21장 크로마토그래피의 원리와 질량분석법

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1 Daniel C. Harris Exploring Chemical Analysis Fourth Edition Chapter 21: Principles of Chromatography and Mass Spectrometry Copyright 2005 by W. H. Freeman & Company 1

2 21 장크로마토그래피의원리와 질량분석법

3 Katia and Maurice Krafft Born Died Cause of death April 17, 1942 (Katia), March 25, 1946 (Maurice) June 3, 1991 Mount Unzen, Japan Killed by the 1991 eruption of Mt. Unzen Nationality French 3

4 Katia Krafft 4

5 Erebus Volcano 로봇 Dante 는남극대륙에있는 Erebus 화산에서나온방출물을분석하기위해기체크로마토그래프장비를지니고있다. Dante is designed to obtain samples of gas from magma in the crater lake in the Mount Erebus for a better understanding of chemistry through the use of gas chromatography on-board and measure the temperature inside the volcano and the radioactivity present in the volcanic material is. 5

6 21-1 크로마토그래피란? 크로마토그래피 (chromatography) 칼럼내에서머무르는시간의차이를이용하여화합물을분리하는방법 6

7 그림 크로마토그래피분리. 용질 A 는용질 B 보다정지상에대한친화력이더크다. 그래서 A 는 B 보다칼럼에더오래머문다. 크로마토그래피란용어는 1903 년에 M. Tswett 의실험으로부터유래되었는데그는고체 CaCO 3 ( 정지상 ) 로채워진칼럼과탄화수소용매 ( 이동상 ) 로식물의색소를분리했다. 색깔을띤띠들의분리이기때문에 색 이라는뜻을가진그리스어의크로마토스 (chromatos) 로부터크로마토그래피란이름이유래되었다. 7

8 8

9 Mikhail Tsvet (1872~1919) Born 14 May 1872 (Asti, Italy) Died 26 June 1919 (aged 47) Nationality Russia Fields botany Known for adsorption chromatography Mikhail Tsvet invented chromatography in 1906 during his research on plant pigments. He used liquid-adsorption column chromatography with calcium carbonate as adsorbent and petrol ether/ethanol mixtures as eluent to separate chlorophylls and carotenoids. He first used the term "chromatography" in print in 1906 in his two papers about chlorophyll in the German botanical journal, Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft. In 1907 he demonstrated his chromatograph for the German Botanical Society 9

10 이동상 (mobile phase) 칼럼을통해이동하는용매 기체 : 기체크로마토그래피 (GC) 액체 : 액체크로마토그래피 (LC) 정지상 (stationary phase) 칼럼안에고정되어머물고있는물질 고체 고체입자에코팅된액체 모세관의안벽에코팅된액체 10

11 용리액 (eluent) : 칼럼으로들어가는유체 용출액 (eluate) : 칼럼에서나오는유체 용리 (elution) : 크로마토그래피칼럼으로부터액체혹은기체를통과시키는과정 11

12 그림 용질과정지상의상호작용형태에따른크로마토그래피의종류 12

13 흡착 (adsorption) 크로마토그래피 고체정지상 + 액체또는기체이동상 용질은고체입자표면에흡착 13

14 분배 (partition) 크로마토그래피 고체지지체위에코팅된얇은액체정지상 용질은정지상과이동상사이에서평형 14

15 The Nobel Prize in Chemistry 1952 "for their invention of partition chromatography" Archer John Porter Martin 1910~2002, United Kingdom Richard Laurence Millington Synge 1914~1994, United Kingdom 15

16 이온교환 (ion exchange) 크로마토그래피 수지 (resin) 에 SO 3 - 또는 N(CH 3 ) 3 + 같은이온성기가공유결합으로붙은정지상 액체이동상 용질과정지상 : 전기적인력 16

17 Ion Exchange Chromatography 17

18 분자배제 (molecular exclusion) 크로마토그래피 gel permeation, gel filtration, molecular sieve 정지상과용질사이의인력은없음 정지상의구멍 큰분자는배제 빨리통과 18

