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1 공학석사학위논문 Comet assay 를이용한환경오염물질의유전독성모니터링연구 Genotoxicity monitoring of environmental pollutants using single cell gel electrophoresis (SCGE, comet) assay 2006 년 2월 서울시립대학교대학원환경공학과박선영

2 Comet assay 를이용한환경오염물질의유전독성모니터링연구 Genotoxicity monitoring of environmental pollutants using single cell gel electrophoresis (SCGE, comet) assay 지도교수최진희 이논문을공학석사학위논문으로제출함 2005 년 12 월 서울시립대학교대학원환경공학과박선영

3 박선영의공학석사학위논문을인준함. 심사위원장심사위원심사위원 印 印 印 2005 년 12 월 서울시립대학교대학원

4 Comet assay 를이용한환경오염물질의유전독성모니터링연구 박선영서울시립대학교대학원환경공학과지도교수최진희 요약문 본연구에서는다양한환경유해물질들의유전독성을평가하기위해동물세포주및생태지표종에서의 comet assay를이용한 DNA 손상측정기법을정립하고, 대표적인발암물질인 benzo[a]pyrene을처리한인간간암세포주에서의 DNA 손상의기전을살펴보고자하였다. 동물세포주에서전통적인산화적스트레스의생체지표인항산화효소의측정을수행한결과, 환경유해물질로인한 catalase 및 GPx의활성의증가또는감소를관찰할수는있었으나, 변화의정도가너무작거나, 경향성이낮았다. 그에비해 comet assay를이용한 DNA 손상의측정은유해물질처리에따른변화가관찰하기쉽고, 비교적민감하게나타나고보이고있다. 동물세포주및생태지표생물종에서처리물질대부분이처리농도에비례하는 DNA 손상을보였고, 유의성도상당히높았다. DNA의손상의기전을관찰하기위해 HepG2 세포에 benzo[a]pyrene을처리하여본결과, 산화적스트레스의지표인 catalase와 MDA, NF-kB의활성은유의하게증가하였고, DNA 손상역시높게관찰되었으나, apoptosis는나타나지않아, comet assay로관찰할수있는 DNA 손상수준이낮은것으로생각된다. 환경시료인하수처리장유입수과목재열분해산물인 bio-oil에서유전독성을관찰한결과를살펴보면하수처리장유입수의경우, 세포독성은낮은편이지만, DNA 손상이관찰되었고, bio-oil 경 - i -

5 우, 높은세포독성을보였으나, 높은휘발성으로세포처리시간이비교적짧아 DNA 손상은크게나타나지않았다. Comet assay 는인체및생태의유전독성을확 인하는데유용한기법으로활용될수있을것이다. 주요어 - 세포독성 ; 유전독성 ; Comet assay; 환경모니터링 - ii -

6 목차 요약문 ⅰ 목차 ⅲ List of Tables ⅴ List of Figures ⅵ 1. 서론 1.1. 연구배경및목적 연구내용및범위 2 2. 이론적배경 2.1. 생체지표 (Biomarker) 환경유해물질로인한산화적스트레스 산화적스트레스지표 6 3. 실험내용및방법 3.1. 처리생물종의배양및처리조건 처리환경물질 Comet assay 항산화효소활성도실험 지질과산화측정 (TBARS법) Eletrophoresis Mobility Shift assay(emsa) Flow cytometry DNA fragmentation 통계처리 15 - iii -

7 4. 결과및고찰 4.1. 다양한환경유해물질의세포독성, 유전독성및생태독성연구 환경유해물질의세포독성 comet assay 항산화효소활성도측정 Bezo[a]pyrene의독성연구 Comet assay Catalase 활성도및 MDA 측정 전사조절인자 NF-kB의발현 Apoptosis 관찰 환경시표의세포독성및유전독성 하수처리장유입수 열분해 bio-oil 결론 33 참고문헌 34 Abstract 39 - iv -

8 List of Tables Table 1. 처리환경물질 10 Table 2. Bio-oil 의주요구성물질 31 - v -

9 List of Figure Figure 1.Production and metabolism of ROS(Reactive Oxygen species) 4 Figure 2. Reaction of GPx 7 Figure 3. Cell viability of in HeLa cells(a) and HepG2 cells(b) for 24hr using trypan blue exclusion assay 17 Figure 4. DNA damage in HeLa cells for 24hr 18 Figure 5. DNA damage in C.tentans for 24hr(a) and DNA damage in C.riparius for 24hr (b) 19 Figure 6. DNA damage in D.magna for 24hr 20 Figure 7. Caltalase activity in HeLa cells for 24hr 22 Figure 8. GPx activity in HeLa cells for 24hr 23 Figure 9. DNA damage of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr 24 Figure 10. Catalase activity of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr 25 Figure 11. Lipid peroxidatation of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr 25 Figure 12. Induction of NF-kB binding activity by benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr 26 Figure 13. Cell cycle in different concentration in benzo[a]pyrene treated HepG2 cells for 24 by Flow cytometry 27 Figure 14. DNA fragmentation in B [a]p treated HepG2 cells for 24hr 27 Figure 15. Cell viability in extract of sewage treated CHO-K1 cells using trypan blue exclusion assay 28 Figure 16. DNA damage in extract of sewage treated CHO-K1 cells for 24hr 29 Figure 17. Cell viability in supernatant of bio-oil and tar of bio-oil treated L5178Y cells for 24hr using trypan blue exclusion assay 30 - vi -

