색소, 미생물, 분쇄, 추출, 세포벽 명세서 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따라효모를건조하여에탄올과디메틸술폭시드용매로추출한아스타잔틴의함량을실험실규모 (A) 와플랜트규모 (B) 의처리횟수별로나타낸그래프, 도 2 는본발명에따라건조규모별로건조한파피아로도지마의건조입자를나타낸

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1 (51) Int. Cl. C12N 1/00 ( ) C12N 1/16 ( ) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2006 년 10 월 16 일 년 10 월 10 일 (21) 출원번호 (65) 공개번호 (22) 출원일자 2004년12월07일 (43) 공개일자 2006년06월12일 (73) 특허권자충남대학교산학협력단대전광역시유성구궁동 220 번지충남대학교 (72) 발명자안길환대전유성구지족동열매마을 5 단지 (74) 대리인권오식박창희 (56) 선행기술조사문헌 JP A JP A * WO A1 * 심사관에의하여인용된문헌 JP A KR A 심사관 : 양인수 (54) 미생물분쇄방법및이로부터색소의추출방법 요약 본발명은색소를함유한미생물의분쇄방법과색소추출방법에관한것으로, 색소를함유한미생물을배양하는단계와 ; 상기배양된미생물을건조기에넣고건조하는단계 ; 및상기건조된미생물을밀 (mill) 에분쇄하는단계를포함하여이루어지는미생물분쇄방법과상기방법에의해분쇄된미생물을용매로추출하는단계 ; 및상기추출물을건조하는단계를포함하여이루어지는색소의추출방법을제공하여식품및식품첨가제또는사료또는사료첨가제의기능성소재로사용한다. 본발명은천연색소를함유한미생물의세포벽을간단하고효과적으로파괴하여, 천연색소를효율적으로추출할수있게되었으며, 상기방법을이용하여사료및사료첨가제로또는식품및식품첨가제의저장성및인체에유익한기능성소재로사용할수있으며저렴하고용이하게적용할수있어동종업계진출시파급효과가클것으로예상된다. 대표도 도 4 색인어 - 1 -

2 색소, 미생물, 분쇄, 추출, 세포벽 명세서 도면의간단한설명 도 1 은본발명에따라효모를건조하여에탄올과디메틸술폭시드용매로추출한아스타잔틴의함량을실험실규모 (A) 와플랜트규모 (B) 의처리횟수별로나타낸그래프, 도 2 는본발명에따라건조규모별로건조한파피아로도지마의건조입자를나타낸 SEM 사진, 도 3 은대조군 (a), 분무건조기군 (b), 드럼건조기군 (c), 분무건조후분쇄 (d) 의건조방식에따라효모의세포벽파괴효과를나타낸 SEM 사진, 도 4 는본발명의건조된효모를사료에첨가하여닭에급여하고도살후, 닭다리부분에서아스타잔틴의축적정도를나타낸사진. 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 본발명은색소를함유한미생물의분쇄방법과색소추출방법에관한것으로, 보다상세하게는간편하게분무건조기나드럼건조기를사용하여건조한다음, 밀 (mill) 로분쇄하여미생물의세포벽을효율적으로파괴함으로써, 기능성색소의추출효과를증가시키는방법에관한것이다. 일반적으로해조류 (algae) 나미생물 (microorganism), 갑각류등에있는카르테노이드색소 (cartenoid) 는통상적으로항산화효과를가지고있는색소로알려져있다. 이중, 아스타산틴 (Astaxanthin) 은새우나가재의갑각류, 해마토코커스 (Haematococcus sp.) 에속하는해조류, 파피아 (Phaffia sp.) 