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1 The Korean Journal of Microbiology (2011) Vol. 47, No. 1, pp Copyright c 2011, The Microbiological Society of Korea 막단백질인 Proteorhodopsin 과 Anabaena Sensory Rhodopsin 의다양한측정환경에따른광화학 / 생물리학적특성 최아름 1 한송이 1 정영호 2 정광환 1 * 1 서강대학교생명과학과, 2 한국기초과학지원연구원 Photochemical/Biophysical Properties of Proteorhodopsin and Anabaena Sensory Rhodopsin in Various Physical Environments Ahreum Choi 1, SongI Han 1, Young-Ho Chung 2, and Kwang-Hwan Jung 1 * 1 Department of Life Science and Institute of Biological Interfaces, Sogang University, Seoul , Republic of Korea 2 Division of Life Sciences, Korea Basic Science Institute, Daejeon , Republic of Korea (Received March 14, 2011 / Accepted March 28, 2011) Rhodopsin is a membrane protein with seven transmembrane region which contains a retinal as its chromophore. Although there have been recently reports on various photo-biochemical features of rhodopsins by a wide range of purifying and measurement methods, there was no actual comparison related to the difference of biochemical characteristics according to their physical environment of rhodopsins. First, proteorhodopsin (PR) was found in marine proteobacteria whose function is known for pumping proton using light energy. Second one is Anabaena sensory rhodopsin (Nostoc sp.) PCC7120 (ASR) which belongs to eubacteria acts as sensory regulator since it is co-expressed with transducer 14 kda in an operon. In this study, we applied two types of rhodopsins (PR and ASR) to various environmental conditions such as in Escherichia coli membranes, membrane in acrylamide gel, in DDM (n-dodecyl-β-d-maltopyranoside), OG (octyl-β-d-glucopyranoside), and reconstituted with DOPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). According to the lightinduced difference spectroscopy, rhodopsins in 0.02% DDM clearly showed photointermediates like M, and O states which respond to the different wavelengths, respectively and showed the best signal/noise ratio. The laser-induced difference spectra showed the fast formation and decay rate of photointermediates in the DDM solubilized samples than gel encapsulated rhodopsin. Each of rhodopsins seemed to be adapted to its surrounding environment. Keywords: absorption spectrum, membrane protein, photocycle, photoreceptor Chromophore로레티날 (vitamin A) 을사용하는막단백질인로돕신은세포막을일곱번가로지르는 helix들이레티날을둘러싸고있는포켓모양을지니는특징이있다 (13, 14, 15, 18). 광감지 (photo-receptor) 로돕신은 1999년이전까지는오직고세균계의 haloarchaea와고등동물계 ( 인간포함 ) 에서만발견되었다 (14). 하지만 1999년이후여러생물계의지놈프로젝트를통해, 거의모든병원성곰팡이류 (fungi) 와일반세 * For correspondence. Tel: ; Fax: 균류 (eubacteria), 원생생물류 (protista) 에서나타남을알게되었다 (3, 7, 18). 또한바다플랑크톤중실험실에서키우기힘든해양박테리아에서도환경지놈연구 (environmental genomics) 결과아주많은종류의로돕신들이보고되었으며, 지금도계속발견되고있다 (1). 기존의고세균 (archaeal) 로돕신의기능과인간의눈에있는로돕신은많은연구가진행되어다양한특성을알게되었으며, 최근에는 X-ray crystal 구조도알려져모든 G-protein coupled receptor (GPCR) 의모델시스템으로연구가진행되고있다 (19). Type I에속하는미생물로돕신은그기능에따라서크게

