7월웹진

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1 바이오의약품생산에서당사슬제어의중요성 오두병한국생명공학연구원 서론 최근삼성이앞으로의먹거리를창출할신수종사업으로바이오의약품을선택하고송도에제조공장을짓기로발표하면서이에대한관심이크게증가하고있다. 현재, 시장에나와있는바이오의약품들은대부분재조합단백질들로서 2013 년전세계시장규모가 1,600 억달러를넘어서며, 이중 70% 인약 130 조원의시장을당사슬이부착된당단백질의약품이차지할것으로예상되고있다. 이러한고부가가치당단백질의약품으로는치료용항체, 조혈인자 (erythropoietin; EPO), 인터페론, 과립구콜로니자극인자 (granulocytecolony stimulating factor; G-CSF), 난포자극호르몬, 효소치료제등이있다. 삼성은초기사업모델로서이러한당단백질의약품을대신해서생산해주는 제조대행업체 (contract manufacturing organization; CMO) 사업을내세우고있으며, 이후바이오시밀러생산을통해서경험을쌓고중장기계획으로바이오신약을개발한다는포석을깔고있다. 유전자재조합기술을이용해서목적단백질을생산하는경우에보통해당유전자를인체가아닌미생물이나식물또는동물세포등에도입하여발현을시키게된다. 따라서, 유전자가동일하다하더라도이를발현하는숙주가다르면생 산되는재조합단백질은인체에서생산되는단백질과 번역후수식 (post-translational modification; PTM) 에서커다란차이를보일수있다. 특히, 당사슬이부가되는당질화 (glycosylation) 반응은대표적인 PTM 으로서생산숙주별로다양한구조와양상을보이게된다. 당단백질에부착된당사슬의성분과구조가인체형과다를경우에치료효능이나체내지속성및조직분포가달라지며, 특히인체에반복해서투여할시에는면역반응을유발할수있다. 따라서, 현재판매되고있는대부분의의약용당단백질들은인간과비슷한당사슬이부가되는 CHO (chinese hamster ovary) 세포등의동물세포에서주로발현되고있다. 하지만, 이들동물세포들도인간에게는존재하지않는구조의당사슬들을미량이지만가지고있다는사실들이밝혀지고있다 (1, 2). 수많은당단백질의약품들의 FDA 승인으로안전성과효용성이검증된 CHO 세포의경우에도인간에게존재하지않는시알산인 N-glycolylneuraminic acid (NGNA) 를부가할뿐만아니라 (1), 최근에는 CHO 세포에서는부가되지않는다고알려졌던 α-gal 항원도극미량이긴하지만존재한다는게알려져우려를주고있다 (2). 따라서, 문제가되는당사슬들의부가를막기위해서 CHO 세포의당사슬생합성경로를재설계하여원하는구조의당사슬을부가하기위한 1 분자세포생물학뉴스

2 연구들이활발히이루어지고있다. 또한, 비인간형당사슬이부가되는문제를불식시키고자아예인간유래의세포들을당단백질의약품생산용세포주로개발하는연구들도큰주목을받고있다 (3). 당단백질의약품에부착되어있는당사슬은치료효능, 체내지속성, 타겟팅및면역반응등에있어서중요한역할을수행하기에품질을결정하는주요인자로부각되고있다. 그러나, 주형을토대로하여복제되거나합성되는 DNA, RNA 및단백질들과달리당사슬은여러종류의효소들이순차적으로작용하여만들어진다. 이러한본질적인특성때문에비균질한당사슬들이당단백질에부착된다. 따라서, 당단백질의약품을생산할때에는배치 (batch) 마다당사슬들이일정하게부착되도록품질을관리하는게중요한이슈가되고있다. 본논단에서는당단백질에부착되는당사슬의생합성이생산숙주별로어떻게다른지를알아보고, 당사슬이사이토카인, 치료용항체및효소치료제와같은당단백질의약품의치료효능과체내지속성및면역반응등에미치는영향에관해서소개를하고자한다. 진화에따른당사슬생합성의차이 단백질에당사슬이부가되는반응에는 N-결합혹은 O- 결합당질화 (N-linked or O-linked glycosylation) 의두가지형태가있다. 이두당질화과정은당사슬합성및부가메커니즘에서차이가있으며, 이중 N-당질화의기작과역할이보다잘알려져있다. N-당질화를통해서부가되는당사슬을 N-당사슬 (N-glycan) 이라부르며소포체에서시작된다. 소포체막에존재하는돌리콜피로인산 (dolichol pyrophosphate, PP-Dol) 에 ALG (Asparagine-Linked Glycosylation) 로명명된일련의 ALG 효소들이 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc), 만노즈 (mannose, Man), 포도당 (glucose, Glc) 등을부가하여, 최종적으로지질과연결된올리고당 (lipid-linked oligosaccharide, LLO) 형태의복합당사슬인 Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 -PP-Dol 을합성하게된다 (4). 