에속하는미생물, 조류의부리, 난황등에주홍색을띄는색소로색상의증진, 풍미효과, 면역기능, 비타민 A 의전구체, 항산화효과, 노화및항암효과등이있는것으로알려져있다. 그러나, 갑각류나해조류, 미생물등에서의아스타산틴색소추출은색소함량이적고추출과정이복잡하기때문에상업화되지못하고있는실정이다. 이는아스타산틴의색소가세포내에주로침착되어, 아스타산틴을효과적으로추출하기위해서는세포벽을효율적으로파괴해야하기때문이다. 일례로아스타산틴을함유한파피아로도지마 (Phaffia rhodozyma, 이명잔고토필로마이세스덴드러스 ; Xanthophyllomyces dendrorhous) 를사료에첨가하여제조하고이를동물에급여시,astaxanthin 을효율적으로생체내에서활용하지못해여러동물의껍질, 알에신선하게저장되지못해사료첨가제로서의역할을충분히하지못하고있다 (Johnson, E. A. 등, 1977). 이의문제를해결하기위해, 종래에는세포벽을파괴하는여러가지방법들이개발되어왔는데, 화학적처리방법으로서는산가수분해를통해효모의세포벽을부순후중화하여아스타산틴을추출하는방법이알려져있으며 [Bacteriol. Rev., (1975); 미국특허제 5,210,186 호 ; 유럽특허 EP 호 ], 물리적인방법으로는프레치프레서 (French pressure), 호모저나이저 (Braun homogeniger), 균질기 (Microfluidiger) 와같은기계를이용하여세포벽을깨뜨린후용매로추출하는방법이있고 [Enzyme Microb. Technol., (1986); J. Appl. Bacteriology (1991) ], 생물학적처리방법으로는세포벽을분해하는효소인셀룰라아제, 헤미세룰라아제, 펙틴나아제등을사용하여처리하는방법이공지되어있다 [Appl. and Environ. Microbiol. 35(6) (1978)]

3 하지만, 상기방법들중화학적처리방법은세포벽파괴와함께추출하고자하는색소도파괴함으로효율이낮고, 기계적인방법으로는색소추출율에비하여장치비, 노동력등의처리비용이많이소요되고, 생물학적인방법으로는장치비용은물론시약및운영비등의처리비용이높아지는등대량화를위한상업화에적용하기어려운문제점이있어왔다. 그러나, 최근우리나라에서는효모균주인파피아로도지마로부터아스타잔틴의에탄올추출물이식품첨가물중천연색소로허가를받게됨에따라, 사료에첨가하거나식품첨가물에적용시에균체자체의아스타산틴의함량을높이는것못지않게, 이의추출방법에관련되는세포벽을효과적으로파쇄하는방법에대한연구가활발히진행되고있다. 발명이이루고자하는기술적과제 이에, 본발명자는색소함유미생물로부터간편하면서처리비용은저렴한세포벽파괴방법및이로부터색소의추출방법을개발하고자하였으며, 건조방식과롤링드럼밀 (roller drum mill) 을사용하여본발명은완성하였다. 따라서, 본발명의목적은색소를함유한미생물을배양하고, 상기배양된미생물을건조기에넣고건조하여세포벽을파괴한후, 상기건조된미생물을밀 (mill) 에분쇄하는단계를포함하여이루어지는미생물분쇄방법을제공하는것이다. 또한, 본발명은상기분쇄방법으로부터분쇄된미생물과이를용매로추출한추출물을함유한사료및사료첨가제또는식품및식품첨가제의제공을목적으로한다. 발명의구성및작용 상기와같은목적을달성하기위하여, 본발명은색소를함유한미생물을배양하는단계와 ; 상기배양된미생물을건조기에넣고건조하는단계 ; 및상기건조된미생물을밀 (mill) 에분쇄하는단계를포함하여이루어지는미생물분쇄방법을제공한다. 또한, 본발명의다른목적을달성하기위하여, 본발명은상기방법에의해분쇄된미생물을용매로추출하는단계 ; 및상기추출물을건조하는단계를포함하여이루어지는미생물색소의추출방법을제공한다. 