2 환경변화에따른로돕신특성변화 23 이온수송펌프역할을하는로돕신과신호전달에사용되는로돕신두가지로나뉘어진다. 첫번째로빛에너지를이용하는수소이온운반체이다. 빛에너지는 ATP 생성, 편모운동, 그리고다른에너지를요구되는과정에서양성자전기화학전위를만드는데이용되고있다. 이온수송펌프역할을하는로돕신을사용하여에너지를생산하는기능은 haloarchaea (bacteriorhodopsin), group II 해양 archaea (euarchaeotic rhodopsin), 세균 [proteorhodopsin (PR) 그리고 xanthorhodopsin (XR)], 그리고시아노박테리아 (Gloeobacter rhodopsin) 에서발견되고있다 (11, 12). 두번째로신호전달리셉터기능을가지는로돕신으로 halobacteria의 sensory rhodopsin I과 II, 미세조류에서발견된 Chlamydomonas의 Chlamydomonas sensory rhodopsin A (CSRA) 와 Chlamydomonas sensory rhodopsin B (CSRB), 시아노박테리아에서분리한 Anabaena sensory rhodopsin (ASR) 등이있다 (8, 17, 20). 이들의신호전달방법은다양하며, 막단백질의전달자 (transducer) 를이용하여특이적파장에반응하는주광성 (phototaxis) 반응을조절하기도하고 (2, 5, 17), 칼슘채널을통한막전위차를이용하여세포의움직임을조절하거나, 특이하게 GPCR처럼세포내수용성전달자를이용하여신호를전달하는메커니즘을이용하기도한다 (7). 또한빛을이용해유전자발현이나단백질기능을조절하는 photoadaptation에관여하는로돕신도있다. 예를들면, Anabaena (Nostoc) sp. PCC7120에있는로돕신은광합성하는동안 chromatic 적응, 즉 phycobilin 합성을위해서특정한파장의빛에반응하는특징을가지고있다 (7, 9, 16). 막단백질을정제하기란어려운일이다. 일반적으로 heterologous expression system을이용하는데, 이때사용하는숙주세포가 Escherichia coli 세포이다 (10). 목적하는단백질을 E. coli에과량발현한다음, 막분획과정을거치게되면, 우리가원하는막단백질을얻을수있다. 하지만, 이는너무불투명하여빛을이용한단백질의성질을측정하기가쉽지않다. 따라서적은양의 non-destructive detergent를사용하여정제한다음, gel로만들어포토사이클등을측정할수있다 (4, 16). 또한, detergent에녹인상태로단백질을정제할수있으며 (6), 이를다시 E. coli 지질에재조립할수있다 (16). 본연구에서는수소이온펌프역할기능을가지는 PR과신호전달기능을하는 ASR을이용하여, 각단백질을다양한측정방법으로환경조건에따른그특성의차이점을알아보려한다. 재료및방법균주및플라즈미드클로닝을위해서, 각 PR과 ASR 유전자를 pkj900 vector 에 NdeI/NotI 제한효소를이용했고 T4-DNA ligase를이용해서라이게이션 (ligation) 을해서 E. coli DH5α에형질전환 (transformation) 을한다음, 50 μg/ml의농도로앰피실린이녹아있는 LB (Luria-Bertani)-broth에접종을하고, 35 C로 조정된배양기에서세포배양했다. 단백질발현을위해서, β-carotene을합성할수있는 porange를 E. coli UT5600에형질전환하여 E. coli strain β/ut를구축했다. β-carotene을두개의레티날로자를수있는쥐의 dioxygenase (β-diox) 는 pkj900 vector에 NcoI/PmeI 을이용하여클로닝했다. 로돕신발현및정제각각의 PR과 ASR은 lacuv5 프로모터 (promoter) 에의해서, β-diox는 pbad 프로모터에의해서 E. coli strain UT5600 이나 β/ut에서조절 발현되었다. pkj900 플라즈미드가형질전환된 UT5600 cell은 1 mm IPTG로유도 (induction) 되고, 5-10 μμ로최종농도가되게끔 all-trans 레티날이첨가되어서 6시간동안 30 C에서배양되었다. pkj900과 porange 플라즈미드가형질전환된 β/ut는 1 mm IPTG와한분자의 β-카로틴을두분자의레티날로자르는역할을하는 dioxygenase를유도하기위해서 0.2% (+)-L-arabinose가첨가되었고, 24시간동안 30 C에서배양되었다. 초음파를통해세포를분쇄시킨다음초고속원심분리기를통해막분획을얻을수있었다. 