23(2)-04(최성숙).fm

Size: px

Start display at page:

Download "23(2)-04(최성숙).fm"

영철 강
6 years ago
Views:

1 J. Fd Hyg. Safety Vl. 23, N. 2, pp. 121~128 (2008) Jurnal f Fd Hygiene and Safety Available nline at Real-time PCR 을이용한원유시료유래황색포도상구균의신속검출 정재혁 정순영 1 이상진 1 최성숙 * 삼육대학교약학대학, 1 삼육대학교과학기술대학동물과학부 SYBR Green I-based Real-time PCR Assay and Melting Curve Analysis fr Rapid Detectin f Staphylcccus aureus frm Raw Milks Samples Jae-Hyuk Jung, Sn-Yung Jeng 1, Sang-Jin Lee 1, and Sung-Sk Chi* Schl f Pharmacy, Sahmyk University, Seul, Krea, 1 Divisin f Animal Science, Sahmyk University, Seul, Krea (Received May 6, 2008/Accepted June 16, 2008) ABSTRACT The aim f this study was t develp a LightCycler-based real time PCR (LC-PCR) assay and t evaluate its diagnstic use fr the detectin f Staphylcccus aureus in raw milk samples. Fllwing amplificatin f 113 bp f ca gene encding an cagulase precursr specific fr Staphylcccus aureus, melting curve and DNA sequencing analysis was perfrmed t verify the specificity f the PCR prducts. Amplificatin f 209 bp gene encding an altered penicillin-binding prtein, PBP2a (meca), melting curve analysis and DNA sequencing analysis was perfrmed t verify methicillin resistance Staphylcccus aureus (MRSA). Accrding t this study, 6 f 647 raw milk samples shwed S. aureus psitive and 2 f them shwed a meca psitive and the detectin limit was 10 fg f DNA. And we als islated Staphylcccus chrmgenes a causative agent f exudative epidermitis in pigs and cattle frm 3 samples. Key wrds : Real time PCR, ca, Melting curve, meca 서론 고도의산업화사회와빠른경제성장은우리식생활양식에많은변화를주었다. 두드러진식생활변화중하나는우유를포함한축산식품소비의급증이라할수있다. 그러나무역시장의개방등에따라국내축산업계에더많은어려움이있고우유소비의둔화와생산과잉으로인한원유의수급불균형은낙농가를더욱어렵게만들고있는실정이다. 또한국제교역이활발해지고식품의공 1) 급이세계화되면서각나라마다자국의산업보호차원에서식품안전을활용하게되었다. 국제식품규격위원회 (CODEX) 에서는 WTO 체제하에서객관적이고과학적인식품안전관리의방법으로위해분석 (risk analysis) 을제시하였다. 위해분석은위해를측정하고위해의영향인자 2,3) 를찾는위해평가 (risk assessment), 위해를조절하기위한전략을발전시키고실행시키는위해관리 (risk management), *Crrespndence t: Sung-Sk Chi, Schl f Pharmacy, Sahmyk University, Seul, Krea Tel: , Fax: sschi@syu.ac.kr 이해관계가있는사람들사이에서위해에대해정보를교환하는위해정보교류 (risk cmmunicatin) 로구성된다. 이러한국제적흐름속에서미생물위해관리의중요성은더욱높아졌으며미국과유럽에서축적한식중독이나관련질환들의자료들을토대로더욱정교하고세분화된미생물위해평가가가능하게되었다. 1999년국제식품규격위원회의식품위생분과위원회에서는 미생물의위해평가의원칙과지침 이라는보고서를채택하였다 4). 이에따르면위험요소확인, 위험요소특성분성노출량평가위해특성분석으로구분하고있다. 식품유래유해미생물중하나인황색포도상구균은그람양성구균으로혈장응고효소인 cagulase를생산하며여러가지감염증을일으키는균으로알려져있다 5). 포도상구균은세계각국에서식중독의원인균으로알려져있으며우리나라에서도서구화되는식단에따라식중독원인균의 3위를차지하고있다 6). 따라서본연구에서는식중독원인균인황색포도상구균을원유시료에서신속정확하게검출하고자 duble strand DNA에선택적결합을하는 SYBR Green I을이용한 realtime PCR기법을이용하고자하였다. 중합효소반응 (PCR) 은 1985년처음소개된방법으로서핵산검출에있어서매우 121

