大 韓 不 姙 學 會 誌 : 第 27 卷 第 4 號 2000

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1 대한의진균학회 제 9 차심포지움초록 일시 : 2009 년 11 월 21 일 ( 토 ) 오후 2 시 ~6 시 장소 : 서울건국대병원대강당 주제 : 표재성진균증의동정 성격 : 교육강연 주최 : 대한의진균학회대한피부과학회피부진균연구회 - 0 -

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4 대한의진균학회제 9 차심포지움진행계획표 0 시간내용 02 : : 10 개회식 02 : : 00 Dermatophytes 동정최종수 ( 영남의대 ) 03 : : 30 Malassezia 효모균동정이양원 ( 건국의대 ) 03 : : 00 흑색진균동정서무규 ( 동국의대 ) 04 : : 20 Coffee Break 04 : : 20 Identification of Medically Important Molds, Dermatophytes, and Yeasts by Oligonucleotide Arrays Tsung Chain Chang, PhD (National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan) 05 : : 30 폐회식 - 1 -

5 대한의진균학회제 9 차심포지움연제순서 교육강연 (1) 02 : : 00 좌장 : 김기홍 ( 영남의대피부과 ) 제목 : Dermatophytes 동정연자 : 최종수 ( 영남의대피부과 ) 교육강연 (2) 03 : : 30 좌장 : 안규중 ( 건국의대피부과 ) 제목 : Malassezia 효모균동정연자 : 이양원 ( 건국의대피부과 ) 교육강연 (3) 03 : : 00 좌장 : 유희준 ( 한양의대피부과 ) 제목 : 흑색진균동정연자 : 서무규 ( 동국의대피부과 ) 초청강연 04 : : 20 좌장 : 문기찬 ( 울산의대피부과 ) 제목 : Identification of Medically Important Molds, Dermatophytes, and Yeasts by Oligonucleotide Arrays 연자 : Tsung Chain Chang (National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan) - 2 -

6 초청강연 04:20-05:20 좌장 : 문기찬 Identification of Medically Important Molds, Dermatophytes, and Yeasts by Oligonucleotide Arrays Tsung Chain Chang ( 張長泉 ) Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan, Republic of China Infections caused by fungi have increased in recent years. Accurate and rapid identification of fungal pathogens is important for appropriate treatment with antifungal agents. On the basis of the internal transcribed spacer 1 (ITS 1) and ITS 2 sequences of the rrna genes, three oligonucleotide arrays were developed to identify 64 species (32 genera) of molds, 17 species of dermatophytes, and 77 species (32 genera) of yeasts of clinical importance. The method consisted of PCR amplification of the ITS regions using a pair of universal primers, followed by hybridization of the digoxigenin-labeled PCR products to panels of species- or group-specific oligonucleotides immobilized on nylon membrane. The sensitivity and specificity of the arrays were higher than 98 and 97%, respectively. The whole procedure can be finished within 24 h starting from isolated colonies; reproductive structures, which are essential for the conventional identification of filamentous fungi are not needed. The arrays also have great potential for direct detection of pathogenic fungi in clinical specimens. In conclusion, the present arrays are powerful tools for identification of fungi and may have the potential to be continually extended by adding further oligonucleotides to the arrays without significantly increasing the cost or complexity

7 심포지움 Tsung Chain Chang Publication list of Tsung C. Chang Reviewed articles (* corresponding author) 1. Chang HC, Leaw SN, Huang AH, Wu TL, Chang TC.* Rapid identification of yeasts in positive blood cultures by a multiplex PCR method. Journal of Clinical Microbiology 2001; 39: Chen CC, Teng LJ, Tsao SK, Chang TC.* Identification of clinically relevant viridans streptococci by an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43: Hsiao CR, Huang L, Bouchara J-P, Barton RH, Li C, Chang TC.* Identification of medically important molds by an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43: Leaw SN, Chang HC, Sun HF, Barton R, Bouchara JP, Chang TC.* Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions. Journal of Clinical Microbiology 2006; 44: Leaw SN, Chang HC, Barton R, Bouchara JP, Chang TC.* Identification of medically important Candida and Non-Candida yeast speices by an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology 2007; 45: Li HC, Bouchara JP, Hsu M. M-L, Barton R, Chang TC.* Identification of dermatophytes by an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology 2007; 45: Li HC, Bouchara JP, Hsu M. M-L, Barton R, Su S, Chang TC.* Identification of dermatophytes by sequence analysis of the rrna gene internal transcribed spacer regions. Journal of Medical Microbiology 2008; 57: Ko W-C, Lee N-Y, Su SC, Dijkshoorn L, Vaneechoutte M, Wang L-R, Yan J-J, Chang TC.* Oligonucleotidearray based identification of species in the Acinetobacter calcoaceticus-a. baumannii complex isolated from blood cultures and antimicrobial susceptibility testing of the isolates. Journal of Clinical Microbiology 2008; 46: Su H-P, Tung S-K, Tseng L-R, Tsai W-C, Chung T-C, Chang TC.* Identification of Legionella species by an oligonucleotide array. Journal of Clinical Microbiology 2009; 47: Bouchara J-P, Shieh HY, Croquefer S, Barton R, Marchais V, Pihet M, Chang TC.* Development of an oligonucleotide array for direct detection of fungi in sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology 2009; 47: And 59 other peer-reviewed publications. Patents 1. Huang SW, Wu JJ, Chang TC An enzyme-capture assay (ECA) for the identification of Escherichia coli in clinical samples. US patent 5,612, Chang TC, Chen HC Method for detecting antimicrobial compounds. US patent 5,591,599; Australia patent 686,139; United Kingdom patent 2,289,946; France patent FR94 06, Chang TC, Chen S, Ding HC Rapid identification of Escherichia coli O157:H7. US patent 6,210, Chang TC, Chen S, Ding HC Rapid identification of microorganisms. US patent 6,428,