막분획에최종농도를 1% 가되게끔 n-dodecylβ-d-maltopyranoside (DDM) 과 octyl-β-d-glucopyranoside (OG) 를첨가해서, 4 C에서두시간이상두어막단백질을가용화시켰다. Ni 2+ -NTA agarose (QIAGEN) 를첨가해서 4 C 에서 4시간배양해서 affinity chromatography를통해단백질을분리하였다. 분리된각단백질은 0.02% DDM에 0.8% OG 에녹아있었다. Membrane Gel 제조와재조립초음파분쇄법을이용해서얻은막분획에최종농도가 0.04% 가되도록 DDM을첨가한다음 4 C에서 30분동안배양하였다. 원심분리를통해 heavy membrane은제거하고초고속원심분리를통해 light membrane을얻었다. 물 1 ml을넣어 pellet을풀은다음 15% polyacrylamide 용액을첨가해서 membrane gel을얻었다. 완성된 membrane gel은탈이온수에넣어서 4 C에서 O/N 동안씻었다. 그리고 sonication buffer (150 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, ph 9.0) 에 membrane gel을넣어서 4 C에서 O/N 동안배양시켰다. 정제된로돕신의최종농도가 OD=0.2가되도록 buffer R1 (150 mm NaCl, 20 mm Tris, 0.1% DDM, ph 7.01) 로희석하여 5 ml을만들었다. DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, 20 mg/ml) 을 30 μl 넣어서 10-30분동안 RT 에서배양시켰다. DOPC가다녹으면 Bio-Bead를 g 넣어서 4 C에서 12시간이상천천히흔들어재조립시켰다. Bio-Bead를걸러낸다음, 차가운 buffer R2 (200 mm NaCl, NaH 2PO 4 2H 2O, ph 7.05) 를 5 ml 넣어서씻어줬다. 6,000 g 로 10분동안 4 C에서원심분리한다음, 상층액은버리고 Buffer R2 1 ml에녹인후 Eppendorf-tube로옮겼다. 14,000 g 로 5분동안 4 C에서원심분리한다음, 상층액은버리고 pellet을녹여측정에사용했다.

3 24 Choi et al. 멸율은 16 번씩재어서평균값으로나타냈다. 결과 Fig. 1. The color of PR and ASR in various physical environments. The order of the samples is MEM (E. coli membrane fraction), GEL (in polyacrylamide gel), DDM (solubilized in DDM), OG (solubilized in OG), and REC (reconstitution into DOPC). 흡수분광학 PR과 ASR 측정샘플은 ph 9.0에녹아있는상태로 Shimadzu UV-visible spectrophotometer (UV-2550) 을사용하여흡수스펙트럼을측정했다. 광-감응차이스펙트럼은 SCINCO 및 RSM 1000 (Olis, USA) 에의해서측정되었다. 화학섬광은 Nd-YAG pulse laser (Continuum, MinilightII, 532 nm, 6 ns, 25 mj) 를통해이용되었다. Photointermediate의생성및소 최대흡수파장사용된 PR 샘플과 ASR 샘플은각환경실험조건을위해완성된형태이다 (Fig. 1). 막분획, gel, in DDM, in OG, 재조립 (reconstitution) 순서로나열되어있다. 막분획은로돕신뿐만아니라 E. coli 내의막단백질도어느정도포함되어있는상태이기때문에색깔이매우탁한것을확인할수있다. Membrane gel은원심분리를통해 heavy membrane fraction 은제거하고, light-membrane fraction만얻었기때문에 membrane fraction 보다훨씬깨끗한단백질을얻을수있었다. Detergent 일종인 DDM에서는단백질이안정하게존재하나, OG에서는조금불안정한단백질이응집되어서뿌연것을확인할수있다. 다시 E. coli phospho-lipid (DOPC) 로재조립한샘플은정제한로돕신을이용했기때문에막상태지만좀더깨끗한샘플을얻을수있었다. Figure 2는 ph 9에서의각 PR 샘플조건과 ASR 샘플조건의최대흡수파장을측정한것이다. PR의경우막 (MEM) 조건과젤 (GEL) 조건의경우약 524 nm에서최대흡수파장 Fig. 2. The λ max of PR and ASR according to the sample preparation states. PR solubilized in DDM is blue-shifted compared to PR which is embedded in E. coli membrane and trapped in polyacrylamide gel. Otherwise, PR solubilized in OG and reconstituted PR represents a red-shifted λ max. In the case of ASR, the λ max of DDM, OG solubilized ASR and reconstituted ASR are significantly blue-shifted than membrane, gel state ASR. The absorption maximum of each state is a little bit different to each other.