2 122 Jae-Hyuk Jeng, Sn-Yung Jeng, Sang-Jin Lee, and Sung-Sk Chi 민감하고특이적이어서분자생물학, 기초및응용생물학, 의학등전분야에서혁명적인진단을가능하게하였다. 그 7) 러나기존의 PCR법은단지증폭된 DNA의크기에기초하여분석하며, 그분석한계도최소한 1ng 이상의 DNA가있어야가능한것으로알려져있다. 또한일단 PCR 반응이끝난후전기영동을실시하여증폭된 DNA band를확인하여야하므로 PCR 및전기영동에만최소 3시간이상의시간이소요되는것으로알려져있다. 그러나 Real-time PCR 기법은미량의 DNA만있어도확인이가능하며 (>1 fg) PCR 반응도중에도증폭되는과정을실시간으로확인이가능하므로증폭하는 DNA의크기에따라 30분정도에도확인을할수있는신속한기법이다. 또한증폭된 DNA의크기에기초한분석이아니고증폭된 DNA 조각의 Tm 값에근거한분석이므로 DNA band 크기에기초한분석기법보다 specificity나 sensitivity가월등히우수한진단기법이다. 따라서본연구에서는원유시료속에존재하는 8-11) 황색포도상구균의검출을보다신속, 정확하게하고자 realtime PCR 기법을이용하여분자수준에서종을확인하고자 ca (cagulase precursr) 유전자에특이적인 primer를 12,13) 디자인하여신속정확하게황색포도상구균을검출하는기법을개발하고자하였다. 또한원유에서분리된황색포도상구균을대상으로항생제에대한위해평가를시도해보고자하였다. 그목표항생제로동물용항생제로사료등에첨가되는페니실린계항생제의일종인 methicillin을선택하였다. 포도상구균의감염증의경우그치료에페니실린계 14) 항생제가사용되어왔다. 그러나페니실린의빈번한사용에따라내성이생기고그에따라 methicillin이치료효과를거두어왔으나지속적인항생제의사용으로오늘날 methicillin에내성인황색포도상구균 (Methicillin Rsistance Staphylcccus aureus, MRSA) 의증가가문제가되고있다. MRSA 는전세계적으로항생제내성균의대표적인 15) 표상이되고있으며이러한균의발견은최근집단적사육환경에서점차증가되고있는것으로보고되고있다. MRSA의검출에는일반적으로 PBP2a를 cding하는 methicillin 내성유전자인 meca 유전자의존재로확인하 며 16,17) 따라서본연구에서는 meca 유전자를확인하기위한 primer를제작하여 real-time PCR을이용하여신속하게 meca 유전자검출을통한 MRSA검출도하고자하였다. 따라서본연구에서는시장개방현실속에우리축산농가의우유실태를조사하여식품위해인자중하나인식중독의원인균으로알려진황색포도상구균의검출방법으로서보다신속하고정확한 real-time PCR 기법을제시하고자한다. 