8 Tsung Chain Chang 심포지움 5. Chang TC, Huang YH, Chang HC E. coli agglutination assay. US patent 6,689,572; European patent (United Kingdom, France, Germany, and Italy). 6. Chen CH, Chang TC, Ding HC Methods for rapid identification of Bacillus cereus. US patent 6,699,679; UK patent 2,374,664; France patent 2,820, M890, 93M917; 中華民國專利第 號, US patent 5,418, 金黃色葡萄球菌快速檢測法 : 南興化工製藥股份有限公司 (1991- 至今 ) ( 農委會計畫編號 89M783, 中華民國專利第 號 ) 2. 用於檢測綠膿桿菌之寡核甘酸探針, 生物晶片擊劍測方法 : 三越公司 (2007-) ( 經濟部科專計畫編號 G97- B210, 中華民國專利第 I 號 ) 3. 系統化環境分子生物技術 (microarray biochip): 台灣中油股份有限公司事業煉製部高雄煉油廠 (2008-), ( 經濟部科專計畫編號 G97-B210, 中華民國專利第 I 號 ) And 33 other patents

9 심포지움 Tsung Chain Chang CURRICULUM VITAE PERSONAL INFORMATION Name: Tsung C. Chang ( 張長泉 ) Address: Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology College of Medicine, National Cheng Kung University 1 University Rd., Tainan 701, Taiwan Place of Birth: Citizenship: Chiayi, Taiwan Taiwan, Republic of China EDUCATION 6/1973 B.S., Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan 6/1977 M.S., Department of Biochemistry, National Taiwan University, Taipei, Taiwan 12/1985 Ph.D. Department of Agriculture Chemistry, National Taiwan University, Taipei, Taiwan PROFESSIONAL EXPERIENCE 8/77 ~ 7/78 Instructor, Department of Medical Technology, Yuanpei University, Hsinchu, Taiwan 9/78 ~ 1/85 Associate Researcher, Department of Food Science, Food Industry Research & Development Institute, Hsinchu, Taiwan 1/85 ~ 1/92 Researcher, Department of Food Science, Food Industry Research & Development Institute, Hsinchu, Taiwan 1/92 ~ 1/96 Senior Researcher, Department of Food Science, Food Industry Research & Development Institute, Hsinchu, Taiwan 8/96 ~ 7/2000 Associate Professor, Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 8/2000 ~ Professor, Department of Medical Science and Biotechnology College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 8/2007 ~ Chairperson, Department of Medical Science and Biotechnology College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 8/2007 ~ Director, Research Center for Medical Technology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan - 6 -

10 교육강연 (1) 02:10-03:00 좌장 : 김기홍 Dermatophytes 동정 영남대학교의과대학피부과학교실 최종수 목적 정확한진단과치료 : 균종에따라임상양상이다르다. 올바른치료제선택감염원, 감염경로, 예방학문적 : 지역분포분류학균종의변화 : 증감, 소멸, 이동 방법 진균배양형태관찰 (colony 육안관찰, 현미경관찰 ) 생리학적검사교배실험 Mating test 분자생물학적인방법 Taxonomy of fungus Class Hyphae Sexual spore Asexual spore Zygomycetes aseptated zygospore sporangium Ascomycetes septated ascospore conidium Basidiomycetes septated basidiospore conidium Deuteromycetes septated not found conidium Dermatophytes의분류 Ascomycota - Pezizomycotina - Eurotiomycetes - Eurotiomycetidae - Onygenales - Arthrodermataceae - 7 -

