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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) ISSN / eissn 총설 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 장의경, 신현경, 백승필 1 * Recent Researches for Diatom as Inorganic and Bioenvironmental Materials Eui Kyoung Jang, Hyun Kyeong Shin, and Seung Pil Pack 1 * 접수 : 2013 년 12 월 17 일 / 게재승인 : 2014 년 2 월 7 일 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: One of the most abundant microalgaes, diatom is characterized by its unique cell wall structures composed of nano-patterned silica. Due to its highly ordered porosity, these silica frustules, which are found as sediments called diatomite, were used as a cheap adsorption material for water purification. Recently, new emerging nanotechnology compels many researchers to have interest in such diatom s unique properties (eg, nano-scale mesoporosity, photo luminescence, light transparency, etc.) as biogenic inorganic materials as well as the biomass resource (conventional usage of microalgae). In this review, we will focus on the current knowledge about the diatoms research and the possibility of its applications. Keywords: Diatom, Nanotechnology, Biogenic inorganic material, Frustule, Bioenvironmental application 1. 서론 규조류 (Diatom) 는 2µm~2 mm 까지의다양한크기로분포 고려대학교생명정보공학과 Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, Korea Tel: , Fax: 하는단세포조류로지구상에서흔히볼수있는대표적인식물성플랑크톤이다. 규조류는육상총 1 차생산량의 20~ 25% 를차지하고, 해상생물량생산의 40% 를차지하고있기때문에수백만년동안해양의생산자로써생태계에중요한역할을담당해오고있다. 현재, 미세조류들은세포질량대비높은광합성효율을갖고있어서배양을통한지질이나바이오연료및생체유용자원의생산등의생산에주로활용되고있다. 한편, 규조류는다른해양미세조류와달리세포외벽구조로무정형의수화된실리카를껍질 (silica frustule) 을형성하는특징을갖는다. 단단한무기질의껍질들은세포가사멸한후에도남아있게되는데, 이것이토양에축적된것을규조토 (Diatomaceous earth (DE) or diatomite) 라고하며, 수질개선을위한필터에서연구실의 DNA 정제를위한분자생물학적도구에이르기까지예전부터널리사용되고있다. 최근들어나노공학의발달로미세기본구조의형태적특성이중요하게다루어지며규조류의독특한미세구조가주목받고있다. 이에따라, 규조류라는단세포생물의실리카껍질을실리카입자로써활용하려는추세이다. 규조류는각각의종마다특징적인크기와모양이있고공통적으로다공성표면을가지므로각각의규조류껍질은고유의특성을갖는실리카입자로활용될수있다. 이에따라규조류연구는과거의생물학적진화의계통분류정도의연구에서벗어나, 실리카외각형성원리를분자적으로접근하거나특정종의껍질을실리카입자로사용하여나노공학소재, 산업적응용소재로써활용하려는연구가진행중이다. 본총설에서는규조류의생물구조적특징에대해정리하고현재진행되고있는규조류에대한연구동향을소개하며무기소재및생물환경소재로써의응용가능성을알아본다.

2 10 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) 2. 규조류 (Diatom) 의특징 2.1. 규조류의구조적다양성규조류는전체지구생물종중에서총유기물생산량의 25% 를차지할정도로널리분포되어있다. 약 2 µm~2 mm 의다양한크기로분포하는규조류는공통적으로단단한다공성실리카 (silica) 벽을갖는단일세포이며각각종의독특한껍질형태에따라분리하였을때약 10 만종이상이존재하는것으로추정된다 [1,2]. 규조류에대한분류는아직완전히정립되지않았지만형태에따라크게 2 가지의분류가적용되고있다. 뚜껑 (valve) 의모양과무늬가방사상의대칭구조를이루는중심규조목 ( 中中中中中 :Centrales) 과깃털형태로가늘고길게늘어진축을가진우상규조목 ( 羽羽中中 : Pennales) 으로나누는것이다 [3]. 그러나이러한계통분류는방사상의구멍배열을갖는양쪽성의규조류인 Biddulphia Gray, Odontella C.Agardh 종및방사상의패턴없이길게늘어진 centric diatom 인 Cymatosira Grunow 종등의구분이어렵기때문에분자생물학적동정을이용한분류가대두되고있다 [4]. 규조류는환경지표로써서식환경의변화와밀접한연관이있고, 규조류의껍질은단위중량당넓은표면적을갖는다공성구조의생물재료로써폭넓은잠재성이있으므로국가차원에서관리가되고있다. 현재미국은자국내규조류종관리를위하여별도의데이터베이스 ( colorado.edu) 를운용하고있다. 국내에서도한국해양미세조류은행 ( 에서국내연안에포집되는규조류를관리하고있으며분양서비스를제공하고있다 규조류껍질 (Frustule) 의형성매커니즘규조류는공통적으로위, 아래두개의외각으로구분되며페트리디쉬 (petri dish) 모양으로결합되어있다. 규조류가성장함에따라두외각은서로멀어지고중앙의겹쳐진부분 (girdle band) 에서새로운실리카외각이형성된다 ( 그림 1A). 복제가반복될수록아래껍질 (hypovalve) 을기반으로분열된종류는크기가점점작아지게된다. 분열이불가능할만 큼작아진것들은반수체 (haploid) 상태의포자체단계로넘어가며크기를회복한다. 규조류의실리카 (silica) 외막 (silanol group [Si(OH) 2 or Si-OH]) 형성은수용액상태의규산 (silicic acid, [Si(OH) 4 ]) 를섭취하면서가능해진다 [5]. 