3. 새싹땅콩추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정성조사 <2 세부 > 1. 세포수준에서새싹땅콩추출물이지방세포증식과분화억제실험 2. 식이로유발된비만동물모델에서새싹땅콩추출물섭취가체중증가와지방조직축적을억제실험 3. 과체중과비만한사람들을대상으로새싹땅콩추출물을섭취하였을때체중조절

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아진 기
5 years ago
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1 [ 별첨 1] 연구개발보고서초록 과제명 ( 국문 ) 새싹땅콩추출물 (Peanutsproutextracts) 을이용한건강기능식품개발 ( 영문 )Developmentofhealthfunctionalfoodusingpeanutsproutextracts 주관연구기관전남대학교 ( 소속 ) 전남대학교주관연구책임자참여기업농업법인 ( 주 ) 장수채 ( 성명 ) 은종방 계 640,020 천원총연구기간 ~ (3 년 ) 총연구개발비 정부출연 연구개발비 480,000 천원 총인원 17 명 (640,020 천원 ) 총참여기업부담금 160,020 천원내부인원 5명연구원수 연구기관부담금외부인원 12 명 연구개발목표및내용 연구개발목표 새싹땅콩추출물 (Peanutsproutextracts) 을이용한건강기능식품개발 - 새싹땅콩을이용한건강기능식품개발을위하여새싹땅콩추출물의추출방법개발및그의기능성식품의제조와새싹땅콩추출물과라스베라트롤의분말화기술을개발하고그의함량을측정하여기능성을조사하고새싹땅콩추출물및레스베라트롤캡슐을개발하여건강기능식품을개발하는것을목적으로함. - 새싹땅콩추출물의비만억제효과와그작용기전을 Invitro,Invivo, 임상실험을 통하여종합적으로관찰하여새싹땅콩추출물을비만조절건강기능식품소재로개발하는것을목적으 로함. - 레스베라톨을함유하고있는새싹땅콩을이용하여새로운항염증제를개발하고자한다. 본연구에서는세포배양법, 아토피피부염의동물모델을이용한전임상동물실험, 아토피피부염환자를대상으로하는임상시험을체계적으로수행하여아토피피부염의새로운국소도포제 ( 연고제, 습포제, 팩제 ) 로개발하여임상에사용함을최종목표로함. 연구개발내용 <1 세부 > 1. 새싹땅콩추출물의추출방법개발및특성조사 2. 새싹땅콩추출물분말및레스베라트롤정제기술개발

2 3. 새싹땅콩추출물및레스베라트롤의캡슐제조및저장안정성조사 <2 세부 > 1. 세포수준에서새싹땅콩추출물이지방세포증식과분화억제실험 2. 식이로유발된비만동물모델에서새싹땅콩추출물섭취가체중증가와지방조직축적을억제실험 3. 과체중과비만한사람들을대상으로새싹땅콩추출물을섭취하였을때체중조절효과실험 <3 세부 > 1. 비만세포를이용한아토피피부염모델개발및새싹땅콩추출물의항염증효능검증 2. 아토피피부염동물모델개발및새싹땅콩추출물의항염증효능검증 3. 아토피피부염환자에서새싹땅콩추출물의항염증효능검증임상시험 연구결과 <1 세부과제 > 본연구는땅콩새싹으로부터레스베라크롤의최적추출조건을확립하고가공소재로활용하기위하여분무건조에의한분말제조시최적공정을검토하였다. 땅콩새싹의용매추출시레스베라트롤함량은추출용매를에탄올로이용하였을때 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구에서 4.67ug/g 으로가장높은함량을나타내었다. 땅콩새싹추출물의페놀성화합물들을정량한결과,80 에서 120 분동한추출한 ethanol 추출물의 catechin galate (CG), epicatechin galate (ECG), epigalocatechin (EGC),epicatechin (EC) 함량은각각 28.7±0.46,72.9±0.56,19.5±0.46,55.6±0.51ug/g 로나타났다. 