11 심포지움 최종수 Anamorph ( 무성세대 ) Teleomorph ( 유성세대 ) Trichophyton Arthroderma Microsporum Arthroderma Epidermophyton - 숙주에따른분류 Anthropophilic Zoophilic Geophilic 형태적분류 분자생물학적분류 multifactorial T. rubrum complex T. mentagrophytes complex 우리나라에서확인된백선균 서순봉 (1976~1995) T. rubrum 81.7%, T. mentagrophytes 5.8%, M. canis 5.7% E. floccosum 1.0%, T. verrucosum 0.6%, M. gypseum 0.2% M. ferrugineum 0.04%, T. tonsurans 0.03%, T. violaceum T. tonsurans (1995), A. benhamiae (2004), T. erinacei (2008) 최근 Very common : T. rubrum, T. mentagrophytes (T. interdigitale) Common : M. canis, M. gypseum Rare : T. tonsurans, E. floccosum, T. verrucosum Very rare : T. violaceum, M. ferrugineum, T. schoenleinii Dermatophytes 배양 1. 배지 일반용도 Sabouraud dextrose agar (SDA), Mycosel agar Potato dextrose agar (PDA): conidiation 촉진 Cornmeal with Tween 80: conidiation 촉진, T. rubrum의붉은색 Dermatophyte test medium (DTM): phenol red - 8 -

12 최종수 심포지움 특수용도 Christensen urea agar Trichophyton agar #1 - #7 (Difco) Takashio medium (Diluted Sabouraud medium): 교배용 PDACT (Potato Dextrose Agar-Corn meal-tween 80) 1986년경북의대서순봉교수님이개발 SDA - 균은잘자라나동정에필요한착색이나타나지않음백선균동정에적합하다. T. rubrum -특유의붉은색, KOH/ 증류수흡수분색자를잘형성 T. mentagrophytes의아형구분융모변성억제 C. albicans 후막포자촉진 조성 Potato dextrose agar (Oxoid) Corn mel agar (Difco) Peptone Tween 80 증류수 20 g 20 g 4 g 6 ml 1 L 2. 배지만들때의주의사항 신선한재료를사용한다. 너무오래끓이지않는다. 사면배지 -충분한양을넣고, 사면을넓게확보 (1:2) 김을충분히뺀다 : 지나친물기는 contamination의원인이된다. 항생제와 cycloheximide: 배지가충분히식은후 (60 ) 첨가한다. 3. 배지보관방법 1주이내에사용한다. 3주가지나면폐기한다. 마르지않도록밀봉하여 4 에서보관. 4. 진균배양을위한진균검사물채취방법 Aseptic technique을사용한다. 살아있는균이있는곳을선택한다 : 환상병소의가장자리, 조갑및모발의근위부 - 9 -

13 심포지움 최종수 많은양을채취 5. 접종및배양 Tube를 2개이상사용한다. 또는접종면을 3등분하여사용할수도있다. 배지표면에넓게펴바른다.: 배지속으로깊게묻히거나접촉이안된상태를피한다. Aseptic - Alcohol lamp 위에서모든과정을시행한다. Cycloheximide 넣은것과없는 2가지배지를사용한다. 25 와 37 에서배양한다. 6. False negative ( 배양이안되는경우 ) 접종한균이적을때죽은균, 항진균제치료중접종을잘못한경우배지접촉안됨, 뜨거운칼나쁜배지 : 오래된배지, 조성이잘못, 배지선택잘못마개를꽉막아질식온도가맞지않을때 : 고온, 저온 Contamination: 백선균이자라기전에배지전체를덮는다. 세균에오염 7. Contamination 을줄이는방법 여러병소에서동시에채취하여배양, 여러개의 tube에배양검사실환경을깨끗하게, mite 제거- 나프탈렌오염된배지를사용하지않는다. 배지를만들때물기를충분히말려서보관평판배지보다는 tube를사용한다. Cycloheximide, 항생제등을첨가한배지사용칼소독, 병변을알코올로소독한후가검물을채취 8. Pathogen 과 contaminant 의구분 여러병소에서동시에채취하여배양여러개의 tube에동시에배양시간간격을두고여러번배양반복하여검출이되면 pathogen으로판단한다. 검체를채취한부위를고려한다