재료및방법 사용균주및배지본실험에는원유시료에서분리된 6 종의 Staphylcccus aureus 균주, 3종의 Staphylcccus chrmgenes, 품질관리를위한표준균으로 Staphylcccus aureus ATCC 6538P, Staphylcccus epidermidis ATCC 및 MRSA 양성대조균으로 Staphylcccus aureus CCARM 3697 ( 항생제내성균주은행분양 ) 을사용하였으며황색포도상구균의분리에는선택배지인 Staphylcccus medium 110 (Difc) 를그외의배양에는 Nutrient brth (Difc) 및 Muller-Hintn 배지 (Difc) 를사용하였다. 황색포도상구균 (Staphylcccus aureus) 의분리및동정 2007년 12월부터 2008년 3월에걸쳐경기북부지역젖소사육농가 15곳으로부터 647개의원유시료를공급받아본실험사용하였으며착유시알코올소독을실시하여 2차감염의기회를최소화하였다. 수집한원유는잘혼화후멸균한면봉으로 Staphylcccus medium 110 (Difc) 에원유시료를도말후 37 C에서 48시간배양하였다. 배양후 형성된집락중포도상구균특유의모양을나타내는황색의집락을순수배양후임상검사센터인세강 ( 서울 ) 에의뢰하여생화학적실험을통한균동정을실시하였다. 항생제감수성검사분리된황색포도상구균을대상으로 Oxacillin (Sigma C. St. Luis MO, USA) 에대한감수성검사를실시하였다. 본실험에는양성대조균 S. aureus CCARM 3697을, 음성대조균으로는 S. aureus ATCC 6538P를사용하였다. 감수성실험은 Clinical Labratry Standards Institute (CLSI, USA) 의고체배지희석법으로실시하였으며배지는 Muller- Hintn 배지 (4% NaCl 함유 ) (Difc) 를사용하였다. 실험 18) 에사용한균주를 37 C, 17시간전배양한후, 이균을 10 CFU/ml 되도록희석한후 5ml씩항생제배지에접종 5 하여배양하고균주의성장을확인할수없는가장낮은 xacillin 농도를최소억제농도로결정하였다. 황색포도상구균의 genmic DNA 분리 PCR반응을하기위해원유시료에서분리한균주로부터 genmic DNA를 GeneAll Cell SV kit( 진올바이오테크놀로지, 서울 ) 을이용하여분리하였으며황색포도상구균의세포벽의분해를용이하게하기위하여 lysstaphin (Sigma C. MO. USA) 을 50 ml (100 mg/ml) 를첨가하였다. Real-time PCR analysis f ca gene 원유시료에서분리된균주중황색포도상구균특유의집락을보이는균주를분자수준에서확인하기위하여종특이적 (species specific) 유전자인 ca (cagualse precursr) 12,13) 유전자의존재를확인하기위하여 SYBR Green-I 을이용한 realtime PCR을실시하였다. ca 검출을위한 primer는 Sigma-Prlig (The Wdlands, TX, USA) 사에서제작하여