추출온도 60 에서 90 분간추출한 ethanol 추출물의비타민 C 함량은 502mg/100g 으로가장높게나타났으며, 땅콩새싹추출물의항균활성중그함양성균인 Bacilus cereus,listeria monocytogenes 는 ethanol 추출물에서유의적으로높은항균활성을나타내었고, Staphylococcus aureus 는열수추출물에서가장높은항균활성을나타내었다. 그람음성균인 Escherichia coli 는 ethanol 추출물에높은항균활성을나타내었다. 땅콩새싹추출물의열풍건조시 50,60,65 에서의레스베라트롤함량은각각 3.76,3.62,3.41ug/g 으로 50 열풍건조시 10 시간건조시킨시료가가장높은레스베라트롤함량을나타내었다. 또한, 동결건조시 4.48ug/g 의함량을나타내어열풍건조시료보다레스베라트롤함량이약간높았다. 땅콩새싹추출물의용매분획별 (n-hexane,chcl3,etoac,buoh,h2o) 레스베라트롤함량을측정한결과각각 1.06,0.7,5.95,2.45,1.11ug/g 으로조사되어레스베라트롤함량이가장높은것은 EtOAc 의 8번분획물이었다. 레스베라트롤의순도를높이기위한정제에서,silica gel 흡착제를사용한분획물이 ug/g( 순도 :70%) 로가장높은레스베라트롤함량을나타내었고,sephadex 흡착제를사용한 12 번분획물은 20.2ug/g( 순도 :63%) 이었다. 또한, 이를기능성식품소재로이용하기위해분무건조를실시하였는데, 이때 inletair 온도 (90,120,150 ) 와 maltodextrin 첨가량 (1,3,5%,w/w) 을달리하여분말을제조한결과, 건조온도 120 에서 maltodextrin5% 첨가처리구에서레스베라트롤함량이가장높게나타났다. 또한땅콩새싹에탄올추출물및 silicagelcolumnchromatography 를이용하여정제한것으로부터제조한분무건조분말의레스베라트롤함량은 6.48 과 64.7 ug/g 으로조사되었으며,silica gel columnchromatography 로정제한것이에탄올추출물에비해약 10 배가량높은레스베라트롤함량을나타내었다. 정제하여제조한분말의수분흡수지수는건조온도 120 처리구가 maltodextrin 첨가량에따라서 87.78,88.78,85.27% 로조사되었으며, 수분용해지수는 93.99,92.52,91.41% 로각각조사되었다. 페놀성화합물들을측정한결과 CG,EGC,protocatechuicacid,galicacid,ferulicacid 함량은 120 C 의건조온도에서 maltodextrin5% 첨가한처리구가가장높게나타났다. 또한향균활성, 항산화활성등을비교하였을시 120 C 의건조온도에서 maltodextrin5% 첨가한처리구가가장높은활성을나타내었다. 이상의결과로부터땅콩새싹추출물을제조하기위한최적공정은추출용매 ethanol 을이용하여 1:10(w/v) 비율로 60 에서 90 분동안추출한처리구가가장높은레스베라트롤함량을나타내었으며, 이추출물의순도를높이기위하여분획후 silicagelcolumnchromatography 를이용하여정제시순도 70% 의레스베라트롤을획득할수있었으며, 분무건조시 120 의온도에서 5% maltodextrin 첨가한처리구가유용물질함량에있어서가장우수한결과를나타내었다. 앞으로, 땅콩새싹으로부터레스