또한, 본발명의또다른목적을달성하기위하여, 본발명은상기분쇄방법에의해분쇄된미생물을제공한다. 또한, 본발명의또다른목적을달성하기위하여, 본발명은상기미생물을함유한사료및사료첨가제를제공한다. 나아가, 본발명은상기추출방법에의해추출된색소추출물을제공한다. 더나아가, 본발명은상기색소추출물을함유한식품및식품첨가제를제공한다. 이하, 본발명을상세히설명하기로한다. 이때, 사용되는기술용어및과학용어에있어서다른정의가없다면, 이발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가통상적으로이해하고있는의미를가진다. 또한, 종래와동일한기술적구성및작용에대한반복되는설명은생략하기로한다. 본발명은아스타산틴을포함하는카로테노이드색소를추출하기위해, 상기색소를생산하는미생물을대량배양하고, 상기배양된미생물을건조기에넣고건조하여세포벽을파괴하며, 상기세포벽이파괴된건조미생물을롤러드럼밀 (roller drum mill) 에분쇄하여, 용매를사용하여색소를효율적으로추출할수있는미생물가루를제조한다. 이때, 본발명에서상기미생물은파피아로도지마 (Phaffia rhodozyma) 및이의돌연변이주로이루어진군에서선택된적어도 1 종이상의파피아 (Phaffia sp.) 속균주를사용하는것이바람직한데, 이는배양시성장이빠르며, 오염이잘되지않는균주이기때문이다. 그리고, 본발명에서세포벽을파괴하기위해사용되는건조기는분무건조기 (spray dryer) 또는드럼건조기 (drum dryer) 를사용하는것이바람직하다

4 그리고, 상기분무건조기와드럼건조기는본발명의분야에서통상적으로사용되고있는분무건조기와드럼건조기라면어느것을사용해도무방하다. 또한, 본발명에서사용되는롤러드럼밀은볼밀, 로드밀및롤러밀로이루어진군에서선택된 1 종의밀을사용하는것이바람직하다. 이때, 상기밀은종류에따라다음과같은특징을가지나, 본발명에서는상기특징으로이용하여세포벽을효과적으로파괴할수있기때문에, 본발명에서사용해도무방하다. (1) 볼밀 (ball mill) 가장대표적인것으로, 광석류. 시멘트원료. 시멘트클링커등의대량미분쇄를비롯하여요업원료나화학공업원요등의미분쇄 극미분쇄에널리이용된다. 볼밀은수평축의주위를회전하는원통형용기에그용적의약 1/3 을채운양의철구을넣은것이다. 용기 (shell) 를회전시키면그에따라서볼이어느정도올라갔다가낙하한다. 이와같은볼의운동에의해서셸에공급되는원료입자가분쇄작용을받아차례로미세하게된다. (2) 로드밀 (rod mill) 볼대신에원통형셸의길이보다도작고짧은특수강또는탄소강의봉 (rod) 을분쇄매체로사용하는분쇄기이다. 로드의지름은 75 mm전후가일반적이다. 로드밀은볼밀에비하여거친분쇄작업에적당하다. (3) 롤러밀 (roller mill) 몇개의롤러가중력 원심력 탄성력등에의해서회전하는테이블또는사발모양의분쇄용기에눌러서붙이는구조이며, 그사이에넣어서원료입자를압축분쇄한다. 분쇄된미세한입자는기류에의해서배출되는데, 주로시멘트공장에서원료를분쇄할때나발전소에서석탄을분쇄할때이용된다. 그리고, 본발명에서는상기세포벽을파괴한건조된미생물에용매를첨가하여색소를추출하고, 상기추출된색소를건조하여색소추출물을제조한다. 이때, 색소추출물에사용할수있는용매는에탄올, 메탄올, 아세톤, 디메틸술폭시드및이들의혼합용매에서선택된적어도 1 종이상의유기용매를사용하는것이바람직하고, 더욱바람직하게는식품의약안정청의기준으로식품및식품첨가물에사용할수있도록에탄올을사용한다. 