이렇게합성된 LLO 는 8개이상의 subunit 으로구성된올리고당전이효소 (oligosaccharyltransferase) 에의해서 co-translational translocation 기작으로리보좀에서소포체로직접번역되어나오는 N-x-S/T 를포함하는펩타이드의 N-당질화시퀀 (sequon) 에전달된다 (4-5). 이렇게단백질에부착되어진 N-당사슬은소포체안에존재하는글루코시다아제 (α-glucosidase I, Gls1p ; α- glucosidase II, Glsp II) 에의해서당사슬맨끝의포도당부터하나씩제거된다. 두번째와세번째포도당이좀더천천히제거되면서 lectin chaperone 인 calnexin/calreticulin 의도움으로폴딩이완성된다. 모든포도당이다잘려나가면단백질폴딩이완료된것으로인지하고 Man 8 GlcNAc 2 당사슬이부착된형태로골치체로옮겨지게된다 (6-7). 그런데, 소포체에서골지체로옮겨가기전에한번더당단백질의폴딩을검증하는품질관리과정이있다. 적절한폴딩이이루어져있지않으면, 포도당한분자를다시붙여서 calnexin/ calreticulum cycle 에들어가도록해서폴딩을완성할수있는기회를주는과정을반복한다. 상기에서소개한소포체에서이루어지는 N-당사슬의초기생합성과정은진핵미생물인효모에서고등생물인동물에이르기까지거의동일한과정으로보존되어있다 (8-9). 그러나, 골지체로넘어간당사슬은각종에특이적으로다양한당사슬수식과정을거치게되며, 그결과로효모, 곤충, 식물및동물등에서완전히다른형태의당사슬들이만들어지게된다 ( 그림 1). 그러나, 이렇게다양한당사슬들도핵심부위는공통적으로가지고있는데, 세개의만노즈와두개의 GlcNAc 이 Asn 의질소에연결된구조로 trimannosyl core 로불린다. 이 trimannosyl core 에주로만노즈가연결된형태를고만노즈형 (high-mannose type) 이라부르며효모와곰팡이등에서많이관찰된다. 전통효모인 Saccharomyces cerevisiae 의경우에는골지체서만노즈부가가계속되어수십여개의만노즈가부가된형태가관찰되기도한다. 반면에곤충세포에서는결핍만노즈형 (pauci-mannose type) 의당사슬을갖는당단백질들이관찰된다 (9). 이들은 웹진 7 월

3 골지체에서만노시다제 (mannosidase IA, IB & IC) 들에의해서먼저 Man 5 GlcNAc 2 형태로다듬어지고여기에 N- acetylglucosaminyltransferase (GNT) I이작용해서 GlcNAc 이하나부가된후에만노시다제 II가작용해서 trimannosyl core 에 GlcNAc 이하나부가되어있는혼합형구조가만들어진다 ( 그림 1). 그리고나서야부가되었던 GlcNAc 이다시잘려나가면서결핍만노즈형당사슬구조가만들어지는것이다. 동물세포는 Asn 잔기에결합되어있는첫번째 GlcNAc 에 α(1,6)- 퓨코스 (fucose) 가종종부가된다. 반면에곤충의경우에는 α(1,6)- 퓨코스와 α(1,3)- 퓨코스가모두부가된 bi-fucosylated 구조들이때때로발견되기도한다. 이러한코어당사슬에연결된 α(1,3)- 퓨코스가 지는인체에서는발견되지않기때문에엘러지와같은면역반응을유발한다고알려져있다. 식물에서도첫번째 GlcNAc 에 α(1,3)- 퓨코스가부가되기도하며, 만노즈코어에연결된 β(1,2)- 자일로스 (xylose), 말단의 GlcNAc 에 β(1,3)- 갈락토스 (galactose) 와 α(1,4)- 퓨코스결합을갖는복합당사슬구조를갖는것들이보고되었다 ( 그림 1) (9). 또한골지체에서합성된당단백질의일부가복합당사슬의생합성중에액포 (vacuole) 로이동하면서결핍만노즈형의 N-당사슬이발견되는데이메커니즘은아직명확히규명되어있지않다. 식물특이적인당사슬구조로는코어 α(1,3)- 퓨코스, bisecting β(1,2)- 자일로스및 Lewis a (Lea) 항원등이알려져있다. 이들은식물특이적인당사슬 그림 1. 효모, 곤충, 식물및동물의주요 N- 당사슬생합성경로와일반적인당사슬구조. 소포체에서의이루어지는 N- 당질화경로는효모에서동물에이르기까지보존되어있는반면에골지체에서일어나는수식과정은매우다양하게진화하였다. 당사슬을나타내는기호는미국 Consortium for Functional Glycomics (htpp:// 의양식을따랐음. ( Introduction to Glycobiology Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer) 3 분자세포생물학뉴스