3 Real-time PCR assay fr Rapid Detectin f Staphylcccus aureus 123 실험에사용하였으며 primer sequence는 Table 1에나타내었다. PCR 반응은 capillary tube (LightCycler instrument, Rche Diagnstic) 에 20 µl 반응액을기준으로 113 bp의 ca특이유전자를다음과같은조건에서증폭하였다. 2 µl 의 LightCycler FastStart DNA master mix fr SYBR Green I (Rche Diagnstc), 0.5 µm 의각각의 primer (ca F, ca R), 2.4 µl 4 mm MgCl 2, 2 µl의 DNA를혼합하여총 20 µl로 capillary에분취후마개를닫은후 500 g 에서 30초간 spin-dwn후 Rche LightCycler를이용하여반응을실시하였다. 95 C, 10분간 plymerase 활성화를실시한후, 45회반복반응 (95 C 10초, 58 C 10초, 72 C 7초 ) 하 여목적 DNA를증폭하였다. 이때 temperature transitin rate는 20 C/s였고증폭된 DNA는 SYBR Green I의결합 으로특유의형광을발하게되어이형광의발생정도를 LightCycler sftware v. 4.5로분석하였다. Melting curve 분석은위증폭과정후즉시다음과같은조건으로실시하였다. 첫번째단계는 95 C 0s (hld time), 두번째단계는 65 C 15s, 세번째단계는 95 C 0s (hld time) 로하였 으며온도변화율은 20 C/s이었고마지막 3번째단계만 0.1 C/s로하였다. 이때얻어지는 melting peak는증폭된 DNA의 GC% 에따라특이적으로나타난다. Real-time PCR analysis f meca gene 원유시료에서분리된황색포도상구균중 xacillin 에저항성을나타내는균에서 meca 유전자의 15,16) 존재를확인하기위하여 SYBR Green-I을이용한 realtime PCR을실시하였다. meca검출을위한 primer는 Sigma-Prlig (The Wdlands, TX, USA) 사에서제작하여사용하였으며 primer sequence는 Table 1에나타내었다. PCR 반응은 primer mecaf와 mecar를사용하여 209 bp의 meca 특이유전자를 capillary tube (LightCycler instrument, Rche Diagnstic) 에 20 µl 반응액을기준으로다음과같은조건으로증폭하였다. 2 µl의 LightCycler FastStart DNA mastermix fr SYBR Green I (Rche Diagnstc), 0.5 µm 의각각의 primer, 4 mm MgCl µl, 2 µl의 DNA를혼합하여총 20 µl로 capillary에분취후마개를닫은후 500 g에서 30초간 spin-dwn후 Rche LightCycler를이용하여반응을실시하였다. 95 C, 10분간 plymerase 활성 화를실시한후, 45회반복반응 (95 C 10초, 55 CC 10초, 72 C 10초 ) 하여목적 DNA를증폭하였다. 이때 temperature transitin rate는 20 C/s였고증폭된 DNA는 SYBR Green I의결합으로특유의형광을발하게되어이형광의발생정도를 LightCycler sftware v. 4.5로분석하였다. Melting curve 분석은위증폭과정후즉시다음과같은조건으로실시하였다 ; 첫번째단계는 95 C 0s (hld time), 두번째단계는 65 C 15s, 세번째단계는 95 C 0s (hld time) 로하 였으며온도변화율은 20 C/s이었고마지막 3번째단계만 0.1 C/s로하였다. 이때얻어지는 melting peak는증폭된 DNA의 GC% 에따라특이적으로나타난다. Real-time PCR fr amplificatin f 16S rrna specific gene fr psitive cntrl 본 PCR 실험의 psitive cntrl로는 Staphylcccus의 16S rrna에특이적인 primer를제작하여 real-time PCR 을수행하였다. 이실험에사용한 primer는 Negar 등이 19) 사용한동일한 primer를사용하였으며 Sigma-Prlig (The Wdlands, TX, USA) 사에서제작하여사용하였으며 primer sequence는 Table 1에나타내었다. PCR 반응은 capillary tube (LightCycler instrument, Rche Diagnstic) 에 20 µl 반응액을기준으로다음과같은조성으로사용하였다. 2 µl의 LightCycler FastStart DNA mastermix fr SYBR Green I (Rche Diagnstc), 0.5 µm 의각각의 primer, 4 mm MgCl µl, 2 µl의 DNA를혼합하여총 20 µl로 capillary 에분취후마개를닫은후 500 g에서 30초간 spin-dwn 후 LightCycler 를이용하여반응을실시하였다. 95 C, 10 분간 plymerase 활성화를실시한후, 45회반복반응 (95 C 10초, 58 C 10초, 72 C 15초 ) 하여목적 DNA를증폭하였다. 이때 temperature transitin rate는 20 C/s였고증폭된 DNA는 SYBR Green I의결합으로특유의형광을발하게되어이형광의발생정도를 LightCycler sftware v. 4.5으로분석하였다. Melting curve 분석은위증폭과정후즉시다음과같은조건으로실시하였다 ; 첫번째단계는 95 C 0s (hld time), 두번째단계는 65 C 15s, 세번째단계는 95 C 0s (hld time) 로하였으며온도변화율은 20 C/s이었고마 지막 3번째단계만 0.1 C/s로하였다. 이때얻어지는 melting peak는증폭된 DNA에특이적이다. Table 1. The sequences f the primers used in this study Gene Primer name Sequence (5' 3') 5' psitin Length (bp) ca meca 16S rrna caf gtg aat aca cag atg gaa cat ttg g car tcc gta tga tac tgt gcc atc ttg mecaf ttt agg cgt taa aga tat aaa cat tca gg mecar tgc ttt ggt ctt tct gca ttc c SF gga att caa akg att tga cgg ggg c SR cgc gat ccc agg ccc ggg aac gta ttc ac