또한, 본발명에따른색소추출물이나건조된미생물을식품및식품첨가제또는사료및사료첨가제로사용한다. 이때, 본발명의색소추출물은필요에따라첨가량을한정하지않고조절하여식품및식품첨가제에서식용유류제품, 드레싱류제품, 마요네즈류제품, 크림류제품, 쵸코렛과감자칩과같은제과류제품, 음료제품, 캡슐제품, 타블렛제품, 분말제품, 빵과쿠키와같은제빵제품등에사용한다. 또한, 본발명의색소추출물은고체, 분말, 입자, 캡슐, 알약, 정제형태또는분산, 유화등의액체형태등의건강보조식품에첨가하여사용한다. 또한, 저장성식품 ( 소시지또는통조림제품 ) 에사용하여저장안정성, 기호성, 유화안정성향상을위해사용하는데, 동식물가공식품의안정성, 기호성및유화안정성향상을시키는목적으로특별한사용농도를두지않고범용적으로사용한다. 뿐만아니라, 본발명의색소추출물과건조된미생물은유기영양소, 무기영양소등의재료와혼합하여색소자체가가진기대되는효과와육류나육가공품의저장안정성을목적으로하여양계용 양돈용 낙농용 비육우용동물사료및사료첨가제의소재로, 특별한사용농도를두지않고범용적으로사용한다. 이하, 본발명의이해를돕기위하여실시예와실험예를제시하여더욱상세히설명한다. 그러나, 이들실시예는오로지본발명을구체적으로설명하기위한것으로, 본발명의범위가이들실시예에한정되는것은아니다

5 [ 실험예 ] 1. 카르테노이드 (cartenoid) 총함량측정 배양한미생물 1 ml를취하여원심분리하고, 상층액은분리하고펠렛 (pellet) 에물을첨가하여 1 회수세 (wash) 한후수분을최대한제거한다음, 1 ml의디메틸술폭시드 (dimethyl sulfoxide; DMSO, 55 ) 또는에탄올을가하고균질기로균일하게혼합 (vortexing) 한후, 아세톤 (acetone), 석유에테르 (petroleum ether), 20%(w/v) NaCl 용액을차례로 1 ml씩첨가하고혼합하여석유에테르층에카르테노이드 (Carotenoid) 가축적되도록하였다. 그런다음, 석유에테르 (Petroleum ether) 층을분리하고, 분광광도계 (spectrophotometer) 를이용하여 474 nm 에서흡광도 (absorbance) 를측정하여카로테노이드의총함량을정량분석하였다. 2. 카르테노이드성분분석 카로테노이드색소를포함하고있는시료를박막층크로마토그래피 (thin layer chromatography) 를수행하여분리한다음, 분리된각카르테노이드에대한고유의파장에서흡광도를측정하여정량분석하였다. 이때, 박막층크로마토그래피는실리카겔 TLC 판 (Silica gel 60, 5 20cm, 0.25 mm thickness; E. Merck, Darmstadt, Germany) 에서색소층분리를하였고, 색소층들의띠는긁어내고 1 ml의아세톤에희석시켜시료로사용하였다. 그리고, TLC 를사용할때의이동상용매는아세톤 : 석유에테르를 20:80(v/v) 으로혼합하여사용하였으며, 각각의카로테노이드함량 (%) 은 각카로테노이드양 총카로테노이드양 (mg/g yeast) 로계산하였으며, 카로테노이드 % 는모든카로테노이드들의흡광도의합과아스타잔틴 (Astaxanthin) 의카로테노이드흡광도의비에기초하여계산하였다. 3. 아스타잔틴 (Astaxanthin) 함량측정 건조한미생물 (cell) 에에틸알콜을첨가한다음, 상기실험방법 1 과동일한방법으로아스타잔틴을추출하고, 에탄올에추출된아스타잔틴시료는분광광도계를이용하여 476nm 에서흡광도를측정하여정량분석하였다. 4. 