14 최종수 심포지움 Dermatophyte 동정 1. Colony 의육안적관찰 성장속도표면과배면의성상색깔 : 표면, 배면 Topography: flat, raised, heaped Texture: smooth, fluffy, granular, suede, velvety Pattern of folding: cerebriform, craterform 2. 현미경적관찰 균집락의채취 : 분생자가충분히형성된곳 ( 중앙부와가장자리의중간 ), Slide culture 투명테이프 (cellophane tape), hook Hyphae Septation Pattern: spiral, raquet, chandelier, nodular body Pigmentation Vesicles or swollen cells Conidium (conidia): asexual reproduction ( spore) Macroconidia: size, number of septum, shape, wall thickness, surface Microconidia: shape, group, 균사에의부착양상 3. 생리적검사 모발천공검사, Urease test, Growth factor requirement 4. 교배시험 Mating test

15 심포지움 최종수 Dermatophytes: 3 genus Microsporum spp. Trichophyton spp. Epidermophyton spp. Macroconidia Microconidia Involved numerous numerous skin, hair spindle-shaped thick walled spiny surface rare Numerous skin, hair pencil or fusiform 균에따라특징적 nail thin walled smooth surface numerous not produced skin, nail boat-shaped thick or thin walled smooth surface T. rubrum 성장속도 : slow 14일 Colony 형태표면 : 솜털모양 (fluffy), white to buff 배면 : 포도주색 >brown, yellow, no-color 현미경소견 Microconidia: numerous to rare tear-shaped, solitary along hyphae " 전기줄에참새가앉은모양 " Macroconidia: rare, pencil-shaped T. mentagrophytes 성장속도 : moderate, 7~10일종류 var mentagrophytes: zoophilic var interdigitale : anthropophilic Colony 형태 : 매우다양 zoophilic - 과립형 (granular) anthropophilic - 융모형 (downy), 분말형 (powdery), 복숭아색형 (persicolor)

16 최종수 심포지움 Powdery form: Radial or concentric fold 배면 : brown > colorless, yellow, red 현미경소견 Microconidia: very round, clustered Coiled spiral hyphae " 포도송이와덩굴 " Macroconidia: 가끔, thin walled T. rubrum vs T. mentagrophytes PDACT 붉은포도주색 KOH 또는증류수를흡수 : T. rubrum 현미경소견 T. mentagrophytes: coild hyphae, clusted microconidia Hair perforation test: T. mentagrophytes: 양성 Urease test: T. mentagrophytes: 양성 Bacterially contaminated T. rubrum T. raubischeckii T. tonsurans 성장속도 : moderately slow, 12일 Colony 형태 Sulfureum 형 : 황색조 Mahogany-red 형 : 처음에는선홍색반점이후회색분말, 탁한붉은색으로변한다. 배면 : Mahogany-red 현미경소견 Micordonidia: diagnostic Variable: tear drop, 곤봉, 성냥알, balloon forms Conidiophore: perpendicular to hyphae May spiral coils Physiologic test: thiamine dependent T. verrucosum 성장속도 : very slow 21~30일, 37도에서더잘자란다 Colony 형태 Small, heaped, button-like> flat

17 심포지움 최종수 Texture: glabrous > downy White -> gray or yellow 배면 : various, 특징없다. 현미경소견염주양의후막포자 (chlamidoconidia in chain) Macroconidia: 쥐꼬리모양 Physiologic test: Thiamin, inositol 필요 M. c a nis 성장속도 : moderate, 6~10일이내 Colony 형태표면 : whitish, fluffy, 방사상주름가장자리 : 균사가방사선상으로퍼져나간다. 배면 : deep yellow -> yellow brown 현미경소견 Macroconidia: 풍부하다. 특징적 Long, spindle shaped, rough, thick walled 손잡이 (knob) 같은끝, 6개이상의세포 Microconidia: a few M. gypsesum 성장속도 : moderateley rapid, 6일이내 Colony 형태표면 : flat, spreading, powdery to granular Buff -> tan to cinnamon brown ( 등황색 ) 배면 : variable 현미경소견 Macroconidia: 매우풍부, 특징적 Symmetric, rough, thin walled, 6개이내의세포끝부분 : rounded <-> pointed M. canis Microconidia: usually E. floccosum 성장속도 : moderately slow, 15일이내 Colony 형태표면 : brownish yellow to olive gray or khaki Lumpy and sparse -> folded, radial groove. velvety

18 최종수 심포지움 수주후 fluffy 배면 : orange to brownish, 가끔 yellow border Pleomorphism이잘생긴다. 현미경소견 Macroconidia: 배양초기에발견된다. Smooth, thin walled, club shaped, round ends 2-6 세포, single or clusters Microconidia: no 요약 1. Colony 색깔 포도주색 : 황금색 : 카키색 : 신나몬 : T. rubrum M. canis E. floccosum M. gypseum 2. 성장속도 빠르다 M. gypseum, M. canis T. mentagrophytes 늦다 E. floccosum, T. tonsurans 매우늦다 T. verrucosum, T. violaceum, M. ferrugineum, T. schoenleinii T. concentricum, T. yaundei, T. Soudanense 주의사항극단적인단순화 실제상황이상한균주 ; 중요한균주, 전문가에문의중요한균주는보관 참고문헌 1. 서순봉, 김기홍, 방용준. 의진균학. 대학서림, 서울, 김정애. 피부사상균의배양, 동정및특수검사. 대한의진균학회제 1차 workshop 초록집, 1998:

19 심포지움 최종수 3. 김기홍. 피부사상균의육안적소견및현미경소견, 대한의진균학회제 3차 workshop. 의진균지 2001; 6: 전재복. 백선균의동정. 대한의진균학회제 6차 workshop. 의진균지 2005; 10: Rebell G, Taplin D. Dermatophytes. Their recognition and identification. University of Miamy Press, Coral Gables, Florida, Larone DH. Medically important fungi. A guide to identification. 3rd ed. Washington: ASM, 1995:

20 최종수 심포지움 연자소개 성명 : 최종수 ( 崔宗壽 ) 생년월일 : 1954 년 1 월 4 일 1979년 2월 연세대학교의과대학의학과졸업 1988년 2월 연세대학교대학원박사 1979년 2월 의사면허증취득 1983년 2월 진단검사의학과전문의취득 1990년 9월 ~ 1991년 3월 미국캘리포니아대학샌프란시스코분교피부과연구원 1997년 8월 ~ 1998년 7월 미국질병관리예방센터 (CDC) 연구원 2008년 9월 ~ 2009년 7월 네덜란드 CBS 연구원 1983년 4월 ~ 현재 영남대학교의과대학피부과학교실교수 관심분야 의진균학분자생물학

21 심포지움 최종수 M E M O

22 교육강연 (2) 03:00-03:30 좌장 : 안규중 Malassezia 효모균의동정 건국대학교의학전문대학원피부과학교실 이양원 Malassezia 효모균은피부의정상균총으로존재하며, 건강한성인의 75~98% 에서발견된다. 본효모균은 1889년소개된이후현재까지전풍 (pityriasis versicolor), 지루피부염 (seborrheic dermatitis), Malassezia 모낭염 (Malassezia follicultitis) 등의원인으로서그중요성이알려져왔으며, 수년전부터아토피피부염 (atopic dermatitis) 의악화인자로서의중요성이부각되고있다. 이외에도최근에는융합성망상유두종증 (confluented and reticulated papillomatosis) 과조갑진균증 (onychomycosis) 과의관련성을제시하는보고가있었으며, 지방산이함유된수액제제를정맥내카테터로투여받는미숙아나면역능력이저하된성인에서 Malassezia 효모균에의한전신감염증이보고됨으로써그병원성이점차대두되고있다 Malassezia 효모균이병원성을띠게되는대표적인소인으로는기후적요인 ( 고온, 높은습도 ) 과생활습관 ( 목욕등 ) 에따른외적인자와만성기저질환의유무, 면역력, 항생제나부신피질호르몬제의오남용등과같은내적인자가있다. 이러한소인들에의해 Malassezia 효모균이과증식하게되고, 기회감염으로피부질환이발생하는것으로보고되고있으나아직그기전은명확하게밝혀지지않았다. Malassezia 효모균이병원성을띠게되면주로가슴, 등, 액와, 목같이피지선이많이분포된체간상부나두피에다양한크기의연한황토색, 황갈색, 적갈색인설반이생기며, 때로는융합하여거대반을만들기도한다. 일광노출부위, 특히안면에서는저색소침착반으로나타나는경우가흔하여백반증과감별이어려울때가많으며드물게소양감을동반한작은모낭성구진, 농포의형태로나타나기도한다. 특히다른피부질환과동반되었을경우 Malassezia 효모균에의한피부질환임을진단하고감별해내기어렵다. 일반적인 Malassezia 감염증은, 전형적인임상증상, 10% KOH/Parker ink 도말검사상짧은균사와둥근아포가혼재되어나타나고, Wood등검사상황갈색내지황금색형광을발하거나, 생검조직의연속절편에서확대된모낭속에둥근분아성효모균과균사를관찰함으로써진단할수있다. Malassezia 효모균의경우피부에상재하는균이므로 Malassezia에의한감염이의심될때에는다른진단법보다직접도말검사및배양이정확하고유용한동정방법이된다. 최근에는 Malassezia 효모균에의한질병의진단검사방법으로다양한분자생물학적기법이도입됨으로써기존의검사방법보다신속하고정확하게동정하고있으며, 새로운분석장비와소프트웨어가개발되고임상적으로적용하고있다. Malassezia 감염증은병원성진균으로서그중요성이점차커지고있으며, 최근다른피부질환과연관되어많은연구가진행되고있다. 이에저자는 Malassezia 감염증의다양한임상양상을이해하고 Malassezia 효모균을신속하고정확하게동정하는방법에대해이야기하고자한다