3 베라트롤을추출하여산업화하기위해서는그순도를더욱더높이기위한연구가더필요하리라생각 된다. <1 협동과제 > -1차년도의연구결과는 resveratrol 은지방세포에서지방세포의증식과분화지표들과분화와관련있는전사인자들의발현을억제하는효과가있었음.Resveratrol 을함유하고있는땅콩새싹추출물도지방세포의증식과분화지표들을억제하고 MMP 활성을억제하는효과가있었음. - 2차년도에는실험동물에게고지방식이를섭취시키면서땅콩새싹추출물을추출물에함유되어있는 resveratrol 함량을기준으로 1일 0,15,30 mg/kg 으로구강으로섭취시킨결과 resveretrol 함량을 30mg/kg/ 일섭취한 RS30 군에서체중과체지방량이감소하는경향이확인되었음. 혈액과간, 지방조직내지방성분이땅콩새싹추출물섭취시감소하는경향을보였으며, 변으로의배설을증가하는경향이었음. 지방조직에서땅콩새싹추출물섭취시지방분화와관련있는전사인자인 PPARγ 와 FABP4 의단백질발현은감소하고, 항염증인자로알려져있는 adiponectin 의발현은증가하는경향이었음, 또한혈액에서 MMP 활성은감소하는경향이었음. - 3차년도에과체중이상이여성을대상으로땅콩새싹추출물을함유된 resveratrol 함량을기준으로 250mg/ 일섭취하는저용량군과 500mg/ 일로섭취하는고용량군으로하여 4주간섭취시킨결과땅콩새싹추출물의섭취는체중조절에효과가있는것으로나타났음. 뇨와혈액성분에서땅콩새싹추출물의섭취는인체에는부작용을나타내지않았음. <2 세부과제 > Peanutsprout 은 resveratrol 을많이함유하고있으며, 우리몸의 antioxidant 활성을높여준다고알려져있다. 본연구에서는땅콩새싹추출물 (ethanolextractofpeanutsprouts,reps) 에대한항염증과항산화작용을 invitro 와 invivo 에서연구하였다. 1차년도에는 in vitro( 세포 ) 에서아토피피부염모델개발및 REPS 의항염증효능을검증하였다. 먼저 REPS 내에포함된 resveratro 의함량을알아보기위하여 trans-resveratrol 을표준물질로사용하여 HPLC 로정량검사한결과,REPS 내에 resveratrol 이 54.2μg/g 이포함되어있음을알수있었다. 아토피피부염과관련된피부세포 Human Epidermal keratinocytes ( 각질형성세포, HEKs) 와 Human DermalFibroblasts( 섬유모세포,HDFs) 를사용하여 MTT assay 를통하여 REPS 에대한세포안정성을확인하였으며, 아토피피부염의병인에중요한그람양성균인 Stapylococcus.aureus(S.aureus) 의 extracts 를피부세포에처리한후 REPS 의항염증효과를분석하였다. 아토피피부염염증과관련된 targetcytokine 을결정하기위한예비실험으로아토피피부염환자의혈청을분리하여염증성사이토카인에대한 ELISA 분석결과, IL-5 으로결정하였으며그이외에도염증의중요지표인 cycloxygenase-2 (COX-2) 와 matrix metaloproteinase-9 (MMP-9) 를주요지표로사용하였다.S. aureus 의 extracts 를처리한결과 interleukin-5(il-5),cox-2 및 MMP-9 의 mrna 와단백발현이현저히증가되었으며,REPS 를처리시이들의발현은현저히감소하여피부세포에서 REPS 의항염증작용을증명하였다. 2차년도에는아토피피부염동물모델개발및땅콩새싹추출물의항염증효능을검증하였다. 