건조된아스타잔틴의잔존에탄올함량측정 에탄올에추출하여건조한아스타잔틴에남아있는잔존에탄올함량은먼저, 0.1M 의인산칼륨완충용액 (potassium phosphate buffer; ph 9.0) 를제조하고, NAD 용액 (nicotinamide adenine dinucleotide, sigma-aldrich 사, 미국 ) 과알코올탈수소효소 (Alcohol dehydrogenase; ADH, sigma-aldrich 사, 미국 ) 용액을준비한다음, NAD 용액 100 μl와 ADH 20 μl와인산칼륨완충용액을혼합하여총부피가 10 ml이되게하였다. 이용액을 cuvette 에 1ml 첨가하고카이네틱 (kinetic) 을이용하여 ΔAbs( 흡광도변수 ) 를측정하고, 표준곡선 (Standard curve) 을이용하여정량분석을하였다. 5. 균주의세포량 (Cell mass) 측정 효모균주의세포량은 80 의진공오븐에효모가포함된 10 ml의용액을건조하여중량을측정였다. 6. 색소의착색도측정 실험이완료된닭은반복별로 3 수씩총 45 수를방혈 ( 防血 ), 탈모 ( 脫毛 ) 하고제 1 경추골상단과두개골하단간을절단하여머리를제거하였으며, 경골하단과중족골관절부위를절단하여다리를제거한후식도, 기관, 폐, 간및내장을적출한후 ( 이상의방법은축산기술연구소가금과관행 ; 이하가금과관행이라함 ), 냉동체상태에서 2 시간운반후피부가계육에부착된상태에서피부의착색도와계육의착색도는피부의착색도를측정한후피부를제거한상태에서계육의착색도를측정하였다. 이때, 착색도는색도기 (chroma meter; Minolta Co. Cr 301) 로명도 (L; lightness), 적색도 (a; redness), 황색도 (b; yellowness) 를국제조명위원회의 CIE (Commision Internationale de Leclairage) 값으로측정하였고, 표준판은 Y=92.40, x=0.3136, y= 의백색타일을사용하였다

6 7. 혈액의카로테노이드색소농도 실험이완료된닭의익하정맥에서 4 ml씩채혈한혈액을 EDTA(disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid) 가첨가된채혈병에넣고, 냉동실에보관한후 HPLC(high pressure liquid chromatography) 를사용하여카로테노이드 (carotenoids) 의함량을분석하였다. 이때, 칼럼 (Column) 은메타켐 (MetaChem; Nucleosil 100A, 5micron), 검출기 (Detector) 는 M730D(UV/VIS Detector, 영린기기 ) 를사용하였으며, 이동상 (Mobile Phase) 은 tbme:hexane:ipa:meoh=30:65:2.5:2.5 의조건으로하였고, 흐름속도 (flow Rate) 는 1.5 ml /min, 파장 (Wavelength) 은 476 nm였으며, 시료주입량 (injection) 은 20 μl로하였다. 8. 시료피부에서산화방지력을측정하기위한 TBA 가측정 시료약 2.5g 을채취한후여기에 4 의 TCA (Trichloroacetic acid) 6 ml을첨가하고, 균일하게혼합 (Vortex mixing) 한후, 증류수 (D.W) 로용액의총부피가 12.5 ml가되도록적정하였다. 그리고, 상기용액을거름종이 (Filter paper; Whatman No.1) 로여과한후, 수집된여과액 3 ml에 TBA (Thiobarbituric acid) 3 ml를첨가하고, 뚜껑으로밀폐하고균일하게혼합한후암소에서상온으로 15 시간정치하였다. 