10 Figure 18. DNA damage in supernatant of bio-oil and tar of bio-oil treated L5178Y cells for 24hr 32 - vii -

11 1. 서론 1.1. 연구배경및목적 최근지속적인산업의발달로인해다양한환경유해물질이발생되어많은환경문제 를유발하고있어, 이들물질들에대한위해성평가가활발히진행되어오고있다. 지금까지의환경유해물질의평가는화학적분석을통한물질의존재여부, 농도및 메커니즘에관한정보에한정되어유해물질의처리에적용하였으나, 환경내모든 물질의화학적분석은불가능할뿐만아니라, 유해물질의혼합물에의한환경오염 에대처할수없다. 또유해물질에대한생물의반응을토대로한바이오모니터링이 개발되었으나, 이러한개체군수준의모니터링으로는오염상태의민감한측정이어 1, 2) 려워, 모니터링을통한오염예방은상당히제한적이다. 이러한문제점들때문에조기경보장치 (early warning system) 의역할을수행할수 있는모니터링방법인생체지표 (biomarker) 의개발의필요성이대두되었다. 생체 지표는환경내에존재하는생물종또는실험실에서배양한세포에서분자, 생화학, 생리적수준의지표를이용하여오염물질또는현재뿐만아니라과거의오염물질의 노출에대한생체의종합화된정보를나타내주고, 낮은농도의유해물질에의한환 경의영향을민감하게평가할수있다. 1) 대부분의유해물질들이직접혹은간접적 으로세포내에활성산소종 (ROS; reactive oxygen species) 을발생시키는데, 이는 세포내 redox 균형을무너뜨려세포는산화적스트레스상태가된다. 3) 일단세포가 산화적스트레스상태가되면단백질, 지질등세포구성물질이손상되고, 염색체이상및 DNA 손상이유발되어, 결과적으로돌연변이, 암, 유전자이상의유전독성을나타낸다. 기존의산화적스트레스의측정지표로는지질과산화측정등의 2차산물을확인하는방법과세포내산화적방어기작을이용한항산화효소의발현의측정, 산화적스트레스로인한DNA 손상을확인하기위해자매염색분체교환 (sister chromatid exchange), 소핵실험 (micronucleus assay), 변형염기 8-hydroxyguanine 측정, 단세포전기영동법 (single cell gel electrophoresis (SCGE, comet) assay) 등의실험기법들이개발되었다. 6,7,8) 이중단세포전기영 - 1 -

12 동법, 즉 comet assay는다른기법들에비해비교적간편하고, 빠르며, 낮은수준의손상까지확인할수있다. 또한 comet assay는세포하나하나의 DNA 손상을확인하는방법이므로, 민감하고, 생물시료로분석이가능하며, 배양세포는물론유해물질을처리한생물조직에서추출한세포에도적용가능하다. 특히높은염기성 (ph13이상) 조건에서의 comet assay는 DNA 양가닥절단 (double strand break), 외가닥절단 (single strand break) 은물론 alkali-labile 손상 (AP 부위 ) 을측정할수있어발암, 돌연변이유발물질의지표로주목받고있다. 7) 1.2. 연구내용및범위 본연구에서는내분비계장애물질및기타환경유해물질들의동물세포주및생태지표종에서의아급성치사 (sub-lethal) 농도를구해, 기존의산화적스트레스측정기법인항산화효소인 catalase, GPx등의활성도를측정하여, comet assay를이용한 DNA 손상을측정한결과와비교하여보고, 인간간암세포주인 HepG2 세포에서의대표적인발암성물질인 benzo[a]pyrene을처리하여전사조절인자인 NF-kB 의활성및지질과산화, 세포주기의변화와 apoptosis의발생등의다양한지표들과 comet assay로얻어진 DNA 손상결과를비교관찰하여 DNA 손상의기전을살펴보고자한다. 또한동물세포주에서하수유입수, 열분해 bio-oil 등의환경시료를처리하여 comet assay를수행하여 DNA 손상으로인한유전독성을평가하고, 환경물질의산화적스트레스로인한유전독성을평가기법을정립하고자한다

13 2. 이론적배경 2.1. 생체지표 (Biomarker) 전통적인바이오모니터링은생물종의존재유무로그종이서식하고있는환경의질을평가하는, 주로개체의치사를종말점 (end-point) 으로한, 지표종 (bioindicator) 을이용한모니터링이었다. 하지만환경내오염의영향이개체군이상에서나타나게되면환경의질은이미돌이킬수없을만큼나빠진후이기때문에기존의지표종 (bioindicator) 에의한위해성평가방법으로는현재환경의질을평가할수는있을지라도, 환경질의개선을기대하기는어렵다. 생체지표 (biomarkers) 연구는지표종 (bioindicator) 에의한위해성평가의이러한한계점을극복하기위한대안으로대두되었다. 1980년대부터미국과유럽을중심으로생물학의미시적인단계즉생리학, 생화학, 분자생물학적관점에서환경독성학을연구하기시작하였는데, 이는생체지표 (biomarkers) 연구로구체화되었다. 현재미국, 유럽등에서의생체지표연구는실험실수준에서의개발뿐만아니라이미응용단계까지실용화되어, 생체지표를이용한수질모니터링을실시하고있다. 생체가독성물질에노출되면분자생물학적, 생화학적, 세포생물학적, 생리학적수준에서의다양한교란이수반되며, 이러한교란은독성물질에대한생체지표로사용될수있다. 즉, 지표종 (bioindicator) 은개체수준에서의영향에대한연구라고하면, 생체지표 (biomarkers) 의연구는개체보다하위생물학적수준에서의독성물질의영향이관심분야이다. 따라서환경독성학에서의생체지표 (biomarkers) 의개념은 생체가오염물질의특징을지닌화학물질에현재노출되고있거나, 과거에노출되었다는사실을말해주는관찰또는측정가능한분자생물학적, 생화학적, 세포생물학적, 생리학적또는행동학적지표 라고정의될수있다. 주로오염물질에의한이쪽부분에교란으로, 개체군, 군집수준의생태적지표보다는빠른반응과높은독성학적연관을보이는지표들이다

14 2.2. 환경유해물질로인한산화적스트레스 세포내에서미토콘드리아전자절단계, 호중구의 NADPH oxidase 방사선 중금속 알킬화제등에의해활성산소 (oxygen radical-ros; reactive oxygen species) 가생긴다. 활성산소란체내의산소가산화과정을거쳐 radical을띠게되어발생되는산화력이큰산소종류를말하며, 강한살균작용으로세포내이 물질을제거하기도하지만, 반응성이커서세포거대분자에손상을준다. 또한 세포기능이상을유도하여질병을유발시키기도한다. 특히, 세포의악성전이를유도하여발암의원인이되기도한다. 활성산소종의종류는 O 2, O - 2, H 2O 2, - OH, HOCl, O 3 등이있다. 정상적인조건에서호기성세포는대사과정중대사되는산소중 2~5% 가활성산소종로전환된다. 세포내에는이들을분해하는효소가있어, 항상성을유지한다. 하지만, 화학물질이나자외선등으로인한자극으로인해활성산소종의생성이과다해지면활성산소의생성과제거의균형이깨지면서세포는산화적스트레스상태가되고, DNA, 단백질, 지질의과산화를일으켜손상을준다. 사람세포에서는산화적스트레스가정보분자가되어몇가지전사인자를활성화하며특정유전자군의발현을유도해활성산소의제거시스템이나환원기구를작동시켜산화환원제어를한다. Aerobic metabolism ROS Specialized physiological reaction Inactive species Antioxidants genotoxicity Protein, lipid, DNA damage Protein induction repaired lipid, DNA Repair enzyme Repair Defense mechanism Antioxidant enzyme Fig 1. Production and metabolism of ROS(Reactive Oxygen species) - 4 -