4 구조로서토끼와인간혈청에서강한면역원성을갖는것으로알려져있다 (10). 동물에서는 trimannosyl core 에 GlcNAc 이하나부가되어있는구조에 GNT II가작용해서 GlcNAc 이하나더부가되어서두개의안테나구조를갖는당사슬이생성된다. 이후에 GNT IV와 V가작용해서네개의안테나구조가만들어지기도하며 ( 그림 1), 일부에서는 GNT VI, IX 또는 VB 등이작용해서 6개의안테나구조까지만들어지는경우도있다. GlcNAc 이부가되어안테나의골격이만들어진후에골지체내에존재하는 β-galactosyltransferase 와 α- sialyltransferase 등이작용해서 GlcNAc 위에갈락토즈와시알산이부가된형태의복합형당사슬구조가만들어진다. GNT V가작용해서형성되는 β(1,6)-glcnac 가지에는 Gal-β(1,4)-GlcNAc-β(1,3) 이반복해서나타나는 polylactosamine 구조가종종발견되며, 이는 T 세포의조절과암의전이등에관련이되어있다. 또한, 다양한종류의 α-fucosyltransferase 등이작용해서당사슬의코어부분또는말단에퓨코스를부가할수도있다. 지질과연결된형태로당화전구체가만들어진후에올리고당전이효소에의해서단백질로전달되는 N-당사슬과달리 O-당사슬의생합성은골지체에서완전히폴딩이끝난단백질에순차적으로당전이효소가작용하여만들어진다. 또한, N-x-S/T 의당질화시퀀을가지고있는 N-당사슬과달리 Ser 이나 Thr 의산소원자에당들이차례로연결된다. 하지만, 부근아미노산들의특징을보면 Ser 과 Thr 잔기가반복적으로나타나고 Pro 도잦은빈도로나타나는특징을갖고있어서이를예측하는프로그램이개발되었다 (11). 특히, 일부재조합당단백질을동물과효모에서발현한경우, 발현숙주의차이에따라연결되는 O-당사슬의서열과구조가완전히다름에도불구하고같은위치에 O-당질화반응이일어난다는보고도있다 (12). O-당사슬의가장대표적인특징은매우다양한형태로나타난다는점이다. 동물에서가장많이부가되는당사슬은뮤신타입으로맨처음에 GalNAc 이 Ser 과 Thr 의산소원자 에연결되면서 O-당사슬의부가가시작된다. 이외에도효모등에서많이부가되는 O-만노즈당사슬을비롯하여 O-글루코스, O-퓨코스등이있고, 세포질과핵에서일어나는 O-GlcNAc 당사슬을비롯한다양한종류의 O-당사슬이존재한다. 나아가 hydroxylation 반응으로변형된아미노산인 hydroxylysine 이나 hydroxyproline 의산소원자에 O-당사슬이연결되기도한다. 현재까지승인된의약용당단백질에서주로발견되는 O-당사슬은뮤신타입으로끝부분에시알산이대부분부가된다. 당단백질생산을위한재조합발현숙주의선택 유전자재조합기술을이용해서단백질을대량으로생산하고자하면조작이용이하고경제적생산성이높은대장균이나효모와같은미생물들을일차적으로고려하게된다. 하지만, 인체유래의복잡한당사슬이부가된당단백질을의약용목적으로생산해야한다면고려하게되는생산숙주도달라질수밖에없다. 우선, 대장균은원핵생물로서당사슬부가능력을갖고있지않으며, 진핵미생물인효모는인체주입시면역반응을일으키는고만노즈형당사슬을부가하고있어서의약용으로사용하기어렵다. 또한, 비교적경제성이높은곤충세포와형질전환식물들도인체주입시엘러지등의면역반응을유발하는비인간당사슬구조들이일부있어서마찬가지의문제점들을갖고있다. 때문에현재판매되는대부분의당단백질의약품들은인간과비슷한당사슬구조를가지는동물세포들에서생산되고있다. 따라서, 경제성이높은당단백질생산시스템을개발하기위해서효모와곤충및식물들의당사슬생합성경로를재설계하여인간화하기위한연구들이큰주목을받고있다. 대표적으로는미국의 GlycoFi 가재조합단백질발현에널리사용되는메탄올자화효모인 Pichia pastoris 의당사슬생합성경로를인간화하는데성공하여큰주목을받았다 (13-14). 곤충과식물에서도여러연구팀들이이와유사한개념을가지고당사슬생합성경로를인간화하고자하는연구들을수행하고있다. 상기에서서술한바와같이당사슬구조의유사성때문에 웹진 7 월