세포막상에는배양액상에존재하는규산을세포질내부로수송하기위한 silicic acid transporter (SIT) 가존재하는데, 이를암호화하는 cdna 가 Hildebrand 연구팀에의해동정되었다 [6]. Transporter 에의해세포질내로이동된규산은 silica-transport vesicle (STV) 에의해세포막분열지점인 girdle band 상에위치하고있는 silica-deposition vesicle (SDV) 까지수송되어진다 ( 그림 2B) [7]. STV 가 SDV 까지이동하는자세한방식은아직밝혀지지않았지만 SDV 의형성과함께미세소관 (microtubule) 이형성된다는사실이보고되었다 [8]. SDV 로수송된수용성규산 (silicic acid) 이규조류의복잡하고다양한표면구조로변화하는원리는아직명확하지않지만, 계속된연구를통해매커니즘에관여하는중요한요소들이밝혀지고있다. Eecky 연구팀 (1973) 에따르면, 규산 (silicic acid) 의고정은다수의히드록실기 (hydroxyl group) 를갖는단백질에의해이루어진다는사실이밝혀졌고 [9], Shimizu, K. 연구팀 (1998) 에의해해면동물인 Tethya aurantia 종으로부터다수의아민 (amine) 및히드록실기 (hydroxyl group) 를갖는단백질 (silicatein 으로명명됨 ) 이동정되었다 [10]. 실리카테인 (silicatein) 과유사한도메인을갖는단백질은규조류상에서도발견된다. 실라핀 (silaffin) 은규조류에서발견되는실리카고정단백질로써 Cylindrotheca fusiformis 으로부터추출되어져기능적측면에대해많은연구가이루어졌다 [11]. 실라핀 (silaffin) 은여러종류가발견되었는데약간의서열차이와변이 (modification) 된정도에따라 7 개의종류로나뉘지만, 모두다수의 lysine, arginine 잔기를포함하며고도로 post-modification 되어있다는것이특징이다. 실라핀 (silaffin) 의양성잔기들은규산단량체와정전기적상호작용을하여뭉치게만든다. 응축된규산 (silicic acid) 은 siloxane bond 를이루며원형으로커지다가 3 차구조로발달한다고알려져있다. 세린 (serine) 잔기의인산화에의한음성화는낮은 ph 에서도실리카 Fig. 1. SEM (scanning electron microscope) images of diatoms. (A) Biddulphia reticulata, a centric diatom. Girdle bands are seen at the center of frustule (size bar = 10 µm). (B) Eupodiscus radiatus, a centric diatom (size bar = 20 µm). (C) Diploneis sp., a pennate diatom. Two diatom frustules in which raphes, feather-like slits, valves, and girdle bands was seen (size bar = 10 µm). (D) Melosira varians, a centric diatom (size bar = 10 µm) (66)

3 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 11 (silica) 고정효율의감소를막는안정화역할을하는것으로밝혀졌다 ( 그림 1C) [12]. 위와같은규조류의외각형성매커니즘을탐구하는것과동시에, 이러한실라핀 (silaffin) 의실리카고정매커니즘을모사하여유용한실리카기반나노구조체를만드는연구들이다양하게시도되고있다. Manfred Sumper 팀은실라핀 (silaffin)-1a 와 monosilicic acid 를섞어준상황에서시간에따라고정된실리카 (silica) 형태를주사전자현미경 (SEM, scanning electron microscope) 으로관찰하여시간에따라형성되는모양 ( 나뭇가지구조에서구슬형태까지 ) 이다르게나타남을보고하였다 [13]. 현재, 실리카고정펩타이드를이용한연구는대부분복잡한형태보다는균일한구체형태의실리카 (silica) 를제어하는데초점을맞추고있다. 하지만, 실라핀 (silaffin) 이나 polyamine 을이용한실리카나노구조체구성의분자적접근법으로규조류가갖는실리카 (silica) 3 차원구조를표현하기위해서는앞으로많은연구가진행되어야할것으로보인다. 비록, 규조류의실리카고정에대한매커니즘을분자수준에서직접이용하기어려운수준일지라도, 10 만여종이상의규조류실리카껍질에서보고되는다양한구조적특징을목적에맞게특성화한다면, 기존소재의한계를넘는생물유래무기소재로써활용가능할것이다. 다음은규조류를환경생물소재로활용하여생물학적원료를생산하거나환경미생물로활용한사례와무기소재로써실리카구조체및센서등에활용한사례를알아본다. 3. 환경생물소재측면에서의응용 3.1. 바이오디젤및생물유용물질생산미세조류는하천및해양생태계의 1 차생산을담당하여개체수가많고널리분포하는생물종이기때문에각종마다특이성이잘보존되어있다. 그만큼미세조류로부터생산되는대사물질도매우다양하다 [14]. 또한일반적으로미세조류는식물보다월등히빠른성장으로생산성이높고특정대사물질을고농도로얻어낼수있어서중요한환경생물소재로활용되었다. 미세조류로얻어낼수있는물질로는단백질, 지질, 색소, 고분자 (polymer), 생리활성물질등이있다. 규조류역시미세조류의일종으로오래전부터지질및생리활성물질을생산하기위한균주로사용되어왔다. 초기규조류의활용은지질생산에높은비중이두어졌다. Dunahay 연구팀은 Cyclotella 종에지질합성에필수적인 Acetyl CoA carboxylase 유전자를복수도입하여생물연료 (biofuel) 생산량을늘리려고하였으나상용화에성공하지는못하였다 [15]. 하지만, 고부가가치의건강보조제나제약분야에서는 docosahexaenoic acid (DHA) 및 eicosapentaenoic acid (EPA) 등의지질이성공적으로추출되어사용되고있다 [16]. 또한화장품을위한단백질생산이나항생제생산및동물사료를위한다양한색소생산을위해규조류를이용한다 [17,18]. 한편, 규조류는일반미세조류와달리규소성분의단단한껍질을갖고있어서세포기질성분의추출후남은껍질이부산물로여겨질수있지만, 최근오염원제거 (pollution remediation) Fig. 2. The structure of a diatom frustule and the process of silica frustule formation with a cell generation. (A) Diatom frustule structure composed of hypovalve, epivalve, and girdle band. (B) Cell division based on silica frustule formation. (C) Representative sequence of silaffin peptide involved in in vivo silica formation in the silica deposition vesicle (SDV). Silaffin is characterized by its highly posttranslational modification.

