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1 최종연구보고서 Rhizopus 와 Monascus 를이용한고기능성 대두발효식품개발에관한연구 (Development of fermented-soy functional food using Rhizopus and Monascus sp.) 연구기관 ( 주 ) 비피도 농림부

2 제출문 농림부장관귀하 본보고서를 Rhizopus 와 Monascus 를이용한고기능성대두발효식품개발에 관한연구 과제의최종보고서로제출합니다 년 4 월 23 일 주관연구기관명 : ( 주 ) 비피도 총괄연구책임자 : 지근억 세부연구책임자 : 지근억 연 구 원 : 박명수, 권빈이상준, 오지환 협동연구기관명 : 국민대학교 연 구 원 : 김선희, 김혜진이성진, 홍성윤김혜성, 김민성

3 요약문 Ⅰ. 제목 Rhizopus 와 Monascus 를이용한고기능성대두발효식품개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 콩의영양과기능성이부각됨에도불구하고이의소비촉진을통한국민건강증진을위한연구는기호성이낮은전통식품에만의존하여그효율성이낮아기호성과기능성이우수한신규제품의개발이절대적으로필요하다. 따라서본연구의목적은청국장, 된장등전통장류식품의영양적측면을그대로유지할뿐만아니라신세대들이나외국인들이꺼리는이취가나지않고곰팡이특유의향긋한냄새를풍겨기호성에서뛰어난식품으로알려진템페의기능성을더욱강화하기위하여홍국균과템페균을활용하여템페의기능성을강화하고응용상품을개발하여새로운형태의고기능성발효식품을개발하고상업적으로대량생산의틀을만드는데목표를두고있다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 위와같은연구목표를달성하기위하여본연구에서는표준균주와홍국제품을대상으로종균으로활용할 Rhizopus와 Monascus 균주를분리하였으며쌀과대두를기반으로생리활성물질 (monacolin K, GABA, isoflavone 등 ) 생산성을기준으로선발하였으며 citrinin의생산성은최소인균주를선택하였다. 선발균주에대하여배양및영양조건에따른 monacolin K 생산성을연구하여최적의생산조건을확립하고자하였다. 또한홍국템페제조공정의확립을위하여대두를이용하여홍국을제조할수있는선발균주에대하여종균의접종량및시료의전처리조건, 발효조건등에대하여탐색하였다. 이상의결과로얻어진조건에서홍국템페시제품을제작하였으며이를이용하여생리활성을동물실험을통하여검증하고자하였다.

4 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의다양한홍국으로부터분리한 26종의균주에대하여 monacolin K와 citrinin 생산성을토대로 1차선발하였다. 그리고각각의시료에서생리활성물질인 monacolin K, citrinin, GABA, isoflavone에대한분석법을확립하였다. monacolin K의생산성은쌀을기질로했을경우 Monascus sp. RC1가가장우수하였으며대두를기질로하였을경우에는 Monascus sp. SB1가가장우수하였다. Monascus sp. RC1 균주에대하여배양조건 ( 온도조건 : 7일간 3 0, 이후는 25 ; 습도조건 : 7일간 65%, 이후는 75%) 및영양조건을최적화한결과초기 monacolin K 생산량에비하여 20배이상의생산성향상을나타내었으며 2% 이상의함량에도달하였다. 또한 citrinin은검출되지않았다. Monascus sp. SB1를이용하여홍국템페를제조할경우간헐멸균을통하여 Bacillus 의오염을차단하는것이가장중요하였다. 이를위한간헐멸균법과대두의전처리공정을최적화하였다. 시제품을이용한동물실험결과템페와홍국쌀을섭취한경우대조군에비하여체중의증가가낮았으며혈압강하효과를보였다. 그리고혈장내의 GABA의농도는템페군에서높게나왔다. 또한대두와템페군에서혈중 estradiol의농도가높아졌으며그효과는템페군에서더강하였다. 난소절제한폐경모델에서도템페를섭취한실험구가골밀도및골강도의감소율이현저히낮았다. 남녀대학생을대상으로한관능평가에서는전반적인기호도가템페, 홍국템페등이청국장보다높게나타났다. 본연구결과를통하여 Rhizopus 와 Monascus 를이용한새로운형태의발효식품을개발하였고관련기능성을확인하였다.

5 SUMMARY ( 영문요약문 ) Fermented foods represent on average one-third of total food consumption. The functionalities of chunggukjang and doenjang, Korean traditional fermented food from soybean, are being reported. Tempeh is one of the major fermented soyabean food and is known for its attractive flavour, texture and superior digestibility. Red rice yeast is another functional food made by fermentation using Monascus sp. which produce monacolin K. We tried to develop new functional food with good sensory characteristics and functionality using Monascus and Rhizopus. For this purpose, we have screened more than 20 strains of fungi with high yield of monacolin and least productivity of citrinin and isolated 2 candidates. For the selected strains, the culture and process conditions were optimized for the maximal production of monacolin K from rice and soybean. As a result, the productivity of monacolin K was increased up to more than 20g/kg. For the successful process, sterilization of Bacillus was critical during the pretreatment of substrates. The tyndallization process was established for this purpose. The small scale production process has been scaled up to 30 KG/batch. The animal test using the sample product showed that tempeh and red yeast rice was effective on inhibiting weight gain and blood pressure level. In addition, the GABA concentration in the serum was higher in the test group than control. The bone mineral density, bone mineral content and bone breaking force were higher in the tempeh treated group. The sensory evaluation of male and female student graded as tempeh>tempeh with monascus>chunggukjang. These days, the excessive intake of animal protein food results in serious probles such as nutritinal imbalance, obesity, and cardiobascular disease, so the soybean, which is a source of vegetable protein, is considered as an important substitution food. The newly developed fermented foods with Monascus and Rhizopus would be widely used as a high value added food.

6 CONTENTS ( 영문목차 ) Chapter 1 Introduction Chapter 2 State of the art Chapter 3 Results and Discussion Chapter 4 Achievement of Research objects Chapter 5 Application of Research results Chapter 6 New information of the related research Chapter 7 References

7 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 2 장국내외기술개발현황 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌

8 주 의 1. 이보고서는농림부에서시행한농림기술개발사업의연구보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시농림부에서시행한농림기술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니다.

9 제 1 장 연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 콩의영양과기능성을증진시키고소비촉진을위하여 Rhizopus 와 Monascus 를이용한새로운발효식품을개발하고자한다. 제 2 절연구개발의필요성 콩의섭취방법은그특이성및기능성을최대한유지시킬수있도록각나라의문화로대두되고있음. 한국은콩을발효시킨메주를사용한된장고추장, 그리고 Bacillus를사용한청국장을오래전부터섭취하고있음. 그러나세대간의음식취향이바뀌면서신세대의취향에적합한콩발효식품의개발은국내에서활발히진행되지못하여, 이웃일본의나또와같은이용감소기로향하고있다. 또한우리나라의전통콩발효식품인청국장과된장은최근그기능성이많이연구되어그우수성이밝혀지고있으나기호성이떨어져젊은층에는크게어필하지못하고있으며특히세계적인글로벌식품으로의개발에는한계가있다. 서양식단의국내유입이증가되면서동물성단백질식품의섭취시인체에미치는영향에대해여러영양불균형및비만그리고혈압상승등의영향에대한연구결과가대두되고있음. 이의대체식품으로서각광받고있는것은전세계적으로식물성단백질원인콩이중요시되고있다. 인도네시아의전통적발효식품인템페 (Tempeh) 는세계적으로도널리알려져있는콩이용식품으로높은기호성으로인하여세계적인성공을거두고있으며콩을주성분으로하여이소플라본함량이높으며풍부한단백질, 아미노산, 비타민 B12 등이우수한제품으로알려져있다. 템페는청국장, 된장등전통장류식품의영양적측면을그대로유지하고있을뿐만아니라신세대들이나외국인들이꺼리는이취가나지않고곰팡이특유의향긋한냄새를풍겨기호성에서뛰어난식품으로기존음식에응용가능한범위가넓어기능성을가진미생물발효시고부가가치의제품개발여지가충분하다. 서양에서의우유와유제품은동양권에서는콩과콩제품으로비교되는데, 우유에비해콩은단백질의아미노산조성으로보면질이떨어지지만지방의조 - 1 -

10 성에서는우유에비해질이우수함. 단백질의질을아미노산가로평가하면우유는 60, 대두는 47이나템페의경우는 79이며쌀등과함께적용되면콩에부족한메티오닌을보충할수있다. 또한콩과우유에가장큰지방산조성의차이는필수지방산 linoleic acid와같은다가불포화지방산을다량함유하고있어혈중콜레스테롤수준을낮추어심혈관계질환의예방및치료효과가있고우유에다량함유되어있는콜레스테롤이콩에는함유되어있지않아영양적으로우수하다. 대두를발효시킨 tempeh는 Rhizopus oligosporus 균이생산하는효소의활성으로단백질과지방의분해가이루어져대두식품보다소화흡수가잘된다. 대두에존재하는피트산은단백질및전분분해효소의활성을저해하고칼슘과같은무기물과불용성복합체를형성하여생체이용도를감소시키는데 tempeh 에는피트산의 1/3 가량이감소한다. 따라서 tempeh는소화흡수불량과골다공증에효용가치가있다. 콩은영양적가치뿐만아니라생리활성물질로서의중요성이인식되고있으며대두의이소플라본은 tempeh로발효시키면함량이증가된다. 이소플라본중 genistein의경우종양의개시와진행단계에서관여하는활성산소종을소거하여항산화효과를나타내며특히유방암과전립선암에대한항암작용이알려져있다. 한편 Monascus는주로쌀을기질로하여홍국등의제품생산에이용되며다양한기능성을가지는 monacolin-k( 고지혈증치료제 ) 라는색소와두뇌식품으로알려진 GABA를생산한다. 이미시장을선점하고있는외국의 tempeh 생산기업들과경쟁하기위해서는기호성은물로기능성이뛰어나며신공법에의한기술장벽을가지는새로운형태의제품개발이필요하다. 식용곰팡이인 Monascus purpureus 및 Rhizopus oligosporus를콩및대두배아, 곡물등에발효하는기술을확립하고이에부산물인 monacolin-k 등다양한기능성물질등이함유된기능성템페생산기술구축할수있다. 본연구에서는이두가지기능성곰팡이를이용하여템페의기능성을강화하고응용상품을개발하여새로운형태의고기능성발효식품을개발하고상업적으로대량생산의틀을만드는데목표를두고있다

11 [ 콩발효식품의특징비교 ] 발효식품미생물종류특징 청국장된장고추장낫또템페 Bacillus sp. Bacillus sp. Aspergilus sp. Bacillus sp. Aspergilus sp. Bacillus natto Rhizopus oligosporus 청국장특유의냄새와점질물및다양한생리활성효과. 기호성이약함, 콩전체를이용하여영양손실이없음발효시오랜숙성요함 (6개월) 한국고유의장으로음식에다양하게쓰임. 기호성이약함대표적인한국의장류식품, 기호성이약함밥에섞어음용. 청국장에비하여적은이취발생, 기호성이약함곰팡이를이용한발효로흰케익모양의균사체형성. 향긋한냄새로이취가거의없음. 다양한응용가능성 ( 콩가스, 스파게티, 피자, 채식인의고기대용품등 ). 다양한원료와혼합가능 ( 쌀, 조, 수수등 ), 곡물전체를이용하여영양손실이없음 - 3 -

12 제 3 절연구개발의범위 구분 주요개발내용및범위 1 단계 ( 기초연구 ) 기초자료조사 : 관련논문및특허조사, 외국의제품수집 협동연구와공조체제확립 : 상호교류방법 스타터균주선발 : Rhizopus, Monascus에서대두를기반으로관능성, 안전성, 생물전환능등을기준으로선발 균주의생육조건조사 : 적정배지및배양조건확립 스타터생산조건연구 : 배양, 표준화및보존조건확립 Monascus 적용연구 : 대두배지를기본으로 Monascus의생육특성분석 혼합배양조건연구 : 스타터의 mixed culture 분석 생리활성지표물질분석법확립 : 추출, 분석및효능평가기술확립 1차시제품의개발 : 다양한원료의혼합가능성타진 2단계 ( 응용연구및시제품제작 ) 스케일업 : 실험실조건에서스케일업 (30KG) 발효공정의분석 : 각단계별공정을안전성, 효율성, 재현성을중심으로분석하고문제점해결 대량생산용스타터생산공정개발 : 배양, 건조, 분쇄, 포장방법확립 대량생산을위한기기설계 대량생산용스타터적용실험 : unit 결정및접종량, 발효시간표준화 스케일업제품분석 : 스케일업하여얻은제품의 Quality control 을통한표준화기초연구 2차시제품의개발 : 사업화를위한제품개발 - 4 -

13 1. 1 단계 ( 기초연구 ) 개발내용및개발범위 가 ) 1 차년도개발목표 기능성콩기반발효제품개발을위한스타터개발및기능성평가방법확립 [ 템페발효공정 ] 공정내용비고 1 원료세척 2 침지및산처리 3 껍질제거 4 증자 5 탈수 6 종균투입 7 배양 콩과곡물을깨끗하게씻어불순물을제거 물의부피가콩부피의 3배되도록붇고빙초산을약 12시간넣어산처리하고산처리된물에침지효율적인물에불린콩의껍질을비벼제거하고물을넣어비껍질제거중의차이로껍질을분리필요껍질이제거된콩에서물을제거하고 110 에서 20 분간증자하여콩을멸균 콩표면에물기를제거하기위해오븐 (80 ) 에넣어약 2 시간정도건조작업을실시 곰팡이를콩 100g당포자 100만개정도접종해주고골고루퍼지도록잘혼합 배양기 (37 ) 에서발효한후하얀색균사체형성을육안으로확인한상태에서발효를종료 약 36 시간 나 ) 1 차년도개발내용및범위 기초자료조사 : 관련논문및특허조사, 외국의제품수집현재국내외관련자료를조사하고기존의개발된내용은재현성을확인하고신규한기능성을부여할수있고본연구를현장에서경쟁력있는제품의개발로이어갈수있도록하는핵심연구분야를선정하기위한준비단계협동연구와공조체제확립 : 본과제의경우산업화및제품화를위한 ( 주 ) 비피도와미생물학적분석과기초연구및기능성분석을위한국민대학교연구팀이공동으로연구를진행하므로상호간의효율적인업무분장과지속적인정보교류를위한공조체제를확립하고자함. 스타터균주선발 : 본연구의핵심은콩을기반으로하는신규한발효제품을 - 5 -