5 당단백질의약품을생산할때에는동물세포배양기술이널리사용된다. 하지만, 그중에서도안전성과효용성이검증된 CHO 세포가선호되고있다. 이는마우스유래의세포들 (NS0, SP2/0) 과는달리 CHO 세포에서생산된당단백질에는인체에서면역반응을일으키는 galactose-α(1,3)- galactose (α-gal) 항원이부가되지않는다고알려져있기때문이기도하다. α-gal 항원은무균돼지의장기를인간에게이식하는이종이식에서발생하는초급성면역거부반응의주요원인으로알려져있으며, 마우스유래세포에서생산된당단백질들에미량부가되기도한다. 대표적인예로는암치료용항체로승인받아판매되고있는 anti-egfr 항체인 Erbitux (cetuximab) 의경우 IgE-mediated 과민반응 (anaphylaxis) 이종종발생하는데, 그원인이바로 α- gal 항원때문인것으로보고되었다 (15). Erbitux 는마우스유래의 SP2/0 세포에서생산되기때문에이러한 α-gal 항원의부가에따른면역반응문제가생기는것으로생각된다. 그러나, 최근에발표된연구결과에따르면 CHO 세포도극미량이기는하지만 α-gal 항원을부가하는것으로보인다 (2). Momenta Pharmaceuticals 의 Venkataraman 박사연구팀에따르면, CHO 세포도 α-gal 항원을부가하는 N- acetyllactosminide-3-α-galactosyltransferase-1 (Ggta1) 을가지고있는것으로밝혀졌다. 또한, CHO 세포에서생산한 CTLA4 와 Fc 융합단백질인 Orencia (Abatcept) 의경우전체당사슬들중에서 α-gal 항원이부가된것들이약 0.2% 존재하는것으로보고되었다. 이들의연구결과를종합해보면, 마우스유래의세포들보다부가능력이훨씬낮기는하지만 CHO 세포도 α-gal 항원을부가할수있으며각클론별로활성정도가다른것으로보인다. 따라서, 생산세포주선별단계에서잘선택을한다면 α-gal 항원이부가되지않는 CHO 세포주를고를수있는것으로보인다. 인간에게는존재하지않지만다른동물들에서존재하는대표적인당으로는비인간시알산 (non-human sialic acid) 인 N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) 을들수있다. 인체에주로존재하는시알산은 N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) 이며, 인간을제외한다른포유류에서일정부분관찰되는 Neu5Gc 는거의관찰되지않는다. Neu5Ac 그림 2. 비인간시알산, N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). (A) CMP-Neu5Gc 는 CMP-Neu5Ac 에 CMP-Neu5Ac hydroxylase (CMAH) 효소가작용해서만들어진다. (B) CMAH 유전자는약 2.8 백만년전에돌연변이에의해서비활성화된것으로추정된다. (J Plant Biotechnol (2010) 37: ) 5 분자세포생물학뉴스

6 는당화전구체인 CMP-Neu5Ac 로활성화된후에 CMP- Neu5Ac hydroxylase (CMAH) 효소에의해서 CMP- Neu5Gc 로전환되어만들어진다 ( 그림 2A). 이 CMAH 유전자는침팬지와인류의공통조상에서침팬지가갈라지고난이후, 뇌용적의팽창이일어나기직전인 2백 80만년전무렵에 6번째엑손 (exon) 에서 92 bp의 DNA 가결손되는돌연변이가발생해서비활성화된것으로추정된다 ( 그림 2B) (16). 따라서, 침팬지등의영장류들도합성하는 Neu5Gc 를인류와이미멸종한네안데르탈인만이합성하지못하게된것이다. 하지만, 육류와우유를섭취함으로써이비인간시알산을체내에흡수할수있기때문에소량이지만인체내에도 Neu5Gc 가존재하며, 암등의이상조직에많이분포한다 (17). 이러한이유로인체내에는 Neu5Gc 를항원으로인식하는항체들이존재하여, 시알산으로 Neu5Gc 가부가된재조합단백질이인체내에주입되었을때면역반응을유발할소지가있다 (1). 햄스터유래의 CHO 세포도 Neu5Gc 를합성할수있는능력을가지고있으나무혈청배지에서재조합단백질을발현하는경우에는단백질에부가되어있는 Neu5Gc 의양은매우미미한수준으로관찰된다. 하지만, 혈청배지를사용하는경우나배양조건에따라서는때때로이양이증가하게되는데이경우 Neu5Gc 에대한면역반응때문에체내에서단백질이빨리제거되기도한다 (18). 이외에도 CHO 세포의당사슬들은인간세포의것들과는다른특징들을가지고있는것으로보고되었다 (19). 우선, 대표적으로는 α(2,6)-sialyltransferase 활성이없어서주로 α(2,3)-linkage 로연결된시알산들만이발견되고있다. 또한, bisecting GlcNAc 을부가하는 GNT-III 의활성과말단에퓨코스를부가하는 α(1,3/4)-fucosyltransferase 활성도거의존재하지않는것으로알려져있다. 