4 12 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) 및나노공학 (nanotechnology) 분야에대한관심이커지며실리카껍질을천연소자로활용하기위해규조류를배양하는사례가늘고있는추세이다 수질측정의지표종다양성이풍부한규조류는서식환경이다양하며환경변화에민감하게작용하기때문에오래전부터환경오염의생물지표 (bioindicator) 로이용되었다. Evensom W. E. 는계절변화에따른수환경내의화학물질변화와규조류의군집의상관관계분석에서 18 가지화학물질에대한규조류 22 종의군집을조사하여규조류가가지는생물지표로서의가능성을확인하였다 [19]. 규조류는외부환경변화 ( 온도, 염도, ph, 영양원, 난기류등 ) 에대해형태의변이를보이기도하는데, 주로온도및염도에따라실리카껍질의 pore 형태가변한다고보고된바있다 [20]. 현재는규조류를이용하여수질오염의정도를파악하는방법으로여러가지지수들을이용하고있다. GI (Genetic Index) 는부영양화의평가보다는유기오염측정에적합한지수로오염과관련된규조류종의비율을나타내고 [21], DAIpo (Diatom Assemblage Index for organic pollution) 은유기오염물질의유무에따라오염된수질과깨끗한수질의 diatom 종의상대적차이를지수로표현한다 [22]. 이외에도부영양화평가에용이한 TDI (Trophic Diatom Index) [23], 부생균의지수를나타내는 SI (Saprobic Index) [24], 비점오염원을관찰하기위한 DMA (diatom model affinity) 를사용하기도한다 [25] Bioremediation 미세조류는수중생태계의 1차생산자로써생태계의유지에중요할뿐만아니라, 중금속및독성물질을제거를위한생물정화기능까지담당하고있다. 또한, 미세조류의일종인규조류도중금속및 dichlorophenol과같은독성화학물질을효과적으로제거할수있다는것이알려졌다 [26]. 규조류는고농도의중금속이온환경에서살아남기위해금속이온과결합하는 glutathion의중합체인 phytochelatin (class III metallothioneins; Mt III) 을생산한다. Phytochelatin의생산은 phytochelatin synthase (PCS) 에의한 glutathion의중합반응으로합성된다. 이때, PCS의활성은금속이온과결합한 glutathion 에의해조절되어, 중금속의노출강도에따라비례하는양의 phytochelatin이합성된다 [27]. 한편, 세포배양을통한오염물처리과정은세포의재사용이힘들고생물체의대사에영향을많이받아서공정을조절하기어렵다는단점이있다. 이를극복하기위해규조류의외골격을사용하는방안이고려되었다 [28]. 그러나, 규조류껍질을사용한오염물제거는껍질의주성분인실리카표면과오염물의물리화학적상호작용에의존하므로중금속이나다양한유기오염물에대한응용은제한적인상황이다. 실리카표면의하이드록실기는친수성오염물질들과수소결합을이루어흡착반응이일어나므로주로아민기를포함한유기오염물에서흡착율이높게관찰된다 ( 그림 3A) [29]. 오스트레일리아의 Losic 연구팀은규조류껍질의제한된흡착능개선을위해표면처리를하여수은이온 (Hg(II)) 의 Fig. 3. Application of diatom frustule for adsorption of the heavy metal ions (Environmental remediation application). (A) Adsorption mechanism of silica-based adsorbent. (B) Elimination of Hg ion by the adsorption ability of diatom frustule enhanced by surface modification.

5 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 13 흡착능을향상시켰다. 연구팀은규조토샘플표면에각각 3- mercaptopropyl-trimethoxysilane (MPTMS), 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTES) 및 n-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (AEAPTMS) 처리를하여 mercapto-, amine- 및 polyamine 기를도입하였다. 표면처리된규조토샘플을이용하여수은이온흡착반응을진행한결과각각 185.2, 131.7, mg (Hg(II)) / g (particle) 의결과를얻었으며 mercapto-, polyamine 도입된샘플에서효율적인흡착반응이일어나는것으로관찰되었다 ( 그림 3B) [30]. 4. 무기소재측면에서의응용 규조류의껍질은순수실리카로구성되며다공성표면과넓 은표면적을제공하고있어서정화, 정제분야 ( 수질정화용필터및 DNA 정제등 ) 에주로사용되어왔다. 이와같은규조류의구조적특성은기존의화학적합성방법으로모사하기어려운부분으로써최근들어진단및약물전달, 반도체분야의나노공학발달과함께기존소재를뛰어넘는활용성이기대되고있다. 본단락에서는규조류껍질의특성을이용한나노공학적연구및응용사례에대해알아본다 Template and Scaffold 규조류껍질은종마다특이적인모양과표면에수많은구멍들을갖고있어서뛰어난중량대비표면적을제공한다. 표면의독특한나노사이즈구멍은계층적으로존재하는데, 커다란구멍 (50 nm 이상 ) 안쪽에미세구멍 (50 nm 이하 ) 들이존재하는고차나노구조로이루어져있다 [31]. 또한껍질의 Fig. 4. Preparation of nano-patterned metal structure via metal evaporation using diatom frustule as template matrix. (A) Diatom silica frustule was used as deposition support (engraving manner) for preparation of metal micro-particles, (B) Half valve of diatom frustule was used as template support (intaglio manner) for preparation of metal surface.