4 124 Jae-Hyuk Jeng, Sn-Yung Jeng, Sang-Jin Lee, and Sung-Sk Chi Sequencing f LC-PCR amplicn f ca and meca 원유시료에서분리된황색포도상구균에서 Real-Time PCR법으로증폭된 DNA 절편이 ca 및 meca인지확인하기위하여 DNA 염기서열을확인하였다. PCR 반응후전기영동을실시하여 113 bp (ca), 209 bp (meca) 크기의 DNA 절편을 agarse gel에서잘라낸후 GeneAll PCR purificaitn kit ( 진올바이오테그놀로지, 서울 ) 을이용해 agarse gel에서 DNA를유출후 Gentech( 대전 ) 에의뢰하여염기서열을확인하였다. 히되고있음을보여주는사례이다. 한편황색포도상구균양성으로판명된 6종의시료는유방염초기의젓소에서유래된것으로사료되며한편돼지나소에서삼출성피부염 (exudative epidermitis) 을일으킨다고알려진 S. chrmgenes 20) 균주가 3개분리되었으며이균도유방염초기소에서분리된것으로사료되며앞으로원유시료를대상으로 S. chrmgenens의분리빈도를확인하고독소생성유전자인 ExhB의존재를신속하게검출할 RT-PCR 기법을개발할예정이다. 실험결과및고찰 원유시료중의황색포도상구균의검색원유시료중의황색포도상구균을검색하기위하여경기북부지역축산농가 15개에서 647개의원유시료를공급받아본실험에사용하였다. 포도상구균선택배지인 Staphylcccal Medium 110 (Difc) 에원유시료를도말후 48시간배양후생성된집락중 Staphylccus 특유의집락모양을나타내는균주를선택하고자하였으며 647개의원유시료중 9 개의원유시료에서황색포도상구균으로의심되는집락이형성되었다. 따라서본 9개의시료에서각각균주를분리배양하고임상검사소세강 ( 서울 ) 에의뢰하여균동정을실시한결과 9개의후보시료중 6개의시료에서분리된균이황색포도상구균으로동정되었으며 3개는 S. chrmgenes 로확인되었다 (Table 2). 6개의황색포도상구균을대상으로 xacillin 저항성을검사한결과 2개의균주가 xacillin 에고도내성을보이는 MRSA로판명되었다. 총 647개의원유시료중 6개의황색포도상구균이검출되고이중 2균주가 MRSA로판명된것은매우낮은검출빈도이며이는축산농가에서의사육젖소에대한위생관리가매우철저 항생제감수성검사분리된황색포도상구균의 methicillin에대한저항성을확인하기위하여다양한농도의 xacillin을함유한 Muller- Hintn 배지 (4% NaCl함유 ) 에서 CSLI의방법에따라감 18) 수성검사를실시하였다. 그결과 Table 2와같은결과를얻었으며 (1~100 µg/ml) 특히이중 2개의균주에대한 xacillin의 MIC가 50 µg/ml 및 100 µg/ml 이상을나타내었으며이는비교적고농도내성으로판단되었다. 원유시료에서분리된 MRSA 균주는비교적 methicillin에대한저항성이높은것을알수있었으며특히본검사의정확성을확인하게위하여항생제내성균주은행에서분양받은 MRSA양성인 S. aureus CCARM 3679균주를양성대조균으로사용하였으며양성대조균의저항성은분양은행의기록과동일한결과를나타낸것을보아저항성검사방법의문제는없는것으로사료된다. Real-Time PCR assay fr detectin f ca specific DNA amplicn 생화학적동정을통해확인된원유시료에서분리된 6종의 S. aureus 및 3종의 S. chrmgenes의종특이성을분 Table 2. Characteristics f Staphylcccus sp. Islated frm Raw Milk Samples Sample N. Strains MIC gentypes (µg/ml) ca 16S rdna meca B 32-1 Staphylcccus aureus D 7071 Staphylcccus aureus S 1220 Staphylcccus chrmgenes 4 + S 81-2 Staphylcccus aureus 100 < S 83-5 Staphylcccus aureus M-29-1 Staphylcccus aureus M-46-1 Staphylcccus chrmgenes 4 + B-58 Staphylcccus aureus B-62 Staphylcccus chrmgenes 4 + Staphylcccus aureus ATCC 6538P Staphylcccus aureus CCARM < Staphylcccus epidermidis ATCC nt +