이렇게인간과는다른특징들때문에인간유래의세포들을재조합단백질발현에사용하려는노력들이계속되고있다. 연구용으로많이사용되는 HEK293 세포를이용해서생산하여승인받은의약품은아직까지 Xigris ( 활성화단백질 C) 만이알려져있다. 이보다는인간섬유육종 (fibrosarcoma) 세포인 HT 을이용해서생산한당단백질들이여러종 -Dynepo (EPO), Elaprase (iduronate-2-sulfatase) 및 Replagal (α-galactosidase) 등- 승인을받은상태이다. 이외에도인간의태아망막세포 (embryonic retina cell) 를조작하여만든 PER.C6 세포가주목을받으며, 여기서생산된당단백질들이 10여종이상이임상시험중에있다 (Crucell, 최근에는독일의바이오벤쳐기업이인간의양수세포 (amniocyte) 를조작하여당단백질생산에적합한생산세포주로만들어서사업화하고있다 (Cevec, ). 인체내에서지속시간을결정하는시알산 치료용항체를제외한대부분의당단백질의약품에서제일중요하게생각되는것은당사슬의맨끝에부가되는시알산캡핑 (capping) 이다. 시알산은당단백질의체내수명을결정하는주요인자로서당사슬의말단이시알산으로끝나지않은당단백질들은체내에서빠르게제거된다. 이는시알산이제거되어말단에갈락토스가노출되면간에존재하는비시알산당단백질 (asialoglycoprotein) 수용체에의해해당단백질이제거되기때문이다 ( 그림 3). 이수용체는당사슬에결합하는특성을가진렉틴의일종으로 1970 년대에이를발견한 Ashwell 교수의이름을따서 Ashwell 수용체로불리기도한다 (20). 이후시알산캡핑과당단백질의체내지속성과관련된수많은연구들이발표되었지만, Ashwell 수용체의생리학적인역할에대한단서가밝혀진것은극히최근의일이다 년 UCSD 의 Marth 교수연구팀은 Ashwell 수용체가병원균감염에의해서유발된패혈증에서생존율을높여주는역할을한다는사실을발표하였다 (21). 이와같이간에존재하는 Ashwell 수용체는시알산이부가되지않고갈락토스로끝난당사슬이부착된당단백질들을혈액에서빠르게제거하는역할을한다. 하지만, 당사슬의말단이갈락토스로끝나는경우에만체내지속성이짧아지는것은아니며, 만노스나 GlcNAc 으로끝나는경우에도체내지속성이짧아진다고보고되었다. 혈액에존재하는만 웹진 7 월

7 그림 3. 간에존재하는수용체에의한비시알산당단백질의제거. Ashwell 수용체는노출된갈락토스를인식해서시알산이떨어져나간당단백질을제거하는역할을한다. 따라서, 시알산이없는당단백질의체내지속성은짧은반면에당사슬말단이시알산으로캡핑되어있는당단백질은혈액내에서긴지속성을갖는다. (J Plant Biotechnol (2010) 37: ) 노스수용체와만노스결합렉틴등이만노스와 GlcNAc 에결합해서빠른속도로해당당단백질을혈액에서제거한다 (22-23). 유사하게세망내피계 (reticuloendothelial system) 를통해서도만노스와 GlcNAc 으로끝난당단백질들이제거되기도한다 (24). 대표적인바이오블록버스터인 EPO 는조혈인자로서악성빈혈환자와만성신부전환자등에사용되는데, EPO 의체내지속성은시알산부가정도에매우민감하게반응한다. 동물실험결과에따르면정상적으로시알산이부가된 EPO 는 5-6 시간의체내반감기를갖는반면, 시알산이제거된 EPO 는 2분이내의체내반감기를갖는다 (25). 특히, GlcNAc 두개가연결된 bi-antennary 당사슬에비해서 4개의안테나구조 (tetra-antennary) 에시알산이부가된경우에체내활성이높으며, 체내지속성도더긴것으로나타났다. EPO 는시알산함량이높을수록체내지속성이길게나타나는데, 이는 EPO 수용체와의이온결합을약화시키는덕분에혈액에서제거되는속도가감소하기때문이다 (26). 암젠은이를이용하여오리지널 EPO 제품의차세 대제품으로 2개의당질화위치를더도입하여시알산함량을크게증가시킨 Aranesp 를개발하여성공적으로상용화하였다. Aranesp 는시알산함량의증가덕분에수용체와의결합력이감소하였으며, in vivo 효능을유지한채로체내반감기가 3배증가하여환자의편의성이증대되었다 (26). Aranesp 는 2001 년에처음시장에도입된이래매출이급성장하여기존오리지널제품들을제치고베스트셀러로등극하여당사슬공학이재조합단백질의약품의성능향상에효율적인전략임을입증해주는대표적인사례가되었다. 치료용항체의성능과관련된퓨코스와갈락토스 항체가치료제로서산업적으로성공할수있었던것은마우스의아미노산서열들을갖고있는단클론항체를인간화시키는기술들이개발되면서부터이다. 하이브리도마기술로제작된초기의마우스유래항체들은인체주입시에면역반응을일으키며빠르게제거되어치료효과가없었다. 카이메 7 분자세포생물학뉴스