6 14 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) 재질은무기질인실리카로써다른생물유래물질과달리화학처리및열처리에강한특성이있다. 이러한특성들로인해규조류의껍질은뛰어난생물유래템플릿으로써높은활용가치를지닌다. 금속나노구조체는일반적으로박막 (thin-film) 이나다공성매트릭스형태또는구형및막대형의나노파티클로제작되고있으며모양에따라특이적인물리적특성들이존재하여반도체, 센서및의료분야에대한활용성이활발히연구되고있다. 현재, 이러한금속나노구조체제작을위해서다공성막이나제올라이트및콜로이드등의인공구조물을이용한방법들이적용되고있으나정밀성의한계로고집적화된나노구조제작을위한인공템플릿의적용은아직많은연구가필요한상황이다 [32]. Northwestern 대학의 Mirkin 교수팀은다공성구조인규조류껍질을템플릿으로활용하여나노패턴의금속입자제작방법을보고하였다. 연구팀은 Synedra 와 Navicular 종의껍질을템플릿으로하여아민표면처리후 DNA 단일가닥을표면에고정시키고, 이에상보적인두종류의 DNA 가코팅된금입자를교대로처리하여사이즈조절이가능한금속입자를개발하였다 [33]. 또한, 다음연구에서는 DNA 같은생분자의매개없이화학적으로규조류껍질모양의금속입자를제작하는방법을적용하였다. 이방법은규조류껍질위에 metal evaporation 기법으로금속층을형성한다음, 불산 (HF) 을이용한 etching 으로템플릿으로쓰인규조류껍질의실리카성분을제거하는것이다 ( 그림 4A) [34]. 상기방법은규조류껍질을템플릿으로하여양각기법으로외형을그대로복제하는것이다. 규조류껍질을기반으로제작된금속제의복제품은광학적성질을갖기때문에 SERS (surface-enhanced Raman scattering) 기반의센서에사용될수있다 [35]. 한편, 규조류를이용한금속나노구조체제작에는위의사례와조금다른방법이적용된다. 규조류표면의구멍들은나노사이즈이며계층적구조를갖고있어서복잡한패턴의나노입자를제작하는템플릿으로활용될수있다. Losic 연구팀은중심규조목에속하는 Coscinodiscus sp., Thalassiosira eccentric 및미지의보유종을대상으로원반모양의템플릿을제작하고 Si wafer 위에올려놓은후, gold evaporation 방식을적용하여금나노구조체및나노입자를음각기법으로제작하였다 ( 그림 4B). 템플릿이제거된후, 금박막 (thin-film) 표면에는규조류의구멍에해당하는구조물이남게되며, 이러한지름약 200 nm 의구조물상에규조류구멍의계층구조처럼세부적인나노패턴을갖게된다. 그리고구조물들을개별적으로분리하게되면나노입자로써의활용이가능해진다 [36]. 규조류기반생물유래템플릿으로얻어진다공성구조물들은매우넓은표면적 (> 1,300 m 2 g -1 ) 을가지는이점이있다 [37]. 넓은표면적을가지는구조체는에너지및물질교환을빠르고효율적으로만들기때문에, 전통적으로이러한구조를사용한화학및생물반응기, 에너지스토리지등의설계 가연구되었다. 다공성의규조류템플릿은촉매반응속도를높이기위한고정화구조체제작에뛰어난소재이며이를이용한연구사례가보고되었다. 미국조지아공과대학의 Sandhage 연구팀은 Aulacoseira 껍질을템플릿으로사용하여제작한탄소및금입자위에효소를고정시킨후빠른 Flowthrough 기반의생촉매시스템을구현하였다. 연구팀은 Glucose oxidase 효소를고정화하기위한고정화담체로다공성의탄소및금 (Au) 입자를선택하였는데, 이들은규조류유래의생물템플릿으로제작되었다. 연구팀은효소고정화를위해, 우선, 효소에양전하가많이존재하는펩타이드를유전적으로결합시킨후, 화학가교제인 protamine 을사용하여입자표면에고정화시켰다. 이어서, 연구팀은제작된효소 (glucose oxidase) 고정입자를이용하여 flow-though 기반의 glucose 산화반응기시스템을제작하였다. 본시스템은펌프로순환하는기질액사이에필터형태의효소고정입자들을위치시켜빠르고효율적인반응이일어나도록한것이다. 반응기의필터에위치한규조류복제파티클들은넓은표면적으로빠른유속을느리게하여짧은시간동안반응이충분히일어날수있게한다 [38]. 상기기술한방법들은약 10 만여종에달하는다양한규조류에대해공통적으로적용될수있어서, 만약연구자가적합한규조류를선정하여템플릿으로사용한다면목적에맞는고차구조의금속입자를손쉽게얻어낼수있을것이다 Metal-oxide complex 금속산화물은외부에너지유입에따라전자를방출시켜고에너지를갖는전자-정공쌍 (electron-hole pair) 을형성하고산화-환원반응을유도하는특성이있어서 [39], 연료감응형태양전지 (DSSC; Dye-Sensitized Solar Cell) 나수질오염원처리를위한광촉매제의개발에응용되고있다. 다양한금속산화물들은서로비슷한결정구조를갖고있음에도불구하고전도성 (eg. 도체, 반도체, 부도체초전도체, 압전체 ), 광학적성질, 자성 ( 자성체, 자기저항성 ) 등에서다양한특성차이를보이며, 동일한금속산화물사이에서도미세구조의형태에따라특성이다르게나타난다. 따라서, 현재, 고집적반도체, 고용량배터리및효과적인광촉매등의금속산화물이적용되는분야의개발을위해적합한금속산화물을선정하고우수한물성을나타내는미세구조를구현하는것이중요한연구주제로고려되고있으며, 이를위해, 넓은표면적을갖는박막 (thin-film) 이나다공성구조체및나노입자등의형태가주로적용되고있다. 한편, 규조류는천연의다공성구조체이며실리카로구성되어서넓은표면적을제공함과동시에빛을투과하는성질을갖는다. 규조류의껍질은금속산화물표면상에대한광자 (photon) 의도달을저해하지않으며, 규조류표면의미세구멍들은빛을모으는안테나역할을하거나산란또는반사시켜서광촉매의활성에도움이되는광학적성질을나타낸다 [40,41]. 이러한규조류의껍질의광학적특성을활용한반도체나센서소자에대한활용방안이활발히연구되고있