23 심포지움 이양원 연자소개 성명 : 이양원 ( 李陽遠 ) 생년월일 : 1971 년 1 월 26 일 학 력 1996년 2월 경희대학교생명과학부유전공학과졸업 ( 이학사 ) 2000년 2월 건국대학교의과대학의학과졸업 ( 의학사 ) 2003년 2월 건국대학교대학원의학석사학위취득 ( 피부과학전공 ) 2006년 8월 건국대학교대학원의학박사학위취득 ( 피부과학전공 ) 경 력 2000년 3월 ~ 2001년 2월 건국대학교병원수련의 2001년 3월 ~ 2005년 2월 건국대학교병원피부과전공의 2005년 3월 ~ 2006년 2월 건국대학교병원피부과전임의 2006년 3월 ~ 2007년 2월 건국대학교병원피부과임상조교수 2007년 3월 ~ 현재 건국대학교병원피부과조교수 학회활동 대한모발학회정회원대한아토피피부염학회평의원대한의진균학회간행이사피부진균학회재무이사피부미용외과학회재무간사

24 교육강연 (3) 03:30-04:00 좌장 : 유희준 흑색진균동정 동국대학교의과대학피부과학교실 서무규 서론 흑색진균은 dematiaceous fungi, black fungi 또는 pigmented fungi라고하며세포막에멜라닌색소를가지고있는것이특징이다. 그리고한가지흑색진균이 1개이상의다른흑색진균에의한감염증을일으킬수있다. 최근국내에서도흑색진균에의한피부감염증의보고가증가되고있으므로흑색진균의동정에도많은관심을기울여야할것으로생각된다. 본론 1. 흑색진균의분류학적위치 * Pathogenic fungi A) 효모균 (Yeasts, yeast-like fungi) 점성 (moist) 균집락을형성하며포자는발아하여출아세포 (budding cells) 를가짐 Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula,.. B) 사상균 (Molds, moulds, filamentous fungi) 균사 (hyphae) 라고불리우는분지하는 filaments 가짐 - Aseptate hyphae: Zygomycetes (Mucorales) 넓은리본모양의균사를보이며격벽 (septum) 이없음 Rhizophus, Mucor, Absidia (mucormycosis) - Septate hyphae Moniliaceous fungi (hyaline molds): 균사에격벽이있고색소가없어초자양으로염색 Aspergillus, Fusarium, Acremonium, Penicillium,.. Dematiaceous fungi (dark molds): 균사에격벽이있고멜라닌색소에의해진한갈색으로염색 Cladosporium, Fonsecaea, Exophiala, Phialophora, Curvularia,

25 심포지움 서무규 2. 흑색진균에의한감염증 흑색백선 (Tinea nigra) 피부각질층의표재성진균감염으로주로손바닥에흑갈색반으로나타나며, 원인균은 Exophiala(Phaeoannellomyces) werneckii, Stenella araguata이다. 손발톱진균증 ( 조갑진균증, Onychomycosis) - 일부분흑색진균에의해손발톱이검어지는것을진균흑색조 (fungal melanonychia) 라고하며원인균으로 Alternaria(A.) alternata, Curvularia lunata, Exophiala(E.) dermatitidis, Cladosporium(C.) carrinonii, Chaetonium perpulchrum, Lasiodiplodia threobromae, Hendersonula toruloidea, T. rubrum with a diffuse black pigment가있다. 흑색털결절진균증 ( 사모증, Black piedra) 털줄기 (hair shaft) 을따라검고단단한결절이생기며주로열대지방에서두피모발에생긴다. 원인균은 Piedraia hortae이다. 각막사상균증 (Keratomycosis) - 일부분각막의진균성감염증으로외상에의해각막실질내침투되어발생하며, 원인균은 A. alternata, Curvularia lunata, Phialophora(P.) verrucosa, C. oxysporum, Aueobasidium pullulans, Phoma oculo-hominis 등이있다. 색소분아곰팡이증 ( 색소분아진균증, Chromoblastomycosis) 흑색진균에의한피부및피하조직의만성육아종성진균감염으로조직에큰구형의두터운벽을가지고분할을보이는경화세포 (sclerotic cells) 가특징적이다. 원인균으로 Fonsecaea(F.) pedrosoi, Cladosporium(Cladophialophora) carrionii가가장흔하고그외에 P. verrucosa, F. compacta, Rhinocladiella(R.) aquaspersa 등이있다. 흑색곰팡이증 ( 흑색진균증, Phaeohyphomycosis) 흑색진균에의한심재성진균증으로피하및전신감염을일으키며조직내에갈색균사, 연쇄상의포자를보이나색소분아진균증에서와같은경화세포는나타나지않는다. 흑색진균증의원인균으로는 E. jeanselmei가가장흔하고 E. dermatitidis, P. verrucosa, Drechslera sp., Phoma sp., Curvularia lunata, A. alternata, Exserhium rostratum, E. moniliae 등이있다. 진균종 (Eumycotic mycetoma) - 일부분피부와피하조직의만성육아종성감염으로종괴 (tumefaction), 농루 (draining sinus tracts), 과립 (granules) 또는세립체 (grains) 의 3가지임상적특징을나타낸다. 원인균으로 Madurella(M.) mycetomatis, M. grisea, E. jeanselmei, Leptosphaeria senegalensis, Curvularia lunata 등이있다. 3. 흑색진균의동정 흑색진균을동정하기위해서는다른진균과마찬가지로검체로부터분리배양된균집락이있어야하며 1단계는육안적관찰로균집락의색깔, 형태, 성장발육속도, texture, 배지의뒷면등의육안적형태를기초로하여어떤균일가능성을추정한후에 2단계로현미경관찰로균집락을슬라이드배양 (slide culture) 표본을만들어 Lactophenol-cotton blue로염색하여현미경하에서포자의종류, 포자의색깔, 포자형성방식, 분생자병 (conidiophore) 및균사의형태등의특징적현미경소견을참고