그리고, 상기시료를 530nm 에서흡광도를측정하여 TBA 가를산출하였다. [ 실시예 1] 균주및배양실험 본실시예에서는아스타산틴색소를생산하기위해야생형 (wildtype) 인파피아로도지마 ( 이명 : 잔토필로마이세스덴드로스, Xanthophyllomyces dendrorhous) 를돌연변이 (mutant) 화하여아티마이신 (antimycin) 유도에의해카르테노이드 (cartenoid) 를초과생산할수있는파피아로도지마 (Phaffia rhodozyma strain) 2A2N 의효모균주를사용하였다. 그리고, 상기효모균주를 30 ml YM 배지가포함된 300 ml플라스크 (baffled flask) 에서종배양 (seed culture) 하고, 상기종배양물을 2l 발효기 (fermentor) 에서배양한다음, 이를대량배양기에공급하고 20 에서 3 5 일동안배양하였다. 이때, 임펠러 (Impeller) 속도는용해산소가꾸준히공급되어공기순환이될수있도록 rpm 으로조절하였다. [ 실시예 2] 배양된미생물의건조및분쇄 본실시예는본발명의분쇄방법의효과를알아보고자, 배양한미생물을건조하고분쇄한다음, 본발명에따른분쇄방법에의한미생물의세포벽분쇄효과를카르테노이드의총함량, 카르테노이드의성분분석, 전자현미경관찰및아스타산틴함량을측정하여분석하고자하였다. 먼저, 상기실시예 1 에서배양된파피아로도지마 ( 잔토필로마이세스덴드로스 ; 이하, 효모로칭함 ) 를분무건조기와드럼건조기를사용하여건조하였다. 이때, 상기분무건조기의건조조건은실험실규모 (pilot scale) 일경우이옐라사 (Eyela Co. Japan) 의분무건조기를분사하여인입구 (inlet) 온도는 180, 출구 (outlet) 온도는 80 로 1 리터를건조하였고, 플랜트규모 (plant scale) 일경우에는삼영화학의분무건조기를인입구온도 190, 출구온도는 90 로하여시간당 200 리터를분사하여총 30 톤을건조하였다. 그리고, 드럼건조인경우에는단해사의드럼건조기를사용하여 150 에서분당 210rpm 의회전속도로하여, 이를처리횟수로기준하면서건조하였다. 그후, 밀 ( 로울러밀, 광농기계공사 ) 로건조된효모를분쇄하여분말의평균입경이 3 mm이하가되게준비하였다. 이때, 밀은 flat roller( 평판롤러 ) 로서 210rpm, 5HP 의조건하에서 1 회에서 10 회까지단계별로반복하여파쇄하였다. [ 실시예 3] 건조변수에따른미생물의분쇄효과 - 6 -

7 (1) 분무건조기사용에따른색소추출효과 본실시예는분무건조기를사용하면서건조규모와횟수에따른카르테노이드색소의추출효과를알아보고자, 상기실시예 2 의동일한방법으로수행하였다. 그리고, 건조된효모를평면롤러밀 (flat roller mill) 을사용하여분쇄하고, 상기분쇄된미생물에추출용매인에탄올 (EtOH) 과디메틸술폭시드 (DMSO) 을사용하였다. 이의결과, 도 1 에도시된바와같이, 실험실규모에서추출된색소의함량은처리횟수가 1 3 회까지증가한후그이후에큰변화가없는반면플랜트규모는 10 회까지꾸준히증가함을알수있었다. (2) 드럼건조기사용에따른색소추출효과 본실시예에서는건조기에따른색소추출효과를알아보고자, 분무건조기와드럼건조기를이용한카로티노이드의총함량과아스타잔틴의추출효과를비교 / 분석하였다. 이때, 배양과분쇄및추출은상기실시예 1, 2 와동일하게수행하였으며, 추출용매는에탄올을사용하였다. 