4 환경변화에따른로돕신특성변화 25 을가지는반면, DDM으로녹인조건에서는약 4 nm가 blue shift 된형태인 520 nm에서최대흡수파장을가지고, OG와재조립 (REC) 된샘플에서는약 5 nm가 red shift 된형태인 529 nm에서최대흡수파장을가진다. ASR의경우 PR과마찬가지로 MEM 조건과 GEL 조건의경우 553 nm에서최대흡수파장을가진다. DDM과 OG에서는약 10 nm가 blue shift 된 543 nm에서최대흡수파장을가진반면, REC 조건에서는약 24 nm가 blue shift 된 529 nm에서최대흡수파장을가진다 (Table 1). 같은단백질이지만샘플조건에따라서 chromophore와단백질간의상호작용정도가달라져서최대흡수파장에차이가있다는것을확인했다. 광감응차흡수 Figure 3은각로돕신에빛을 20초쬐어준다음로돕신의파장 (wavelength) 별흡수스펙트럼 (absorption spectrum) 을나타낸다. PR의경우 pk a 가 7.5로알려져있다. 따라서, PR의 acceptor 기능을하는 Asp97이 deprotonated form을유지해서 PR이좀더효율적인 M-, O-like intermediate을형성할수있도록 ph 9.0에서광감응차흡수를측정했다. MEM과 GEL, 그리고 REC에서는최대흡수파장인약 530 nm에서 G (ground state) 를보였고, 약 410 nm에서 M-intermediate, 약 600 nm에서 O-intermediate을보였다. 전체적으로 ΔOD=0.04 로적은차스펙트럼을보이고있다. 반면에, DDM과 OG에녹아있는 PR의경우, 약 500 nm에서 G (ground state) 를보이며, 각 M-, O-intermediate은약 400 nm, 약 600 nm에서보이고있다. MEM, GEL, REC 보다약 100배인 ΔOD=0.3 의차스펙트럼을보인다. ASR 역시모든샘플의조건을 ph 9로준비했다. ASR의 MEM인경우, 발현양이너무작고너무탁해서차스펙트럼을측정하지못했다. MEM과비슷한환경의조건인 GEL과 REC의경우, 시그널이매우미미하지만, 약 550 nm에서 G (ground state) 가보이며, 약 400 nm에서 M-intermediate, 약 600 nm에서 O-intermediate를보인다. ASR의경우, 센서 (sensory) 로돕신이기때문에수소이온을펌핑하는로돕신보다상대적으로느린포토사이클을지닌다. 따라서, 빠른포토사이클을가지고있는 PR에서는측정하기어려운 M-intermediate ( 약 390 nm) 가 DDM과 OG에녹아있는 ASR에서는아주높게형성되는것을확인할수있다. M-intermediate 형태의로돕신이많은비율 (ΔOD=0.04) 로축적되어있기때문 에, 상대적으로 O-intermediate ( 약 610 nm) 는적은 ΔOD값인 0.01로나타나는것을확인할수있다. PR과 ASR 모두 DDM에서깨끗하고명확한광감응차스펙트럼을얻을수있는것을확인할수있다. 레이저감응포토사이클측정각 PR과 ASR의각 intermediate의포토사이클효율 (rate) 을계산하기위해서레이저감응포토사이클을측정하였다 (Fig. 4). PR 막의경우 ground formation의 half time이 39 ms로 O decay의 half time 36 ms와비슷하게나타났다 (Table 1). PR gel의경우, G formation time (49 ms) 이 MEM보다느려졌지만 O decay time (10 ms) 는 MEM의것보다훨씬빨라진것을확인할수있다. PR DDM의경우, 매우빠른 M decay (1 ms) 도측정할수있었다. 반면, G formation (12 ms) 과 O decay (23 ms) 는매우빠른것을확인할수있다. PR OG에서는가장느린포토사이클 rate을보이고있다. PR REC는 MEM과같은패턴을보인다. ASR G (ground) formation half time은 GEL, DDM, OG, REC 모두비슷한약 40 ms이다. 그리고 MEM, DDM, OG에서비슷한속도 ( 약 38 ms) 의 M-intermediate을측정할수있었는데, 이는 PR의 M-intermediate의 decay 속도보다약 40 배가느리다는것을확인할수있다. 반면, 모든 ASR 환경조건을 ph 9.0에서측정했기때문에 O-intermediate은관찰되지않았다. PR, ASR 모두 DDM에서빠른포토사이클 half time을가지는것을확인할수있다. PR GEL의 O decay는 2개의시간으로계산되었는데, T 1 값은약 10 ms로빠르지만, T 2 값은 40 ms로길게나왔기때문에 DDM의 half time 보다는느린것을알수있다. 반면 PR, ASR 모두 OG에서는가장느린포토사이클 half time을가진다. 고찰본연구에서는 PR과 ASR이과발현된막분획상태, PR과 ASR이과발현된 light membrane을 polyacrylamide-gel로고정시킨상태, 각로돕신을정제하여 DDM에녹인상태, OG 에녹인상태, 정제된각단백질을 E. coli lipid인 DOPC로재조립한상태로준비해서흡수스펙트럼, 광감응차스펙트럼, 레이저감응포토사이클을측정했다. Table 1. The absorption spectra and photocycle rates of PR and ASR in different sample conditions PR ASR λ max M 400 decay G 530 formation O 600 decay λ max M 400 decay G 540 formation O 600 decay MEM 525 ND ND ND GEL 523 ND ND ND DDM ND OG 528 ND ND REC 529 ND ND ND nm msec nm msec