7 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 15 다. 금속산화물중에는실리카분자와교차배열하여성질이달라지는경우도있다. 대표적으로, 게르마늄산화물 (GeO 2 ) 은분자구조상에실리카와동시에배열되어있을시강한푸른색빛을발광하는성질이있고, 비전도성과전도성을동시에띄는성질이있어서 optoelectronic 나반도체분야에고루쓰이는금속이다 [42,43]. Sandhage 는고차구조의게르마늄산화물을얻기위해규조류껍질을활용한사례를발표하였다. 연구팀은규조류껍질을마그네슘가스와함께 4 시간동안 900 o C 에서가열시켰고 3 차구조의변형없이부분적으로규조류기반마그네슘나노입자를만들수있었다 [44]. 하지만, 가열건조시켜만드는방법은규조류표면의 silicon oxide 를 Ge 원소로교환을통한방법이므로중량대비높은효율의금속나노입자를얻기어렵고외각표면의미세구조파괴를피하기어렵다는단점이있다. 이를극복하기위해 Rorrer, L. G. 그룹 (2008) 은살아있는규조류 (Pinnularia sp.) 에게르마늄입자를고정시키는방법을개발하였다 ( 그림 5) [45]. 이방법은규조류가 silicon 의존적으로 DNA 복제를시작한다는원리를이용하여 silica starvation 에의해세포분열을조절하는것이다 [46]. 이방법은두단계로나뉜다. stage1; 초기배양액에포함된 silicic acid 를모두소진하며일정수에도달한규조류세포는 starvation 단계를거친다. stage2; starvation 후다시게르마늄전구체와실리카전구체를배양액상에동시에공급해주었을때, 규조류가 Si transporter 를통해 Si 를흡수할때동시에 Ge 이온을흡수한다. Rorrer 그룹은이방법 (two stage metabolic insertion) 에의한게르마늄금속이온의대사적흡수로온화한배양조건에서규조류의손상없이생물유래금속나노입자를만들수있었다. Rorrer 연구팀이개발한규조류를이용 한대사적흡수방법은 TiO 2 같은광촉매성금속산화물의제작에도적용되었다. 금속산화물의주요활용분야인광촉매는자외선이나가시광선의조사후방출되는전자와그로인해생성된정공 (h+) 의산화에의해산화분해력이높은히드록시라디칼 (OH) 을발생시키고, 이것이유기화합물이나바이러스등을산화분해하는원리로작동한다. 광촉매중 TiO 2 는내산성과내알카리성이우수하고인체에무해하여가장많이사용되고있으며, 유기염소계화합물 (TCE, PCE 등 ) 혹은 BTEX (Benzene, Toluene, Ethyl Benzene, Xylene) 와같이수질오염을유발하는고농도난분해성물질의처리에가장많이적용되고있다 [47,48]. 하지만, 수질정화에서광촉매입자의효율성을높이기위해 TiO 2 입자를나노입자형태로사용하면입자간상호작용에의한엉김현상이발생하여오염물과접촉하는표면적을크게하락되고나노입자의특성상회수에의한재사용이어려워져수질정화의효율및경제성이떨어지는현상이발생한다. 연구자들은이러한광촉매나노입자의문제점을해결하기위해표면고정화수단을고려하고있다. 규조류템플릿기반의광촉매입자는오염물과의넓은접촉면적을가지며광투과성까지있으므로효율적광촉매제작을위한대안이될수있다. Rorrer 연구팀은펩타이드종류인 PLL (poly L lysine) 을이용하여 in vitro 상에서 Pinnularia 종에티타늄전구체 TiBA- LDH (titanium (IV) bis(ammoniumlactacodihydroxide)) 를표면에도입 (deposit) 하는연구를하였다. 펩타이드에의해규조류껍질표면에도입된티타늄전구체는 TiO 2 형태로결합되며잇따른열처리과정 (680 o C 에서 2 시간 ) 에의해 TiO 2 결정구조에서광촉매활성에중요한 anatase 상을갖게된다. TiO 2 함량은 1.32 g TiO 2 /g SiO 2 frustule 비율로얻어졌다. Fig. 5. Production of biogenic metal oxide particles by metabolic insertion. In starvation step (silica depletion), diatom growth was stalled, then biogenic metal oxide frustule was formed when silica sources was resupplied with metal precursor at the same time.

8 16 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) Rorrer 연구팀은다음으로게르마늄산화물입자를제작했을때사용되었던대사적인금속이온흡수방법을이용하여 TiO 2 입자를생산하였다 [49]. 1차배양으로실리카소스가고갈된상황에서 starvation 후 2차배양에고체상태의 Ti(OH) 4 를산성용액에녹인티타늄전구체와염기성의실리카전구체를배양액상에서동시공급해주는방식으로대사적인 Ti 이온흡수를유발하였다. 배양결과 2.3 g Ti/100g SiO 2 의비율로 TiO 2 입자를얻을수있었다. 본연구에서 Rorrer 연구팀은대사적흡수를위한티타늄의전구체로 Ti(OH) 4 를사용했지만이와달리 TiBALDH를 Thalassiosira weissflogii 종에사용하여대사적으로 TiO 2 입자를제작한사례도발표되었다 [50]. 대사적흡수방법으로금속산화물입자를생산하는방식은기존의물리, 화학적기법 (eg. physical vapor deposition (PVD), chemical vapor deposition (CVD), ion implantation, sol-gel법, dip coating, spray coating) 등에비해실리카질량대비고정된금속의비율이높지못한편이다. 하지만, 본방법의장점인, 첫째, 온화한배양액조건에서 TiO 2 합성이가 능하다는것과, 둘째, 제조과정중값비싼화학공정을필요로하지않는다는점, 셋째, 규조류세포의대량배양을통해많은양의금속산화물입자를얻을수있다는점들은본방법이약간의개량을통해충분히활용될가치가있음을말해준다 Sensor 현대나노기술의집약체인센서는온도나빛등의물리에너지의탐지에서부터식품및위생측정의현장적용에이르기까지다양한분야에활용되고있다. 특히, 바이오프로브를활용한바이오센서는임신, 당뇨등의진단분야뿐만아니라난치성질병의조기진단및환자의예후진단같은의료분야의필수진단도구로자리잡아가고있다. 현장에서사용되는센서는낮은분석물질의농도에반하여상대적으로높은비특이적신호를줄여야하고체내삽입시생체친화성을고려해야하는등의문제점에노출되어있기때문에, 검출프로브의성능과밀도를높이고, 비특이적결합을줄이는등의지속적인개량을위한연구가필요한상황이다. 연구자들은규조 Fig. 6. Application of the diatom frustule for antibody-based sensor development. (A) Antibody was immobilized on the diatom surface by chemical cross-linking method. Using this matrix, the detection of antigen is possible by measuring a variation of photo-luminescence intensity. (B) Enhancement of the sensitivity of antibody-based sensor via hierarchical pore structures on frustule. Diatom's nano pore can reduce non-specific interaction effects in antigen-antibody binding.