아토피성피부염유발은 1% DPCP (Diphenylcyclopropenone)100 μl를 hairless 마우스등전체에일주일동안매일도포하여감작시킨후일주일뒤부터 0.5% DPCP 100 μl를 hairless 마우스의등표면에 5주간이틀간격으로도포하면서 REPS 연고를 DPCP 도포 7시간후에마우스의등표면에도포하였다.DPCP 만도포한그룹과 DPCP 와 REPS 을함께도포한마우스그룹에대해육안관찰후피부염증평가, 조직학적분석법인 H & E stain,real-timert-pcr 그리고 Westernblot 분석을통해항염증과항산화효소에대한분석을하였다.0.5% DPCP 를도포한후 2주부터피부가심하게피부염이유발되었으나, DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹의마우스등에서는피부가건조하기는했으나피부염의유도가억제됨을확인하였다.DPCP 도포군, 대조군그리고 DPCP 와 REPS 연고를함께도포한군에대한피부염증평가결과홍반에대한중증도평가는각각 2.8±0.4 그리고 2.4±0.5 이었으며, 인설에서는 2.8±0.4 그리고 1.7±0.8 로평가되었다. 태선화스코어는각각 2.8±0.4 그리고 2.0±0.7 로평가되었다. 이는 DPCP 도포군그리고 DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹간의홍반, 인설그리고태선화의중증

4 도평가에서모두통계적유의함을나타냈다. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 REPS 에대한염증성사이토카인 (IL-5 와 INF-γ)mRNA 발현에대한 real-timepcr 결과 DPCP 를처리한그룹에서는 IL-5mRNA 의발현이증가하였으며, 반대로 IFN-γ 의발현은감소되었다.DPCP+REPS 를함께도포한그룹에서는 IL-5 의발현은억제되었으나 IFN-γ 의발현은약간증가됨을확인할수있었다. 아토피피부염이유도된마우스피부조직에서 REPS 에대한염증성단백 COX-2 과항산화효소의발현을 Western blot 분석으로확인한결과,DPCP 처리한그룹에서는 COX-2 의발현이증가하였으며, DPCP+REPS 를함께도포한그룹에서는 COX-2 의발현이현저히억제되었다. 이는 REPS 가항염증효과가있음을확인한결과이다. 또한아토피피부염이유도된마우스피부조직에서항산화효소인 catalase (CAT),glutathione peroxidase (GPx) 및 peroxiredoxin I(Prx I) 에대한발현을 Western blot 분석으로확인하였다.DPCP 를도포하여아토피피부염이유도된마우스피부조직에서는항산화효소의발현이억제되어있었다.DPCP 와 REPS 연고를함께도포한그룹간항산화효소발현을비교한결과 CAT,GPx 그리고 Prx I에대한발현이 DPCP 마우스그룹에비해 REPS 연고를바른그룹의마우스피부조직에서발현이증가되어있었다. 3차년도에는아토피피부염환자에서 5% REPS 연고제및 2.5% REPS 팩제의항염증효능검증임상시험및 REPS 의항산화효능평가를하였다.REPS 의임상시험상, 건강한사람에서 REPS 에대한안정성검사를한결과특별한부작용이나타나지않았다. 아토피피부염환자에서도피부자극이나염증, 감염등의특별한부작용은호소하지않았다. 아토피환자에 REPS 에대한임상시험결과는 REPS 연고도포 4주후에홍반, 태선화병변의호전을보였다.REPS 연고및팩제모두가아토피피부염의환자에서항염증작용을보여피부증상이호전되는결과를보였으며특히팩제가더우수한효능을보였다. 이는대조군인기제만도포한부위에비하여통계적으로의의있는차이를보여향후부작용이없는아토피피부염의새로운도포제로개발이기대되었다.REPS 의항염증작용과관련하여항산화효과여부룰알아보기위하여 HDF 에서자외선 UVB 조사에의한산화적손상에대한피부세포보호기능을알아보기위한추가실험을시행하였다.FACS 검사상,UVB 조사를받은 HDF 의세포사 (apoptotic celdeath) 가 20±4.5% 로정상세포 (4±1.5%) 에비하여현저히증가되었으나 REPS 처리한 HDF 에서는 7±2.5% 로 REPS 가강한세포보호기능이있음을알수있었다. 