8 릭항체와각종인간화기술들이나오고서야이러한문제들이해결되어치료제로서성공할수있었던것이다. 그리고, 이제는항체의아미노산서열뿐만아니라부착된당사슬을완전히인간화시키는데에관심이집중되고있다. 그래서초창기에는치료용항체를 NS0 와 SP2/0 와같은생쥐유래의하이브리도마세포등에서발현하기도하였으나, 최근에는보다인간과유사한당사슬이부가되는 CHO 세포를생산세포주로선택하는추세이다 ( 그림 4A). 모든 IgG 항체는항체불변영역 (Fc) heavy chain 의 Asn297 에당질화위치를갖고있으며, 약 ~20% 의 IgG 는 Fab 의가변영역 (variable region) 에당사슬이부착되기도한다 ( 그림 4A). 가변영역에부가되는당사슬은일반적인경 우와마찬가지로 2~4 개정도의안테나에시알산이부가되는구조를갖는다. 그러나, Fc의 Asn297 에부착된당사슬은두개의안테나에갈락토스 (G로표시 ) 가 1-2 개정도부가되거나 (G1 또는 G2 형태 ), 부가없이 GlcNAc 으로끝나는형태 (G0) 를갖는다. 혈액내에존재하는약 ~5% 내외의일부 IgG 항체는 Asn297 의당사슬에시알산이부가되어있기도한다. 하지만, CHO 세포에서생산하는치료용항체는시알산이부가된형태가거의관찰되지않으며갈락토스부가정도도낮은편이어서갈락토스가없는 G0 형태가제일많이관찰된다. 다른당단백질들과달리항체의 Fc에부가되는당사슬은시알산이부가되지않아도 2-4 주에이르는매우긴체내반 그림 4. IgG 항체의당사슬구조. (A) 인간 IgG 항체는 heavy chain 의 Asn297 에당사슬이부착되며, 혈액내에존재하는 IgG 항체들중약 20% 는 Fab 의가변영역에도당사슬이부착되는경우가있다. Asn297 에는 bi-antennary 형태의복합형당사슬들이부착되는데, 인간의혈액에서발견되는항체들중약 5% 는시알산이부가되는경우도있으나대부분은갈락토스나 GlcNAc 으로끝나게된다. CHO 세포에서생산되는항체들은 GlcNAc 으로끝나는경우가많으며, 갈락토스가일부부가된다. NS0 와 Sp2/0 세포와같은마우스유래세포들은간혹미량의 galactose-α(1,3)-galactose 항원이부가되기도한다. (B) Glycart 는 bisecting GlcNAc 을부가하여 ADCC 성능을향상시키는 GlycoMAb 기술을개발하였고, 일본 Kyowa-Hakko 의자회사 Biowa 는퓨코스가부가되지않은항체를이용한 ADCC 성능향상기술을개발하였다. (J Plant Biotechnol (2010) 37: ) 웹진 7 월

9 감기를갖는다. 이는 Asn297 에부착되는당사슬이두개의 heavy chain 이이량체 (dimer) 를이루는안쪽에위치하여간에존재하는 asialoglycoprotein 수용체등에의해서인식이되지않기때문으로생각되고있다. X-ray 크리스탈구조분석에의하면 Fc의당사슬은단백질의표면과다수의비공유상호작용을하고있어서 3차구조를이루는일부로볼수있다 (27). 그래서, Fc에부착된당사슬의종류와구조에따라서 Fc의 3차구조가변하게되며, 이는항체의 Fc부위와 Fc수용체들 (FcγI, FcγII, FcγIII, C1q 등 ) 간의상호작용에영향을미치게되는것이다. 항체의 Fc에의해서유도되는 ADCC (antibody dependent cell cytotoxicity) 와 CDC (complement dependent cytotoxicity) 등의기능이치료효능을결정하므로, 결론적으로부착된당사슬이항체의성능을결정하게된다. 항체의 Fc에당사슬이부가되지않은항체는이러한기능이심각하게저해되는것으로알려져있다 (28). 따라서, 항체의 Fc에부착된당사슬의구조를제어하여항체의치료효능을극대화하기위한기술로당사슬공학이각광받고있다. 특히, 당사슬구조의변화로외래병원균및자가이상세포등을제거하는 ADCC 성능을향상시키는기술들이개발되어사업화되었다 ( 그림 4B). 스위스 ETH 의연구그룹은두개의안테나사이에위치하는 bisecting GlcNAc 이부가된당사슬을갖는항체가월등한 ADCC 성능을보인다는사실을발견하고 (29), 성능향상기술 (GlycoMAb TM ) 을제공하는 Glycart 회사를설립하였다. 한편, 일본의거대제약회사인 Kowa Hakko 는코어퓨코스가부가되지않은당사슬을갖는항체가 배이상의 ADCC 성능향상을보인다는사실을발견하고 (30), 미국에자회사인 Biowa 를설립하여퓨코스제거에의한성능향상기술 (POTELLEGENT TM ) 을이용한차세대제품개발에주력하고있다. 