9 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 17 류껍질이가지는다공성구조및빛을투과시키는성질과고유의발광패턴같은광학적특성에주목했고, 이것을기존의플랫폼에적용하여이상적인센서를제작하는연구를수행하였다. 규조류껍질을이용한초기형태의센서는다공성을이용한 NO 2 기체의포집과정량분석용으로개발되었다. 실리카로이루어진규조류껍질은고유의발광 (PL; photoluminescence) 특성을지니는데, 이것이 NO 2 기체를흡수할경우친전자성인 NO 2 에의해실리카구조의전자가영향을받아발광현상이억제된다. 이와같은원리를이용하여 Stefano 연구팀은 Thalassiosira Rotula 종및 Coscinodiscus Wailesii 종을대상으로 NO 2 검출센서를개발하였다 [51]. 한편, 전통적인바이오센서의분석도구인항체 (Antibody) 를규조류껍질의구조적및광학적특성에접목시키려는연구도시도되었다. Stefano 연구팀은 Coscinodiscus concinnus 종의껍질에항체를화학적으로고정시킨후, 항원 - 항체반응을유발하여규조류의발광스펙트럼이변화함을증명하였다 [40]. 또한, Gale 연구팀은 Cyclotella 종을대상으로항체를고정하여청색파장대의발광변화를정량분석하였다 [52]. 항체와규조류를이용한센서중규조류의다공성구조에기인한필터능력의활용에초점을맞춘사례도있다. Lin 연구팀은중심규조목에속하는원반모양의 Coscinodiscus 종을선택하고센서전극위에배치시킨후항원 - 항체반응을일으켜높은감도의검출능력을이끌어내었다 [53]. Coscinodiscus 표면구조는커다란구멍내에작은것이반복되는프랙탈구조로이루어져있으며최소구경은약 40 nm 이다. 이론적으로, 센서표면의각항체프로브는규조류표면구멍에일치하는크기로배열되게되고, 이에따라검출물질외의비특이적결합반응을줄일수있어서잡음비율이줄어들게되어검출감도가높아지는방식이다 Drug delivery 약물전달은단일분자약물투여로유발될수있는부작용을줄이고표적부위에대한효과를특이적으로높이기위한수단으로써많은연구가진행되었다. 단일분자상태의약물을직접투여하는것은약물동력학적관점으로보았을때빠른체외배출및약물이간이나신장등의특정장기에만체류하는현상이관찰되기때문에표적특이적인전달과약물의노출시간을늘리기위한시스템의개발이활발히연구되고있다. 현재, 약물전달체는폴리머및다공성실리카매트릭스등을기반으로제작되어특정세포에대한약물분비기간을늘리는방향으로활발히연구되는중이다. 이러한약물전달패턴을위해서는약물을적정량보관할수있는내부용량과서서히분비시킬수있는다공성구조가중요한요소인데, 최근들어이를가능케하는새로운전달체의발굴이활발히진행되고있다. 한편, 자연계에널리존재하는다양한규조류들은종마다특징적인나노사이즈의구멍을갖는다공성표면을제공하기때문에, 넓은담지용량이중요한약물전달체의대 체물질로써관심이모아지고있다. 또한, 규조류의껍질은실리카기반의생체친화적인소재이며기능기도입을위한표면개질이수월하기때문에체내삽입용매트릭스소재로서의가능성도기대되고있다. 현재까지규조류를대상으로한약물전달연구는기존실리카소재기반연구의연장선에있으며전달체로의가능성정도만확인한단계이다. Losic 연구팀은규조류표면에도파민처리된산화철입자를고정시켜자성을띈약물전달체개발을진행하였다. 산화철입자에의한자성은규조류기반약물전달체의분리및정제를수월하게만든다. 연구팀은자석을이용해분리된규조류로부터도파민이분비되는정도를측정하였다. 비록, 실험상에서도파민이분비되는정도는 1 일내에 70% 정도써지속적약물분비가필요한약물전달체용으로부적절하였지만, 약물담지용규조류를적합한종으로선정하거나폴리머등을이용한외부코팅으로약물분비속도를조절하는등의추가개량을한다면규조류기반의이상적인자성약물전달체개발이가능해질것이다 [54]. 이어서 Losic 연구팀은값싼재료인규조토를대상으로친수성및소수성표면처리를하여물에녹지않는약물 (water-insoluble drugs) 인 Ind 의담지능력을측정하였다. 규조류껍질표면에친수성그룹도입을위해각각 3-aminopropyltriethoxy silane (APTES), N-(3-(trimethoxysilyl) propyl) (AEAPTMS) 및 2- carboxyethyl-phosphonic acid (2-phos) 를처리하였고소수성표면을위해 16-phosphono-hexadecanoic acid (16-phos) 를처리하였다. 약물담지효과는 AEAPTMS 처리한규조토에서가장높게나타났으며다음으로 2-phos > APTES > bare-de > 16-phos 순으로나타났고약물분비는 6~15 일간지속되는것으로관찰되었다. 연구팀은소수성규조토에서가장낮은약물담지효과가나타난것은소수성약물이흡착되는것에비해분비되는속도가빠르기때문인것으로해석하였다 [55]. 캐나다의 Manitoba 대학 Gordon 박사는미래형약물전달체로써규조류기반의전달체를능동적로봇형으로발전시킬몇가지방안을제시하고있다. 우선, 규조류를실리카캡슐로활용하여내부에약물을담지하고금속입자도입으로인한자성부여로분리정제가수월하게한다. 다음으로, 표적에대한유도를위해표적특이적인 affinity 분자를표면에고정시킨다. 마지막으로표적까지능동적으로나아가게하는동력발생을위해박테리아의편모를이용한다. 전달체말단에부착된박테리아편모들은추진력을발생시킬수있다. 편모는포도당을원료로움직이기때문에별도의에너지공급이어려운상황에서규조류기반미세로봇의추진체로적합할것이다. 다만, 박테리아의편모는체내에서강한면역반응을일으킬수있기때문에, Gordon 박사가제시한청사진대로활용하기위해서는아직해결해야할숙제가많아보인다 [56]. 규조류를이용한나노공학적활용은충분히가치가있지만그에대한연구는아직초기단계에머물러있다. 규조류의활용사례는금속나노입자형성을위한뼈대나센서, 약물전달의캡슐등으로규조류껍질자체를 천연실리카소재