19 Gel filtration chromatography 19

20 친화 (affinity) 크로마토그래피 가장선택적 정지상에고정된분자와용질간의선택적상호작용 ( 항원항체 ) 20

21 Affinity chromatography 21

22 21-2 크로마토그램의해석 크로마토그램 (chromatogram) 시간에대한검출기의감응 봉우리 : 칼럼에서용출되는물질 머무름시간 (retention time) t r : 용질이주입된후검출기에도달하는시간 22

23 반높이너비 (w 1/2 ), w=4σ 그림 머무름시간과반높이너비측정을보이는기체크로마토그램도식. 바탕선나비 (w) 는 Gauss 곡선의가장가파른부분에서탄젠트를바탕선에대해외삽하여얻는다. Gauss 곡선의표준편차는 σ 이다. GC 에서 0.1~1 μl 이시료와함께주입한적은부피의 CH 4 는보통첫번째용출된다. 23

24 이론단 (theoretical plate) 24

25 증류칼럼 액체와증기가평형을이루는칸 (plate) 으로구성 칼럼의단수증가 분리효율증가 이론단 용질분자가이동상과정지상사이에서평형을이루는불연속적인칸 이론단수의증가 띠너비감소 25

26 5.55t 칼럼의이론단수, N N 2 w r 26

27 단높이 (plate height), H L : 칼럼의길이 H L N 단높이감소 이론단수증가 봉우리나비감소 분리효율증가 GC : 100 ~ 1000 μm, HPLC : ~10 μm 27

28 GC : 100 ~ 1000 μm HPLC : ~10 μm 28

29 분리도 (resolution), R s R s t w r av t w av1 2 r 그림 같은면적과크기의 Gauss 봉우리들의분리도. 점선은각각의봉우리, 실선은두봉우리의합, 그림자는중첩면적. 29

30 정성및정량분석 정성분석 (qualitative analysis) 머무름시간의비교 : 표준시료, 미지시료 소량첨가 (spike) : 미지시료에표준시료를 spike 봉우리의크기가증가 미지시료 = 표준시료 MS 또는 IR 을이용 30

31 정량분석 (quantitative analysis) 봉우리면적 시료의농도 내부표준법 : 실험조건의변화 내부표준과시료에동일한효과 내부표준과시료의봉우리면적을비교 그림 크로마토그래피봉우리의면적을얻기위한바탕선. 컴퓨터는사람이만드는것과같은바탕선을그리지않을수도있다. 31

32 5-4 내부표준 (internal standard) 내부표준 분석물질과는다른화합물로써미지시료에첨가하는기지양의화합물 분석물의신호와내부표준의신호를비교하여분석물질의농도확인 기기의감응이매측정마다조금씩변할때유용 HPLC, 이동상의유속이변하면검출기의감응이변화, 표준물의감응이변한만큼시료의감응도변화 시료의준비, 시료의손실이있는경우내부표준도시료만큼손실, 표준물질대분석물의비는일정

33 분석물질신호의면적 표준물신호의면적 F 분석물질의농도 표준물의농도 A x As F [X] [S] [X],[S]: 서로섞은후분석물과표준물의농도 그림 5-6. 내부표준사용을설명하는크로마토그램. 아는양의표준물을미지시료 X 에첨가한다. 피크의면적으로부터미지시료에 X 가얼마나들어있는지알수있다. 그러기위해서별도실험을통해각화합물의기지양에대한상대감응을측정할필요가있다.

34 대규모분리 분석용크로마토그래피 혼합물을분리, 확인, 정량, 소규모 길고얇은칼럼사용 : 좋은분리도 제조용크로마토그래피 혼합물중의성분을유리, 대규모 짧고굵은칼럼 : 분리도감소 2 mg 의혼합물분리 1.0 cm 직경의칼럼 20 mg 의혼합물분리? cm 34

35 규모계산식 큰주입 (g) 작은주입 (g) 큰칼럼의반경 작은칼럼의반경 2 분리도를유지하면서규모를크게 칼럼의단면적 분석물질의질량 칼럼의길이는일정하게유지 부피흐름속도 칼럼의단면적 시료부피 분석물의질량 35

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