세포보호기능과관련하여 reactive oxygenspecies(ros) 에대한콘포칼현미경검사상 (DCF-DA 염색 ) 정상 HDF 에서는관찰되지않았던 ROS- 양성형광이 UVB 조사시강하게관찰되었으나 REPS 를처리한 HDF 세포에서는거의관찰되지않았다.DCF-DA 에대한 FACS 검사상에서도정상 HDF (100±25%) 의 ROS 양이 UVB 조사에의하여현저히증가되었으나 (2150±450%),REPS 를처리한 HDF 에서는 180±42% 를보여 REPS 가강한항산화능을가지고있음을알수있었다. 항산화제의발현검사상,REPS 를처리한 HDF 에서항산화제인 heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase-1 (NQO-1), glutathione-s-transferase pi(gstpi),manganase superoxide dismutase (MnSOD) 의발현이정상 HDF 에비하여현저히발현이증가되어있음을알수있었다. 또한이들의발현에중요한전사인자인 Nrf-2 의발현도 REPS 처리에의하여발현유도됨을알수있었다. 이상의결과 REPS 가강한항산화능을보이며이는이에포함된높은함량의 resveratrol 에기인하리라추정되었다. 결론적으로,REPS 가세포실험, 동물실험및인체실험에서아토피피부염에서항염증작용이있음을증명할수있었으며이는 REPS 에함유되어있는비교적높은함량의레스베라트롤에기인하리라추정되었다. 본연구결과를이용하여인체에안전하며경제성이뛰어난아토피피부염의치료제로개발할수있는근거를제공하였다.

5 연구성과활용실적및계획 본연구에서밝혀진땅콩새싹으로부터추출된레스베라트롤의효능및활성물질에대하여더욱깊이있는연구가필요하리라생각된다. 다른질병이나, 실험모델에적용시켜추가적인생리활성효과에대해연구해볼필요사있다. 본연구과제로부터얻은땅콩새싹추출물및레스베라트롤은특허출원및등록을진행하고있으며이후기능성소재로의기술이전과홍보를위해서는전임상및임상실험을통한식품의약품안전청으로부터건강기능식품의기능성원료로개별인정획득이필요하리라생각된다. 본연구에서진행된약리및생리활성물징의효능과이를이용한가공식품소재화는기술의의존도가높은무공해산업으로향후국내산업에서중요한역할을담당하게될것으로에상된다. 특히제조공정상하나의시설로다양한제품의생산이가능하고공정이비교적단순하기때문에소량다품종생산특성을가질수있다. 건강관리가필요한중장년층을대상으로기능성식품의개발을통하여기호식품화를하거나기능 성화장품의원료및본실험에서밝혀진바와같이아토피나비만예방용기호식품으로활용이가능 하리라생각된다. 세포실험에서는 resveratrol 은지방세포에서지방세포의증식과분화지표들과분화와관련있는전사인자들의발현을억제하는효과가있으며 resveratrol 을함유하고있는땅콩새싹추출물도지방세포의증식과분화지표들을억제하고 MMP 활성을억제하는효과가있음을확인하였다. 그리고본연구결과는특허를신청하고, 국내외저명학술지에발표할계획이다. 땅콩새싹추출물 (REPS) 은세포의아토피피부염모델에서염증성사이토카인그리고염증성단백질의발현을억제시켜아토피피부염을완화시키는항염증효능이있으며, 땅콩새싹추출물 (REPS) 은세포에서산화적스트레스에의해생성되는활성산소 (ROS) 를제거함으로써세포를보호하는항산화효능이있음이조사되었다. 특히해독화효소인 PhaesⅡ 효소들의발현을높게함으로써염증반응및암효능에도좋을것으로사료됨에따라향루다음과같은연구가필요하리라생각된다. 항산화효능이뛰어난땅콩새삭추출물을천가한새로운아토피피부염개선제의개발 : 피부도포제의개발 항산화효능이뛰어난땅콩새싹추출물을첨가한새로운자외선차단제의개발 피부흡수및보습효능을극대화하기위한피부전달시스템개발 : 피부팩제품개발

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,