이의결과, 하기표 1 에나타난바와같이, 드럼건조기로분쇄한효모는분무건조기를사용한것보다초기색소추출이높으나총색소함량이낮음을알수있었다. 분무건조 드럼건조 [ 표 1] 구분 카로테노이드함량 [ mg /g( 효모 )] 아스타산틴 [ mg /g( 효모 )] 처리전 처리후 처리전 처리후 이와같은차이는건조시, 열판에의한세포벽의손상이드럼건조기가더크기때문인것으로판단된다. (3) 건조입자크기 상기실시예 3-1 과 3-2 에서분쇄된효모의건조입자의크기를알아보고자, SEM(Scanning electron microscope) 을사용하여육안으로형상및크기를측정하였다. 이의결과, 도 2 에도시된바와같이건조입자크기가실험실규모는 μm, 플랜트규모는 μm로나타남으로써, 건조규모에따라크기가 2 3 배차이가있음을확인할수있었다. (4) 건조방식에따른세포벽의파괴효과 건조방식에따라효모의세포벽파괴효과를 SEM 을통해육안으로확인하고자하였다. 도 3 에도시된바와같이 (a) 는대조군 ( 스케일바 5 μm ), (b) 는분무건조기군 ( 스케일바 10 μm ), (c) 는드럼건조기군 ( 스케일바 20 μm ), (d) 는분무건조후분쇄 ( 스케일바 5 μm ) 를나타내었으며, 이의결과분무건조후밀 (mill) 에의한분쇄는세포벽을파괴하는데효과가우수함을알수있었다. [ 실시예 4] 세포벽파쇄효모의동물에의실체이용실험 - 7 -

8 본실시예는본발명의방법에따라세포벽을분열시킨효모를실험동물에급여하여미생물이가지고있는아스타잔틴의생체활용효과를확인하고자기간및첨가별수준에따른산란계의착색도를측정하여생체내흡수되는정도를비교 / 분석하였다. 실험방법은다음과같이수행하였다. 180 마리이사브라운암탉 (ISA 갈색암탉 ) 을실험대상으로선정하고, 6 주간사육을하였으며, 사육조건은공시축에닙플이장착된 2 수용 3 단철제케이지에 2 수씩수용하였고, 사료와음수는자유채식하도록하였으며, 점등은새벽 4 시부터오후 9 시까지 17 시간고정점등하였다. 그리고, 사료는 60 개의닭장 ( 닭장당 1 마리 ) 에임의적으로동일한양을실험대상닭에게급여되도록하였으며, 하기표 2 에보는바와같이, 78 주령이사브라운갈색산란계 225 수를공시하여대조군 (control) 닭의사료는아스타잔틴이전혀포함되지않게조제하고 ( 무첨가군 C), 실험군은아스타잔틴을 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.3% 를추가하여제조하고, 이를급여한 5 개의군으로나누어수행하였다. [ 표 2] 구분 추가량 (%) 무첨가군 반복수 반복당마리수 총마리수 그리고사료는하기표 3 에보는바와같이, 황색옥수수와대두박위주의배합사료를사용하였는데, 조단백질과에너지함량이각각 16% 와 2,800 kcal / kg이었다. [ 표 3] 성분 함량비율 (%) 옥수수 대두분 옥수수글루텐가루 3.60 대두유 - 석회석 (limeston) DL-메티오닌 L-리신 비타민-미네랄복합체 0.50 식염 0.25 총합 100 화학적조성 물질대사에너지 (ME), kcal / kg 2,800 조단백질 (CP) 칼슘 (Ca) % 3.40 유용한인산 (P) % 메티오닌 % 0.76 리신 % 0.33 비타민-미네랄복합체사용량 ( 사료 1kg기준 ) 비타민A 1,600,000 IU, 비타민 D 3 300,000IU, 비타민 E 800IU, 비타민K3 132mg, 비타민 B2 1,000 mg, 비타민 B12 1,200 mg, 니아신 2,000 mg, 판토네이트칼슘 800 mg, - 8 -