Real-time PCR assay fr Rapid Detectin f Staphylcccus aureus 125 자수순에서확인하기위하여황색포도상구균특이적인 cagulase precursr 유전자인 ca에특이적인 primer를제작하여 PCR을수행하였으며그결과 S. aureus로확인된균주에서는 ca에특이적인 Tm 값이 80.33 ± 0.

aureus에서만나타난 Tm 80.33 ± 0.14 C 의 113 bp의 ca DNA 검출은본실험에서사용한 ca specific primer 는아주선택적으로본균주를분자수준에서동정이가능한것으로생각된다. cagulase 생성능은 Staphylcccus 속균주중 S. aureus를구분하는특징적인생화학반응이다.

5 Real-time PCR assay fr Rapid Detectin f Staphylcccus aureus 125 자수순에서확인하기위하여황색포도상구균특이적인 cagulase precursr 유전자인 ca에특이적인 primer를제작하여 PCR을수행하였으며그결과 S. aureus로확인된균주에서는 ca에특이적인 Tm 값이 ± 0.14 C에서 나타내는 113 크기의 band가증폭된것을확인하였다 (Fig. 1). 본실험결과양성대조균인 S. aureus ATCC6538P 및 6 종의원유시료유래 S. aureus에서만특유의 Tm 값을나타내었으며 S. epidermidis 와 S. chrmgenes에서는 negative cntrl과동일하게특징적인 peak를관찰할수가없었다. 따라서 S. aureus에서만나타난 Tm ± 0.14 C 의 113 bp의 ca DNA 검출은본실험에서사용한 ca specific primer 는아주선택적으로본균주를분자수준에서동정이가능한것으로생각된다. cagulase 생성능은 Staphylcccus 속균주중 S. aureus를구분하는특징적인생화학반응이다. 기존의생화학적반응으로 cagualase 생성을확인하기위하여는균주의배양시간이소요되므로 24시간이상의시간이필요하다 21). 그러나 cagulase precursr를 cding 하는 ca 유전자를 real-time PCR로증폭하여확인하는과정은 1시간이내에가능한매우신속한기법이다. 또한 DNA의검출한계가 10 fg정도로미량의 DNA도검출이가능한것으로사료되며이는 Real- Time PCR기법의우수성을보여주는좋은예라할수있다 (Fig. 4). Real-Time PCR assay fr detectin f meca gene 원유시료에서분리된 MRSA를대상으로 methicillin저항성의원인유전자인 meca 유전자를확인하기위하여 SYBR Green I based real-time PCR을실시하였다. PCR 기계는 Rch LightCycler (1.5) 를사용하였으며양성대조균으로 MRSA CCARM 3697을음성대조균으로 S. aureus ATCC 6538P를사용하였다. MRSA균주가 methicillin에내성을나타내는기전은고유한 penicillin-binding prtein (PBP) 인 PBP2a를생성하기때문이다. PBP는세포막에결합한단백질로세균의세포벽합성에서 crss-linking 반응 Fig. 1. LightCycler (LC) printuts shwing meltimg curves f ca specific fragments generated by the LC-PCR assay. Specific signals had melting temperatures f ± 0.14 C. Fig. 2. LightCycler (LC) printuts shwing meltimg curves f meca specific fragments generated by the LC-PCR assay. Specific signals had melting temperatures f ± 0.11 C.

126 Jae-Hyuk Jeng, Sn-Yung Jeng, Sang-Jin Lee, and Sung-Sk Chi 을촉매한다. PBP는 β-lactam 항생제의결합부위가되 22) 는데 β-lactam 항생제는 catalytic site 에결합하여세균의세포벽합성을저해하므로항생현상을나타낸다.

이 PBP2a 23) 를 cding하는유전자가 meca이며전체크기는 2010 bp, 670 aa으로되어있다. PCR 결과양성대조균인 CCARM 24) 3679와원유시료에서분리된 2 균주는 79.11 ± 0.11 C에서특유의 Tm 값을나타내는 DNA 절편의증폭을확인하였고 S. aureus ATCC 6538P 및나머지 S.