10 18 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) 로활용한경우들이다. 규조류는종마다특이적인구조를가지고있지만천연소재로써적합한종을찾으려면우선세포모양의특징화연구가더진행되어야할것이다. 아울러, 궁극적으로는규조류유전자의완벽한이해를통해용도에맞도록규조류의표현형 (phenotype) 을재구축하는환원주의적접근법까지고려되어야할것이다. 다음설명할부분은규조류의기능변화를위해유전자조작을이용한사례이다. 5. Genetic Modification and Future Application 지구대부분의수생환경에서식하는규조류는다양한종의수만큼이나특이적인성질로학술연구 (eg. 대기중이산화탄소고정효과, 2 차공생관계에대한진화론적연구 ) 및규조류를이용한유용물질생산이나실리카기반의구조물연구의대상이되었다 [57]. 이러한연구들을수월하게수행하기위해규조류에대한유전자서열의해석이필요해졌고, Thalassiosira pseudonana 종과 Phaeodactylum tricornutum 종의서열이최초로분석되었다 [58,59]. 규조류종의서열이점점밝혀짐에따라연구자들은규조류에분자유전학기법들을도입하는연구를시작했고 P. tricornutum [60], C. fusiformis [61], Navicula saprophila 및 Cyclotella cryptica [62], Pseudonana [63] 종에서안정적인유전적형질전환이가능하게되었다. 규조류의형질전환은실리카기반의무기소재에효소나 binding motif 등의기능성분자도입을자동적으로수행하며유전적변이가일어난규조류종을배양및유지시킴으로써반영구적으로복제생산이가능하다는점에서규조류기반나노공학의강력한도구가될수있다. N. Kröger 연구팀은살아있는규조류의실리카껍질에산화환원효소들을발현시키는연구를수행하였다 [64]. 우선, 연구팀은대장균에서발 현되는 β-glucuronidase (GUS) 효소의유전자를규조류의실리카고정에중요한역할을하는단백질인 silaffin tpsil3 서열사이에위치시키고 Pnr2/Tnr2 expression cassette 기능을보유한플라스미드 (ptpnr) 사이에넣은후규조류세포내로전달하였다. 결과적으로 GUS 는 Pnr2/Tnr2 expression cassette 유전자의기능에의해암모늄이온이존재할경우발현이억제되며, 질산염이온이존재할경우발현이진행되어활성을나타낸다 ( 그림 7). 또한, N. Kröger 연구팀은같은방식으로규조류껍질의 girdle band ( 껍질의옆테두리면 ) 형성에특이적으로관여하는 Cingulin 단백질의유전자와 GFP 유전자를융합하여 T. pseudonana 종의 girdle band 에만제한적으로발현되는나노패터닝시스템을구축하였다 [65]. 한편, 무기질인실리카에기능기를도입하는연구와더불어, 유전자조작으로외형과구멍사이즈를인공적으로변형시켜 맞춤제작형규조류껍질 을생산하기위한연구방향이검토되고있다. 하지만, 이를위해서는규조류의각유전자가구조형성에미치는상관관계에대한높은이해를요하며궁극적으로실라핀 (silaffin) 과같은단분자의역할을넘어껍질형성매커니즘을완전히이해하기위해선앞으로많은연구가진행되어야할것이다. Gordon 박사는원하는모양의규조류껍질을얻기위한수단으로임의적인돌연변이를통해유용한구조의규조류를스크리닝하는시스템을제안한바있다 [8]. 이방법은규조류의배양중일부를지속적으로채집하여미생물의 random mutation 에적용되는방법인자외선조사또는화학처리를통한규조류의돌연변이유발로외형에변화를일으키는종을생산하고컴퓨터프로세서기반 (compustat) 의현미경추적으로반응조내부의각개체들외형을구별하는것이다. 이와동시에, 기대와일치하지않는종을레이져및자외선으로제거하고남은종을지속적으로배양함으로써미리입력된기준에근접한세포를스크리닝할수있다. Gordon 에의해 Fig. 7. Introduction of redox enzyme on the living diatom's frustule by genetic engineering. β-glucuronidase (GUS) was expressed in the presence of NO 3 - under the Pnr2/Tnr2 gene expression cassette, then it was immobilized on the silica frustule newly synthesized through SDV.

11 무기소재및생물환경소재로서의규조류활용연구동향 19 제시된이아이디어는매혹적이나이것이실현화되어규조류기반의무기소재개발에기여하기위해서는많은선행연구가필요할것이다. 6. 결론 지구상에풍부하게존재하는규조류는미세조류의일종으로써광합성을하는단세포수생생물이며규소성분의무기물껍질을가진독특한개체이다. 규조류가사멸하고남은껍질은오래전부터규조토 (Diatomite) 라는퇴적물형태로발견되었고다공성표면에의한높은흡착성능이밝혀짐에따라, 값싼흡착재료로써수질개선을위한필터링분야에주로응용되어왔다. 또한, 규조류를미세조류로써활용한생물연료의생산이나수질측정의지표등의환경생물소재로써활용성연구도진행되었다. 최근에는일반미세조류에비해규조류가가지는차이점인다공성실리카껍질및나노사이즈의계층적구멍구조와그로인한넓은표면적특성에중점을두어규조류의껍질을기존의화학적합성방법으로모사하기어려운고차구조의무기소재로써활용하려는연구가활발히진행중이다. 규조류를템플릿으로한나노구조의금속입자나금속산화물의제작방법이화학적, 생물학적방법을동원하여다양하게개발되고있으며이러한입자들은고집적구조가필요한다양한전기화학및광전자기반기술 (eg. 연료감응형태양전지, 배터리, 반도체, NO 2 센서, 바이오센서등 ) 에대해적용되어실용가능성이연구되고있다. 또한, 최근임플란트같은의학분야에서무독성및재생가능실리카 (silica) 기반생물재료들에대한관심이뜨거워지며규조류의가치가재평가되고있다. 현재, 규조류껍질의의학분야응용을위해, 규조류껍질의표면개질을통한약물담지또는자성컨트롤이가능한마이크로스케일의약물전달체개발등의기초실험이진행중이다. 규조류를이용한나노공학적활용은충분히가치가있지만구체적인활용방안에대한연구는아직가능성확인단계에머물러있다. 규조류는종마다특이적인구조를가지고있지만천연소재로써적합한종을선별하여활용분야에대한특이성을높이려면우선세포모양의특징화연구가더진행되어야할것이다. 이러한맞춤제작형규조류를제작하기위해서, 기존규조류유전자의엔지니어링을통해기존형질을개선하는방법이근본적인해결책이될수있다. 이에따라, 몇몇규조류를대상으로유전자를도입하는방식이개발되었고, 이를이용한규조류껍질내효소도입방법이개발되었다. 규조류의활용가치를더높이기위해서는아직연구되어야할부분이많아보인다. 하지만, 규조류기반의생물유래무기소재가가지는다공성, 빛투과성및입자의균일함, 껍질내부공간등의구조적이점은다른화학적합성에기반한실리카소재가모사할수없는부분이다. 향후이러한특성을고려한화학적, 생물학적, 유전적연구가지속적으로수행된 다면, 규조류가기존기술의한계를극복할수있는핵심환경및무기소재로써널리활용될수있을것이다. 사사 본연구는환경부에서주관하고환경산업기술원에서시행한토양 지하수오염방지기술개발사업 GAIA Project 의지원 ( 과제번호 ) 과해양수산부재원인한국해양과학기술진흥원의지원을받아수행된연구임 ( 해양바이오산업신소재기술개발 ). REFERENCES 1. Field, C. B., M. J. Behrenfeld, J. T. Randerson, and P. Falkowski (1998) Primary production of the biosphere: integrating terrestrial and oceanic components. Science 281: Grachev, M. A., V. V. Annenkov, and Y. V. Likhoshway (2008) Silicon nanotechnologies of pigmented heterokonts. BioEssays: news and reviews in molecular, cellular and developmental biology, 30: Round, F. E. (1990) Diatom Communities - Their Response to Changes in Acidity. Philos. T Roy. Soc. B, 327: Alverson, A. J., J. J. Cannone, R. R. Gutell, and E. C. Theriot (2006) The evolution of elongate shape in diatoms. J. Phycol. 42: Treguer, P., D. M. Nelson, A. J. Vanbennekom, D. J. Demaster, A. Leynaert, and B. Queguiner (1995) The silica balance in the world Ocean - a Reestimate. Science 268: Hildebrand, M., B. E. Volcani, W. Gassmann, and J. I. Schroeder (1997) A gene family of silicon transporters. Nature 385: Drum, R. W. and H. S. Pankratz (1964) Post mitotic fine structure of Gomphonema Parvulum. J. Ultra Mol. Struct. R, 10: Parkinson, J. and R. Gordon (1999) Beyond micromachining: the potential of diatoms. Trends Biotechnol. 17: Hecky, R. E., K. Mopper, P. Kilham, and E. T. Degens (1973) Amino-Acid and Sugar Composition of Diatom Cell-Walls. Mar. Biol. 19: Shimizu, K., J. Cha, G. D. Stucky, and D. E. Morse (1998) Silicatein alpha: Cathepsin L-like protein in sponge biosilica. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95: Kroger, N., C. Bergsdorf, and M. Sumper (1994) A new calciumbinding glycoprotein family constitutes a major diatom cell-wall component. Embo. J. 13: Kroger, N., R. Deutzmann, and M. Sumper (1999) Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation. Science 286: Sumper, M. (2004) Biomimetic patterning of silica by long-chain polyamines. Angew. Chem. Int. Edit. 43: Borowitzka, M. A. (1992) Algal biotechnology products and processes - Matching science and economics. J. Appl. Phycol. 4:

12 20 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 9-21 (2014) 15. Dunahay, T. G., E. E. Jarvis, S. S. Dais, and P. G. Roessler (1996) Manipulation of microalgal lipid production using genetic engineering. Appl. Biochem. Biotechnol. 57-8: Tonon, T., D. Harvey, T. R. Larson, and I. A. Graham (2002) Long chain polyunsaturated fatty acid production and partitioning to triacylglycerols in four microalgae. Phytochemistry 61: Lebeau, T. and J. M. Robert (2003) Diatom cultivation and biotechnologically relevant products. Part II: Current and putative products. Appl. Microbiol. Biot. 60: Lebeau, T. and J. M. Robert (2003) Diatom cultivation and biotechnologically relevant products. Part I: Cultivation at various scales. Appl. Microbiol. Biot. 60: Evenson, W. E., S. R. Rushforth, J. D. Brotherson, and N. Fungladda (1981) The effects of selected physical and chemical factors on attached diatoms in the uintah basin of Utah, USA. Hydrobiologia 83: Leterme, S. C., E. 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