5 26 Choi et al. Fig. 3. Intermediates formation by flash-induced photochemical analysis of PR and ASR. All PR samples represent ground state, O-intermediate at 530 nm, 600 nm respectively. A little amount of M-intermediates showed at 400 nm. A significantly distinct signal was detected in PR soaked in 0.02% DDM. In the case of ASR, light induced the formation of many M-intermediates instead of O-intermediates at ph 9.0. Likewise PR, the ASR in 0.02% DDM represents the difference of absorption.

6 환경변화에따른로돕신특성변화 27 Fig. 4. Laser flash-induced absorption changes of PR and ASR. After a brief illumination of 532 nm laser, transient light absorption changes caused by depletion or formation of photo intermediates were observed. Transient depletion species turned up at 530 nm and the trace of transient absorption increased at 600 nm in the case of PR. It is possible to observe O-intermediate in PR, otherwise, M-intermediates are abundant in ASR after energy transfer since the measurement was performed at ph 9.0.

7 28 Choi et al. 두로돕신모두 MEM, GEL, REC 환경과 DDM, OG 환경에따라광화학 / 생물리학적성질이바뀌는것을확인할수있었다. 최대흡수파장의경우, 자연상태와가장비슷한조건인 MEM, GEL, REC 환경에서는두단백질모두좀더안정한상태인 blue shift 형태로존재했고, detergent에용해시킨 DDM, OG에서는조금불안정한상태인 red shift 형태로존재했다. 이는로돕신이 detergent에용해되어 micelle을형성하는것보다는, 소수성부분이많으면서이중막구조를이루는 E. coli membrane에끼워있는것이막단백질인로돕신의구조적측면에서는더안정하다는것을보여준다. MEM, GEL, REC에서는단백질이구조적으로안정할지는모르지만, 광감응스펙트럼결과를보면, 빛을흡수한로돕신이구조변화를하는데는 E. coli 지질에의해방해받는것을볼수있다. 따라서 DDM과 OG에정제된상태로있는로돕신이빛을효율적으로흡수하고, chromophore인레티날이 photo-isomerization 과정을하면서, 레티날과 binding 되어있는단백질이함께움직이면서구조변화를좀더쉽게하는것이라예상된다. 보통레이저감응포토사이클을측정할때로돕신을 gel에고정시켜서실험을진행한다 (16). 하지만, 로돕신이깨끗하게발현되지않으면 gel을만들어포토사이클을재면, 깨끗한시그널을얻기가쉽지않다. 반면에, DDM은정제한로돕신의포토사이클을측정하기때문에깨끗한시그널이나온다. PR DDM의경우 gel보다약 4배빠른포토사이클시그널을얻을수있었다. 만약다른종에서얻은수소이온로돕신을정제해서 DDM 상태에서포토사이클을측정했지만, gel 상태에서는얻을수없었다면, PR의것과비교해서 gel 상태의포토사이클속도를예상할수있을것이다. 1999년지놈프로젝트이후, 많은생물종의지놈유전자배열을알수있다. 따라서, 여러종생물에서로돕신유전자를분리및클로닝할수있다. 이를통해얻은다양한로돕신의성질을규명하는데있어, 본연구에서얻은결과가좋은표준참고자료역할을할것이라생각된다. 적요 Chromophore로레티날 (vitamin A) 을사용하는막단백질인로돕신은 7개의막단백질로이루어진다. 최근광화학 / 생물리학측정방법이다양해지면서, 그에따른새로운특성도함께다양하게보고되고있다. 하지만, 다양한측정환경에따른그광화학 / 생물리학특성의차이점에대한비교연구는없는상태이다. 