14 개발하는것이며여기서가장중요한것이스타터균주의선정이다. 본연구에서사용하고자하는균주는 Rhizopus, Monascus 속이다. 스타터균주개발의가장중요한부분은발효의적정성 ( 생육특성 ), 발효후의관능적인면에서의우수성 ( 관능평가 ), 식품으로사용할수있는안정성특히 Monascus의경우 citrinin의생성이없는균주선발 (citrinin 분석 ), 발효과정중의콩이소플라본의생물전환능 (TLC 및 HPLC 분석 ) 등임. 균주의생육조건및스타터생산조건연구 : 스타터로서사용하기위해서는 Rhizopus와 Monascus의배양특성을파악하고최대의포자를형성하는적정배지및배양조건을확립하기위한방법의표준화가필요하다. 이를위해서식용으로가능한적정배지 ( 감자, 쌀, 콩등을이용한배지 ) 의조성확립과포자형성을최대로하는배양조건 ( 온도, ph, 습도 ) 에대한미생물학적배양연구가필요하다. 또한산업화를위해서는 1회성의연구가아닌항상일정하게재현될수있도록하는생산조건의표준화와스타터를보관하면서사용할수있도록보존조건, 부형제의선택등에대한연구가필요함. 혼합배양조건연구 : 본연구에서는단일스타터에의한단순배양뿐아니라고기능성의콩기반발효제품의개발을위하여 Monascus와 Rhizopus의혼합배양이이루어져야한다. 성공적인혼합배양을위해서는이들을적정비율로접종하고배양조건 ( 온도, 초기 ph, 습도, aeration) 의변화에따른배양경과를정밀분석하여균총의변화를추적하여야한다. 경시적인균총의변화의관찰과기능성지표물질들의변화를단독배양과비교하여최적의조건을확립하여야한다. 생리활성지표물질분석법확립 : 본연구에서는콩에서일반적인기능성물질로알려져있는 isoflavone 뿐아니라, monacolin-k, citrinin 등을지표물질로하여이들의추출, 분석법을확립하여제품생산시품질관리의지표로사용하고자한다. 또한협동연구에서는총체적인제품의효능을평가하기위하여동물실험을통하여효능평가 ( 콜레스테롤저하, 항산화효과, 골다공증예방 ) 를위한기술확립한다. 1차시제품의개발 : 1차년도에는상반기의연구결과를토대로실험실적인조건에서선발된종균을이용하여콩을기반으로하고쌀과기타곡류등을혼합하여발효한시제품을개발하고이를협동연구팀에서분석하도록한다

15 나. 2 단계 ( 응용연구및시제품제작 ) 개발내용및개발범위 가 ) 2차년도개발목표 1차년도의연구결과를기반으로스케일업을통하여산업화의기초를확립하고시제품을생산하여효능을평가. 나 ) 당해연도개발내용및범위 1. 스케일업및발효공정의분석 : 실험실조건에서스케일업 (30KG) [ 템페발효공정 ] 공정내용비고 1 원료세척콩과곡물을깨끗하게씻어불순물을제거세척기 2 침지및산처리 3 껍질제거 4 증자 5 탈수 6 종균투입 7 배양 물의부피가콩부피의 3배되도록붇고빙초산을넣어산처리하고산처리된물에침지 물에불린콩의껍질을비벼제거하고물을넣어비중의차이로껍질을분리 껍질이제거된콩에서물을제거하고 110 에서 20분간증자하여원료를멸균 침지조 껍질제거기 콩표면에물기를제거하기위해오븐 (80 ) 증자 + 탈수 + 접종에넣어약 2시간정도건조작업을실시일괄공정필요 곰팡이를콩 100g당포자 100만개정도접종해주고골고루퍼지도록잘혼합 배양기 (37 ) 에서발효한후하얀색균사체형성을육안으로확인한상태에서발효를종료 배양종료시점표준화 2. 발효공정의분석및기기설계 : 각단계별공정을효율성있게일괄통합할수있는부분은통합하고생산 cost를낮출수있는비용절감공정을구성하고각각에맞는기기를선정하고다시공정에맞도록개선하는것이필요하다. 또한반복적인시제품제작실험을통하여중점관리포인트를설정하고재현성있게공정을확립한다. 이상의결과를바탕으로가장효율적인동선의구성과공정 lay-out을설정한다

16 3. 대량생산용스타터생산공정개발 : 대량배양을위한스타터를안정적으로공급하기위한스타터균주의배양, 건조, 분쇄조건을설정하고포자수를기준으로표준화하여생산공정에맞게 batch별투입량에따른포장방법을확립한다. 4. 대량생산용스타터적용실험 : 원재료에따른스타터종류및접종량을 unit로결정하여표준화하고제품의완성도에따라모니터링하여발효종료시점을결정한다. 특히 Monascus를스타터로적용하는연구를본격적으로실시하며그에따른생리활성물질의분석 (monacolin-k, citrinin) 도함께병행한다. 5. 스케일업제품분석 : 스케일업하여얻은제품의 Quality control 을통한표준화기초연구를위하여스타터접종량, 발효시간, 발효조건 ( 온도, 습도, 통기량 ) 등에따른시제품의지표물질에대하여분석하여최적의조건을선정한다. 6. 2차시제품의개발 : 이상의연구결과를토대로사업화를위한제품을확정하여협동연구팀에전달하여생리활성을분석한다

17 제 2 장 국내외기술개발현황 한국인의식생활은사회경제수준의향상으로최근 30년간많은변화를겪고있다. 국민건강영양조사에서열량섭취를 3대영양소의비율로보면, 탄수화물 : 단백질 : 지방이 1970년에는 78:13:9, 80년에는 79:13:8, 90년에 69:17: 년에는 66:15:20로탄수화물의섭취는감소하고지방섭취가현저히증가하였다. 단백질의총섭취량에서동물성단백질의섭취가 70년의 20% 에서 90년대이후에는 50% 로증가하였으며동물성지방의섭취도 7, 80년대의 30% 에서 90년에 38% 로증가하여 2001년에 48% 로증가하였다. 역학조사에서의질병발생의추이도점차동물성식품섭취가많은서구사회의형태로변화되고있는실정이다. 우리나라에서는전통적인콩발효제품으로된장및청국장이소비되고있는데 tempeh는발효기간이 2-3일정도로짧으며청국장과같은강한냄새가없어서장점이있고관능검사를통하여기호에맞는다양한형태로제품화하면소비가많을것으로전망하고있다. 전통적으로는템페는 Rhizopus oligosporous 를이용하여제조하며첨가해주는곡물에따라약간의변화를주어스타터를선택하는데제조공정상 Bacillus의오염이가장큰문제점으로지적되고있다. 기존의템페연구는주로영양성분과기능성성분의분석에국한되어왔으며전통적인템페의국내에서의재현에불과하며실험실적인연구를탈피하지못하고있으며상업화한경우는없다. 국내에서는 90년대에정식품에서템페를통하여대두올리고당에의한설사를방지하는기술과콩비린내를제거하는기술에대하여특허를출원하였으나기존의방법은기술진입장벽이낮아쉽게따라할수있다. 기능성을향상을위하여식품용곰팡이중 Monascus를적용하는것이필요하지만아직이에대한연구는없는상태이다. Monascus는 monacolin-k라는기능성물질 ( 약품명로바스타틴 lovastatin: 항고지혈증치료제 ) 을생산하는균주이지만또한 citrinin이라는독소 ( 신장독소 ) 를생산하기도하여이를극복하기위한기술개발이시급하다. Monacolin K, compactin과이들의유도체는혈액에서저밀도 lipoprotein과 - 9 -

18 cholesterol complex의양을낮추는효과를가지고있어새로운치료제로개발이가능함. Maltese등은 monacolin K가 dolichol, ubiquinone이나 isopenteyl-trna 와같은 nonsterol isoprenoid 화합물의합성을억제하는효과가있기때문에암세포의성장을억제하는효과가있다고보고하였음. 이러한보고로인하여최근에는 monacolin-k이나이와유사한화합물들을이용하여여러가지의암에대한임상치료용약제로개발하기위한관심이고조되고있다. 시트리닌의생성에대한보고는연구자에따라다름 ( 동일조건에서생성에대한상반되는연구결과들이보고되고있어최적의조건을찾는연구가필수적임-액체배양, 고체배양, 쌀배지, 기타곡류배지등 ) 따라서 monacolin-k는다량생산하면서 citrinin 생성이없는종균의개발이선행되어야한다 ( 현재건강기능식품공전에서허용치는 50ug/kg). 국내장류의수급현황을보면수요는점차증가하고있는반면공업화비율은진척이상당히느려제품의고급화와표준화등에약점을노출하고있어세계시장에서일본에밀리고있는실정이다. 이는장류발효가제어가까다로운복잡한혼합발효시스템이기때문이며여기에대한체계적인연구가필요하다. [ 국내장류의수급현황과공업화비율 ]

19 따라서새로운기능성을부여하기위한스타터개발과혼합배양을위한신공정개발및개발된제품의기능성평가를동물실험을통하여규명하는연구가필요하며그결과기술진입장벽이높으며고기능성의제품을개발할수있을것이다. 외국에서는가정에서템페를제조할수있도록종균을공급하는기업도있으나국내에템페를생산하는기술을보유한기업은없는실정이다. Monascus를이용한홍국제조기술을보유한회사는있으며 2004년도에건강기능식품으로등재되어그시장이커질것으로예상되고있다. 홍국의경우배양방법에따라 citrinin의생성정도가달라위험성이상존하므로독소생성이없는종균의개발이시급한상황이다. 홍국과템페의기능성을향상하고상호간의시너지를내고자하는연구는아직진행된바없으며이기술이성공할경우된장이나청국장의시장규모를능가할것으로예상된다. 낙농국가가아닌상황에서요구르트시장은이미 1조원이상의시장규모를형성하며승승장구하는것이하나의좋은벤치마킹대상이라고할수있다. 동물성단백질대체원을찾고있는현시점에서새로운형태의발효식품인템페를개발하는것은매우의미있는일이며시장진입도무난할것으로보인다

20 [ 본연구관련분야의주요기술및기술수준 ] 국내국제목표 곰팡이배양기술 비고 의약품분야보다는식품분야에서는상당히앞서발전되어있음 혼합배양기술 공정제어나분석이미흡함 스타터제조기술 주로수입종균을사용하여외화누출 스타터개발기술 주로수입종균을사용하여외화누출 기능성평가기술 동물실험및인체실험이상당히발달된장에대한항돌연변이원성, 항산화활성, ACE 억제작용, 면역증강활성청국장발효균의혈전용해작용미소의항암작용낫또의항암작용 prolyl endopeptidase 에대한활성혈전생성억제작용 기능성개발기술 외국의소재및방법을도입하는경우가많음 균주개량기술 유전자조작등의기술은매우발달함 생물전환기술 미생물을이용한생물전환이활발하게연구되고있음 (isoflavone 전환률 ; 약 70%) 템페제조기술 아직도입되지않고있음 청국장제조기술 최근들어활발하게연구되고있음 된장제조기술 전통적인방식이주가되고있음

21 [ 현재유통되는기능성식품의증거수준-미국과학건강협회 (ACSH) 보고서 ] 기능성식품 생체 활성성분 잠재적건강효과 권장량또는복용횟수 효과의 증거수준 통귀리식품 베타-글루칸 콜레스테롤수준저하 3g/ 일 매우강력 차전자 수용성섬유질 콜레스테롤수준저하 1g/ 일 매우강력 통대두식품, 콩단백질로만든식품 콩단백질 콜레스테롤수준저하 25g/ 일 매우강력 스 타 놀 특수성분 3.4g/ 일, 강화마가 식물성스타놀 스 테 롤 린 혹은 또는 스테롤 콜레스테롤수준저하 1.3g/ 일 ; 매우강력 샐러드소스 에스터 반드시식사와함께섭취 무설탕검, 캔디 당알코올 충치유발없음 해당없음 매우강력 오메가-3 지지방어족심장병위험감소 2회 / 주 * 강력방산덩굴월귤 proanthocyan 요로감염감소중간주스 idins 마늘 유기황화합물 콜레스테롤수준저하 중간 녹차 카테친일부유형의암위험미약내지 (catechins) 감소중간 토마토와리코펜일부의암 ( 특히전립미약내지토마토제 (lycopene) 선암 ) 위험감소중간품 암록색잎연령관련황반퇴화루테인 (lutein) 미약채소위험감소고기 ( 肉 ) 와유방암위험감소, 근미약유 ( 乳 ) 제품공액리놀레산육량증가, 기타 es, indoles 감소십자화과채소 isothiocyanat 일부유형의암위험 미약 발효유 생균활성제위장건강보강 ; 면역 (probiotics) 력강화 미약

22 제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절연구수행방법 가. Monascus sp. 를이용한 Tempeh starter 개발 1) Monascus sp. 발효법개발 발효기질및발효균에적합한통풍가능및살균가능제품의발효용기제작또는구입후개조. 또한 starter 특성상바로 caping 되거나 sealing 되는 disposable 또는 recycling 되는재질의용기를사용. 균일한접종방법모색및접종시오염균의간섭을줄일수있는방법탐색. 접종양에따른 starter의활성상태연구. 접종시기질의온도에따른발효 patern 분석및기능성물질탐색. 색소분석은 Monascus sp. 에의해만들어지는색소들은매우복잡한혼합물의형태로존재하고있기때문에대부분이전의연구는비교적간단하고단순한 UV spectrophotometer의분광학적방법을이용하여 yellow pigment에대하여는 400nm 그리고 orange 와 red pigment에대하여는각각 470 과 500nm에서흡광도를측정함으로서이들색소들을확인하였음. 여러색소에대한정성분석은 silica gel의 TLC plates 상에서 chloroform: methanol: acetic acid (285: 21: 9) 로전개함으로서확인된다고보고되었음. 또한 HPLC를이용하여여러가지색소들의확인이될수있음. 이때사용되는 column은 mobilephase acetonitrile 과 Trifluoroacetic acid를 gradient로사용할것임. HPLC에의한색소의정량분석은여러색소들의분석시사용하는 detector에대한흡광도의민감성의차이점이있기때문임. Monacolin K 의정성및정량법개발 starter로부터 monacolin K를분리하여생산하기위한 column chromatogrphy 및 HPLC 방법은다음과같음. sample의배양액을 ph 4-4.5로적정하여 ethyl acetate로추출함. 추출액을농축한후 polymeric resin을이용하는방법으로서 XAD-2 resin 으로충진된 column chromatography에서 isopropanol: ethyl:dichromethane (25: 45: 30) 으로추출함. HPLC 방법은건조된시료를 acid가첨가되지않은상태로 water: acetonitrile: 2-propanol

23 (75: 20: 5) 에다시녹인후, 이용액의적당량을취하여 HPLC system에주입함. GABA 정량법확립일반적인아미노산분석방법을선택하여 HPLC 방법으로 GABA를정량하였음. 배양시간단축방법탐색 Rhizopus oilgosporus 의탈피대두에대한활성화된 starter의단일균발효는약 24-48시간안에 Tempeh의제품생산이가능함. 그러나 Monascus sp. 의 co-culture시 Monascus sp. 의생장시간이약 5일또는그이상으로발효시간이차이가남. 이차이를줄일수있는것은기질의초기투입시기의조전을연구하려함. 나. 다양한탄소원및질소원을통한활성형 Tempeh starter의개발 발효기질탐색발효에적합한탄소원들은기존의 Tempeh starter 기술개발에서착안하여개발하려고함. 대두를기본으로쌀과국산곡류를혼합하여발효에적합한탄소원을탐색하여순위를책정하고발효산물을연구하려함. starter의저장안정성증대활성형 starter의개발은초기 starter 제조시균체의상태와보관중의균체의변형에따른안정성에영향을줌. 각 step에대한연구를통해최적상태를유지하는조건을탐색하려함. 다. 시제품의이소플라본정량 제품의이소플라본중 aglycone type인 genistein과 daidzein 함량을 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 를이용하여분석함. 제품의시료를냉동건조하여분말로만든다음 ethanol을넣고밀봉후 55 shaking incubator에서 30분간배양하여이소플라본을완전히추출한후실온에서냉각함. 3,000 rpm에서 15분간원심분리시킨후상층액에 4 mol/l HCl를첨가한후끓는물의항온수조에서 30분간담가이소플라본의 conjugates를가수분해시킴. C 18 solid phase extraction cartridges를이용하여가수분해시킨시료를 methanol과함께 loading 시켜분석함. 라. 동물실험 동물실험설계 : 실험동물은 SD계수컷흰쥐를구입사용하며, 실험

24 식이는기본적인 AIN 93G diet에시제품이첨가된식이를 6주간제공하고대조군과비교함. 시료수집 : 소변과대변의수집은실험식이급여 5주째에실험동물들을대사장에 1마리씩옮겨서 24시간수집함. 소변은총부피를측정한후 30 ml로맞추어냉동보관하여분석하고, 대변은털과이물질을제거한후총무게를측정하고분석전까지냉동보관함. 실험종료일에 16시간결식후희생시켜혈액을채취하여 3,000 rpm에서 30분간원심분리하여혈청을획득함. 간과다른장기조직도함께채집함. 시료분석 : - 혈청및간장의총콜레스테롤함량측정- Zak-Henly방법을이용하여시료의총콜레스테롤함량을비색측정함. Ferric chloride precipitating reagent 4 ml안에시료 100 ul를넣고 2-3분후에혼합액을원심분리함. 상등액에진한황산 2 ml을넣고 vortex로완전히혼합한후 ferric chloride diluting reagent 3 ml과진한황산 2 ml의혼합물을혼합한후실온에서냉각시켜 560nm에서흡광도를측정함. - 혈청및간장의 LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤함량측정- LDL- 콜레스테롤은 β-lipoprotein C-test를이용하고, HDL-콜레스테롤은 HDL-C555를이용하여분석함. - 중성지질함량측정 : Trigkyzyme-V를이용하여, 혈청및간조직의중성지질농도를측정함. - 단백질효율 (Protein efficiency Ratio: PER) 및보유율 (Protein Retention %) 측정 : 단백질효율은 6주간의대사실험기간의단백질섭취량에대한체중증가량이비율로구함. 단백질보유율은실험마지막주에뇨와변을각각수집하여단백질을정량함. - Ca, P 정량 : 실험마지막날쥐를희생시킨뒤오른쪽 tibia와 femur 를채취한후 에서회화한후방냉하여가루로만든후 Ca, P 및기타무기질의함량을 Inductively Coupled Plasma-mass Spectrometry (Model #7500a, Agilent Technology, Palo Alto. Ca) 를사용하여측정함. 통계처리 : 모든자료의처리는각처리군에따라평균과표준편차를구하고 SPSS를이용하여분석함. 마. Tempeh starter Library 구축 1) 제품의특징별 Library 구축 구입한 starter 및 Tempeh 제품의종류별구분과발효균, 사용한기질

25 등을분석하여 library를구축하겠음. 기호가비슷한아시아쪽을위주로그리고유럽및아메리카권도종류별기호별로구분하여하려함. 바. Tempeh 및 starter 활성포자화연구및저장안정성증대조건탐색 혼합발효가완성된상태에서각각의발효균의포자화를유도하여저장기간의증대및보관안정성을높이는연구를주력하겠음. 또한포자의상태에대한문헌및실험을통해최적포자형성시기를조정하고제품에적용하는실험을할것임. starter의배양시에항세균성물질의생산기시및생산량의최적시기를포착하여제품에적용할것이며, 다른기능성물질의생산시기와도연대를이루어배양최적시기및배양종점을찾도록하겠음. 사. 제품의특성측정 제품의색도는 chromameter (model CR-300, Minolta Co., Japan) 을사용하여 L( 명도 ), a( 적색도 ), b( 황색도 ) 값을측정함. 제품의 texture는 Texturometer (model TA-XT2, Micro Systems Ltd., England) 를사용하여측정함. 제품을일정한크기로잘라중앙부위의견고성 (hardness), 부서짐성 (fracturability), 부착성 (adhesiveness), 탄력성 (springiness), 응집성 (cohesiveness), 씹힘성 (chewiness) 등의 6가지항목에대해실험군당 10회반복측정함. 라. 관능검사 관능검사에사용하는시료는제품을일정한크기로잘라접시에담아사용함. 관능검사의대상은서울시에거주하는성인 20대, 40대, 60대를연령별로남녀각각 10명씩선발하여실시함. 관능검사를실시하기전에평가항목에대한사전교육을실시함. 시료를시식하는순서는한개의시료를먹고그시료에대한평가를적은다음반드시생수로입안을깨끗이헹구고수초후에다른시료를시식하고평가하도록함. 관능검사는 tempeh에대한전체적인기호도와색깔, 풍미, 맛, 부드러움, 씹힘성, 촉촉함등 6가지요소에대해조사하고, 매우좋다 (5점), 좋다 (4 점 ), 그저그렇다 (3점), 싫다 (2점), 매우싫다 (1점) 까지의 5단계기호도검사법으로평가함

26 제 2 절연구내용및결과 1. Tempeh 제조를위한종균의탐색 1) Monascus 분리를위한홍국제품의수집홍국템페의제조를위해서는현행건강기능성식품법에서제시하고있는기준 ( 홍국제품의경우 citrinin 은 50ug/kg 이하 ) 로되는조건을만족시켜야한다. 공시균주를대상으로한예비실험결과공시균주는 citrinin을생산하고 monacolin K 생산능이낮아 tempeh starter로의이용에적합하지않았다. 따라서 Tempeh starter로적합한 Monascus 를분리하기위하여자체적으로제조한홍국쌀및수집홍국시료등총 26 종을사용하였으며그현황은표 1과같다. 계대를위하여 1.5% Potato Dextrose Agar 평면배지에 7일간계대하여실험에사용하였다 ( 표 1). 표 1. 홍국균주시료 균주번호 균주 출처 1 M. ruber KCTC6122 KCTC 2 M. kaoliang KCCM KCCM 3 M. purpureus KCTC 4 M. pilosus KCCM60084 KCCM 5 M. anka 이호재박사 6 M. anka (yellow mutant) 이호재박사 7 M.araneosus 8 M.isolate71109 미동정균주 9 Monascus spp. A 홍국쌀 10 Monascus spp. RC2 홍국쌀 11 Monascus spp. C 홍국쌀 12 Monascus spp. RC1 홍국쌀 13 Monascus spp. E 선식 14 Monascus spp. SB1 홍국쌀 15 Monascus spp. G 영양선곡 16 Monascus spp. H 홍국쌀 17 Monascus spp. I 홍국쌀 18 Monascus spp. J 홍국분말 19 Monascus spp. SB2 홍국분말 20 Monascus spp. M 홍국분말

27 21 Monascus spp. N 홍국분말 22 Monascus spp. SB3 홍국분말 23 Monascus spp. T 홍국분말 24 Monascus spp. U 홍국분말 25 Monascus spp. V 홍국분말 26 Monascus pilosus 홍국분말 2) 홍국으로부터 Monascus 분리홍국을분말화하여멸균수에혼합하여현탁액을 potato dextrose agar, malt extract agar, C 배지에도말한뒤 30 에서 4-6일간배양하였다. 오염균은계대배양을반복하여제거하고 Monascus를순수배양하였다. ( 그림 1). 그림 1. 분리된 Monascus sp. 2. Citrinin, monacolin-k, GABA 분석법의확립 1) Bioassay에의한 citrinin 정량법 Citrinin은신장독으로알려져있어식품용으로활용하기위해서는 citrinin 비 ( 저 ) 생산균주의선발이중요하다. 이를위해서는많은균주로부터빠른 citrinin 비 ( 저 ) 생산균주의선발방법이필요하였다. 본연구에서는 citrinin에의해성장이저해되는것으로알려져있는 Bacillus cereus를이용하여 citrinin 비생산여부를검사할수있는방법

28 을 1차선발로서사용하였다. 그림 2에나타난바와같이 500 ng/ μl농도에서 B. cereus의저해환이관찰되었으며야생형 M. ruber 배양액또한분명하게저해환을보여 citrinin 비 ( 저 ) 생산균주선발에이용할수있음을보여준다. 그림 2. Citrinin에의한 Bacillus cereus의성장저해 A. Standard citrinin 농도별 B. cereus 저해 (a, 5 μg / μl ; b, 500 ng/ μl ; c, 50 ng/ μl ; d, 5 ng/ μl ), B. Monascus sp. 배양액의 B. cereus 저해 (a, M. ruber KCTC6122; b, M. ruber; c, M. anka) 2) HPLC에의한 citrinin 정량법품질관리등에서정량적으로 Citrinin 을분석하기위하여 HPLC 조건을확립하였다. 이동상으로 Methanol /acetonitrile/water를 30:30:40 (v/v/v) 의비율로사용하였고유속은 0.6 ml/min으로하였다. 컬럼은 Hypersil ODS column을사용하였고 fluorescence detector (330/500 nm) 로검출하였다. 그결과표준 citrinin의 HPLC chromatogram은그림 3A와같고 retention time은 6분정도였다. 홍국으로부터시료제조방법은다음과같음 1 홍국시료를 2 g 취하여 blender로갈아준다음막자사발을이용하여 powder처럼될때까지더갈아준다. 2 추출용매 acetone/ethyl acetate, 50:50 (v/v) 를 15 ml 첨가하여충분히섞어준뒤 20 ml로총부피를맞춰준다 로맞춰놓은 shaking water bath에서 90분간 160 rpm으로섞어준다. 4 상온에서원심분리 (5,300 x g, 11 min)

29 5 상등액 9 ml을따서진공상태에서농축시킨다. 6 3 ml의 ethyl alcohol을넣고시료의농축액을만든다 µm, PTFE filter로거른다. 3) HPLC에의한 monacolin K 정량법 Monacolin K 정량분석법으로 HPLC 조건을확립하였다. 즉 Acetonitrile/0.1% phosphoric acid, 65:35 (v/v) 을이동상으로사용하였고유속은 1.0 ml/min으로하였으며 Hypersil ODS column을사용하였고 UV detector (280 nm) 로검출하였다. 표준 monacolin K의 HPLC chromatogram은그림 4A, 4B와같고 retention time은활성형은 4분, 비활성형 6분정도였다. 홍국으로부터시료제조방법은다음과같음 1 구매한시료를 2 g 취하여 blender로갈아준다음막자사발을이용하여 powder처럼될때까지더갈아준다. 2 추출용매 ethyl alcohol을 15 ml 첨가하여충분히섞어준뒤 20 ml로총부피를맞춰준다 로맞춰놓은 shaking water bath에서 60분간격렬히섞어준다. 4 상온에서 10,000 rpm, 15 min 분간원심분리 µm, PTFE filter로거른다. 4) HPLC에의한 GABA (gamma-amino butyric acid) 정량법 GABA 정량분석을위하여 HPLC 조건을확립하였다. 즉 10 g disodium hydrogenphosphate, 117 mg EDTA, 1.5 ml tetrahydrofuran, 300 ml methyl alcohol을이동상으로사용하였고유속은 0.8 ml/min으로하였다. 컬럼은 C18-AA column을사용하였고 fluorescence detector (350/450 nm) 로검출하였다. 이때표준 GABA의 HPLC chromatogram은그림 5와같고 retention time은 1.5 분정도였다. 홍국제품으로부터시료제조방법은다음과같음 1 시료를 2 g 취하여 blender로갈아준다음막자사발을이용하여 powder처럼될때까지더갈아준다. 2 추출용매 9% ethyl alcohol을 8 ml 첨가하여충분히섞어준뒤 15 ml로총부피를맞춰준다 로맞춰놓은 shaking water bath에서 20시간동안격렬히섞어준다. 4 상온에서 10,000 rpm, 15 min 분간원심분리 µm, PTFE filter로거른다

30 5) HPLC에의한 isoflavone 정량법템페의제조과정에서대두속의 isoflavone의전환과그결과물의정량분석을위하여 HPLC 조건을확립하였다. 즉 0.1% Acetic acid in acetonitrile과 0.1% Acetic acid in water를이동상으로하였고유속은 1.0 ml/min으로하였으며아래와같은 gradient 조건을사용하였다. 0 min Acetonitrile : water = 15 : min Acetonitrile : water = 35 : min Acetonitrile : water = 15 : min Acetonitrile : water = 15 : 85 분석용컬럼은 C18- column을사용하였고 fluorescence detector (350/450 nm) 로검출하였다. 템페로부터시료제조방법은다음과같음 1배양이완료된템페 1g에메탄올 10ml와 1N HCl 200μl를가한후, 균질기 (IKA-Werk, Japan) 로 1분이상균질화시켜이소플라본을추출한다음 3000rpm에서 15분간원심분리하였다. 2상층액 2ml를취하여질소가스로휘발, 건조시킨후다시 80% 메탄올 (v/v) 2 ml에용해시켰다. 3이중일정량을취해 0.45μm폴리프로필렌필터 ( 밀리포아, 미국 ) 에여과한후 HPLC를수행하여이소플라본비배당체 ( 제니스테인및다이드제인 ) 의농도를측정하였다. 4) 국내외에시판되고있는홍국제품의 citrinin, monacolin K, GABA의정량분석비교분석을위하여국내시장에유통되고있는홍국제품에함유되어있는 citrinin, monacolin K, GABA의함량을 HPLC를통하여정량하였다. Standard citrinin 은 6분대에검출되었으며 ( 그림 3A), 대부분의시료의경우세개의 peak가검출되어 ( 그림 3B), spike 시험으로 citrinin peak를확인하였다. ( 그림 3C) Citrinin 함량은 standard citrinin peak와 peak 높이비교로계산하였고, 측정된함량은표 3에정리하였다. A

31 B. C. 그림 3. Citrinin HPLC 분석 chromatogram A. citrinin standard, B. 제품 A 추출물, C. 제품 A 추출물 + citrinin standard 홍국시료 B 추출물의 monacolin K HPLC chromatogram은그림 4C와같고각제품의 monacolin K 함량은검량선식에대입하여 monacolin K의양을계산하였다. ( 표 3)

32 monacolin K 활성형 A. monacolin K 비활성 형 B. C. 그림 4. Monacolin K HPLC chromatogram A. 표준 monacolin K 활성형, B. 표준 monacolin K 비활성형, C. 제품 B 추출물 GABA의 HPLC chromatogram은그림 5와같으며정량은 standard GABA의 peak 높이와제품에서분석한 GABA의 peak높이를비교하여계산하였다 ( 그림 5)

33 A. B. 그림 5. GABA HPLC chromatogram A. GABA standard, B. 제품 A 추출물 홍국시료의 citrinin, monacolin K, GABA의정량결과는표 2과그림 6에정리하였음

34 표 2. 홍국시료의 citrinin, monacolin K, GABA 함량 products Citrinin Monacolin K GABA ug/kg mg/kg g/kg A ± ± ±0.17 RC ± ± ±0.19 C ± ± ±0.02 RC ± ± ±0.01 E ± ± ±0.09 SB ± ± ±0.01 G ± ± ±0.01 H ± ± I ± ± ±0.004 J ± ± ±0.03 SB ± ± ±0.08 L ± ± ±0.16 M ± ± ±0.02 N ± ± ±0.38 SB ± ± ±

35 contents (g/kg) A RC2 C RC1 E SB1 G H I J SB2 L M N SB contents ( μg /kg) monacolin K (g/kg) GABA (g/kg) citrinin ( μg /kg) 그림 6. 홍국시료의 citrinin, monacolin K, GABA 함량 Citrinin은분석결과국내시료는 10가지가운데 2가지를제외한나머지모두건기식기준인 50 μg/kg 의 1/50-1/2 수준인것으로나타났으나중국시료는대부분건기식기준의 3-6배이상인것으로나타났다. Monacolin K의경우중국시료에서훨씬높게나왔으며 GABA의경우국내시료가운데는 A가가장높았고, 중국산가운데는 L이가장높았다. 3. 분리된 Monascus 의 citrinin, monacolin K, GABA 생산능 1) Citrinin 생산능분리균주들의배양조건에따른 citrinin의생산정도를알아보기위하여균주들을 YES 배지 (sucrose 16%, yeast extract 4%), 25, 150 rpm 조건으로 144 hr 배양하면서분석하였다. Citrinin 은배양액을인산용액으로 ph 3.0으로맞춘다음원심분리하여 (12,000 x g, 30 min) 상등액을취한뒤 0.45 μm filter로여과하여추출하였다. 그결과그림 7에나타난바와같이대부분의분리균주는 citrinin 생산최적배지인 YES에서공시균주보다낮은생산성을보였다

36 25.0 contents ppm (mg/l) M.anka M.anka(Y) M.koaliang M.pilosus Monascus sp. I Monascus sp. RC2 Monascus sp. J 그림 7. 여러 Monascus 의액체배지에서의 citrinin 생산능 2) 배양시간에따른 monacolin K 생산분리균주의 monacolin 생산성을비교하기위하여다음과같이실험하였다. 배지조성은 2% rice powder, 4% glucose, 1% monosodium L-glutamate, 1% peptone 으로하였으며 ph 5.0으로적정하였다. 접종양은 PDA 평판배지에서 6일간배양한것을직경 13 x 높이 5 mm의 cork borer로찍어 3개를취하여배지 50 ml에접종하였다. 배양온도는 30 로일정하였으며, 160 rpm으로 shaking하여 6일에서 9일까지배양하였다. 시료의전처리는배양액과동량의 ethyl acetate를섞어상온에서 2시간동안 150 rpm으로교반한뒤원심분리후상등액 2 ml을취해 65 rotary evaporator로농축하고 1 ml의 acetonitrile로 resuspension한뒤 filtering하였다. 그결과배양시간에따른 monacolin K 생산은그림 8과같았다. contents (mg/l) day M.ruber M.pilosus M.anka Monascus sp. RC2 Monascus sp. SB1 Monascus sp. N Monascus sp. U 그림 8. 여러 Monascus 의배양시간에따른 monacolin K 생산

37 세가지공시균주를포함한일곱가지 Monascus 가운데 7일배양시 Monascus sp. RC2가가장많은 monacolin K를생산하는것으로나타났다. Monascus sp. N의경우 8일째배양하였을때가장많은 monacolin K를생산하였으나그양이 Monascus sp. RC2를 7일배양한값에는미치지못하였다. 시료 RC2에서직접추출한 monacolin K 함량과시료 N의것을비교해보았을때시료 N의함량이시료 RC2의 4배이상인것을고려할때 tempeh starter용우수균주선발은액체배지보다는고체배지에서선발도고려해야할것으로판단되었다. 3) 배양시간에따른 GABA 생산 GABA는 MSG에서 decarboxylase에의하여생산되는물질로신경안정, 두뇌활동촉진등의효과가있는생리활성물질이다. 분리균주들의배양조건에따른 GABA 생산성을비교하였다. 배양조건은 (2% rice powder, 4% glucose, 1% monosodium L-glutamate, 1% peptone/ph 5.0, 30, 160 rpm, 144 hr) 으로하였으며배양액과동량의 ethyl acetate를섞어상온에서 2시간동안 150 rpm 으로교반한뒤원심분리후상등액 2 ml을취해 65 rotary evaporator로농축하고 1 ml의 acetonitrile로 resuspension한뒤여과하여시료를만들었고분석결과는그림 9와같았다. contents (g/l) day M. ruber M.pilosus M.anka Monascus sp. SB1 Monascus sp. U 그림 9. 여러 Monascus 의배양시간에따른 GABA 생산 GABA 함량을측정한결과 monacolin K 와는다른양상을보였다. 즉다섯가지균주를대상으로 rice powder가포함된배지에서배양한결과 Monascus sp. SB1를제외한모든균주가 7 일째에서가장높은값을나타내었다

38 4. 템페시제품제조및 isoflavone 변화분석 1) 템페의제조 템페의제조는아래와같이하였다. 공정내용비고 1 원료세척콩과곡물을깨끗하게씻어불순물을제거 2 침지및산처리 3 껍질제거 4 증자 5 탈수 6 종균투입 7 배양 물의부피가콩부피의 3배되도록붇고빙초산약 12시간을넣어산처리하고산처리된물에침지물에불린콩의껍질을비벼제거하고물을넣효율적인껍어비중의차이로껍질을분리질제거필요껍질이제거된콩에서물을제거하고 110 에서 20분간증자하여콩을멸균콩표면에물기를제거하기위해오븐 (80 ) 에넣어약 2시간정도건조작업을실시곰팡이를콩 100g당포자 100만개정도접종해주고골고루퍼지도록잘혼합배양기 (37 ) 에서발효한후하얀색균사체형약 36시간성을육안으로확인한상태에서발효를종료 템페제조에는국산대두를이용하였다 ( 그림 10). 템페를제조한후발효과정에서일어나는 isoflavone의변화를 HPLC를이용하여분석한결과 ( 그림 11) 배당체의 isoflavone이발효과정에서비배당체로전환됨을확인할수있었다 ( 그림 12). 그림 10. 대두와 Rhizopus 를이용하여제조된템페및진공포장형태

39 대두 템페 그림 11. 대두및템페의이소플라본분석 A : daidzin(4.58 min), B : genistin(7.95 min), C : daidzein(15.90 min), D : genistein(23.83 min) 템페 콩 단위 : mg/g Daidzin Genistin Daidzein Genistein 그림 12. 발효에따른대두중의이소플라본의변화및함량 5. 선발균주의 monacolin K 생산최적화 홍국균은 Monacolin K와함께신장독소인 Citrinin도함께만들어낸다는연구결과들이밝혀지고있다. 이에 Monacolin K의함량은높고 Citrinin의함량이낮은홍국을만드는것은매우중요한일이라하겠다. 본연구에서는 1차년도선발균주의

40 생리활성물질생산성을토대로하여 Citrinin을생성이낮거나없는균주를선발하여 Monacolin K의함량이높은홍국기질및 nutrition factor, 배양조건을알아보고자하였다. 가 ) 재료및방법 (1) 균주 표 1 의분리균주 26 균주를사용하여실시하였다. (2) Regents 멥쌀과 DO powder는시중에서구입하였으며, yeast extract, Peptone, Maltose, Potato Dextrose Agar는 DIFCO, glycerol은 AMRESCO 제품을사용하였다. NaNO 3 는 Sigma, (NH 4) 2SO 4 는DUKSAN, Ethanol은 Merk에서각각구입하였다. Monacolin K, Citrinin 표준품은 Sigma, HPLC grade mobile phase는 J.T Baker 시료를사용하였으며 phosphoric acid는 JUNSEI, Trifluoroacetic acid는 FLUKA 에서구입하였다. (3) Screening of Monascus spp. 총 26균주중 MK 생산량이높으면서 Citrinin 생산이없거나적은균주를선별하기위해두차례에걸쳐예비실험을하였다. ( 가 ) agar배지에의한 1차균주선별 1.5% PDA에 3% rice power, 1% NaNO 3, 0.3% Ethanol을첨가한배지에 26균주를접종한후 14일간 30도에서배양하였다. 습도는 1일 ~7일 65%, 8일 ~14일은 80% 로유지하였다. 14일간배양후커터기로배지를잘게부순후 MK, Citrinin 검출을위한 HPLC 시료로사용하였다. ( 나 ) 고체배지에의한 2차균주선별 agar배지에서 1차선별된균주를고체배지접종, 최종균주를선별하였다. 시중에서구입한멥쌀을 15시간, 37도 incubator에서일야수침한후쌀을체에걸러서물기를제거하고 50g씩무게를달아유리 petri-dish(140mm*20mm.vol= 약 350ml) 에덜어낸다. 121도 30분증자하여충분히식힌각각의쌀배지에 5% spore suspension(2.5ml, 1*10 6 spore/ml) 을고루뿌려잘섞어준다. 여기에 50% nutrition factor (5.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS/25ml) 를첨가한후 1일 ~7일동안온도 30도, 습도 65% 로배양하고나머지 8일 ~21일동

41 안은온도 25도습도 80% 로배양하였다. 배양후 dry oven에서 80도, 60분간건조하여후드믹서로제분하여 MK 검출을위한 HPLC 시료로사용하였고나머지일부시료는수분함량측정시사용하였다. (4) Solid State Fermentation ( 가 ) Seed Culture 1.5% Potato Dextrose Agar에서 30도, 5~7일간배양된균주는 10% glycerol에침지하여 -70도저장하거나계대배양하여실험에사용하였다. ( 나 ) Solid Culture 시중에서구입한멥쌀을 15시간, 37도 incubator에서일야수침한후쌀을체에걸러서물기를제거하고 50g씩무게를달아유리 petri-dish(140mm*20mm.vol= 약 350ml) 에덜어낸다. 121도 30분증자하여충분히식힌각각의쌀배지에 50% nutrition factor (25ml, 배지중량의 50%) 와 5% spore suspension(2.5ml, 1*10 6 spore/ml) 을고루뿌려잘섞어준다. 28일간항온항습기에서습도와온도를달리하여배양한다. 배양후 dry oven에서 80도, 60분간건조하여후드믹서로제분하여 MK, Citrinin 검출을위한 HPLC 시료로사용하였고나머지일부시료는수분함량측정시사용하였다. Table 2. 고체배지의 nutrition factor 배지 No. 1 nutrition factor control (50g rice + 5% spore suspension(2.5ml,1*10 6 spore/ml) + 50% 멸균수 ) 2 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS 3 5.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS 4 7.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS % DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 7% glycerol 5.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 7% glycerol 7.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 7% glycerol