이러한 ADCC 성능의향상효과는코어퓨코스가부가되지않은당사슬에의해서유도되는것으로알려졌으며, bisecting GlcNAc 부가에의한효과는코어퓨코스의부가반응과같은기질을두고경쟁적으로이루어지기때문 에발생하는간접적인효과인것으로밝혀졌다 (30-31). 코어퓨코스가없는당사슬을갖는항체는 FcγRIIIa 수용체와의결합력이증가하므로세포표면에이수용체를가지고있는자연살해 (natural killer) 세포등을끌어모아서 ADCC 성능이향상되는것이다 (32). 항체에부착된당사슬은 CDC 에서도중요하다. 카이메릭항체인 Alemtuzumab 의경우당사슬말단의갈락토스가제거되면 CDC 가감소하였다 (33). 또한, 항-CD20 항체인 Rituxan 의경우에도갈락토스가하나붙어있는 G1F 당사슬을가진항체가갈락토스가전혀없는당사슬 G0F 가부착된항체보다두배의 CDC 성능을보였다 (34). 따라서, 이들항체의경우인허가를받을때항체에일정함량이상의갈락토스가부가되어야한다는규격을정하였고, 제조공정에서당사슬분석을통해서품질관리가되도록엄격하게제어하고있다. 인체의혈액내에존재하는항체의당사슬들을분석해보면, 약 ~5% 내외의 IgG 항체는 Fc의 Asn297 에부착된당사슬에도시알산이부가되어있다. 미국록펠러대학의 Ravetch 교수연구팀은 Asn297 의당사슬에부가되는시알산은체내지속성보다는항염증작용을위한스위치로작용한다는연구결과를발표하였다 (35). 그리고이를바탕으로항체의 Fc를재조합발현한후에 α(2,6)- 시알산을부가하여염증반응을억제하는효과를보여주었다 (36). 특히, 류마티스관절염, 루푸스및크론병등과같은자가면역질환을치료할수있다는것을동물실험으로확인하여새로운치료제로서개발될가능성을보여주었다. 라이소좀타겟팅을결정하는만노스 -6- 인산 라이소좀저장질환 (lysosomal storage disease) 은선천적인유전자이상으로라이소좀에존재하는분해효소의활성이결핍되어대사물질이축적되어발생하는질환들이다. 이러한질환을갖고태어난환자들은치료를받지못하면대부분젊은나이에죽음을맞이하게된다. 현재까지유일하게승인받은치료법은효소대체요법 (enzyme replacement 9 분자세포생물학뉴스

10 therapy) 으로정상적인효소치료제를외부에서주입하는방법이다. 미국 Genzyme 는 1998 년에첫번째효소대체요법을위한제품으로고셔병치료제 Ceredase 를시판한이래 Cerezyme, Fabrazyme, Aldurazyme 및 Myozyme 등의효소치료제를개발하여이분야에독보적인영역을구축하고있다. 효소치료제는고가의재조합의약품으로서유전적대사질환을가진소수의환자들을대상으로하고있음에도불구하고, 비싼가격때문에전체규모가 2.5 조원이넘는큰시장을형성하고있다. 그러나, 효소치료제를라이소좀으로타겟팅하기위해서는당사슬을제어하여원하는구조로최적화해야하는높은기술적장벽을갖고있어서 1-2 개기업이전세계시장을독점하는비정상적인구조를보이고있다. 라이소좀은세포에서불필요한물질들을분해하여재활용하도록하는소화와자기분해기능을가진소기관이다. 그래서, 다양한소화효소들이라이소좀으로이동해야하기때문에특수한전달신호를가지고있는데, 이것이바로만노스-6-인산 (mannose-6-phosphate) 이다. 골지체에서 N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase (GlcNAc-PT) 가라이소좀으로이동할당단백질들의 3차구조를인식하여 GlcNAc- 인산을당사슬의만노스잔기에부가한다 ( 그림 5). 그리고, 여기에 uncovering 효소 (phosphodiester glycosidase) 가작용하여 GlcNAc 잔기만을제거하여만노스에인산이남게되는 2단계과정으로만노스-6- 인산이형성된다. 한편만노스 -6- 인산이포함된당사슬을인식하는수용체에는두종류가존재한다. 양이온의존적만노스 -6- 인산수용체는 ~45 kda 정도의분자량으로 dimer 또는 tetramer 로작용하는반면에양이온비의존적수용체는 kda 정도의큰분자량을지니며만노스 -6- 인산외에도다른여러리간드에대한결합부위를가지고있다. 만노스 -6- 인산수용체는골지체에서만노스 -6- 인산을가지고있는당단백질에결합하여이를내포 (endosome) 를거쳐라이소좀으로이동시킨다. 그러나, 이때만노스 -6- 인산수용체와결합하지못한당단백질은세포밖으로분비되게된다. 이렇게분비된당단백질들을다시내포반응 (endocytosis) 을통해서라이소좀으로이동시키는 분비- 그림 5. 만노즈 -6- 인산신호를이용한치료용효소의라이소좀타겟팅. 라이소좀으로이동할당단백질들은우선 GlcNAc-PT 에의해서인식되어 GlcNAc- 인산이부가되고, uncovering 효소에의해서 GlcNAc 부분이제거되어서만노스 -6- 인산이만들어진다. 두종류의만노스 -6- 인산수용체 (MPR) 가존재하며각각 cationdependent (CD)-MPR 과 cation-independent (CI)-MPR 로불린다. (J Plant Biotechnol (2010) 37: ) 웹진 7 월