15 환경내존재하는많은유해화학물질들이산화-환원활성물질들 (redox active compounds) 이고이러한산화-환원과정 (redox cycling) 에서독성을나타내게된다. MFO 유도물질 (mixed function oxydase: MFO inducer) 보다더많은범위의화학물질들이산화-환원활성물질들 (redox active compounds) 인것으로알려져있다. 또한활성산소종생성은산소소비, 세포호흡등생체내에너지대사과정과밀접하게연관된과정으로활성산소종에의한산화적손상은높은생리적인의미를가진다. 산화적스트레스는인체의많은질병의발병및진행과의높은연관성으로인해보건의학분야에서이미질병의진단및치료목적으로상당한수준의연구가진행되어왔고또그중많은부분은실재임상에적용하는단계에까지도달해있다. 하지만환경분야에서는아직초보적인단계에머무르고있다고할수있다. 3,4,5) - 5 -

16 2.3. 산화적스트레스지표 산화적스트레스로인한 DNA 손상지표로서의 comet assay 활성산소종로인한 DNA 손상이과도하게진행되면돌연변이를초래하고나아가암으로발전하게된다. 활성산소종로인한 DNA의손상은크게 DNA 가닥절단, alkali labile 부위생성, 산화된염기생성등으로나눌수있다. 8) Comet assay는각각의세포의수준에서 DNA 손상을확인하기위해개발된 microgel electrophoresis 법이다. 세포핵안에단단하게뭉쳐존재하는 DNA에고농도의염으로해리시키면핵단백질이빠져나가핵모양으로지니면서내부의 DNA를포함하는핵양체가되는데, 이핵양체내에가닥의절단등의손상이있는경우, 염기성상태에서 DNA 염기쌍이분리되고양쪽끝이서로풀리게되어단단히뭉쳐있던구조가변형된다. 결과적으로 DNA구조가이완되고음극에노출되어전기영동시양극쪽으로이동되어원래구조로부터확장된꼬리형태를보여전기영동에의해감지할수있다. DNA 손상을입은세포는밝은형광을나타내는머리부분과꼬리부분이나타나게되고, 손상정도는꼬리 (tail) 의형광강도로알수있다. 6-22) 항산화효소계와지질과산화항산화효소는산화적스트레스의방어기작으로, 활성산소종가과다하게발생되면제거하는효소가발생하여활성산소종를제거한다. 대표적인항산화효소로는 catalase와 GPx, SOD 등이있는데, Catalase는 2H 2 O 2 2H 2 O+O 2 를촉매하는효소로혐기성세균을제외한거의모든생물에존재한다. 포유류에서는적혈구 간 신장, 고등식물에서는엽록체에다량함유되어있다. 생체내의대사과정에서생성된유독한과산화물로부터생체조직을보호한다. 매우안정하고분자량은 22만 ~25만으로매우크다. GPx(Glutathione perxidase) 는 H 2O 2 와두분자의 GSH(glutathione) 이반응하여 GSSH(Oxidized GSH) 로변화시키는효소이 - 6 -

17 다. 포유류적혈구주에서주로많이관찰되면, 세포내의과산화물을소모하여 지질의과산화를방지하는역할을한다. GPx 의효소반응은 Fig.2. 와같다. 23, 24, 25) Fig.2. Reaction of GPx 세포내거대분자의구성물질인지질은산화적스트레스로인해많은 2차산물을생성하는데, 그중 MDA(malondialdhyde) 는지질과산화과정에서발생하는알데하이드 (Adehyde) 류의중간산물이다. 세포내 MDA의생성의증가는산화적스트레스의지표로사용되어진다 산화적스트레스로인한전사조절인자 NF-kB 의활성 진핵세포전사에관여하는기본기구는세종류의 RNA 중합효소, 프로모터, 중합효소와프로모터가결합하게하는보편전사인자가있다. 보편전사인자는전사출발점과전사방향을정하지만, 낮은수준의전사 (basal level transcription) 만을가능하게한다. 실제세포내에서는활성을나타내는활성을나타내는유전사의전사는추가적인유전자-특이적전사인자 (gene-specific transcription factor) 들이수행하게된다. NF-kB는 DNA에붙는단백질로염증에관여하는라디칼이나사이토카인과반응성이큰중간대사체중많은물질이 NF-kB에의 해조절되는유전자로부터생성된다. p50, p65 의이종이량체인 NF-kB 는세포 질에서저해제인 I-kB(Inhibitor-kB) 와복합체를형성하여불활성형으로존재하 - 7 -

18 지만, 활성산소에의해 I-kB가유리되면 NF-kB는핵으로이동하여유전자를유도한다. 그때 NF-kB가 DNA 응답성엘리먼트와결합할수있게되기위해서는산화적스트레스에의해유도된티오레톡신 (Trx) 으로프로세싱을받아 NF-kB의 disulfide결합 (S-S결합) 이환원되어지고 C kinase, serine kinase, trysine kinase를활성화하며 NF-kB I-kB를인산화하여활성화하는것으로추정된다 ) - 8 -

19 3. 실험내용및방법 3.1. 처리생물종의배양및처리조건 동물세포주의배양및세포독성실험 인간간암세포주인 HepG2 cells, 자궁경부암세포주인 HeLa cells, 및 chinese hamster 난소암세포주인 CHO-K1 cells 등을 10% 의 fetal bovine serum, 1% antibiotics가포함된dmem, RPMI1640 배지를이용하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 또 mouse 임파구세포인 L5178Y cells를 10% Horse serum, 1% penysilin/streptomysin이포함된 RPMI1640배지를이용하여 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 각농도의유해물질을 24시간, 혹은 2시간동안처리한후, trypan blue 염색법과 MTT법을이용하여세포독성을측정하였다. Trypan blue 염색법은 12well plate 에 2X10 5 의세포를 24시간배양하여안정화한뒤, 유해물질을처리한후, 3분정도 0.4% trypan blue로염색하여죽은세포의세포막이 trypan blue로염색되는것을이용하여세포생존율을구하였다. MTT법은 96well plate에 2x10 4 를 24시간배양한하여세포를안정화한후, 유해물질을 24시간처리하였다. 다시배지를제거하고 MTT(3-4,5-dimethylathiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide) 용액을세포에 4시간정도다시배양한뒤, DMSO로녹여 540nm에서흡광도를측정하여세포생존율을구하였다 지표생물종의배양및처리조건 Daphnia magna 22 ± 1 의조건에서 16h. Light/8h. dark의광주기로 M4배지에서 Chlorella sp. 를먹이로사용배양하였다. M4배지에각농도의유해물질을처리한후급성독성농도를구하여, 이를기준으로 comet assay를이용한 DNA 손상을측정실험을실 - 9 -