42 % DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 3% glycerol 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 5% glycerol Table 3. 항온항습기별배양온도및습도 항온항습기 No. 온도 습도 1 1~14일30도 /15~28일 25도 1~7일 65%/8~28일 75% 2 1~7일30도 /8일 ~28일 25도 1~7일 65%/8~28일 75% 3 1~7일30도 /8일 ~14일 25도15일 ~21 일 30도 /22일 ~28일 25도 1~7일 65%/8~28일 75% (5) HPLC Analysis of Monacolin K and Citrinin in RFR ( 가 ) Monacolin K (MK), Citrinin (CT) Extract 제분된시료 1g과 80% ethanol 9ml을혼합하여 150rpm, 30도 water bath에서 60 분간추출하였다. 4도, 2000rpm에서 20분간원심분리후 0.45μl PTFE 여과하여 HPLC 시료로사용하였다. ( 나 ) HPLC Analysis of Monacolin K in RFR 다이오닉스 HPLC system (C18 ODS Column) 을사용하여 acetonitrile :0.1% phosphoric acid water=65:35(v/v) 이동상으로 UV wave length 238nm에서 MK 함량을측정하였다. Flow rate는 1ml/min, Injection volume 10μl, Acquisition time은 40분이었다. ( 다 ) HPLC Analysis of Citrinin in RFR by UV detector 다이오닉스 HPLC system (C18 ODS Column) 을사용하여 acetonitrile :water:tfa=55:45:0.05(v/v) 이동상으로 UV wave length 330 nm에서 citrinin

43 함량을측정하였다 Flow rate는 1 ml/min, injection volume 10μl, acquisition time은 40분이었다. ( 라 ) HPLC Analysis of Citrinin in RFR by Fluorescence detector HPLC system (C18 Thermo Hypersil Gold Column) 을사용하여 Acetonitrile:Methanol:0.1% Phosphoric acid water=55:45:0.05(v/v) 이동상으로 Fluorescence wave length Ex 330nm/Em 500에서 Citrinin 함량을측정하였다. Flow rate는 0.6ml/min, Injection volume 20μl, Acquisition time은 30분이었다. Table 4. MK 및 Citrinin 의 HPLC 검출조건 검출조건 MK Ctrinin Ctrinin Column C18 ODS C18 ODS C18 Thermo Hypersil Gold Detector UV(238nm) UV(238nm) Fluorescence(Ex 330nm/Em 500) Mobile phase (Isogratic) Acetonitrile : 0.1% phosphoric acid water=65:35(v/v) Acetonitrile :water: Trifluoroacetic acid=55:45:0.05(v/v) Flow rate 1ml/min 1ml/min 0.6ml/min Injectionvolu me Acquisitionti me Acetonitrile:Methanol :0.1% phosphoric acid water=55:45:0.05(v/v) 10 μl 10 μl 20 μl 40min 40min 30min 나 ) Results and discussion (1) 균주선발 ( 가 ) agar배지에의한 1차균주선별결과 26균주중 UV detector와 Fluorescence detector(data not shown) 모두에서 Citrinin이검출되지않은균주는 Monascus ruber, A, RC1, I, J, U, V였으며, 이들 7균주중 MK 함량이비교적높은균주는 Monascus spp.rc1,i,j로각각 MK 함량이 0.028mg/g, 0.013mg/g, 0.016mg/g로나타났다. 또한 Monascus spp.rc2의경우 Citrinin은검출되었지만 MK함량이 0.024mg/g로 Monascus spp.rc1에이어높게검출되었다. 이러한결과를바탕으로 Monascus spp.rc2,rc1,i,j가 1차균주선별에서선택되

44 었으며, 이후고체배지에서의 2 차균주선별실험에사용되었다. 1,400 ct spike #2 0.1 mg/ml UV_VIS_1 mau WVL:330 nm 1 - ct , min ct spike #8 m.isolate71109/pren UV_VIS_1 mau WVL:330 nm ct min ct spike #18 m.d/pren UV_VIS_1 mau WVL:330 nm min Figure 13. agar배지에의한 1차균주선별실험에서 HPLC(UV detector) 에의한 Citrinin 표준품및고체시료의 Citrinin 검출결과 ( 나 ) 고체배지에의한 2 차균주선별결과

45 M K ( m g / g ) 차선별균주의 M K 생산량 B D I J M o n a s c u s s p p 고체배지에 nutrition factor와함께 Monascus spp.rc2,rc1,i,j를접종하여 21일간배양한후시료를건조, 분쇄하여 MK HPLC 분석하였다. 그결과는아래의그림에서와같이 Monascus spp. RC1의 MK 생산량이 6.107mg/g으로가장높았다. 이에이후의고체배양에서는 Monascus spp.rc1를접종, 실험에사용하기로하였다. RC2 RC1 Figure 차선별균주의고체배지에서 MK 생산량비교 (2) HPLC 에의한고체시료의 MK 검출 HPLC에의한고체시료의 MK검출은아래의그림과같다. 첫번째그림은활성형 MK 표준품으로 14.3초대에검출되었으며두번째그림은비활성형 MK표준품으로 8.2초대에검출되었다. 그다음아래의두그림은각기다른고체시료의 HPLC 분석결과를보여준다

46 3,000 mk (1~27+13,soxhlet)3 차 #2 mk 2.0mg/ml UV_VIS_1 mau WVL:238 nm 8 - mk ,000 1, mka min ,000 mk (1~27+13,soxhlet)3 차 #6 mka 1.6mg/ml UV_VIS_1 mau WVL:238 nm 4 - mka ,000 1, mk min ,600 mk (1~27+13,soxhlet)3 차 #22 13 UV_VIS_1 mau WVL:238 nm 4 - mka , mk min

47 배지조성 1~ 14일 30도, 15일 ~ 2 8일 25도 1~ 7일 30도, 8일 ~ 28일 25도 1~ 7일 30도, 8~ 14일 30도, 15 ~ 21일 25도, 22~ 28일 30도 1,200 mk (1~27+13,soxhlet)3 차 #30 21 UV_VIS_1 mau WVL:238 nm mka mk min Figure 15. HPLC 에의한활성, 비활성형 MK 표준품및고체시료의 MK 검출결과 (3) 고체배양시배양온도에따른 MK함량고체배지에 Monascus spp.rc1 접종후각각의 Nutrition factor(table 2) 를첨가하였다. 각각의 Nutrition factor를첨가한배지는동일한습도조건에서각기다른온도조건 (Table 3) 으로 28일간배양되었다. 28일후시료를건조, 분쇄하여 HPLC 로 MK 함량을측정하였으며결과는아래의그림과같다. Nutrition factor 6번과 8번, 11번을제외한나머지 Nutrition factor에서는 1~7일간 30도, 8일 ~28일 25도배양한고체배지의 MK함량이가장높은수준을보였다. 이때의습도는 1일 ~7일 65%, 8일 ~28일은 75% 유지하였다. 배양온도별 M o n as c u s s pp.d 의 M K 함량 MK(mg/g)

48 Figure 17. 동일습도에서의배양온도별 Monascus spp.rc1 의 MK 생산량비교 (4) 고체배양시 Nutrition factor에따른 MK함량고체배지에 Monascus spp.rc1 접종후각각의 Nutrition factor(table 2) 를첨가하였다. 온도는 1일 ~7일 30도, 8일 ~28일 25도로유지하였으며습도또한 1 일 ~7일 65%, 8일 ~28일 75% 로유지하였다. 배양 28일째시료를건조, 분쇄하여 HPLC로 MK 함량을측정하였으며그결과는아래의그림과같다. 배지성분을첨가하지않은대조군의 MK함량이 0.893mg/g인데반하여, 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS를첨가한고체배지의MK의함량이 mg/g이었으며, 3.0% DO powder + 0.3% ethanol + 1% YE + 1% SN + 1% AS + 3% peptone + 1% maltose + 3% glycerol을첨가한고체배지의 MK 함량은 mg/g로두배지모두약 2% 가량검출되었다. 배지조성별 Monascus spp.d 의 MK 생산량 M K(mg/ g) 배지조성 Figure 5. 동일습도및온도에서의 Monascus spp.rc1의배지조성별 MK 생산량비교 (5) 고찰 MK는 Monascus spp. 에의해생산되는 2차대사산물로서배양후기에발현되는특

49 징을가지고있다. 이러한특성은본연구에서볼수있듯이온도변화와밀접한관련이있다. 즉, Monascus spp. 의 MK 생산량을최대화하기위해서초기 7일간온도는 30도, 이후의배양온도를 25도로낮추어주었다. 초기설정온도는균사의성장을촉진하여균사량을충분히증가시키며, 이후온도를낮추어줌으로써균사의성장보다는 2차대사산물을만들어내는환경을조성해주었다. 또한, 기존여러연구에서밝혀졌듯이 MK 생산량은수분함량에크게영향을받는다. 배양기간동안일정한수분을공급하지않을경우배양후기로접어들면서점차기질의수분이공기중으로날아가게되고쌀등의기질이노화현상을일으켜 Monascus spp. 가기질을이용하지못하게된다. 이러한기질노화현상은배양기간동안일정한습도를유지해줌으로써감소시킬수있으며, 이는 MK생산량증가로이어진다. 이와함께다양한 Nutrition factor도 MK 생산에중요한요소로작용한다. 위의결과에서알수있듯이대조군의 MK생산량이 0.893mg/g인데비하여 Nutrition factor를첨가한경우21.967mg/g~22.299mg/g으로대조군의약 20배이상의 MK 를생산하였다. 특히 Monascus spp.rc1에의한 Nutrition factor의개별성분별 MK생산량은 3% Peptone, 1% NaNO3가각각 2.842mg/g, 2.084mg/g으로매우높은수준을보였고나머지Nutrition factor의 MK생산량은대조군과비슷한수준을보였다.(data is not shown) 이는 Nutrition factor가 MK 생산에있어서개별적인효과보다는함께첨가됨으로써시너지효과를나타내고있음을보여준다. 본실험을통해서홍국의MK, CT 생성능은균주에따라현저히다르며또한동일한균주라하더라도배양온도, Nutrition factor의조성이달라지면 MK, CT의생산량또한달라짐을알수있었다. 이에 Monascus spp. RC1는 MK 함량은높이고 CT 함량을최소화할수있는홍국을제조하기에적합한균주라사료된다. 아래의그림은 HPLC(UV detector) Citrinin 분석결과를보여준다. 첫번째그림은 Citrinin 표준품분석결과로 8.1초대에 peak가나타났고, 두번째그림은 Monascus 미동정균주의분석결과로동일한시간대에서 Citrinin 0.003mg/g 검출결과를보여준다. 마지막그림은 Monascus spp. RC1의분석결과로 Citrinin이검출되지않았다 6. 선발균주를이용한 starter 제조및홍국템페제조공정의개발 가 ) Monascus sp. SB1 Starter 제조및이를이용한콩의발효 현재분리된균주중콩을기질로하여발효하였을때 monacolin-k 생성능력이좋은 Monascus sp. SB1를분리하여사용하였다

50 안정적인발효를하기위해서열처리된콩에접종할 Starter의형태를결정하였다. 우선기존의방법대로 PDA에서 Monascus sp. SB1를순수분리한다음 PDB에접종하여포자수가 1.0E+4cfu/ml 가될때까지키운다. 스타터배양기간은약 1 주일소요되었고배양된스타터를간헐멸균 (105 1시간, 15시간방치후 121 1시간 ) 시킨 200g의콩에 2% 접종하였다. 접종후포자수와 monacolin-k의함량을비교해보았다 (Fig 18.). starter(pdb) Growth(spore) 3.E+05 3.E+05 2.E+05 2.E+05 1.E+05 5.E+04 0.E+00 포자수 M.K 0 일 5 일 10 일 15 일 20 일 25 일 30 일 35 일 40 일 monakolin-k (mg/kg Fig.18 PDB starter 를이용한발효 PDB starter를이용하여접종했을경우는균체의성장이빠르고 monacolin-k의함량도기준치이상으로높게나온것을관찰할수있었다. 그러나초기포자수기준접종량을결정하기어렵고수분이많아 Bacillus sp. 에의한오염이쉽게발생하기때문에 control의조건을맞추는것이어려웠다. 따라서초기접종량을늘리고재현성있게발효를하기위해서스타터를분말화시켰다. PDA에 1주일키운균체를회수하여동결건조시킨 Starter를 (1.0E+4cfu/g기준) 를준비하였고접종량도 2% 로동일하게배양하였다. 또한소량의멸균처리된콩에 PDB에서 1 주일배양된 Monascus sp. SB1를 1.0E+4 cfu/g까지배양시켰고콩에 2% 접종하여성장에따른포자수의변화와 monacolin k의양을측정하였다 (Fig 19., Fig 20.)