9 엽산 60 mg, 염화콜린 35,000 mg, DL- 메티오닌 6,000 mg, 철 4,000 mg, 구리 500 mg, 마그네슘 12,000 mg, 아연 9,000 mg, 코발트 100 mg, BHT 6,000 mg, 요오드 250 mg [ 실시예 5] 본발명에따른사료첨가제효과 본실시예는본발명에따라건조된효모를첨가한사료를닭에게급여한다음, 닭의혈액과피부에함유된아스타잔틴의양을측정하여아스타잔틴활용효과를알아보고자하였다. 이때, 상기건조된효모는상기실시예 3 과동일한방법으로드럼건조기를사용하여건조한것을사료 1 kg당 100g 을첨가하여닭에게 6 주동안일정량을동일하게급여하였으며, 대조군은분쇄하지않는효모를그대로첨가한사료를사용하였다. 그런다음, 사료공급후에닭의혈액과피부및계란에함유되거나침착된아스타잔틴양을측정하였다. 이때, 통계분석은본시험에서얻어진피부착색도와계육착색도은 SPSS 11.0 프로그램 (program) 을사용하여분산분석을실시하였으며, 처리간의유의차검정은세프테방법 (Sefte's method) 를이용하였으며신뢰수준은모두 95% 수준에서분석을실시하였다. 이의결과, 닭의혈액은세포벽이손상시키지않은효모 ( 이하대조군 ) 를사료에첨가하여급여한경우아스타잔틴양이 2 주령은 530ng/ ml, 4 주령은 830ng/ ml, 6 주령은 1310ng/ ml이었으며, 드럼건조기로건조한효모 ( 이하실험군 ) 에서는 2 주령은 744ng/ ml, 4 주령은 1030ng/ ml, 6 주령은 2264ng/ ml으로측정되었다. 그리고, 닭피부의착색도는대조군과실험군이각각 2 주령 554 과 1073ng/g, 4 주령 684 과 1696ng/g, 6 주령 784 과 1863ng/g 으로나타났으며, 도 4 에서보는바와같이육안으로도색소의착색도가뚜렷이구분됨을알수있었다. 따라서, 본발명에따른미생물의분쇄방법은미생물에축적된색소의추출효과와이를섭취하여이용할수있는생체활용도를증가시켜아스타잔틴을피부뿐만아니라체내의지질부분에도축적시키는것을확인할수있었다. 상술한바와같이, 본발명의방법에따라분쇄된효모는세포벽의파괴정도가우수하고, 이에따른색소추출효율이증가되기때문에, 생체활용도가높아서사료및사료첨가제또는식품및식품첨가물로사용할시, 유효성분을효율적으로이용할수있어기능성소재로활용될수있을것으로판단된다. 급여한동물들의 astaxanthin 축적은명백하였다. astaxanthin 은피부뿐만아니라체내의지질부분에도축적되었다. 발명의효과 이상과같이, 본발명은천연색소를함유한미생물의세포벽을간단하고효과적으로파괴하여, 천연색소를효율적으로추출할수있게되었으며, 상기방법을이용하여사료및사료첨가제로또는식품및식품첨가제의저장성및인체에유익한기능성소재로사용할수있으며저렴하고용이하게적용할수있어동종업계진출시파급효과가클것으로예상된다. (57) 청구의범위 청구항 1. 청구항 2. 청구항

10 청구항 4. 청구항 5. (1) 아스타잔틴을함유하는파피아로도지마 (Phaffia rhodozyma) 및이의돌연변이주로이루어진군에서선택되는 1 종이상의파피아속균주를배양하는단계 ; (2) 상기배양된균주를드럼건조기에서건조하는단계 ; (3) 상기건조된균주를롤러밀에서분쇄하는단계 ; (4) 상기분쇄된균주를에탄올로추출하는단계 ; 및 (5) 상기추출물을건조하는단계 : 를포함하는, 아스타잔틴의추출방법. 청구항 6. 청구항 7. 청구항 8. 청구항 9. 청구항 10. 도면

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