipofectamin TM 2000을이용하여 Transfection 하였고, 24시간뒤에세포를분해하여, RAN를추출하였다. LUX Primer를이용하여 Target유전자의 cdna양을 qrt-pcr로측정하였다. 모든 Sample은 GAPDH로 Control 측정하였다. Figure 1-Stealth TM RNAi exhibits increased specificity for target genes 8 KDR Process Volume 15

6 RESULT AND DISCUSSION Gene silencing의 specificity와 efficacy 모두가최대가될때최적의 RNAi라고할수있다. Stealth TM RNAi는화학적으로변형되어 sense strand 의 silencing을억제하고그로인하여특이성이증가되었다 (Figure 1). 이에비해변형되지않은 sirna duplex는 sense strand가관여하여원하지않은유전자를 targeting하는 off-target effect가나타날수있다. Guide strand에의해매개되는잠재적인 off-target effect를최소화하기위하여, Target RNA와 antisense strand 사이에서특이하게일치하는부분을찾기위하여노력하였고, 그중 34개의효율적인 Human Stealth TM RNAi를선택하였다. 선택한 Human Stealth TM RNAi는 pscreenit TM target screening system 을이용하여상응하는 Murine Target genes 의발현억제율을검사하였다. 그중 3 개의 Sequence 가 mouse target에 100% 유전자일치를보였고, 높은 Targeting 효율을보였다. 나머지 Stealth TM RNAi Sequence는상응하는 mouse target gene에한개또는그이상의일치되는부분을포함하고있었다. 일치하지않은부분은 gene silencing level과비교되어관찰되었다. Antisense strand의 5 end로부터 2~12 position의 mismatches는확연한 Knock-down 효율감소를보였고, 실험결과와일치하였다 [4] Stealth TM RNAi는 cross-species 분석을통한확인된정보를이용하여, 특이성을강화하였다 Figure 2-Position specific mismatches at the 5 end of the antisense strand significantly reduce the efficacy of Stealth TM RNAi molecules BLOCK-iT TM RNAi Designer를이용하여 171개유전자에해당되는 1000개의 Stealth TM RNAi 효율을 pscreen-it TM target screening system 을이용하여관찰하였다. 그결과 design된 90% 이상의 Stealth TM RNAi가 70% 이상의 knock-down효율이나타냄을증명하여, Stealth TM RNAi 가효율이매우높음을알수있었다 (Figure 2). Invitogen은진보된 Algorithm과특이성을결합하여, Human genome의겹치지않는 3개의 Stealth TM RNAi를 Design하고, Design된 Stealth TM Select RNAi의 gene silencing효과를실험하였다. Stealth TM RNAi 50nM을 A549 cell에 lipofectamin TM 2000을이용하여 transfection하였고, Target 유전자발현율은 24시간후에 qrt-pcr을통해분석하였다. 각각의 Stealth TM Select RNAi는 gene silencing을매개하여 80~90% 의높은 knock-down 효율을보였다 (Figure 3) Volume 15 KDR Process 9

7 Figure 3-Stealth TM RNAi sequence result in highly effective knockdown CONCLUSION Stealth TM RNAi는특이성과안정성이높고, 비특이성효율이적은화학적으로변형된 dsrna다. 효율성이높은 BLOCK-iT TM RNAi Designer를이용하여수천개의 Stealth TM RNAi를 Design하고효과를증명하였다. 효율이가장좋은 sequence와좋지않은 sequence의독특한 sequence 특징을 computational analysis를통해확인하고, Design Algorithm에도입하였다. 이 Algorithm을통하여 human 유전자의겹치지않은 3개의 Stealth TM Select RNAi를 design할수있게되었다. Stealth TM Select RNAi에대한자세한정보는 Reference 1. Dykxhoorn, D.M.et al. (2003). Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol.4(6): Schward.D.S.et al. (2003). Asymmetry in the Assembly of the RNAi Ezyme Complex. Cell.115(2): Jackson, A.L.et al. (2003). Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nature Biotechnology 21(6): Haley,B. and Zamore P.D. (2004) Kinetic Analysis of the RNAi enzyme Complex. Nature Structual & Molecular Biology 11(7): KDR Process Volume 15