51 Starter(PDA powder) Growth(spore) 3.E+05 3.E+05 2.E+05 2.E+05 1.E+05 5.E+04 0.E 포자수 M.K 일 5일 10일 15일 20일 25일 30일 35일 40일 monakolin-k(mg/kg Fig 19. PDA 스타터분말을이용한발효 Starter(soybean powder) Growth(spore) 2.E+05 2.E+05 1.E+05 5.E+04 0.E+00 포자수 M.K 0 일 5 일 10 일 15 일 20 일 25 일 30 일 35 일 40 일 monakolin-k (mg/kg) Fig 20. Soybean 스타터를이용한발효 Fig 20. 에서는동결건조된발효콩을스타터로하여접종하였을경우초기성장속도가액상 PDB로접종하였을때보다느린것을확인할수있었고 Monascus 의성장이느려지면서본배양중인콩이 Bacillus sp. 에오염되어콩의일부가발효되지않는것을확인할수있었다. 이에따라 monacolin k의생산도 15일이후증가폭이낮아스타터로쓰기에는어렵다는것을확인할수있었다. Fig2. 에서는 PDA에서키운균체를분리하여동결시킨후접종하여본배양한결과로발효콩스타터보다는비교적오염이없이안정적으로포자를생성하고 monakolin k도 30일경과일까지도계속생산되는것을확인할수있었다. 위결과는 PDB를이용한액상스타터가가장활성이좋으며 monakolin k의생산성도좋다는것을보여주고있다. 그러나세가지결과를종합해볼때

52 Bacillus에의한오염이빈번하게일어나기때문에발효할콩의양과콩의전처리법개선이없이는재현성있는결과를얻기힘든것으로확인되었다. 따라서실험하기에앞서콩의전처리법에대해연구할필요가있었다. 나 ) 콩의전처리법에관한연구 A. 간헐멸균조건검색 콩의전처리조건을개선하기위해우선간헐멸균의온도및시간을변화시켜 Bacillus sp. 가얼마나사멸되었고배양기간동안에성장하는지를알아보았다 (Table5). Table 5 간헐멸균조건선별 1차멸균 2차멸균 Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day6 Day min min 121 1h h 105 1h h min control h h control h (-; 음성, +;200 개 /g 이하, ++; 2000 개 /g이하, +++;2000 개 /g 이상 ) 1차멸균후 15시간상온에서방치하여내생포자의발아를유도시킨후 2차멸균하는과정을 3회반복실험한결과를 Table 5에서보여주고있으며 2차멸균시 121 로처리해준콩을 30 에서총 7일간배양한결과 2일까지배양이이루어지지않았고모든시료들이 2일후에는 Bacillus sp. 의성장을확인하였다. 따라서간헐멸균법은콩을전처리하는방법으로적합하지않음을보여주고있다. B. 세척전처리콩의발효

53 콩을전처리하는조건중침지조건에서침지액의 ph를식초를이용하여 ph4.0으로맞춘후세척된콩에콩부피의 3배이상의침지액을넣고상온에서 1, 2, 4, 8, 16, 24 시간침지하며침지조건을최적화하였다. 다 ) 최적조건으로발효한콩을이용한기능성발효식품 Tempeh 제조 앞서실험한다양한조건을조합하여최적화조건을설정하였으며전처리조건을이용하여콩을발효하여기존에간헐살균하여홍국균으로발효시킨데이터와비교해본결과 Fig 21 에서 Monascus sp. SB1를접종하여포자수의증가를측정했을때 10일째 6.8E+4 개 /g와 Fig 22 의 10일째발효시점에서 1.0E+5 개 /g 의포자가관찰되었다. 이결과를볼때간헐살균한콩이 Bacillus sp. 에의해오염이되었기때문에 Monascus sp. SB1 가발효초기에우점균으로자리잡지못했다는것을보여주고있다. 이에반해본개발법은발효초기에우점균으로자리잡을수있는환경이만들어졌기때문에기존방법으로최적화시킨발효보다 5일이상포자의분열을촉진시켰다. 포자의분열및균체의성장과더불어 monacolin-k의생산속도도증가되었으며 35일 1670mg/kg 의 monacolin-k가생산된것을확인할수있었다. 따라서홍국템페를제조하기위해오염균에의한저해효과없이홍국발효콩을안정적으로생산하기위한조건을구축하였고 monacolin-k 함량이증가된홍국템페를제조할수있었다. starter(pdb) Growth(spore) 3.E+05 3.E+05 2.E+05 2.E+05 1.E+05 5.E+04 0.E+00 포자수 M.K 0 일 5 일 10 일 15 일 20 일 25 일 30 일 35 일 40 일 monakolin-k (mg/kg) Fig. 21 기존간헐멸균법으로전처리한콩발효

54 발효주정처리후멸균 growth(spore) 4.E+05 3.E+05 3.E+05 2.E+05 2.E+05 1.E+05 5.E+04 0.E+00 포자수 M.K 0 일 5 일 10 일 15 일 20 일 25 일 30 일 35 일 40 일 monakolin-k(mg/kg Fig. 22 최적조건으로전처리한콩발효 라 ) 홍국발효콩을이용한 Tempeh 의제조 1) Monascus와 Rhizopus 스타터를이용한혼합배양조건앞에서분리된 Monascus SB1와템페를제조할때쓰이는 Rhizopus oligosprorus의스타터를준비하기위해 Monascus는 PDB에서 2주간배양한것과 Rhizopus를 PDA배지에서 5일간키운것에서 0.8% NaCl용액으로포자만을취한후스타터로이용하였다. 멸균된콩에 Monascus 와 Rhizopus를각각 1.0E+4개 /g 취하여접종시켰다. 접종후 30 에서발효시킨결과 1주일도안돼서 Rhizopus의균사가콩에전체적으로퍼져서증식했기때문에 Monascus는더이상자라지못했다. 이러한문제를해결하기위해 Monascus를접종한후 monacolin K 의생산이정점에이르는 30일까지발효시킨후 Rhizopus를접종한결과증식하지못한것을확인하였으며홍국콩을 분멸균하여 Rhizopus를재접종한결과도마찬가지로증식하지못했다. 따라서홍국발효콩의탄소원과질소원등의영양성분이부족하여템페가만들어지지않는다는사실은확인하였고홍국발효콩에멸균된콩을 30%(w/w) 첨가하였다. Rhizopus oligosprorus 스타터를 1.0E+4개 /g 접종한결과 Rhizopus가증식하여홍국템페를제조할수있었다

55 2) 홍국 Tempeh 제조 Step 1 백태세척및침지 (ph 4.0, 20hr) Step 6 발효용기에삶은콩분주 Step 7 121, 1hr 멸균 (autoclave) 홍국발효콩제조완료 Fig. 23 홍국템페의제조공정도 Step 2 콩탈피 (95% 이상 ) Step 3 100, 1hr 끓임 Step 5 발효용기에삶은콩분주 Step 4 콩표면건조 ( 상온, 30min) Step 8 Monascus F 포자접종 (1.0E+4 개 /g, 2%) Step 9 30, 85%RH 35 일발효 멸균콩 30% 첨가 (step8 참조 ) Rhizopus oligosporus 스타터접종 30, 75%RH 60hr 배양 홍국템페제조완료

56 마 ) 결과요약콩발효식품의일종인 Tempeh 의경우인반대두가공품보다단백질함량이높아단백질보충원으로동남아시아에서주로섭취하고있다. 동물성단백질을대체할수있으며된장및청국장낫또등의콩기반발효식품과달리이미이취가적고오히려콩의풍미가개선되는효과를볼수있다. 게다가기능성물질인이소플라본과같은물질이항함활성이나콜레스테롤의체내축적방지, 칼슘흡수촉진및갱년기증상완화등의특성을가지고있기때문에세계적으로관심을가지는발효식품중하나로자리잡고있다. 템페와함께 Monascus sp. 를이용한홍국템페를제조하여홍국의기능성물질인 monacolin-k의생산성을증가시키고콩발효식품의풍미개선이나질감색상을개선시킬수있었다. Monascus SB2 Monascus SB3 Monascus SB1 Fig. 24 Monascus SB1, SB2, SB3 비교사진 ( 아래사진 1000 배확대 ) 우선한국, 일본, 중국에서수집한 26가지시료에서분리한 17종의 Monascus의 monacolin K 생산성을콩에서비교해본결과식약청기준 (500mg/kg) 에적합한균을 Monscus SB1, Monascus SB2, Monascus SB3 세가지로분리할수있었다. Monascus SB2와 SB3는 PDA에서자라는특성이비슷하고 monacolin-k 생산성이나 ctrinin 생산성이비슷하여같은균주임을확인할수있었기때문에실험에는 Monascus SB1, SB2 두종류를이용하여비교하였고본배양시 Monascus SB1가 citrinin을생성하지않기때문에스타터로이용하였다. 홍국템페를제조하기위해주원료인콩에서 Monascus와 Rhizopus 두가지균주의혼합배양을시도해본결과 Monascus의느린생장속도로홍국콩이되기전에템페가완성이되기때문에 Monascus를전배양한후 Rhizopus를추

57 가접종하여홍국템페를제조할수있었다. 제조시콩의전처리및멸균과정으로 Bacillus sp. 를포자까지제거시켜활성을억제시켜야하는데멸균이제대로되지않게되면발효되는중간에 Monascus와 Bacillus 두가지균이동시에자라게된다. 따라서오염이된부분은홍국콩이되지않으며홍국과 Bacillus균주가서로저해하면서생긴물질과콩이부패하면서생기는이미이취가강하기때문에제품화할수없었으며만약홍국콩이만들어졌다고할지라도 monacolin K의생산율의차이가심해재현성을확인할수없었다. 이문제를극복하기위해기존의간헐멸균방법을개선하였다. 기존의간헐멸균방식은 1차멸균후하루를방치하여재멸균하는방법으로시간이오래걸리고살균효율이좋지않았으며최적화된 70% 발효주정세척멸균법을이용하여살균한결과 B.subtilis를저해시킨것을확인할수있었다. 특히발효시간이 35일이기때문에중간에오염되는일이없어야하고초기에 Monascus가우점균으로성장해야하기때문에가장적합한멸균법으로본연구에사용하였다. 기존간헐멸균법에서오염되지않고균체가잘자랐을경우 35일째최대 1120mg/kg 의 monacolin-k가생성되었으며최적멸균조건으로멸균하고동일한조건으로발효시켰을때최대 1670mg/kg의 monacolin-k가생성되어오염균의활성억제가 Monascus의 monacolin-k 생산성과연관성이있다는것을확인하였다. 위조건으로발효된콩에 Rhizopus oligosporous를배양하기위해발효된콩에영양소보충원으로 30% 증자멸균된콩을첨가하여접종한후홍국템페를제조할수있었다 (Fig. 25). Monascus sp. SB1 Monascus sp. SB2 Fig. 25 Monascus SB1, SB2 를이용한홍국템페의제조시제품

58 바 ) 문제점해결및활용방안본연구를통하여분리개발한균주들의모나콜린생산성을 20 배이상증가시키고 Rhizopus와 Monascus을이용한템페, 홍국, 홍국템페등의제품생산기술을확립하였다. 앞으로도, 지속적인연구개발을통하여발효시간을단축시키고모나콜린생산대사등의대사속도를연구를수행하면좋을것이다. 최적화된생산조건을이용하여홍국발효콩자체로도동결건조를하거나열풍건조하여분발형태의기능성식품원료로사용될수있을것이며홍국템페의경우진공포장을하여튀김이나잡곡밥에넣을수있는형태또는레토르트제품등에적용시켜상품화할수있을것이다. 7. Tempeh, 대두, 홍국 tempeh 시제품섭취에따른생리변화 가 ) 식이섭취량 실험동물의식이섭취량은고혈압군에서다소낮은경향을보였으나통계적인유의성은나타나지않음 ( 표 6) 대두와 tempeh를섭취한군에서대조군보다섭취량이적음 표 6. 식이섭취량 (g) group 1wk 2wk 3wk CC 16.5 ± 0.6 a 18.6 ± 0.9 a 17.0 ± 0.4 a CB 9.8 ± 0.4 cd 11.3 ± 0.6 cd 15.0 ± 0.9 ab CT 9.0 ± 0.7 d 9.7 ± 0.7 cd 13.6 ± 0.6 b CM 15.3 ± 0.6 ab 17.6 ± 0.7 ab 14.8 ± 0.5 ab HC 13.2 ± 0.9 b 12.3 ± 0.9 cd 14.9 ± 0.6 ab HB 8.4 ± 0.5 d 8.8 ± 0.6 d 12.3 ± 0.7 b HT 9.6 ± 0.4 cd 8.2 ± 0.7 d 11.8 ± 0.5 b HM 12.8 ± 0.5 bc 13.7 ± 0.6 bc 13.3 ± 0.5 b CC; 정상혈압대조군, CB; 정상혈압대두군, CT; 정상혈압템페군, CM; 정상혈압홍국군, HC; 고혈압대조군, HB; 고혈압대두군, CT; 고혈압템페군, HM; 고혈압홍국군 a, b; means with different superscripts are significantly different at P<

59 나 ) 체중 실험기간에실험군별체중을보면대두, 템페, 홍국쌀군이모두대조군에비해체중이적었음 ( 표 7) 표 7. 체중 group 1wk 2wk 3wk 4wk CC 128 ± 4 n.s 180 ± 5 a 224 ± 7 a 269 ± 8 a CB 126 ± ± 2 bc 163 ± 4 c 204 ± 7 c CT 127 ± ± 1 c 165 ± 3 c 214 ± 6 bc CM 132 ± ± 5 a 225 ± 6 a 209 ± 4 bc HC 123 ± ± 7 abc 198 ±14 b 246 ±12 a HB 127 ± ± 4 c 158 ± 4 c 194 ± 6 c HT 131 ± ± 6 abc 172 ± 7 c 207 ± 6 bc HM 125 ± ± 5 ab 213 ± 8 ab 203 ± 6 c 다 ) 혈압 실험기간에실험군별혈압의변화를보면 10% fructose를첨가한물을 ad libitum으로공급받은 HC, HB, HT, HM군이 CC, CB, CT, CM군에비해혈압이높았으며대두, 템페, 홍국쌀군이모두대조군에비해혈압이낮아짐을볼수있었음 ( 그림26). 혈압강하효과는대두와홍국쌀군에서더현저하였음 CC CB CT CM HC HB HT HM 그림 26. 혈압의변화

60 라 ) 혈장무기질농도 실험기간에실험군별혈장의무기질농도는표 8 에서와같음 표 8. 혈장무기질농도 group Na Mg P K Ca CC CB 2.49 ± 0.30 abc 3.09 ± 0.20 ab 19.1 ± 2.5 NS 22.2 ± ± 14.6 NS 90.0 ± ± 29 ab 288 ± 20 a 130 ± 14 NS 142 ± 15 CT 3.17 ± 0.08 a 23.4 ± ± ± 15 a 138 ± 7 CM 2.79 ± 0.13 abc 21.6 ± ± ± 11 ab 123 ± 4 HC 2.58 ± 0.19 abc 18.3 ± ± ± 16 ab 106 ± 9 HB 2.41 ± 0.18 abc 18.5 ± ± ± 11 ab 101 ± 8 HT 2.13 ± 0.15 bc 18.5 ± ± ± 19 ab 87 ± 8 HM 2.04 ± 0.13 c 17.4 ± ± ± 12 b 127 ± 19 마 ) 무기질배설 대변과소변을통한 Na, Mg, P, K, Ca 배설량은표 9, 표 10 과같음 표 9. 소변중무기질배설량 group Na Mg P K Ca CC CB 11.2 ± 2.0 ab 10.9 ± 0.8 ab 1.05 ± 0.38 c 7.35 ± 0.78 a 2.82 ± 0.77 b 0.18 ± 0.03 c 28.5 ± 3.5 b 83.6 ± 8.5 a 0.67 ± 0.21 b 5.78 ± 0.65 a CT 8.4 ± 1.8 ab 5.90 ± 0.51 a 0.64 ± 0.43 c 47.4 ± 5.2 b 2.92 ± 1.17 ab CM 16.5 ± 1.8 a 2.00 ± 0.58 bc 4.14 ± 1.09 ab 46.4 ± 4.4 b 0.94 ± 0.33 ab HC 10.4 ± 1.8 ab 2.38 ± 0.62 bc 0.78 ± 0.24 c 29.7 ± 4.3 b 2.60 ± 1.55 ab HB 7.6 ± 2.5 ab 4.88 ± 0.77 ab 0.84 ± 0.62 c 54.5 ± 6.9 ab 3.29 ± 1.25 ab HT 5.7 ± 1.4 b 4.48 ± 0.56 ab 0.66 ± 0.35 c 30.2 ± 5.7 b 1.47 ± 0.56 ab HM 13.2 ± 1.3 ab 2.06 ± 0.30 bc 4.87 ± 0.53 a 36.3 ± 3.5 b 0.58 ± 0.06 b