11 재도입 (secretion-recapture) 경로가존재하는데주로양이온비의존적만노스 -6- 인산수용체가그기능을한다. 바로이경로가효소대체요법이이용하는중요한기작이다 ( 그림 5). 환자들에게만노스 -6- 인산당사슬을가진효소를투여하면, 분비- 재도입경로를거쳐서정상효소가라이소좀으로이동하여축적된대사물질을대신분해해주는것이다. 따라서, 효소치료제는만노스 -6- 인산당사슬의부가를정밀하게제어하는것이품질관리에있어서매우중요하다. 만노스 -6- 인산당사슬을가진효소치료제로는파브리병을위한 Genzyme 사의 Fabrazyme 과 TKT와 Shire사의 Replagal, 폼페병을위한 Myozyme (Genzyme), 헌터증후군을위한 Elaprase (Shire), 뮤코다당침착증 I형을위한 Aldurazyme (Genzyme) 및 IV 형을위한 Naglazyme (Biomarin) 등이있다. 효소치료제중에서최대의매출을보이는고셔병치료제, Cerezyme 은다른효소치료제들과달리만노스 -6- 인산대신에당사슬의비환원말단이만노스로끝나는것이중요하다. 고셔병은 β-glucocerebrosidase 효소활성의결핍으로대식세포에 glucocerebroside 가축적되어생기는질환으로부풀어오른대식세포가간, 비장, 골수등의조직에쌓이면서심각한빈혈, 간비장비대및골괴사를수반한골격합병증이나타난다 년대에태반에서분리정제한 glucocerebrosidase 를환자에게투여하였을때처음에는일관된결과가나오지않았다. 이는외부에서투여한효소가대식세포의라이소좀으로이동하기위해서는대식세포의표면에있는만노스수용체와결합하여야하기때문이다. 따라서, 복합형당사슬을가지고있는효소에시알산분해효소 (sialidase), 갈락토스분해효소 (galatosidase) 및 hexosamine 분해효소 (hexosaminidase) 등을순차적으로처리해서당사슬말단에만노스를노출시킨후에야효과적인효소치료제 Ceredase 를개발하게되었다. 이후 CHO 세포에서 glucocerebrosidase 를재조합으로발현하고동일하게세개의당분해효소들을처리해서만노스가노출된당사슬을가지도록한효소치료제가 Cerezyme 이다. 결론 본논단에서는당단백질의약품을생산할때에고려하여야하는생산숙주의당질화경로와당사슬제어의중요성에관한소개를하였다. 당단백질의약품에있어서당사슬은치료효능, 체내지속성, 타겟팅및면역반응등의품질을결정하는주요인자이다. 그러나, 현재동물세포들에서당단백질을생산하는경우에비균질한형태의당사슬이부가되어문제가되고있다. 따라서, 국제수준의 ICH (International Conference on Harmonization) 가이드라인에서는당단백질의약품에부착된당사슬의비균질성을규명하고, 각배치마다재현성있게생산된다는것을증명하도록요구하고있다. 한국식품의약품안전청에서도국내바이오업체들의당분석수준을국제화시키고자 당단백질의약품의당구조분석시험법길라잡이 (2007 년 ) 와한국실정에부합하는 당단백질의약품의당구조특성분석및규격설정에관한가이드라인 (2009 년 ) 등을고시하며, 당분석의품질제어를강화해가고있다. 그리고, 2011 년 4월에는 N- & O-당사슬분석을위한분석시험법 핸드북을발간하였으며, 2009 년부터지속적인연구사업수행을통해서당분석향상을위한노력을기울이고있고, 2011 년에는 바이오의약품의기기분석을이용한 N- 및 O-당사슬분석법확립에관한연구 사업을수행하고있다. 당단백질의약품생산시에당사슬을제어하기위한노력들은앞으로도계속주목을받으며진보해갈것이다. 감사의글 본논단작성에도움을주신식약청첨단바이오제품과관계자여러분께감사드립니다. 참고문헌 1. Ghaderi D, Taylor RE, Padler-Karavani V, Diaz S, Varki A. (2010) Implications of the presence of N- glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic 11 분자세포생물학뉴스

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