8 SuperScript TM Plus Direct and indirect cdna Labeling System Achieve better results with Alexa Flor dye over home brew CyDye reagent methods. 서로다른 Biological process 동안일어나는변화를이해하는데있어서, DNA microarray는단순한자극에대한모든 gene의 relative expression 의 snapshot을나타낼수있다. 이러한강력한방법은 functional genomics studies의여러가지방법중에가장좋은방법이다. 예를들면, DNA microarray는 (1) 전통적인 brain tumor (2) host-pathogen interaction 연구그리고, (3) alternative splicing 분석등 living system에서 drug response를연구하는데이용되어진다. 이러한, 연구의가장중요한 point는, gene이분화되지않으면 2개의 label되어진 sample signal은똑같을것이라는가정에서시작된다. 두 signal의움직임에대한변화율은똑같이 zero일것이다. Signal ration에있어서 noise 의크기는 gene expression에서서로다른작은변화에대한 researcher activity에의해결정이된다. 많은요소들이 Microarray noise에영향을준다. Noise을감소시키는가장효과적인방법은 labeling protocol 을반복적으로할수있는그리고, 밝고안정적인형광 dye를서로잘 match 할수있는 robust이다. Invitrogen의새로운 SuperScript Plus Direct and indirect cdna Labeling System은이러한목표를달성가능케한다. Advantages of SuperScript TM III Reverse Transcriptase (RT) SuperScript Plus Direct and indirect cdna Labeling System 은 robust cdna 합성을위해, SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) 를이용한다. SuperScript III RT는 primer specificity를높여주는역할을하는열에대한안정성을증가시켰고, enzyme 작용에영향을주는 RNA template 의 secondary structure 를감소시켰다. 결과적으로, SuperScript III RT는 longer cdna product yield가높다. 부가적으로, 증가되어진 half-life(50도에서 220분 ) 는별도의 enzyme없이 reaction time을연장시키는기능을한다. Advantages of Alexa Fluor Dyes Alexa Fluor 555와 Alexa Fluor 647은존재하는모든 microarray scanner에적합하다. 부가적으로, 이러한 dye는 fluorescence quenching을나타내는 DNA에서 dye-dye interaction 에저항성을나타낸다. 이러한기능적인속성은 signal을더정확하게만들고, microarray 실험에서 gene expression change에대한 resolution을높여준다. 이미발표된연구자료를보면, 이들두 dye는 95% prediction level에서 1.3배의 gene expression level 차이를나타낸다. SuperScript Plus Direct and indirect cdna Labeling System은 amine-modified nucleotide incorporation과 dye coupling을효과적으로높이기위해, Optimized reagent와 Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 647를함께포함한다. 또한, Alexa Fluor 555와 Alexa Fluor 647은 11-atom spacer에 dutp nucleotide가결합되어져있다. 이러한, labeled 5-aminohexylacrylamido-dUTP(aha-dUTP) nucleotide는 Nucleotide 와 dye 사이 spacer에서의 unique hexylacrylamide linker에의해 modified되어진다. 이 spacer는 Nucleotide 와 dye 사이의 interaction을감소시켜결과적으로는, 더강력한 conjugation을만들어준다. New Low-Elution Columns SuperScript Plus Direct and indirect cdna Labeling System은 microarray hybridization 전에, dry-down step을없애는것에의해전체 protocol 시간을짧게만드는 reducing volume(20ul) elution을위한새로운 purification column을포함한다. 이러한, column은더욱깨끗한 cdna을만들어내고, 더나아가 microarray background와 noise를현저하게감소시킨다. Direct cdna Labeling with SuperScript Plus and Direct cdna Labeling System; 간단하고, 빠르며재반복적인결과때문에, cdna 합성과정에서 labeled nucleotide의 direct incorporation은 microarray expression analysis에서가장인기있는방법이다. SuperScript Plus Direct and Direct cdna Labeling System은단지 3가지 step만이필요하다.: 1) mrna나 total Volume 15 KDR Process 11

9 RNA에 anchored-oligo(dt) annealing, 2) reverse transcrptase에의한 Alexa Fluor 555-dUTP 와 Alexa Fluor 647-dUTP의 incorporation, 그리고, 3) incorporation되어지지않은 nucleotide로부터 labeled cdna purification. CyDye(Ameraham Biosciences) 를가지고가장보편적인 home brew 와 direct cdna labeling 방법을비교해보면, 새로운 Superscript Plus Direct cdna Labeling System이더정확하다. 이들은두가지차이점을지닌다. 두 Dye channel로부터 signal은 scatter graph에서 plot되어지고, correlation coefficient 가결정되어진다 (Figure 2, Figure 3). 뿐만아니라, 서로다른 gene expression percentage를두가지방법에의해 calculate 했다. 그결과, Superscript Plus Direct cdna Labeling System이 correlation coefficient이더높으며, false calls이더낮음을보여준다. 12 KDR Process Volume 15

10 indirect cdna Labeling with SuperScript Plus Indirect cdna Labeling System RT동안 amion-modified nucleotide 의 Enzymatic incorporation 과 Fluorescent succinimidyl ester 에의한 cdna subsequent chemical coupling은, DNA microarray expression analysis를하는데있어서많은과학자들이 labeling method로즐겨하는방법이다. SuperScript Plus Indirect cdna Labeling System 은 Alexa Fluor dyes를가지고 two-color indirect cdna labeling을할수있는첫번째complete kit이다. 이 kit는 aminoallyl-dutp 와 aminohexyl-datp nucleotide를포함한다. 뿐만아니라, single-use tube 의 Alexa Fuor 555와 Alexa Fuor 647 dye succinimidyl ester를포함한다. 또한, superscript direct cdna Labeling System은 low-elution volume을위한 purification colume을포함하기도한다. Superscript Plus Indirect cdna Labeling System은 4가지 step이필요하다 (Figire 4) : 1) mrna나 total RNA에 anchored-oligo(dt) annealing, 2) RT에의한 aminoallyl-dutp 와 aminohexyl-datp nucleotide의 incorporation, unincorporated nucleotide 제거를위한 purification, 3) Alexa Fluor 555 succinimidyl ester와 Alexa Fluor 647 succinimidyl ester 의 coupling, 4) free dye로부터 labeled cdna purification. Superscript Plus Indirect cdna Labeling System은가장보편적인방법인 CyDye에의한 home brew indirect cdna labeling method와비교해보았을때, 더정확하고 sensitive 했다 (Figure 5). 이 system은잘못된 down-regulated genes이없음이밝혀졌고, 단지 positive gene의 0.5% 만이잘못된 up-regulated 로밝혀졌다. More Positive Features Detected and Better S/B Ratios. Home brew method보다더높은 Correlation coefficients 와더낮은 false calls 때문에, SuperScript Plus cdna Labeling Sytem은 positive gene detect에더효과적이고, DNA microarray에서더나은 S/B rations를제공한다 (Figure 6, Figure 7) Volume 15 KDR Process 13

11 Superscript Plus Direct 와 Indirect cdna Labeling System 의상세한정보를원한다면, 방문하시기바랍니다. Ordering information 14 KDR Process Volume 15