61 표 10. 대변중무기질배설량 group Na Mg P K Ca CC CB 489 ± 60 NS 643 ± ± 2.3 b 46.0 ± 2.8 a 18.3 ± 4.3 b 38.8 ± 4.0 a 98.0 ± 10.6 NS ± ± 32 NS 196 ± 18 CT 504 ± ± 4.8 b 3.8 ± 2.1 b 83.2 ± ± 20 CM 493 ± ± 2.9 ab 16.8 ± 2.8 b 71.9 ± ± 26 HC 369 ± ± 2.8 b 8.6 ± 4.7 b 39.9 ± ± 25 HB 329 ± ± 1.8 b 13.0 ± 2.6 b 45.6 ± ± 29 HT 335 ± ± 4.3 b 3.0 ± 1.8 b 61.2 ± ±143 HM 539 ± ± 2.4 b 11.6 ± 1.4 b 71.1 ± ± 43 마 ) 혈장 GABA 농도 혈장의 GABA 농도는대두와템페군에서대조군에비해높은경향을보였음 ( 그림 27) 1000 cd a abc ab a bc de e CC CB CT CM HC HB HT HM 그림 27. 혈장 GABA 농도

62 8. Rhizopus oligosporus 발효제품이골밀도및골강도에미치는영향 : 난소절제흰쥐와성장기흰쥐를대상으로한동물실험 가 ) 개요우리나라는전통적으로콩발효식품인된장, 청국장, 고추장을섭취하고있다. 된장과청국장은 Bacillus sp. 와 Aspergillus sp. 에의한발효로특유의냄새와향을가지며, 일본의낫또는 Bacillus natto에의한발효제품으로청국장에비해이취는적으나점액질의균사체를형성한다. 반면인도네시아의템페 (tempeh) 는 Rhizopus oligosporus에의한발효제품으로흰케익모양의균사체를형성하며이취가거의없고무취에가깝다. 콩을발효시키면콩의생리활성물질인이소플라본은비배당체에서배당체로전환되어장에서의흡수와생체이용률이증진된다. 또한이소플라본은에스트로겐호르몬과유사한구조를가지므로에스트로겐호르몬수용체와결합하며에스트로겐의활성을갖는것으로알려지며, 폐경기여성의에스트로겐결핍으로인한골다공증의예방과진행억제에도효과가있을것으로알려져있다. 그러므로 Rhizopus에의한대두발효제품인템페가골밀도에미치는영향이있는지를알고자하여흰쥐를대상으로실험을하였다. 나 ) 방법 : 난소절제한암컷쥐를대상으로템페를 6주간급여하였으며, 템페섭취의영향이연령에따른차이가있는지를알고자하여실험하였다. 실험동물은 Sprague-Dawley종 15주령의암컷흰쥐 40마리와 7주령의암컷흰쥐 32마리였으며 15주령의암컷흰쥐는난소절제수술, sham수술, 그리고수술을하지않는대조군으로나누어수술하였으며식이는 AIN-93M 식이를기본으로하여단백질급원으로대두또는템페를넣은 iso-caloric, iso-protein 식이를사용하였다 ( 표 11). 따라서실험군은크게나이든쥐 (old rats) 와어린쥐 (young rats) 으로나누었으며실험식이에따라대조군 (control), 대두군 (bean), 템페군 (tempeh) 으로하여 OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet) 군으로분류하였다. 사육실은온도 23±1, 상대습도 65±5% 인환경에서 12시간의낮과밤주기로조절하였다. 실험결과는 SPSS-12 package를이용하여분석하였다

63 표 11. 식이조성 1 Ingredients(g/kg) control bean tempeh Corn starch Sucrose Cellulose Casein bean tempeh L-cystine Corn oil Mineral mixture Vitamin mixture Choline butylhydroquine bean과 tempeh는건조시켜분말화한제품임 Mineral mixture provides calcium carbonate, 12.5 g: sodium chloride, 2.59 g: potassium citrate, 2.48 g: potassium phosphate, 6.86 g: potassium sulfate, 1.63 g: magnesium oxide, 0.85 g: manganous carbonate 0.02 g: ferric citrate, 0.21 g: zinc carbonate, 0.06 g: cupric carbonate, 0.01 g: potassium iodate, g: sodium selenite, g: chromium potassium sulfate, 0.01 g: ammonium paramolybdate, g: sodium meta-silicate, 0.05 g: libitium chloride, g: boric acid, g: sodium flouride, g: nickel carbonate, g: ammonium vanadate, g: sucrose finely powdered, 7.73 g. Vitamin mixture provides thiamin HCl, g: riboflavin, g: pyridoxine HCl, g: nicotinic acid, 0.03 g: calcium pantothenate, g: folic acid, g: D-biotin, g: vitamin B 12, g: vitamin A palmitate, g: DL-alpha tocopheryl, 0.15 g: vitamin D g: vitamin K, g: sucrose finely ground, 9.75 g. 실험동물을 6주간사육후단두로희생시켜서경동맥에서혈액을채취하였으며채취한혈액에서 estradiol의 % bound를분석하였다. 또한양쪽대퇴부에서대퇴골을해부하여근육을제외하였으며대퇴골의골밀도와골강도를측정하였다. 골밀도는동물용 Dual X-ray densitometer(model pdexa Sabrem., Norland Co., Sweden) 를사용하였으며골강도는 Model TA-HDi, MHK trading Co., Japan) 을사용하여 pre-speed 2mm/s, test-speed 0.05mm/s, distance 1.0mm의조건에서 breaking force를측정하였다. 다 ) 결과및토의 : 1) 식이섭취량및체중 식이섭취량은난소절제의영향이나타나서난소절제한실험동물이대조군에

64 비해유의적으로많았다 ( 표 12). 그러므로체중증가량의경우에서도 OSC군이 OOC군에비해유의적으로적었다. 식이효율은대두와템페를섭취한 OOB와 OOT군에서 OOC군에비해유의적으로낮았다. 이는본실험실에서의다른실험결과와동일한결과이다. 어린쥐의경우에서도대두와템페식이는식욕을억제하여식이섭취량이적었을뿐만아니라식이효율도낮았다. 또한실험종료시의체중도낮았다. 표 12. 식이섭취량및체중 1 Group Initial Body weight(g) Final Body weight(g) Food Intake(g/week) FER OOC ± 5.7 NS ± 16.0 b ± 22.8 b 0.09 ± 0.02 c OOB ± ± 7.2 b ± 15.9 ab 0.04 ± 0.01 a OOT ± ± 39.1 b ± 27.4 ab 0.04 ± 0.01 ab OSC ± ± 5.9 a ± 19.2 ab 0.08 ± 0.01 bc OCC ± ± 7.0 a ± 16.0 a 0.08 ± 0.02 bc YSC ± 2.3 NS ± 6.5 b ± 15.8 b 0.12 ± 0.01 NS YC ± ± 5.8 ab ± 13.5 ab 0.11 ± 0.01 YB ± ± 5.6 a ± 72.4 a 0.10 ± 0.01 YT ± ± 9.1 ab ± 35.3 ab 0.11 ± Values are means±sem. Values in a column with different superscripts in the same age groups are significantly different (p<0.05) as assessed by one-way ANOVA and the Duncan's multiple range test. NS; not significant. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet). 2) 자궁무게및혈중에스트로겐호르몬농도 자궁의무게는난소절제한동물이 0.11~0.28g이었는데반하여난소절제를하지않은대조군은 0.46~0.90g로차이가있었다 ( 표 13, 그림 28). OSC군과 OCC군의경우평균자궁무게는 0.603g과 0.596g 이었으나난소절제를한 OOC군은 0.227g, OOB군은 0.143g, OOT군은 0.329g으로유의적으로적었다. 즉, 난소절제

65 수술은잘되었음을확인할수있었다. 혈중 estradiol의함량도역시자궁무게와비슷한경향을나타내었다. 그러나템페식이의경우 OOT 군이난소절제를하지않은 OSC, OCC 군의 serum estradiol 함량과거의비슷하여템페식이를하면여성호르몬인에스트로겐의생산을자극함을알수있었다. 그러나대두식이의경우에서는비슷한효과를나타내지않아발효여부에따른차이를알수있었다. 콩은영양적가치뿐만아니라피틴산, 트립신저해제, 이소플라본, 사포닌, 식이섬유, 올리고당등의다양한기능성물질이존재하는것으로알려져있다. 콩의생리활성물질인이소플라본은식물계에광범위하게존재하는 diphenol 화합물로서배당체형태인 genistin, daidzin, glycitin과비배당체형태인 genistein, daidzein, glycitein 등의형태로존재한다. 대두에들어있는이소플라본은대부분배당체형태로존재하며이는비배당체인 aglycone 형태에비해체내이용률이낮다고알려져있다. 식품으로배당체의이소플라본을섭취하면섭취후장관의효소인 glucosidase에의해비배당체로전환되어체내로흡수되어들어가지만, 대두를발효시키면대부분의이소플라본이비배당체형태로전환되고생리활성이증가한다. 그러므로본결과와관련하여보면대두의발효여부는인체의생체이용성에중요한작용을함을알수있다. 이소플라본은에스트로겐호르몬과그구조와역할이비슷하여 phytoestrogen 이라고불리기도한다. 이소플라본이에스트로겐과구조적으로유사하며두물질이공유한 phenol 고리가중요한역할을하는것으로알려진다. 구조적인유사성때문에이소플라본은에스트로겐수용체 (estrogen receptor; ER) 에대한결합력이높아서이소플라본의생리적효능에관련된연구들은에스트로겐호르몬과관련하여많이이루어지고있다. 에스트로겐수용체는뇌에서시상하부, 뇌하수체, 해마등에서많이발견되며, 이수용체는에스트로겐에의해활성화되면신경전달물질을합성한다고알려진다. 이소플라본의복강내주입시뇌의이소플라본농도는증가하였다고한다. 또한 phytoestrogen를강화시킨그룹에서 medial basal hypothalamus 내의 daidzein과 genistein 농도가더높았으므로뇌에이소플라본이존재하며에스트로겐호르몬의활동과관련하여중요한역할을할것으로짐작된다

66 표 13. 자궁무게와혈중에스트로겐호르몬농도 1 Group uterus weight (g) serum estradiol (% bound) OOC ± 0.07 b 2880 ± 948 OOB ± 0.01 b 2107 ± 480 OOT ± 0.11 b 4372 ± 1232 OSC ± 0.06 a 4256 ± 1035 OCC ± 0.06 a 3434 ± 675 YSC ± ± 1658 b YC ± ± 534 b YB ± ± 1370 b YT ± ± 1805 a 1 Values are means±sem. Values in a column with different superscripts in the same age groups are significantly different (p<0.05) as assessed by one-way ANOVA and the Duncan's multiple range test. NS; not significant. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet) estradiol (ml/pg) estradiol (ml/pg) OOC OOB OOT OSC OCC 0 YSC YC YB YT 그림 28. 혈중 estradiol 농도 Bars represent means±sem. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet)

67 3. 골밀도및골강도 6주간의사육후난소절제한대조군과난소절제한대두섭취군에서골밀도 (bone mineral density; BMD) 가 sham수술을한대조군이나 sham수술을하지않은대조군에비해유의적으로낮았다 ( 표 14, 그림 29). 그러나템페를섭취한난소절제군에서는 sham수술대조군과 sham수술을하지않은대조군에유의적인차이가나타나지않았다. 골질량 (bone mineral content; BMC) 의경우에난소절제한대두군에서 sham수술을한대조군이나 sham수술을하지않은대조군에비해유의적으로낮았다. 골면적 (bone area) 의경우에는실험군간차이가없었다. 여러가지변인들의상관관계를살펴본결과자궁의크기는골밀도및골질량과양의상관관계를보였으며식이의종류는 estradiol호르몬과매우유의적인관계를나타내었다. 이러한상관관계는성장기흰쥐에서는나타나지않았다. 따라서대두와템페는여성호르몬에관여함을알수있었다. 본실험의결과로미루어볼때템페의섭취는난소절제흰쥐에서여성호르몬에관여하여골밀도를높이는효과를보이므로폐경기여성에게서흔한골다공증의예방및치료효과가있을것으로제안된다. 표 14. 골밀도 Group bone mineral density (g/ cm2 ) bone mineral content (g) area ( cm2 ) OOC 0.195±0.002 abc 0.392±0.009 a 2.00±0.38 OOB 0.188±0.003 c 0.365±0.005 b 1.95±0.41 OOT 0.195±0.003 bc 0.386±0.009 a 1.98±0.26 OSC 0.202±0.003 ab 0.395±0.004 a 1.96±0.27 OCC 0.203±0.003 a 0.390±0.006 a 1.92±0.20 YSC 0.181± ± ±0.28 a YC 0.179± ± ±0.23 b YB 0.179± ± ±0.21 ab YT 0.177± ± ±0.28 ab 1 Values are means±sem. Values in a column with different superscripts in the same age groups are significantly different (p<0.05) as assessed by one-way ANOVA and the Duncan's multiple range test. NS; not significant. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet)

68 BMD (g/cm²) BMD (g/cm²) OOC OOB OOT OSC OCC YSC YC YB YT 그림 29. 골밀도 Bars represent means±sem. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet). 골강도의경우에서는난소절제한실험동물인 OOC군에서 sham 수술한 OSC군이나 OCC군에비해골강도가낮았다 ( 표 15, 그림 30). 그러나대두와템페식이를섭취한 OOB와 OOT군의경우골강도가증가하는경향을보여평균의경우에서는 OSC군에근접한결과를나타내었다. 이러한결과는위의골밀도와함께살펴볼때폐경이후의여성에게대두는골대사에유익한효과가있을뿐만아니라발효시킨대두의경우더욱효과적임을입증하였다고본다. 성장기흰쥐의경우에서는대두가골강도에는별다른효과가나타나지않았다. 표 15. 골강도 Group bone breaking force(g) OOC ± 596 OOB ± 449 OOT ± 616 OSC ± 361 OCC ± 459 YSC ± 579 YC ± 474 YB ± 215 YT ± Values are means±sem. Values in a column with different superscripts in the same age groups are significantly different (p<0.05) as assessed by one-way ANOVA and the Duncan's multiple range test. NS; not significant

69 Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet) BBS (g) BBS (g) OOC OOB OOT OSC OCC YSC YC YB YT 그림 30. 골강도 Bars represent means±sem. Abbreviations: OOC(old ovariectomized control diet), OOB(old ovariectomized bean diet), OOT(old ovariectomized tempeh diet), OSC(old sham-operated control diet), OCC(old non-operated control diet), YSC(young sham-operated control diet), YC(young control diet), YB(young bean diet), YT(young tempeh diet). 라 ) 결론 : 대두와대두에 Rhizopus oligosporus 를접종하여발효시킨템페제품은식이섭취량을감소시키고체중증가를다소억제하는효과가있음을알수있었다. 대두의구성성분인이소플라본은에스트로겐호르몬과구조적으로유사하여대두와템페의섭취는혈중 estradiol의농도를증가시키는역할을함을알수있었으며그러한작용은대두보다는대부를발효시켰을때더뚜렷하였다. 난소절제수술을한폐경모델의흰쥐에서골밀도가감소하였는데, 이러한결과는템페식이의섭취가골밀도를증진시키는작용을함을나타내었다. 골밀도와함께골강도의경우에서도비슷한경향을나타내었으므로템페식이는골대사를증진시키는역할을함을알수있었다. 9. Rhizopus oligosporus 발효제품과 Monascus starter 제품에대한기호성 가 ) 개요 : 우리나라전통식품인청국장은 Bacillus sp. 에의한발효로청국장특유의냄새와점질물을형성하고있으며, 된장은 Bacillus sp. 와 Aspergillus sp. 에의한

70 발효로발효시에오랜숙성기간을필요로하여대기중의여러미생물의작용에의해가정마다향미가약간씩다른특징이있다. 일본낫또 (natto) 는 Bacillus natto 에의한발효제품으로청국장에비해이취는적으나점액질의균사체를형성한다. 반면 Rhizopus oligosporus 에의한발효제품은흰케익모양의균사체를형성하며이취가거의없고무취에가깝다. 세계여러지역에서콩의발효식품을식용으로하는데특히인도네시아의경우에는 Rhizopus 에의한대두제품으로템페를만들어서주식에가깝게다량섭취하고있는실정이며발효기간이 2-3일정도로짧아서가정에서쉽게만들고있고가정에서템페를제조할수있도록기업체에서종균을공급하기도한다. Monascus속의홍국균은현재약 20종, 균주로서약 70종류가분리동정되어있고균의종류에따라생물활성에차이가있다. 붉은색소를생산하는홍국균은주로중국남부나대만에서약 600년전부터술, 두부, 어육제품의착색제나보존제로서식품에이용되어왔다. 本草綱目 에는홍국의약효로消食活血 健脾燥胃 ( 소화를도와혈액의흐름을도움 내장을강하게하여위를상쾌하게함 ) 작용이있는것으로기재되어있다. 또한홍국의약리효능이입증된것으로는콜레스테롤생합성억제작용, 항균효과, 암예방효과, 혈압강하효과등이있다. 홍국균의대사산물중에 monacolin K는혈중지질을저하시키고 catalase 활성을증가시켜서 H 2 O 2 와같은활성산소에의한동맥경화증을예방하는것으로알려져있다. 현재한국인의식사패턴은연령층에따라매우다른데, 우리나라의전통적인콩발효식품인청국장과된장은최근그기능성에관하여많은연구가이루어지고우수성이밝혀지고있으나, 젊은연령층의기호에적합하지않아세계적인글로벌식품으로부각되기에는한계가있다. 청국장, 된장등전통장류식품의독특한냄새가신세대들의기호를감소시키는요인이된다. 대두를 Rhizopus oligosporus 균에발효시키면생산하는효소의활성으로단백질과지방의분해가이루어져대두식품보다소화흡수가잘된다. 그러므로대두의발효제품인청국장과템페를삶은대두를대조군으로하여관능평가하고자한다. 나 ) 방법 : 삶은대두, Rhizopus oligosporus 균에발효시킨템페, Bacillus sp. 에의한발효제품인청국장, 템페에 Monascus starter를접종한홍국템페의 4가지시료를준비하였다. 이들시료는기본적으로삶은대두를이용하였으며단지접종시킨균의종류만달리하여발효시킨제품들로구성하였으므로시료별식품특성은거의유사하였다. 그러므로관능적인평가항목은색깔, 맛, 향, 질감의 4가지와

71 전반적인기호도로구성하였다. 국민대학교에재학중인남녀대학생 241명 ( 남자 170명, 여자 71명 ) 을대상으로관능평가하였다. 관능평가에사용한재료인삶은콩, 템페, 청국장, 홍국접종한템페는약간찧어서 5cm 직경의두께 0.5cm 둥근모양으로만들어서되도록기름을적게두르고후라이팬에서익혔다. 이를접시에담아관능평가에사용하였다. 관능검사를하기전에평가항목에대한사전교육을실시하였다. 시식하는순서는한개의시료를먹고그시료에대한평가를적은다음반드시생수로입안을깨끗이헹구고수초가지난다음에다른시료를시식하고평가하도록하였다. 관능검사는전체적인기호도와색깔, 향, 맛, 질감등 4가지항목에대하여매우좋다 (5점), 좋다 (4점), 그저그렇다 (3점), 싫다 (2점), 매우싫다 (1점) 의 5점척도로평가하였으며점수화하였다. 이를남녀별비교하였다. 다 ) 결과및토의 : 전반적인기호도는남자에비해여자가낮은현상을보였다 ( 그림 31, 그림 32). 여자의경우색깔에대한평가는청국장이가장낮았으며향에대한평가에서도시료중평가점수가가장낮았다. 청국장다음으로홍국템페가낮았으며템페가그다음이었다. 맛의평가에서는색, 향, 질감과같은다른항목에비해서절대적인기호도가모든시료에서다낮았다. 질감의평가에서는네가지시료가거의비슷한기호를나타내었다. 그러므로전반적인기호도에서청국장이가장낮은점수를보였으며홍국템페, 템페, 삶은콩의순서로기호도가증가하였다. 따라서템페의경우모든관능평가항목에서청국장보다는기호도가높았다. 남자의경우전반적으로여자와평가항목별비슷한경향을나타내었다. 색깔에대한평가는청국장이가장낮았으며나머지세가지의시료에서는기호도가거의비슷하였다. 향에대한평가에서도청국장이시료중평가점수가가장낮았으며홍국템페가청국장과비슷한점수를보였다. 맛의평가에서는색, 향, 질감과같은다른항목에비해서절대적인기호도가모든시료에서다낮았다. 질감의평가에서는네가지시료가거의비슷한기호를나타내었으며평가점수가높은편이어서질감은다른평가항목에비해서이들시료가만족스러운것으로평가되었다. 전반적인기호도에서는여자와는다소달랐는데, 청국장과홍국템페, 템페가거의비슷하였다. 그러므로템테는색이나, 맛, 향, 질감등모든면에서청국장보다는높은기호도를나타내었다

72 여성 색향맛질감기호도 그림 31. 여자의관능평가 삶은콩템페청국장홍국, 템페 남성 색향맛질감기호도 그림 32. 남자의관능평가 삶은콩템페청국장홍국, 템페 라 ) 결론 : 대두와대두에 Rhizopus oligosporus를접종하여발효시킨템페제품및템페에 Monascus starter를접종한홍국템페그리고 Bacillus sp. 에의한발효제품인청국장등 4가지의제품을관능평가한결과템페는청국장보다색, 향, 맛, 질감의평가항목에서높은점수를보였으며전반적인기호도도높았다. 홍국템페의경우템페에비해모든항목에서다소낮은평균점수를나타내었다. 그러나청국장보다는관능평가점수가높으므로적절하게제품화한다면템페의생리활성뿐만아니라홍국의기능성을함께얻을수있어서좋을것으로생각된다. 템페에이취가없고냄새가없다는점이청국장과낫또에비해이점이므로적절

73 한조리방법의탐구와함께식사로활용방안을모색할필요가있다고제안된다

74 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 사업년도 1차년도 2005 연구내용 비율 세부내용 목표달성율 Monascus 균주분리 20종이상의 Monascus 10 % 100% 및확보 sp. 확보 Citrinin, monacolin Bioassay 및 HPLC에의 K, GABA, isoflavone 20 % 100% 한정량분석법개발분석법확립 건기식기준 (citrinin 50 μg Citrinin 저생산, / kg이하, monacolin K 0.5 monacolin K 고생산 20 % 100% g/kg 이상 ) 을생산할수있균주확보는 Monascus sp. 확보 Tempeh 시제품의동물모델을이용한생리기능성평가 50 % 동물실험에서시제품의적정섭취수준의결정여부 100 시제품의섭취가성장발달 100 에미치는영향조사 시제품의혈중콜레스테롤수준개선의생리기능조사 100 시제품의혈압강하생리기 100 능조사 시제품의체내무기질이 100 용성영향

75 2차년도 2006 M o n a s c u s 와 Rhizopus의 혼합배양 40 % 조건의확립 스케일업조건확립 30 % Tempeh 제품의특성 평가및기호도와관 능평가 30 % 균주의생육조건조사 100% Monascus 이용 tempeh적 100% 용연구 혼합배양조건연구 100% 대량생산용스타터생산 100% 공정개발 스타터균주적용 100% 스타터생산조건연구 100% 시제품생산 100% 시제품의관능검사에참여 100 하는대상의적절성 시제품에대한설문조사 100 방법과절차의적절성 통계처리의타당성

76 제 5 장 연구개발결과의활용계획 1. 추가연구의필요성본연구를통하여분리개발한균주들의모나콜린생산성을 20 배이상증가시키고 Rhizopus와 Monascus을이용한템페, 홍국, 홍국템페등의제품생산기술을확립하였다. 앞으로도, 지속적인연구개발을통하여발효시간을단축시키고모나콜린생산대사등의대사속도를연구를수행하면좋을것이다. 또한제품의특성을살리기위해 2가지이상의 Monascus균을혼합배양하여 Monascus SB1에대한색소, 풍미및조직감등을더욱개선시키면좋을것이다.. 최적화된생산조건을이용하여홍국발효콩자체로도동결건조를하거나열풍건조하여분발형태의기능성식품원료로사용될수있을것이며홍국템페의경우진공포장을하여튀김이나잡곡밥에넣을수있는형태또는레토르트제품등에적용시켜상품화할수있을것이다. 2. 활용방안및사업화계획 1. 활용방안가. 대두발효식품을성인병예방 ( 골다공증, 암, 치매, 심장병, 고혈압등순환계질환, 갱년기장애 ) 용건강기능식품으로활용나. 기능성식품의소재로활용 : 발효제품을분말화하여다양한건강기능식품에첨가제로활용 2. 사업화계획가. 개발된기술에대한특허권을확보하고기술이전을통하여로얄티수입나. 소규모단위의제조기술을개발하여영농조합법인이나영세조합에기술보급다. ( 주 ) 비피도에서완제품을조리가용이하도록포장하고다양한조리법을개발하여템페전문점등의프랜차이즈사업을통하여건강기능식품보급확대

77 제 6 장정보 연구개발과정에서수집한해외과학기술 콩의생리활성성분및기능성 이소플라본 : 인체의여성호르몬인에스트로젠과유사한작용을하여항암효과, 유방암과전립선암등에예방효과가높은것으로알려짐. 골다공증예방효과 : 미국의경우골다공증환자가 2,800만명에이르러치료비가연간 140억달러에달함. 우리나라의경우도골다공증환자가 300만명, 골다공증위험군에속하는사람은 600만명정도인것으로추정됨. 사포닌 : 친수성기와소수성기를모두가지고있는양친성분자-콜레스테롤저하작용, 면역증강작용및항암작용이보고됨. 대두올리고당 : raffinose와 stachyose 와같은올리고당이함유되어있는데, 이들올리고당은인체소화효소에의해분해되지않기때문에저칼로리당이며, 장내미생물중특히비피더스균과같은인체유익균의생육을촉진하기때문에변비예방과같은정장작용을함. 대두펩티드 : 대두에존재하는단백질을화학적또는생물학적으로분해하여생산하는물질로간장과된장등대두발효식품에함유됨. 항종양효과와혈압강하활성그리고혈청콜레스테롤수치를감소시키는효과를갖는다. 최근라면에첨가하기도하여기능성소재로알려지고있다. 기타 : 대두를발효시키게되면제품내단당류, 이당류, 아미노산, 에탄올, 젖산및비타민 B 1,B 2 가강화되어영양가치를높일수있다. 또한항암작용이있는트립신저해제, 식이섬유, 피틴산, 레시틴, 식물성스테롤등의유용생리활성물질이존재한다. 이들물질은분리정제되어의약품이나식품의소재또는기능성식품으로판매되고있는실정이다. 마. 외국템페제품현황 제조국 : Canada 제조회사 : Light life foods 특징 : original tempeh로잘게부숴서 salad나 potato 위에올려먹을수있는용도로개발된상품

78 제조국 : Canada 제조회사 : Light life foods 특징 : barley( 보리 ), rice( 쌀 ), millet( 수수 ) 3가지곡식을콩과함께섞어발효 제조국 : U.S.A 제조회사 : Rhapsody natural foods 특징 : original tempeh로다양한음식에섞어먹을수있게만듬