20 행하였다 Chironomus riparius, Chiromus tentans 20 ± 1, 폭기조건에서 14h light / 10h dark의광주기로, Tetramin를먹이로사용하여배양하였다. Chironomus 유충을유해물질이처리한사육수에서 24시간배양하여각농도의유해물질을처리한후급성독성농도를구한다. 이를기준으로 comet assay를이용한 DNA 손상을측정실험을실행하였다 처리환경물질 환경유해물질 Table1. 처리환경물질 Nonylphenol(NP, Ca. No ) Alkyl phenols Bisphenol A diglycidyl dtehr(bpa, Ca.No ) Endosulfan(ES, Ca. NO ) Pesticides PAH & VOC Paraquate dichloride(paraquat, Ca NO. M2254) Chloropyriphos(CP, Ca. No ) Benzo[a]pyrene(B[a]P, Ca. No. B1760) Carbon tetrachloride(ccl4, Ca. No ) 그외환경유해물질 Octachlorostyrene(OCS, Ca. No ) Octachlorostyrene 외의모든처리환경유해물질은 Sigma -aldrich 에서구매하였 고, Octachlorostyrene 은 wako 에서구매하여사용하였다

21 환경시료중랑하수처리장의 1차침전지하수유입수와 DCM(dichloromethane) 를분별깔대기에 5:1 비율로섞어강하게세번흔들어주었다. 하층부의 DCM에용해된유입수내의유기물을모아거름종이에 Na 2SO 4 를넣고거르고 rotary evaporator를이용하여40도로증류하여모아진유기물을 DMSO 1mL에녹여사용하였다. Bio-oil은목재류를약 500 에서무산소조건으로열분해하여얻어진 oil를사용하였다 Comet assay 동물세포주의경우, 세포독성에서얻은 IC 50 을기준으로실험을수행하였다. 이때음성대조군은유해물질을희석할때사용한 DMSO(dimethyl sulfoxide) 를사용하였고, 양성대조군은 10μM의 H 2O 2 를사용하였다. 4X10 5 cells/ml이들어있는 6well plate에각각농도별로시험물질과 H 2 O 2 를처리하여 24시간동안배양한다. 24시간후, 0.05% trypsin을처리하여세포를뗀후, 원심분리 (1300RPM, 3분 ) 하여상층액을버린다. 처리된세포를 PBS로부유시킨후, 1% normal meting point agarose를미리코팅해둔슬라이드에부유액을 1% low melting point agarose 100μL와 1:1 비율로혼합하여얇게입히고 4 에서건조한다. 다시슬라이드에 0.5% 의 low melting point agarose를입혀 4 암실에서 10분동안건조시킨다. 건조된슬라이드를 4 암실에서 1시간 30분동안 lysis 버퍼 (2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1% Triton X100, ph 10) 에담가 lysis시켰다. 지표생물종의경우, 급성독성실험에서구한 LC 50 및 EC 50 농도를기준으로실험을수행하였고, 대조군으로는처리물질을희석한에탄올내지는 DMSO 등을사용하였다. 각유해물질을농도별로 24시간처리한후, 얇게저미고, 10% DMSO와 2mM의 EDTA가함유된 PBS를넣고 vortex를 5회정도반복하여세포를분리하였다. 분리된세포로동물세포주와마찬가지로슬라이드를제조하여, 4 암실에서 60 분동안 lysis(2.5m NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1% Triton X100, 10% DMSO, ph 10) 시키고, 20분동안 unwinding(0.01m EDTA, 0.3M NaOH, ph13)

22 시킨다. Unwinding된슬라이드들을 unwinding 버퍼로전압 25V, 전류 300mA에서 20분동안전기영동을실시한다. 전기영동이끝난슬라이드는 0.4M Tris buffer로 10분씩 3회세척하고, 70% ethanol 으로 5분동안탈수시킨후, 완전건조시킨다. 건조된슬라이드는 Ethidium Bromaide(5μg/mL) 50μL로염색하여, 형광현미경으로관찰한다. 각슬라이드별로 25~50개의세포의 Tail moment(tm) 및 Olive tail moment(otm) 의평균을 Kinetic Komet 5.5프로그램을이용하여구하였다. 6-22) 3.4. 항산화효소활성도실험 동물세포주의경우, 2X10 6 세포에유해물질을 24시간처리한후, PBS로세척한후 K-Phosphate 버퍼로파쇄하여 1% 의 trypton-x 100를가해 10분간 4 에방치한후, 8000rpm으로원심분리하여상층액을효소샘플로이용하였다. 지표생물종의경우, 처리된개체에액체질소를넣고파쇄하여 Tris-EDTA 버퍼를가해 4, 3,000rpm에서원심분리한다. 상층액을다시 4 에서 10,000rpm으로원심분리후, 그상층액을효소샘플로사용하였다. 이렇게얻어진효소샘플은 Bradford 법으로단백질의양을측정하였다. Bradford 용액을 1:5 의비율로증류수에희석한다. BSA standard (1mg, 2mg, 4mg, 6mg, 8mg, 10mg, 12mg, 14mg, 16mg,18mg, 20mg) 1mL Bradford 희석용액 에 BSA standard 를넣어주고 5 분간상온에방치한후 spectrophotometer 를이 용하여 595nm 에서흡광도를측정한다. Linear regression curve 을이용하여검 량선을작성한다. 추출된단백질을같은방법으로처리하여검량선로부터단백 질량을도출한다. 효소활성측정의원리는효소에의해증가하는생성물이나감소하는반응물을스펙트로미터로흡광도로찍어흡광도의변화율을몰흡광계수를이용하여반응률로환산하여효소활성을측정한다