6 126 Jae-Hyuk Jeng, Sn-Yung Jeng, Sang-Jin Lee, and Sung-Sk Chi 을촉매한다. PBP는 β-lactam 항생제의결합부위가되 22) 는데 β-lactam 항생제는 catalytic site 에결합하여세균의세포벽합성을저해하므로항생현상을나타낸다. 대부분의세균들은분자량, β-lactam 항생제에대한친화력, 효소작용이다양한여러가지 PBP를생성한다. MRSA 또한고유한 PBP를생산하는데이를 PBP2a 또는 PBP2' 라고부르며 β-lactam 항생제에대한친화력이낮기때문에정상적인 PBP에결합하는 β-lactam 항생제에대하여는결합하지않으므로이들항생제에내성을나타낸다. 이 PBP2a 23) 를 cding하는유전자가 meca이며전체크기는 2010 bp, 670 aa으로되어있다. PCR 결과양성대조균인 CCARM 24) 3679와원유시료에서분리된 2 균주는 ± 0.11 C에서특유의 Tm 값을나타내는 DNA 절편의증폭을확인하였고 S. aureus ATCC 6538P 및나머지 S. aureus에서 는음성대조군과마찬가지로양성대조균과동일한 Tm 값을갖는 peak를확인할수없었다 (Fig. 2). PCR을통해증폭된 DNA가 meca 유전자인지확인하기위하여 DNA 염기서열분석을 Gentech ( 대전 ) 에의뢰하였고그결과 100% 동일함을확인하였다 (Fig. 5). 따라서본연구에서디자인한 primer를이용한 real-time PCR 기법을이용하면초기유방염젖소에서황색포도상구균의조기검출및 MRSA의검출을신속, 정확하게할수있을것으로사료된다. Real-Time PCR assay fr detectin f 16S rrna specific DNA amplicn 본실험의전반적인과정의문제없음을확인하기위하여양성대조군으로16S rdna에특이적인 primer를제작 Fig. 3. LightCycler (LC) printuts shwing meltimg curves f 16S rdna specific fragments generated by the LC-PCR assay. Specific signals had melting temperatures f ± 0.17 C. Fig. 4. LightCycler (LC) printuts shwing detectin f ca DNA by LC-PCR assay. Flurescent signal related t cycle number n a panel f ten-fld dilutins between 10 7 and 10 fg f S. aureus ca DNA.

7 Real-time PCR assay fr Rapid Detectin f Staphylcccus aureus 127 Fig. 5. Sequencing and DNA blast results f PCR amplified ca and meca fragmnet. 하여 PCR을수행하였으며그결과 Staphylcccus 속으로확인된균주에서는 16S rdna에특이적인 Tm 값이 ± 0.17 C에서나타내는 479 bp 크기의 band가증폭된것을확인하였다 (Fig. 3). 즉본실험과정의균주의분리, 배양, DNA의분리및 PCR 과정에서의실험오류는없는것으로판단되었다. 요약 본연구는 LightCycler (Rche) 를이용한 Real-Time PCR (LC-PCR) 기법을통하여원유시료에서신속, 정확하게황색포도상구균을검출하는기법을개발하고자하였다. cagulase 전구체를 cding하는 113 bp의 ca 유전자의증폭, melting curve 분석및 DNA염기서열을분석하여황색포도상구균특유의유전자검출하는기법을개발하였다. 또한분리된균주중메치실린에내성을나타내는균주를검출하고자 penicillin-binding prtein, PBP2a (meca) 를 cding 하는 209 bp의 meca 유전자의증폭, melting curve 분석및 DNA염기서열을분석하여메치실린내성황색포도상구균을 real-time PCR 기법으로검출하는기술을개발하였다. 본실험에따르면 647개의원유시료중 6개의시료에서황색포도상구균이검출되었으며이중 2개의시료에서분리된황생포도상구균이메치실린내성황색포도상구균임을확인하였다. 또한 DNA 검출한계는 10 fg으로기존 PCR에비해매우감도가우수한것을확인하였다. 또한 3 개의원유시료에서돼지나소의삼출성피부염의원인균인 Staphylcccus chrmgenes가분리되었다. 참고문헌 1. Yn, J. C., Lee, J. C., Kim, S. K., Park, T. S., Kim, J. T., Lee, C. G., and Lee, C. Y.: Prevalence f islated micrrganisms an and antimicrbial susceptibility frm half milk in dairy gats. Krea J. Vet. Res. 44(1), (2004)