26 서무규 심포지움 로하여동정을한다. 때로는포자의광학현미경관찰에전자현미경관찰이추가되기도한다. 육안적및현미경관찰로균종감별이힘들때는당대사실험 (sugar assimilation test), 온도내성검사 (heat tolerance test) 등의생화학및생리학적검사 (biochemical & physiological test) 가사용되어왔는데최근에는 rdna ITS (internal transcribed spacer) region sequence법등의분자생물학적접근이보완적으로시도되고있다. 또한흑색진균의동정에서는분리배양된균집락뿐만아니라병리조직학적소견이많은도움을줄수있다. 왜냐하면흑색진균은세포막에멜라닌색소를가지고있기때문에무염색조직표본 (unstained tissue section) 에서도갈색의진균요소를확인할수있으며, 특히색소분아곰팡이증을일으키는흑색진균들 (F. pedrosoi, C. carrionii, P. verrucosa, F. compacta, R. aquaspersa 등 ) 은조직에큰구형의두터운벽을가지고분할을보이는경화세포가특징적으로발견되기때문이다. 1) 제 1단계 : 육안적관찰 1 균집락의색깔과형태흑색진균은대부분균집락의색깔이흑색이며, 배지이면 (reverse) 도흑색을보인다. 대부분의흑색진균은균집락의색깔이 dark-olive에서 black으로변하면서솜털 (fluffy) 모양의균집락을보이나 E. dermatitidis는 creamy한 yeast-like colony를보인다. 2 발육속도 (growth rate) 균집락의발육속도는크게대게 5~7일이내 full growth되는신속발육 (fast-growing), 6~13일이내발유하는중등발육 (moderate-growing), 14일이상또는그이상지나야발육하는지연발육 (slowgrowing) 으로나누어지는데대부분흑색진균은중등발육에속하나 Alternaria 균종은신속발육진균이며 F. compacta는지연발육진균이다. 3 발육온도균의발육온도는흑색진균동정에중요한기준이되며, 같은균속 (genus) 내에서도균종에따라달라지며, 같은균종내에서도서로다른경우가있다. 예를들면 Exophiala 균속의균종중 E. jeanselmei 는 38 이상에서살지못하여균집락이자라지않는데비해 E. dermatitidis, E. moniliae 및 E. spinifera 는 38 이상에서도잘자란다. 2) 제 2단계 : 현미경관찰 1 포자의종류흑색진균중 Cladosporium 균종은연쇄상분아포자 (blastospores) 를보인다. 2 포자의색깔흑색진균은모두갈색또는검게보인다. 3 포자형성대부분의흑색진균의포자형성은분생자가생겨서연쇄상으로연결되는 Cladosporium형, 분생자병의끝이나옅을따라포자가형성되는 Rhinocladiella형, phialide라는플라스크형분생자병의끝에포자가형성되는 Phialophora형중하나로보이는데 F. pedrosoi는 3형의혼합을보인다. 4 분생자병의형태 E. jeanselmei는특징적으로끝이점차가늘어져뾰쪽해진원통형또는원추형의분생자병을관찰할수있다