23 - Catalase 활성측정 측정 23) PBS(pH 7.0) 0.95mL에샘플 0.05mL를넣고 25 에서 1~3분간 preincubation한후, 0.1%H 2 O 2 를넣어섞는다. 석영셀을이용하여스펙트로미터로 1분간 H 2 O 2 의감소정도를 OD 240nm에서정량한다. - GPx (Glutathione Peroxide) 활성측정 측정 23) 50mM tris buffer 0.15mL에 reactive solution(gsh 20mM, NADPH 0.12mM, GR 약 1unit) 1.25mL와샘플 0.05mL를넣고 25 에서 5분간 preincubation한뒤, 8mM의 cumen 0.05mL 넣고 GSSH가생성으로인한발색을이용하여 GPx 가 GSH를 GSSG로변화시키는정도를 340nm UV, 1분측정하여정량한다. Se-GPx의정량은 Cumen 대신 NaN 3 (1mM) 0.05mL 넣고 5분간 preincubation 후 2mM의 H 2O 2 를가해주고, 340nm에서 1분간, 발색정도를측정한다 지질과산화측정 (TBARS 법 ) Cyclo-oxenase pathway에서 TBA(Thiobarbituric acid) 에의하여형성되는 MDA( malondialdehyde) 를정량하여지질과산화정도를판단하였다. 1X10 6 세포에유해물질을 24시간처리하고 1mL의 PBS를넣고파쇄하였다. 파쇄한샘플 30μl에 8.1% SDS 30μl, 20% acetic acid(ph 3.5) 225μl, 0.8% TBA 225 μl을넣고 D.W. 로총 600μl를맞춘다. 이때, TBA standard(200, 100, 80, 40, 20, 10, 0 μmol/l) 도샘플과동시에처리해준다. 잘흔들어섞는후, water bath에서 95, 60 min 끓인다. 4 에서바로식히고, n-butanol 600μl을넣고 잘섞어준다. 4, 3000rpm 에서 30 분간원심분리하고, 상층액을 plastic cuvette 에최대한넣고흡광도를 532nm 에서측정하였다. TBA 검량선을그려 각처리샘플의 MDA 의생성량을구하였다. 26, 27) 3.6. Electrophoresis Mobility Shift assay(emsa) 산화적스트레스로인한전사조절인자인 NF-kB 의활성을확인하기위해

24 EMSA 를실시하였다. 2X10 6 수의세포를 24 시간배양하여안정화시킨후, 환 경유해물질을 24 시간처리한다. 배양액을제거하고미리준비해둔 차가운 PBS 10mL로 2회세척하였다. 0.5mL 차가운 PBS를넣어주고스크래퍼로긁어주어새튜브로옮기고, 3,000 rpm으로 4 에서 5분간원심분리한다. 상층액을제거한후버퍼 A(10mM HEPES, ph 7.9, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5 mm PMSF) 를 400 ml 넣고약하게섞어주고얼음위에서 15분간방치하였다. 10% NP-40를 25 ml 넣고 10초간세게 vortex한후 13,000 rpm 으로 4 에서 1~2분간원심분리하는단계를 2회반복한다. 버퍼 B(20mM HEPES, ph 7.9, 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT,1mM PMSF) 50 ml를넣고 4 에서세게 10분간 vortex하고, 13,000 rpm으로 4 에서 10분간원심분리한후상층액을핵단백질추출물로사용하였다. 32) 추출한단백질은 Bradford 방법으로정량하여사용하였다. NF-kb의 probe와 EMSA 시약은 Panomics 사의 EMSA Gel-Shift kit(usa, Redwood) 에포함된것을사용하여 수행하였다. 5μg의핵단백질과 2μL의 5Xbinding 버퍼와 1μL Poly(dI-dC) 를넣고증류수로 10μL를맞춘후, 30분간반응시키고, 0.5X TBE버퍼를가한 6% PAGE gel(polyacrylamide gel) 에서 60분간전기영동을하였다. 전기영동후, nylone membrane에 transfer하고 membrane을 85 건조기에넣고고정시킨다음 Streptavidin-HRP conjugate으로 dectection 하고, ECL 용액을처리하고필름에노출하였다. 30,31) 3.7. Flow cytometry 1X10 6 수의세포를 24 시간배양하여안정화한후, 유해물질을처리하고다시 24 시간배양하였다. 처리한세포를 PBS 로세척한후, 1000rpm 으로 10 분간원 심분리하였다. 상층액을버리고, 1mL 의 70% 에탄올을잘섞어준뒤, 4 에 서 30 분간두었다가, 2mM 의 EDTA 가포함된 PBS 를넣고 1000rpm 으로두번 원심분리하였다. 0.5mL 의 PI(Propidium Iodide) 용액을넣고잘섞어준뒤, 37, 암실조건에서 30 분간배양하고, Flow cytometry 로세포주기를관찰하

25 였다. 33) 3.8. DNA fragmentation 유해물질을처리한세포를 PBS로세척하고, 400rpm으로원심분리하여, DNeasy R Tissue Kit(Qiagen, Germany, Cat.No ) 를이용하여 DNA를추출하였다. 260nm에서측정한흡광도를이용하여 DNA의농도를구하고, 각처리농도별로 10μg의 DNA를 1.5% 의 agarose 겔에서 90분간전기영동하여 DNA fragmentation의생성을관찰하였다 통계처리 항산화효소의활성및 MDA 측정결과에서대조군과유해물질처리군간의통계적유의성은 parametric t test법으로분석하였다. Comet assay의결과는각처리군별로 75개에서 200개의세포에서측정한 Tail moment와 Olive tail moment의평균값과표준오차를 Dunnett`s multiple comparison test인 one way ANOVA법으로분석하였다. 통계적유의성은 p<0.05 이하에서평가하였고, 모든통계처리는 SPSS 12.0KO (SPSS Inc., Chicago, Il, USA) 를이용하여분석하였다

26 4. 결과및고찰 4.1. 다양한환경유해물질의세포독성, 유전독성및생태독성연구 환경유해물질의세포독성 Cell viability(%) Cell Viability(%) R 2 = IC 50 = 8.263mg/L 0 R 2 = IC 50 = 12.2mg/L NP(mg/L) BPA(mg/L) Cell viability(%) Cell Viability(%) R 2 = IC 50 =22mg/L 0 R 2 = IC 50 = mg/L ES(mg/L) Paraquat(mg/L)