12 Proteomics ZOOM IEF FRACTIONATOR A Tool to Enhance Your Protein Profile Solution Phase IEF Solution phase IEF를이용한 Native protein fractionation은 Bier et al., (1979) 에의하여처음시도되었다. 그들은 ampholytes를이용하여수평상태의장치에서 ph gradients를만들었다. 이장치의 sample chamber에는 60 ml 부피의샘플을담을수가있었다. 이후에이장치에대한개선으로 1987년에 Faupel가 immobilized ph membranes과분리된 chamber를이용하여 ml sample 을분리할수있는장치를개발하였다. (Faupel et al., 1987). 이 large-scale의전처리용의장치는 solution phase에서 IEF를수행하고분리하려는 Protein의 pi 값에기초하여각각의 chamber 안으로 focusing을한다. Zuo and Speicher (2000) 는복잡한 proteome을각각의 pi range 별로 denaturing 조건하에서적은 sample 부피 (~0.5 ml) 에서 fractiontion을수행하였다. ZOOM IEF Fractionator는 Zuo and Speicher의방법에기초하여제작되었다. Introduction Two dimension gel electrophoresis는 protein profiling과 mass spectrometry를사용하기전의 sample preparation에좋은방법이된다. 그러나광범위한 pi range와생물학시료에서적은농도의 protein은이기술의유용성을제한한다. 2DE 실험에서 Fractionation과 enrichment 는 lower abundant protein의농도를증가시키고 sample complexity를감소시키고 resolution을증가시킨다. Narrow range zoom IPG strip은특정 pi 범위내에있는 protein을증가시키는데사용되고그범위내에있는 protein의 resolution을증가시킨다. narrow range gels을사용하는단점은관심있는 pi 범위밖의 protein은완전히잃어버리고, 많은 protein을 loading하였을경우에는 resolution 이감소된다는것이다. 이것은 Narrow range 2DE를하기전에 solution-phase IEF를수행함으로서이단점을극복할수있다. 이연구에서는 downstream의 2DE와 MALDI-TOF분석에 pre-fractionation과 enrichment를할수있는효과적이고재현가능한 ZOOM IEF Fractionator의이용에대하여설명하겠다. Figure 1. ZOOM IEF fractionator Results-Fractionation ph 3.0, 4.6, 5.4, 6.2, 7.0, 10.0 다섯개의 disk를사용한 fraction에서 2, 3, 4번째 fraction을갖고 4-7 strip에서실험한결과 ph별로정확한 fractionation이되었음을볼수있다. (ph :fraction1, ph :fraction2, ph :fraction3, ph :fraction4, ph :fraction5) Volume 15 KDR Process 15

13 Proteomics FIGURE 2. RCS sample Fraction 을 4-7 IPG strip 에서 2DE 를한결과. FIGURE 3. S. Dawley sample Fraction 을 4-7 IPG strip 에서 2DE 를한결과. Results - Narrow Range IPG Narrow strip 을이용한실험에서는 crude extract 보다 fractionation 을거친 sample 에서보다많은 spot 을확인할수있다. FIGURE 4. Narrow Range IPG strips 을사용하여 crude extract 와 Fractions 2 의 spot 을비교한결과 16 KDR Process Volume 15

14 Proteomics Result - Spot Resolution Narrow strip 을사용할경우 broad range 에서분리되지않았던 spot 들이분리됨을볼수있다. FIGURE (top) IPG strips 과비교하여 narrow range (bottom) 의 resolution 이향상됨을볼수있다. Crude extract 와비교하여보았을때 fractionation 을거친 sample 이 spot 수와 sensitivity 가향상되었음을보여준다. FIGURE 6. Fractionation 은 protein spot 의수와강도을증가시킨다. 화살표는 crude extract ( 좌 ) 와 Fractionated ( 우 ) samples 에서동일한 protein 을가리킨다. Results - Spot intensities Crude extract 와비교하여보았을때 fractionation 을수행한 sample 이 sensitivity 가증가하였음을보여준다. FIGURE 7. Fractionation 샘플의 sensitivity 가 Unfractionation sample 보다강하다 Volume 15 KDR Process 17

15 Proteomics Results-differential analysis Crude extract 2DE gel 에서나타나지않았던 spot 들이 fractionaion 을거치면서나타난다. FIGURE 9. 화살표로표시된 protein 은 crude extract 2DE gel 에서는관찰되지않은것이다. Conclusion 상업적으로이용가능한 disk를이용하는 Solution Phase IEF 는 isoelectric point에기초한정확하고재현성있는결과를제공한다. Pre-fractionation은정확한 pi값내에서 protein을농축시키고 visualization되는 spot의양을증가시키고각각 protein의 staining 강도를늘리며 MALDI-TOF에서볼수있는 peptide의수를늘린다. Solution phase IEF를거친후의 narrow range gel에서의 2DE는높은 resoultion을제공한다. Reference 1. Zuo, X. and Speicher, D.W. (2000) Anal. Biochem. 284: Zuo, et. al. (2001) Electrophoresis 22: Zuo, X. and Speicher, D.W. (2002) Proteomics: 2: Zuo, X., Hembach, P., Echan, L., and Speicher, D.W. (2002) Journal of Chromatography B 782: Zuo, X. and Speicher D.W Microscale solution isoelectrofocusing: A sample prefractionation method for comprehensive proteome analysis. In: Methods in Molecular Biology: Protein Purification Protocols. Humana Press, Totowa, NJ (P. Cutler, ed.), pp KDR Process Volume 15