첫째, 빛에너지를이용하여수소이온펌프역할하는것으로잘알려져있는 proteorhodopsin (PR) 은해양 proteobacteria에서발견되었다. 둘째, 한오페론에서 14 kda 전달자와같이발현되면서신호전달기능을하는 Anabaena sensory rhodopsin (ASR) 이있다. 이에본연구에서는이두미생물로돕신을이용하여다양한조건에서그차이를살펴보았다. 각단백질이막에끼어있는상태 (membrane state), polyacrylamide gel에고정되어있는상태, nonionic detergent 일종인 DDM (n-dodecyl-β-d-maltopyranoside) 과, OG (octylβ-d-glucopyranoside) 에녹아있는상태, 좀더자연상태와유사한환경을위해단백질만깨끗하게정제한다음다시 Escherichia coli의지질인 DOPC (1,2-didecanoyl-sn-glycero- 3-phosphocholine) 에재조립한상태, 이렇게 5가지조건에서각각의광화학 / 생물리학특징을흡수스펙트럼 (absorption spectrum), 빛-어둠차이흡수스펙트럼 (light-induced difference spectrum), 포토사이클 (photocycle) 을측정하였다. 그결과 DDM에녹아있는 PR과 ASR에서각다른파장에서 M과 O state와같은선명한 photointermediate를가지고, 가장 signal/noise 비율이좋았다. 본연구를통해막단백질의다양한측정환경에대한그특성의차이점을살펴봄으로써앞으로다양한종류의로돕신연구에기초기반이될것으로사료된다. 감사의말 본연구는교육과학기술부 ( , C00242, C00029) 와국토해양부소관연구개발사업의연구비지원에의해수행되었습니다. 참고문헌 1. Beja, O., E.N. Spudich, J.L. Spudich, M. Leclerc, and E.F. DeLong Proteorhodopsin phototrophy in the ocean. Nature 411, Bogomolni, R.A. and J.L. Spudich Identification of a third rhodopsin-like pigment in photoactic Halobacterium halobium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, Brown, L.S Fungal rhodopsins and opsin-related proteins: eukaryotic homologues of bacteriorhodopsin with unknown functions. Photochem. Photobiol. Sci. 3, Choi, A.R., S.Y. Kim, S.R. Yoon, K. Bae, and K.H. Jung Substitution of Pro206 and Ser86 residues in the retinal binding pocket of Anabaena sensory rhodopsin is not sufficient for proton pumping function. J. Microbiol. Biotechnol. 17, Choi, A.R., S.Y. Kim, S.R. Yoon, and K.H. Jung Glu-56 in HtrI is critical for phototaxis signaling in Halobacterium salinarum. Intergrative Biosciences 9, Jung, J.Y., A.R. Choi, Y.K. Lee, H.K. Lee, and K.H. Jung Spectroscopic and photochemical analysis of proteorhodopsin variants from the surface of the Arctic ocean. FEBS 582, Jung, K.H The distinct signaling mechanism of microbial sensory rhodopsins in Archaea, Eubacteria and Eukarya. Photochem. Photobiol. 83, Jung, K.H., V.D. Trivedi, and J.L. Spudich Demonstration of a sensory rhodopsin in eubacteria. Mol. Microbiol. 47, Kawanabe, A., Y. Furutani, K.H. Jung, and H. Kandori Photochromism of Anabaena sensory rhodopsin. J. Am. Chem. Soc. 129, Kim, S.Y., S.A. Waschuk, L.S. Brown, and K.H. Jung Screening and characterization of proteorhodopsin color-tuning mutations in Escherichia coli with endogenous retinal synthesis. BBA. 1777,

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