27 Cell Viability(%) cell viability(%) R 2 = IC 50 =217.2mg/L 0 R 2 = IC 50 = mg/L CP(mg/L) CCl4(mg/L) (a) Cell viability(%) NP(mg/L) (b) Fig.3. Cell viability of in HeLa cells(a) and HepG2 cells(b) for 24hr using trypan blue exclusion assay 여러환경유해물질을 24시간처리한후, 세포생존율구하였다. HeLa 세포에서의세포독성실험의결과각각의 24시간 IC 50 (50% 생존저해농도 = 50% 세포생존농도 ) 은 nonylphenol은 8.263mg/L, bisphenol A는 12.2mg/L, endosulfan은 22mg/L, Paraquat은 262.1mg/L, chloropyriphos는 217.2mg/L 였다. 알킬페놀류의세포독성은높은편으로관찰되었으나, 수용성의농약류인 paraquat과 chloropyriphos의세포독성은낮게관찰되었다. HepG2 세포에서의독성실험결과 nonylphenol은 3.8mg/L였다

28 comet assay 손상을입은 DNA는염기성조건에서음전하를띠게되어전기영동시양극방향으로끌려, 혜성 (comet) 모양을나타내게된다. DNA 손상정도를판정하기위해 Tail moment (tail length X tail % DNA /100) 및 Olive tail moment( (tail mean - head mean) X tail %DNA/100) 를측정하여음성대조군과비교하여유의성을확인하였다 동물세포주에서의 comet assay Fig.4. DNA damage in HeLa cells for 24hr. Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). HeLa 세포에서의 comet assay 결과는 Fig.4. 에나타내었다. 환경유해물질처리군에서음성대조군에비해 tail moment, olive tail moment 모두증가하는경향을나타내었다. 양성대조군은 10μM의 H 2O 2 를처리하였는데, 모든조건에서음성대조군에비해유의성을나타내었다. HeLa 세포에산화적스트레스를주는것으로알려진제초제인 Paraquat 262mg/L, 131mg/L, 625mg/L 313.5mg/L를 24시간처리하고 comet assay를실시하였을때, olive tail moment는모든처리농도에서유의하게나타났고, tail moment 역시 262mg/L과 131mg/L 처리농도에서유의하게나타났다.(p<0.05) 알킬페놀류인 nonylphenol를 8.26mg/L, 4.13mg/L,

29 2.065mg/L 의농도로 24 시간처리한결과, 8.26mg/L 과 4.13mg/L 처리군에서 tail moment, olive tail moment 모두음성대조군에비해유의하게나타났다. paraquat, nonylphenol 모두유전독성이상당히높은것으로보인다 지표생물종에서의 comet assay 지표생물종 (Chironomus riparous, Chironomus tentans, Daphnia magna) 의 comet assay 결과는 Fig에나타내었다. 급성독성실험에서얻어진 LC 50 및 EC 50 농도의 1/10, 1/100, 1/1000의농도에서 comet assay를수행하였다. Tail moment, Olive tail moment Tail moment Olive tail moment CP(µg/L) (a)

30 Fig.5. DNA damage in C.tentans for 24hr(a) and DNA damage in C.riparius for 24hr(b). Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). (b) 대표적인수생지표생물종인 C. riparius와 C. tentans에 nonylphenol를각각 100 μg/l, 10μg/L, 1μg/L를처리하고 24시간배양후, comet assay를실시하였을때, C. riparius와 C. tentans 모두 100μg/L, 10μg/L 처리군에서 tail moment, olive tail moment 모두대조군에비해유의성이나타났다. C.tentans에염소계농약류인 chloropyrifos 250μg/L, 25μg/L, 2.5μg/L 처리하였을때, 250μg/L 처리군에서유의성이높게나타났지만, Octachlorostyrene 5mg/L, 500μg/L, 50μg/L 처리군과 benzo[a]pyrene 3mg/L, 300μg/L, 30μg/L 처리군에서는처리농도에따라 tail moment, olive tail moment 모두증가하는경향을보였으나, 유의성을나타나지않았다 Tail moment Olive tail moment Tail moment, Olive tail moment BPA(µg/L)

31 Fig.6. DNA damage in D.magna for 24hr. Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). 수중급성독성의대표적인지표종인 C. magana에서는 C. riparius, C. tentans와마찬가지로농도에비례하여 DNA 손상이증가하는경향을보였고, benzo[a]pyrene 2μg/L, 0,2μg/L, 0.02μg/L를처리하였을때, 2μg/L 처리군에서는 tail moment, olive tail moment 모두대조군에비해유의하게증가하는것으로나타났다. 알킬페놀류인 nonylphenol과 bisphenol A 30μg/L, 3μg/L, 0.3μg/L처리시, 모두대조군에비해증가경향을보였고, bisphenol A 처리군에서는 3, 30μg/L 처리군에서 tail moment, olive tail moment 모두유의성이보인반면 nonylphenol 은모든처리농도에서유의성을보이지않았다. 지표생물종의경우급성독성농도에비해 10배내지는 1000배이상낮은농도를처리하였음에도환경유해물질의처리에따른 DNA 손상의관찰이용이하였다

32 항산화효소활성도측정 Catalase 측정 CAT activity (U/mg protein) CAT activity(u/mg protein) NP(mg/L) BPA(mg/L) CAT activity(u/mg protein) CAT activity(u/mg protein) C.P(mg/L) Paraquat(mg/L) Fig.7. Caltalase activity in HeLa cells for 24hr. (n=3, mean ±SEM p < 0.05). HeLa 세포에서는전체적으로 catalase의활성도매우낮았다. Nonylphnol의경우, 농도에비례하여 catalase의활성이증가하였으나, 유의성을보이지않았다. Bisphenol-A은대조군에비해처리군에서의활성이높았고, 6.1mg/L에서는유의성을보였다. Paraquat의경우에도대조군에비해처리군에서의 catalase의활성이높았고, 31.25mg/L, 62.5mg/L에서유의성을보였다. 반면에 Chlorophyriphos의경우 138.5mg/L에서만유의하게감소했을뿐나머지처리군에서는변화가거의없었다

33 GPx Total GPx activity Se-GPx activity Toatal GPx Se GPx GPx activity(u/mg protein) GPx activity(u/mg protein) BPA(mg/L) Paraquat(mg/L) Fig.8. GPx activity in HeLa cells for 24hr. (n=3, mean ±SEM p < 0.05). HeLa 세포에서 GPx의활성은 catalase에비해유해물질처리군에서대체로큰증가를보였다. Bisphenol-A의모든처리군에서대조군에비해유의한증가를보였고, 총 GPx의활성과셀레늄 GPx의양이큰차이를보이지않았다. Paraquat 처리군의경우에는총 GPx는가장낮은처리농도인 3.05mg/L에서가장높은활성을나타내었고, 점점감소하는경향을보였고, 셀레늄 GPx는 31mg/L에서가장높은활성을보였다. 또, Bisphnol-A와는달리총 GPx에비해셀레늄 GPx의활성이상당히낮았다

34 4.2. Benzo[a]pyrene 의독성연구 Comet assay Tail moment, Olive tail moment Tail moment Olive tail momet PC PC B[a]P (µm) Fig.9. DNA damage of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr. Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). HepG2 세포에서의 benzo[a]pyrene의세포독성은매우높다. 29) Benzo[a]pyrene의 DNA 손상기전을살펴보기위해, benzo[a]pyrene 0.1μM, 1μM, 4μM, 10μM, 양성대조군 10μM의 H 2 O 2 를 HepG2에 24시간처리하고 comet assay로 DNA 손상을살펴보았다. 양성대조군및모든처리농도에서 tail moment와 olive tail moment 모두유의성을나타냈다. Benzo[a]pyrene이 HepG2 세포에서유전독성이매우높음을알수있다

35 Catalase 활성도및 MDA 측정 60 CAT activity(u/mg protein) B[a]P(µM) Fig.10. Catalase activity of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr. (n=3, mean ±SEM p < 0.05). HepG2 세포에서의 catalase 의활성이 HeLa 세포에비해매우높고, HepG2 의 benzo[a]pyrene 처리군에서는농도에비례하여 catalase 의활성이눈에띄게증가 함을볼수있다. 8 MDA(nmol/mg protein) B[a]P(µM) Fig.11. Lipid peroxidatation of benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr. (n=3, mean ±SEM p < 0.05). 대조군에비해 benzo[a]pyrene 처리군에서의 MDA 의생성량이증가함을볼수 있어, benzo[a]pyrene 가지질과산화를유발함을알수있다. Benzo[a]pyrene

36 이 HepG2 세포내에서산화적스트레스를유발하는것을관찰할수있다 전사조절인자 NF-kB 의발현 (a) μ (b) Band dendsity B[a]P(µM) Fig.12. Induction of NF-kB binding activity by benzo[a]pyrene in HepG2 cells for 24hr by electrophoresis mobility shift assay(emsa) abalysis(a); densitometric analysis(b) NF-kB 는세포가산화적스트레스상태가되었을때항상성을유지하기위해활 성화되는전사조절인자로, 대조군에비해 benzo[a]pyrene 처리군에서발현이 증가하는경향을보였다

37 Apoptosis 관찰 Fig.13.Cell cycle in different concentration in benzo[a]pyrene treated HepG2 cells for 24 by Flow cytometry Fig.14. DNA fragmentation in B [a]p treated HepG2 cells for 24hr Flow cytometry 실험결과, 모든처리농도 (0~10μM) 에서 cell cycle arrest는관찰할수없었고, DNA fragmentation이형성되지않는것으로보아 apoptosis가유발되지않은것으로보여진다. Benzo[a]pyrene의산화적스트레스로인한 DNA의손상및 catalase활성도, MDA의증가가눈에띄게관찰되었다. 또세포의 DNA 수복, cell cylcle arrest 및 apoptosis에중요한역할을하는단백질인 p53과 p21 28) 은단백질의증가가관찰되었으나 29), apatosis는관찰할수없었다. 따라서 Comet assay로관찰되는 DNA의손상은매우낮은수준이라고생각된다

38 4.3. 환경시료의세포독성및유전독성 하수처리장유입수 Fig.15. Cell viability in extract of sewage treated CHO-K1 cells using trypan blue exclusion assay. CHO-K1세포에하수처리장유입수의유기물추출물을 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, %, % 처리한후세포독성을관찰한결과, 24시간세포 50% 생존저해농도는 % 였다. 가장높은 1% 의농도에서도 48.48% 의생존율을보여하수처리장유입수의세포독성은높지않은것으로관찰되었다

39 10 Tail moment, Olive tail moment Tail moment Olive tal moment PC PC (H 2 O 2 10µM) Extract of sewage(v/v%) Fig.16. DNA damage in extract of sewage treated CHO-K1 cells for 24hr. Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). 하수처리장유입수의유기물추출물 1%, 0.5%, 0.25% 와양성대조군인 H 2O 2 10μM를처리하고 comet assay를수행한결과처리농도에비례하여 DNA 손상을보였고, 양성대조군, 가장높은처리농도인 1% 에서 tail moment와 olive tail moment, 0.5% 처리군에서 tail moment가유의하게나타났다. 하수처리장유입수의추출물은그다지높지않은세포독성을보이고있었지만, 높은처리농도에서는 DNA의손상을유발하는것으로관찰되었다

40 열분해 bio-oil Cell viability(%) R 2 = IC 20 = % Supernatant(%) Fig.17.Cell viability in supernatant of bio-oil and tar of bio-oil treated L5178Y cells for 24hr using trypan blue exclusion assay. Bio-oil를 L5178Y 세포에 2시간처리하여세포독성및유전독성을관찰하였다. Bio-oil은 37 에서휘발되는경향이있어, 세포에 2시간만처리하였다. Bio-oil 상층액과하등액을 L578Y 세포에 2시간처리하여세포독성실험을실시한결과, 상층액의경우 2시간세포 80% 생존농도는약 %, 하등액의경우, 약 % 였다. 상당히높은세포독성을보이고있고, 하등액에비해상층액의세포독성이더높게나타났다

41 표 2. Bio-oil 의주요구성물질 Compound Chemical structure Compound Chemical structure Propionic acid Cyclopentanone Acetol acetate; 2,5-dimethyl-furan - 1-(2-furanyl)- Ethanone Phenol 3-methyl-Phenol; m-cresol 2,4-dimethyl-Phenol ; 2,4-xylenol 1-(acetyloxy)-2-Propa none (1-methylethyl)- Benzene 2-methyl-Phenol; o-cresol 2-methoxyl-Phenol; Guaiacol 4-ethyl-Phenol; p-ethyl-phenol Naphthalene 4-methyl- Benzaldehyde 3-methyl- 1,2-Benzenediol 1,4-Benzenediol ;Hydroquinone 4-methyl-cathchol 2-methyl- 1,4-Benzenediol 4-ethyl-1,3- Benzenediol 1,2-Benzenediol ; Catechol 1-ethyl-4- methoxy- Benzene 9H-fluorene 4-ethyl-2-methoxy- Phenol 2-methyl- Naphthalene 2,6-dimethoxy- Phenol; Syringol 1,4-dimethoxy- Benzene 1,1'-Biphenyl Biphenylene

42 Fig.18. DNA damage in supernatant of bio-oil and tar of bio-oil treated L5178Y cells for 24hr. Tail moment and Olive tail moment were measured by comet assay (n=3, mean ±SEM p < 0.05). Bio-oil의 comet assay는양성대조군로는 MMS(methylmethansulfonate) 150μM 를사용하고, 세포독성실험에구한 80% 생존농도를기준으로실시하였다. 두처리군모두양성대조군에서유의성을확인할수있었고, 상층액의경우 80% 의생존농도인약 % 처리군에서 olive tail moment의유의성이관찰되었다. 하등액에서의 comet assay 결과는, 세포 80% 생존농도인 % 와 %, % 처리군에서모두 DNA 손상이증가하는경향을보였으나, 유의성을보이지않았다. 세포독성과마찬가지로상층액의유전독성이하등액보다높은것으로나타났다. GC-MS 분석결과 bio-oil의주요구성물질로는 propanoic acid, alkylated benzenediol, phenol, and alkylated phenols, furan derivatives, furfural, catechol, levoglucosan등이다. 주로방향족탄화수소계열의물질이많아, 세포내 DNA 손상을유발하는것으로보인다. 38) Oil의낮은 ph( 약 ph2) 의영향으로세포독성은비교적높은것으로관찰되었나, 휘발성이강한성질때문에세포에처리하는시간이비교적짧았고, 세포생존율이높은농도에서 comet assay를수행하여 DNA 손상이크게관찰되지는않았다. 이와같이환경시료를처리하여동물세포주에서 comet assay를실시한결과, 환경시료의유전독성을판단하는데유용한기법이될것으로생각된다

43 5. 결론 동물세포주에서대표적인산화적스트레스의측정지표인항산화효소의측정을수행한결과, 환경유해물질로인한효소의활성의증가또는감소를관찰할수는있었으나, 변화의정도가너무작거나, 경향성이낮았다. 그에비해 comet assay를이용한 DNA 손상의측정은유해물질처리에따른변화가관찰하기쉽고, 비교적민감하게나타나고보이고있다. 실험대상인동물세포주및생태지표생물종에서처리물질대부분이처리농도에비례하는 DNA 손상을보였고, 유의성도상당히높은편이다. 특히세포독성이그리높지않았던유해물질의경우에도유전독성은상당히높은것으로관찰되었다. 또, DNA의손상의기전을관찰하기위해 HepG2에 benzo[a]pyrene을처리하여본결과, comet assay로관찰할수있는 DNA 손상수준이낮은것으로생각된다. 목재열분해산물인 Bio-oil의주요성분은 DNA 손상을유발하는것으로알려진방향족탄화수소로이들물질로인해유전독성이나타나는것으로생각된다. 환경시료인폐수추출물과 bio-oil에서유전독성을관찰한결과를살펴보면다양한환경유해물질들이혼재되어있는환경시료에 comet assay의적용이용이할것으로보인다. Comet assay는기존의만성독성실험이나돌연변이유발실험등에비해실험기법이간단하고, 빠른시간내에결과를얻을수있어환경유해물질의 DNA 손상을확인하는데, 유용한기법으로사용될수있다. 또한낮은수준의 DNA 손상도확인할수있고, 정확성이높아, 생체의사멸혹은이상반응을나타내기전에독성을확인하여환경유해물질로인한생체내영향메커니즘에접근할수있을것으로보인다

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49 Genotoxicity monitoring of environmental pollutants using single cell gel electrophoresis (SCGE, comet) assay by Park, Sun Young Department of Environmental Engineering Graduate School, The University of Seoul Supervised by Professor Choi, Jin Hee Abstract Effects of various environmental pollutants were evaluated on DNA damage, lipid peroxidation, transcription factor induction and antioxidant enzyme activity in human cell lines and biomonitoring species, Daphnia and Chironomus. Focuses were given on screening of cytotoxic and genotoxic properties of environmental pollutants through cell viability test and Comet assay, respectively. DNA damage was more sensitive endpoint than antioxidant enzyme activities. Benzo[a]pyrene induced DNA damage, and P53 induction was concomitantly observed however, these phenomenon were not related to apoptosis. Sewage treatment plant influent water seems to possess genotoxic property, whereas pyrolysis product possess cytotoxic property. Taken into account of overall results, cytotoxic and genotoxic tests seem to be useful tools in rapid screening of hazardous properties

50 of environmental samples. Keywords- cytotoxicity; genotoxicity; Comet assay; environmental monitoring 감사의글 드디어졸업을하긴하나봅니다. 제대로공부해보고싶어서시작했던대학원생활이었는데, 과연얼마나제대로했는지되돌아보게되네요. 지난 2년간참힘들다고많이투덜거린것같은데, 지금보니별로힘들지는않았던것같네요. ^^;; 실수많고어리버리한절믿고지도해주신우리최진희교수님감사합니다. 교수님사랑해요 ~! 저의부족함에도논문을쓰는데많은지도해주신안승구교수님, 김주식교수님감사합니다. 학부때부터지금까지가르침을아낌없이주셨던환경공학부교수님들.. 진심으로감사드립니다. 언제나그자리에서무뚝뚝하고고집센큰딸의선택을믿고지켜봐주신부모님, 이제사회인의티가완연한더이상뚱땡이라고놀릴수없는내동생, 그새더늙으신것같으신나의영원한서포터즈할머니. 가족이라는이름으로절감싸주셔서정말감사합니다

51 실험이잘안풀리고, 일이꼬이고, 힘들때언제나서로힘이되어주는우리방동기세범오라방, 지연언니. 이두사람이없었으면잘이겨내고이렇게졸업할수없었을텐데.. 정말고마워요 ~~~~~~~~~~~~~~~ 점점이뻐지는멋쟁이선배순미, 애교덩어리미희, 언제나신중한시원이, 이제새롭게실험실생활시작하는성만군. 고맙다.~ 전자정보관지하에서동고동락한지하방식구들.. 다들고마워요 ~ 20년동안눈빛만으로서로를파악해버리는경지에이르게해준은정이 ^^;; 그리고유은이, 미해, 경진이, 인애, 현이, 민실이, 주연이... 친구들... 다들고마워. 내맘알지? 대학원생이돼서도반실의유혹은너무달콤했습니다.^^ 서울시립대학교극예술연구회 ~ Fighting~