27 심포지움 서무규 Fig. 1. Fonsecaea pedrosoi 의현미경소견 (Lactophenol-cotton blue 염색, 400) Fig. 2. Exophiala jeanselmei 의현미경소견 (Lactophenol-cotton blue 염색, 400) Fig. 3. Phialophora verrucosa 의현미경소견 (Lactophenol-cotton blue 염색, 400)

28 서무규 심포지움 3) 제 3단계 : 생화학및생리학적검사 (biochemical & physiological test) 1 당대사실험 (sugar assimilation test) Exophiala 균속의균종중 E. jeanselmei는당대사실험에서 glucose, D-gluconate, gluconate에양성반응을보이나 lactose, melibiose에는음성반응을보여, melibiose에는양성반응을보이는 E. dermatitidis, E. moniliae 및 E. spinifera와균종감별이가능하다. 2 온도내성검사 (heat tolerance test) Exophiala 균속의균종중 E. jeanselmei는최대발육온도 (maximum growth temperature) 가 37 로 38 이상에서살지못하여균집락이자라지않는데비해, E. dermatitidis는 42, E. moniliae 및 E. spinifera는 40 가각각최대발육온도로 38 이상에서도잘자라므로균종감별이가능하다. 4) 제 4단계 : 분자생물학적분석 (molecular analysis) 배양된균집락을 bead beater나액화질소로흑색진균진균요소의세포벽을파괴하여 DNA를분리하여아래와같은분자생물학적기법으로균종의동정이나균종내다양한아형 (subtype) 을구분할수있다. RAPD (Random amplified polymorphic DNA) 법 mtdna (mitochondria DNA) RFLP (restriction fragment length polymorphism) 법 PCR (polymerase chain reaction)-rflp법 chitin synthase sequence법 DNA ITS region sequence법 β-tubulin (TUB1) & actin (ACT1) regions sequence법 결론 흑색진균에의한감염증은피부의표재성진균감염보다는대부분피하조직이나전신감염을보이는심재성진균감염으로나타나므로임상적으로농양이나사마귀양판의피부병변을보이고조직학적으로만성육아종성염증소견을보이면반드시진균배지에조직배양 (tissue culture) 을하여원인균을동정하여흑색진균을확인하여야한다. 참고문헌 1. Suh MK, Lee YH. Infections caused by dematiaceous fungi. Kor J Med Mycol 2005; 10: Suh MK. Phaeohyphomycosis in Korea. Jpn J Med Mycol 2005; 46: Suh MK, Kim YJ, Kwon SW, Kim JC. Ribosomal gene analysis of dematiaceous fungi using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Korean J Dermatol 2003; 41: Suh MK, Suh JC, Kim JC, Lee HC. Genetic diversity of dematiaceous fungi using random amplified polymorphic DNA. Kor J Med Mycol 2003; 8: Kim SO. Molds identification I. Kor J Med Mycol 2003; 8: Ko WT, Suh MK, Ha GY. Antifungal susceptibility testing of dematiaceous fungi using Etest. Kor J Med Mycol 2009; 14(in press)

29 심포지움 서무규 7. Suh MK, Suh JC, Seo SK, et al. A case of subcutaneous phaeohyphomycosis caused by Exophiala jeanselmei. Korean J Dermatol 1999; 37: Suh MK, Sung YO, Yoon KS, et al. A case of chromoblastomycosis caused by Fonsecaea pedrosoi. Korean J Dermatol 1996; 34:

30 서무규 심포지움 연자소개 성명 : 서무규 ( 徐武揆 ) 생년월일 : 1958 년 2 월 3 일 학력 의학사 : 경북대학교의과대학의학과졸업 (1982년) 의학박사 : 경북대학교대학원피부과학전공 (1993년) 경력 1983년 3월 ~ 1986년 2월경북대학교병원피부과전공의수료 1991년 5월 ~ 현재동국대학교의과대학피부과학교실교수및동국대학교경주병원피부과장 ( 동국대학교의과대학피부과학교실주임교수역임, 1997~2007) 학회 대한피부과학회정회원, 이사및학회지심사위원대한의진균학회정회원, 평의원및총무이사일본의진균학회정회원 (JSMM) 세계인수의진균학회정회원 (ISHAM)

31 심포지움 서무규 M E M O

32 서무규 심포지움 M E M O

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- 2 - - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - [ 그림 1] 산수유 [ 그림 2] 더덕 - 6 - - 7 - sample [ 그림 3] 균분리를위한접종 - 8 - PCA PCA with inoculum Slide glass [ 그림 4] Slide culture 모식도 - 9 - - 10 - Nutrient Medium Paperdisk with Antibiotics

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