8 128 Jae-Hyuk Jeng, Sn-Yung Jeng, Sang-Jin Lee, and Sung-Sk Chi 2. Ann: Results f the Uruguay rund f the multilateral trade negtiatins 1993: agreement n applicatin f sanitary and phytsanitary measures. Wrld Trade Organisatin, Genva. (1995) 3. Cdex Aimentarius Cmmissin: Principles and guidelines fr the cnduct f micrbilgical risk assessment. CAC/ GL30. Geneva (1999). 4. Eurpean Cmmissin: Principles fr the develpment f risk assessment f micrbilgical hazards under directive 93/ 43/EEC cvering the hygiene f Fd shp. (1997). 5. Eley, A. R.,: Micrbial fd pisning, 2nd ed., Lndn, Cha,pman & Hall. (1992). 6. Pan, T. M., Wang, T. K., Lee, C. L., Chien, S. w., and Hrng, C. B.: Fd-brne disease utbreaks due t bacteria in Taiwan, 1986 t J. Clin. Micrbil., 35(5), (1997). 7. Maurer, J.: The methdlgy f PCR. pp 27-40: In: PCR methds in fds. Maurer J (ed.), Springer, Inc., New Yrk, NY, USA(2006). 8. Wilhelm, J. and Pingud, A.: Real-time plymerase chain reactin. ChemBiChem. 4, (2004). 9. Sails, A. D., Fx, A. J., Bttn, F. J., Wareing, D. R. and Greenway, D. L. : A real-time PCR assay fr the detectin f Campylbacter jejuni in fds after enrichment culture. Appl. Envirn. Micrbil. 69(3), (2003). 10. Se, K. H., Valentin,-Bn, I. E., Brackett, R. E. and Hlt, P. S.: Rapid, specific detectin f Salmnella enteritidis in pled eggs by real-time PCR. J. Fd Prt. 67, (2004). 11. Studer, S., Schaerent, W., Naskva, J., Pfaeffli, H., Kaufmann, T., Kirchhfer, M. and Steiner, A: A lngitudinal field study t evaluate the diagnstic prperties f a quantitative real-time pplymerase chain reactin-based assay t detect Staphylcccus aureus in Milk. J. Dairy Sci. 91, (2007). 12. Martineau, F., Picard, F. J., Ry, P. H., Ouellette, M.. and Bergern, M. G.: Species-specific and ubiquitus-dna based assay fr rapid identificatin f Staphylcccus aureus. J. Clin. Micrbil. 36, (1998). 13. Phnindaeng, P., O reilly, M., Nwlan, P., Brmley, A. J. and Fster, T. J. : The cagulase f Staphylcccus aureus sequence analysis and virulence f site-specific cagulasedeficient mutants. Ml. Micrbil. 4, (1990). 14. Mcdermtt, P. F., Zha, S., Wagner, D. D., Simjee, S., Walker, R. D. and Whitw, D. G. : The fd safety perspective f antibitic resistance. Animal Bitech. 13, (2002). 15. Anyliffe, G. A. J. : The prgressive intercntinental spread f methicillin-resistant Staphylcccus aureus. Clin. Infect. Dis., 24 (Suppl. 1), S74-49 (1997). 16. Kuhl, S. A., Pattee, P. A. and Baldwin, N. J.: Chrmsmal map lcatin f the methicillin resistance determinant in Staphylcccus aureus. J. Bacteril. 135, (1978). 17. It, T., and Hiramatsu, K.: Acquisitin f methicillin resistance and prgressin f multiantibitic resistance in methicillin-resistant Staphylcccus aureus. Yunsei Medical Jurnal. 39, (1998). 18. Clinical and Labratry Standards Institute (CLSI), Perfrmance standards fr antimicrbial susceptibility test; 15th Infrmatinal Supplement Dcument M100-S15, CLSI, Wayne, PA.,(2005)19. Sabet, N. S., Subramaniam, G., Navaratnam, P and Sekaran, S. D.: Simultaneus species identificatin and detectin f methicillin resistance in Staphylcccus using triplex real-time PCR assay. Dia. Micrbil. Infect. Dis. 56, (2006). 20. Ansersn, L. O., Ahrens, P., Daussard, L. and Bille-Hansen, V.: Exudative epidermitis in pigs caused by txigenic Staphylcccus chrmgenes. Vet. Micrbil. 105, (2005). 21. Kearns, A. M., Seiders, P. R., Wheeler, J., Freeman, R., and Steward, M.: Rapid detectin f methicillin-resistant Staphylccci by multiplex PCR. J. Hsp. Infect. 43, (1999). 22. Waxman, D. J. and Strminger, J. L.: Penicillin-binding prteins and the mechanism f actin f b-lactam antibitics. Annu. Rev. Biche, 52, (1983). 23. Chambers, H. F. and Sachdeva, M.: Binding f b-lactam antibitics t penicillin-binding prteins in methicillin-resistanr Staphylcccus aureus. J. Infect. Dis. 161, (1990). 24. Sng, M. D., Wachi, M., Di, D., Ishin, F. and Matsihashi, M.: Evlutin f an inducible penicillin-target prtein in methicillin-resistant Staphylcccus aureus by gene fusin. FEBS Lett. 221, , (1987).

Æ¯ÇãÃ»

Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence