Evaluation of Phoenix for AST of S. pneumoniae 213 mento, CA, USA) 이사용되고있다. 2000년에 Becton Dickinson에서포도알균, 장알균과그람음성세균의동정과항균제감수성검사를위한 Phoenix Automated

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1 대한진단검사의학회지제 29 권제 3 호 2009 Korean J Lab Med 2009;29:212-7 DOI /kjlm Original Article Clinical Microbiology 폐렴알균의항균제감수성검사를위한 Phoenix System 의평가 이교관 1 류남희 2 김성태 1 채석래 1 허희진 1 동국대학교일산병원진단검사의학과 1, 계명대학교의과대학진단검사의학교실 2 Evaluation of the BD Phoenix Automated Microbiology System SMIC/ID-2 Panel for Antimicrobial Susceptibility Testing of Streptococcus pneumoniae Kyo Kwan Lee, M.D. 1, Nam Hee Ryoo, M.D. 2, Sung Tae Kim, M.T. 1, Seok-Lae Chae, M.D. 1, and Hee Jin Huh, M.D. 1 Department of Laboratory Medicine 1, Dongguk University International Hospital, Goyang; Department of Laboratory Medicine 2, School of Medicine, Keimyung University, Daegu, Korea Background : With the emergence of antimicrobial resistance among Streptococcus pneumoniae, a more accurate and automated antimicrobial susceptibility testing method is essential. We evaluated the BD Phoenix Automated Microbiology System (Becton Dickinson Diagnostic Systems, USA) SMIC/ID-2 panel for antimicrobial susceptibility testing of S. pneumoniae. Methods : A total of 113 clinical strains of S. pneumoniae (88 penicillin susceptible strains, 8 intermediate strains, and 17 resistant strains by 2008 CLSI criteria) were tested. Minimum inhibitory concentrations (MICs) for penicillin, cefotaxime, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, trimethoprim/ sulfamethoxazole, tetracycline, and vancomycin were determined by Etest (AB Biodisk, Sweden) and Phoenix System. The results obtained by Phoenix system were compared to those obtained by Etest. Results : The overall essential agreement of MICs (within one dilution of MICs) defined by the Phoenix and Etest was 92.3%. Neither very major errors nor major errors were produced, and minor errors were 6.5%. Minor errors were frequently observed in susceptibility testings for penicillin (22.1%), cefotaxime (12.4%), and trimethoprim/sulfamethoxazole (11.5%). Conclusions : The Phoenix SMIC/ID-2 panel provided a simple and rapid susceptibility testing for S. pneumoniae, and the results were in a good agreement with those of Etest. The Phoenix system appears to be an effective automated system in clinical microbiology laboratories. (Korean J Lab Med 2009;29:212-7) Key Words : Streptococcus pneumoniae, BD Phoenix, Antimicrobial susceptibility test, Etest 서 론 폐렴알균 (Streptococcus pneumoniae) 은지역사회획득폐렴 Received : February 9, 2009 Manuscript No : KJLM2226 Revision received : April 1, 2009 Accepted : April 2, 2009 Corresponding author : Hee Jin Huh, M.D. Department of Laboratory Medicine, Dongguk University International Hospital, 814 Siksa-dong, Ilsandong-gu, Goyang , Korea Tel : , Fax : 을일으키는가장흔한원인균이며수막염과중이염의주요원인균이다 [1]. Penicillin에내성을보이는폐렴알균이증가함에따라일차선택약제로써 penicillin의사용이제한되고있으며 macrolides, fluoroquinolones에내성을보이는폐렴알균또한증가함에따라적절한항균제치료와병원균의전파를막기위해서는정확하고자동화된항균제감수성검사법이필요하다 [2-5]. 자동화된사슬알균의항균제감수성검사장비로는 Vitek-2 (biomerieux, Inc., Hazelwood, MO, USA) System과 Microscan MICroStrep plus panel (Dade Behring, West Sacra- 212

2 Evaluation of Phoenix for AST of S. pneumoniae 213 mento, CA, USA) 이사용되고있다. 2000년에 Becton Dickinson에서포도알균, 장알균과그람음성세균의동정과항균제감수성검사를위한 Phoenix Automated Microbiology system (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 을소개하였고, 최근에는사슬알균의동정과항균제감수성검사를위한 SMIC/ID 2-panel (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 이개발되어국내에소개되었다. 이방법은 16가지항균제에대하여간편하게최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 결과를얻을수있는방법이다. 이에저자들은 SMIC/ID-2 panel을이용하여폐렴알균의항균제감수성검사를시행하여그유용성을평가하고자하였다. 대상및방법 1. 대상균주 2005년 12월부터 2006년 11월까지동국대학교일산병원과계명대학교동산의료원환자의다양한임상검체에서분리된폐렴알균 113주를대상으로하였다. 균주들은객담 87주, 기관지세척액 8주, 혈액 6주, 소변 4주, 뇌척수액 2주등에서분리되었다. 항균제감수성검사상 Etest 기준으로 penicillin에대하여감수성 88주, 중간 8주, 내성 17 주였다. 단추모양의집락형태와 α용혈양상으로의심되는집락을선택한후폐렴알균을동정하는검사실의전통적인방법인그람염색, catalase 시험, optochin 디스크감수성, bile esculin 검사를시행하여폐렴알균을확인하였다. Phoenix SMIC/ID-2 panel을이용하여동정과항균제감수성검사를시행하였고, Phoenix 균주동정결과가검사실동정결과와일치하는경우감수성검사를위한대상검체로선택하였다. 균주들은 -70 에냉동보관였다가계대배양하여사용하였고, 검사방법의정도관리를위해서 penicillin에중등도내성을가진 S. pneumoniae ATCC 표준균주를사용하였다. 2. Phoenix SMIC/ID-2 panel을이용한항균제감수성검사폐렴알균의동정과항균제감수성검사는 Phoenix SMIC/ID- 2 panel 이용하여제조사의권장방법에따라시행하였다. 혈액한천배지에서 16-24시간동안 35 에서배양한균집락을 ID broth에풀어서 BD PhoenixSpec 혼탁측정기로 Mc- Farland 탁도로맞추고, 25 μl 를취하여항균제감수성검사 (AST-S) 지시약을한방울첨가한 AST-S 액체배지로옮긴후, SMIC/ID-2 panel에분주하고장비에장착하여대상균주의 MIC를측정하였다. 각항균제에대한감수성결과는 2008 CLSI 판정기준에따라감수성, 중간, 내성으로판정하였고, penicillin의경우뇌척수액에서분리된균주를제외하고비수막염정맥내기준에따라판정하였다 [6]. 3. Etest를이용한항균제감수성검사 Etest (AB Biodisk, Solna, Sweden) 는제조사의지침에따라시행하였다. Phoenix와비교하기위해사용된항균제는 penicillin, cefotaxime, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracycline, vancomycin 으로총 8가지였다. 혈액한천배지에서 16-24시간동안 35 에서배양한균집락을 Mueller-Hinton broth에풀어서 BD PhoenixSpec 혼탁측정기로 0.5 McFaland 탁도로맞추고, 5% 의면양혈액을첨가한 Mueller-Hinton agar (BBL, Sparks, MD, USA) 에접종하였다. Etest strip을놓은후, 35, 5% CO 2 에서 20-24시간배양한후 MIC를측정하였다. 제조사가제시한기준에따라 Etest MIC가 1/2 log2 농도인경우에는 Phoenix의 MIC와비교를위해다음높은 log2 MIC값으로올렸다. 각항균제에대한감수성결과는 2008 CLSI 판정기준에따라감수성, 중간, 내성으로판정하였고, penicillin의경우뇌척수액에서분리된균주를제외하고비수막염정맥내기준에따라판정하였다 [6]. 제조사가제시한기준에따라 erythromycin은 MIC가 1 μg/ml 이하를감수성, 2 μg/ml 중간내성, 4 μg/ml 이상을내성으로판정하였고 clindamycin은 MIC가 0.5 μg/ml 이하를감수성, 1 μg/ml를중간내성, 2 μg/ml 이상을내성으로판정하였다. 4. MIC 및판정결과의비교 Phoenix SMIC/ID-2 panel의 MIC 결과를 Etest의 MIC 결과와비교하였다. Phoenix SMIC/ID-2 panel의 MIC 결과와 Etest의 MIC 결과의차이가 2배이내의희석배수를보인경우일치한결과 (essential agreement) 로판정하였다. Phoenix SMIC/ID-2 panel의항균제감수성검사판정결과를 Etest의판정결과와비교하였다. 항균제감수성검사판정결과가일치하는경우범주일치 (categorical agreement), 한방법에서는내성혹은감수성결과를보였으나다른방법에서는중간내성인경우 minor error, Etest에서내성인결과를감수성으로판정한경우를 very major error 로, Etest에서감

3 214 이교관 류남희 김성태외 2 인 수성인결과를내성으로판정한경우를 major error 로정의하였다. Phoenix 항균제감수성결과와 Etest의감수성결과비교에서 very major error 와 major error 인경우는 Phoenix와 Etest 모두재검사하였고재검사한결과를최종결과로판정하였다. 결 총 113균주를대상으로항균제감수성검사를시행하였다. Etest 기준으로 penicillin 비감수성은 2008 CLSI 기준으로 22.1% ( 이전 CLSI 기준 83.2%) 였고 erythromycin 내성은 72.6% 로높았다. Cefotaxime과 levofloxacin 내성은 9.7% 로낮았으며 vancomycin 내성인균주는없었다 (Table 1). MIC 결과에서 Etest 결과에대한 Phoenix SMIC/ID-2 panel 결과의전체적인일치율은 92.3% 였다. Levofloxacin, tetracycline, vancomycin에대해서는각각한균주를제외하고는 Table 1. Antimicrobial susceptibility of 113 S. pneumoniae clinical isolates as determined by Etest 과 N (%) of isolates tested Susceptible Intermediate Resistant Cefotaxime 90 (79.7) 12 (10.6) 11 (9.7) Clindamycin 42 (37.2) 1 (0.9) 70 (61.9) Erythromycin 27 (23.9) 4 (3.5) 82 (72.6) Levofloxacin 100 (88.5) 2 (1.8) 11 (9.7) Penicillin 88 (77.9) 8 (7.1) 17 (15.0) (Former criteria) 19 (16.8) 44 (38.9) 50 (44.3) Tetracycline 29 (25.7) 0 84 (74.3) Trimethoprim/ 39 (34.5) 24 (21.2) 50 (44.3) Sulfamethoxazole Vancomycin 113 (100) 0 0 모두일치한 MIC 결과를보인반면, clindamycin (71.7%), penicillin (85%) 에대해서는비교적일치율이낮았는데 clindamycin의경우전체적으로 Phoenix의 MIC 결과가 Etest의 MIC 결과보다낮았다 (Table 2). 판정결과에서는 Phoenix SMIC/ ID-2 panel의범주일치율은 93.5% ( 이전 CLSI 기준 94.7%) 였다. Very major error와 major error는관찰되지않았으며 minor error는 6.5% ( 이전 CLSI 기준 5.3%) 였다. Minor error 는 penicillin 22.1% ( 이전 CLSI 기준 12.4%), cefotaxime 12.4 %, trimethoprim/sulfamethoxazole 11.5% 에서관찰되었다 (Table 3). Table 3. Interpretative category errors determined by Phoenix SMIC/ID-2 panel and Etest method N (%) of Interpretative category errors* CA Very major Major Minor Cefotaxime 99 (87.6) (12.4) Clindamycin 112 (99.1) (0.9) Erythromycin 109 (97.4) (3.6) Levofloxacin 111 (98.2) (1.8) Penicillin 88 (77.9) (22.1) Tetracycline 113 (100) Trimethoprim/ 100 (88.5) (11.5) Sulfamethoxazole Vancomycin 113 (100) Total (6.5) *, Very major error, resistant by the reference method but susceptible by Phoenix; major error, susceptible by the reference method but resistant by Phoenix; minor error, intermediate by one method but resistant or susceptible by the other., MICs obtained by Etest were interpreted by the manufacture s interpretative criteria., Penicillin MICs interpreted using nonmeningitis parenteral criteria except for CSF isolates. Abbreviation: CA, Categorical agreement. Table 2. Comparison of the MICs determined by Phoenix SMIC/ID-2 panel with those determined by Etest for S. pneumoniae clinical isolates N of MICs by Phoenix SMIC/ID-2 panel within indicated log2 of Etest MICs* < >+2 % Agreement (±1 dilution) Cefotaxime Clindamycin Erythromycin Levofloxacin Penicillin Tetracycline Trimethoprim/Sulfamethoxazole Vancomycin *, There were some off-scale MICs that could not be compared accurately. Abbreviation: MIC, minimum inhibitory concentration.

4 Evaluation of Phoenix for AST of S. pneumoniae 215 고찰국내의폐렴알균의 penicillin 비감수성률은 70-86% 로높으며 macrolides의내성률은 83.1% 로높다 [2-5]. 2008년 CLSI에서는폐렴알균감염에서 penicillin에대해새로운항균제감수성기준을발표하였다. 이전기준은 penicillin 투여경로와임상증상에상관없이감수성, 중간, 내성 MIC 기준이각각 0.06, , 2 μg/ml이었다. 새기준은임상적치료결과를반영하여비수막염경구용은변화가없으나비수막염정맥내는 MIC 기준이각각 2, 4, 8 μg/ml이고수막염정맥내는감수성과내성기준이 0.06, 2 μg/ml로바뀌었다 [6]. 비수막염폐렴알균감염에서 penicillin에대한감수성, 중간, 내성이이전기준에서각각 74.7%, 15.0%, 10.3% 에서새로운기준을적용하였을때각각 93.2%, 5.6%, 1.2% 로감수성비율이증가하였다는보고가있으며 [7], 본연구에서도 Etest에서 penicillin 비감수성은이전기준으로 83.2% 에서 2008 CLSI 비수막염정맥내기준으로 22.1% 로감수성비율이증가하였고 erythromycin 내성은 72.6% 로높았다. 따라서가장효과적인치료제선택을위해서는빠르고정확한항균제감수성검사방법이요구된다. 폐렴알균의항균제감수성검사에서디스크확산법은 penicillin 내성을선별할수있으나, oxacillin 억제대지름이 19 mm 이하인경우, penicillin 이외의 beta-lactam 계열항균제와뇌척수액에서분리된폐렴알균에대해서는 MIC를검사해야한다 [6]. CLSI 액체배지희석법은신뢰도는높지만검사과정이복잡하고많은노력이필요하여통상적인검사에이용하기어려운단점이있고, Etest는빠르고간편하게 MIC를측정할수있으나값이비싸다. Phoenix SMIC/ID-2 panel은 CLSI 미량액체배지희석법을이용하여균의동정은발색반응과형광신호를측정하고, 항균제감수성검사는균의성장을탁도변화와 AST-S 지시약의발색반응을 20분마다측정하여 16가지항균제의 MIC 측정이가능한검사이다. MIC 결과에서 Etest 결과와비교하여 Phoenix SMIC/ ID-2 panel 결과의전체적인일치율은 92.3% 이고범주일치율은 93.5% ( 이전 CLSI 기준 94.7%) 였다. Phoenix와 CLSI 미량액체배지희석법의 MIC와감수성을비교한연구들에서는일치율이 % 이고범주일치율이 % 로모두 90% 가넘었고, 약 820 임상균주를대상으로 13가지항균제의감수성을비교한연구한연구에서는항균제모두일치율이 96.2% 가넘었고범주일치율은 % 로높았는데 penicillin, cefepime, imipenem, meropenem 등 beta-lactam계항균제에서상대적으로높은 minor error율을보였다 [8-10]. 본연구와 같이 Phoenix SMIC/ID-2 panel을사용하여 Etest와비교한연구에서는일치율이 91.9%, 범주일치율이 95.0% 로본연구결과와비슷하였다 [11]. 본연구에서일치율을비교했을때 clindamycin이 71.7% 로가장낮았고전체적으로 Phoenix의 MIC결과가 Etest의 MIC결과보다낮았다. 이는 CLSI 미량액체배지희석법이대기배양인데비해 Etest는한천배지에 5% CO 2 배양을하고 ph가낮아져 penicillin, cefotaxime에서는큰영향을미치지못했지만 macrolides와 lincosamides 계열의항균제활성에영향을미쳐서 Etest의 MIC값이높아졌기때문이다 [12-14]. 그러나항균제감수성판정결과에서는 minor error 한균주를제외하고는모두감수성결과가일치해서불일치로인한임상적문제는적을것으로판단된다. 판정결과에서는 Phoenix SMIC/ID-2 panel 은 very major error와 major error는없었고 minor error는 6.5% ( 이전 CLSI 기준 5.3%) 였다. Minor error는 penicillin 22.1% ( 이전 CLSI 기준 12.4%), cefotaxime 12.4%, trimethoprim/sulfamethoxazole 11.5% 에서빈번하게관찰되었는데, minor errors 중 71.2% (42/59) 는변곡점경계에서두희석배수이내차이였다. Penicillin과 cefotaxime의경우 Etest의 MIC가 CLSI의미량액체배지희석법이나배지희석법에비해더낮게측정되는경향이있다고보고되었고 [15, 16], penicillin의경우 Phoenix 의 MIC가미량액체배지희석법보다높게측정된다고보고되었는데 [8], 본연구에서는 penicillin에서는 Phoenix의 MIC가 Etest의 MIC보다높은경우가더많았고 cefotaxime에서는낮은경우가더많았다. Trimethoprim/sulfamethoxazole의경우 Etest의결과와 CLSI 미량액체배지희석법의 MIC 결과의일치율이낮고, minor error가다소많다고보고되었는데본연구에서도그런경향을보였다 [17]. 일차비교에서 very major error가 7균주, major error가 2 균주나왔지만재검사결과감수성이일치하였는데, 불일치원인은 Phoenix가 7균주이고 Etest가 2균주였다. 균주의희석과정이 Phoenix의 MIC 결과에영향을주었을가능성이있기때문에정확한균농도측정이필요하다. Etest의항균제감수성판정시 clindamycin과 erythromycin의경우에는제조사의기준에따라 CLSI 기준보다각각 1 희석배수와 2 희석배수씩올려서판정하였고, 그결과 clindamycin의경우한균주에서 very major error가 minor error로바뀌었지만, erythromycin의경우 4균주에서 minor error가생겼다. 아직까지폐렴알균을대상으로자동화장비들을직접비교한연구는없지만 Vitek-2 System 의경우폐렴알균 100균주에대해미량액체배지희석법과비교하였을때일치율이 93.0% 이고 very major error 1.9%, major

5 216 이교관 류남희 김성태외 2 인 error 2.0%, minor error 8.6% 로 cefotaxime과 penicillin에서 minor error율이높았다고보고하였고, MicroScan MICro- STREP plus panel (Dade Behring) 의경우폐렴알균 75 균주에대해미량액체배지희석법과비교하여일치율이 93.0% 이고 very major error 0.7%, major error 0.7%, minor error 11.7% 로 meropenem (33.3%), ceftriaxone (29.3%), cefotaxime (16.0%), penicillin (12.0%) 에서 minor error율이높았다고보고하였다 [18, 19]. Vitek-2와 MicroScan은 Phoenix system과비교하여전체적인일치율, very major error와 major error율은비슷하였고 meropenem, ceftriaxone, cefotaxime 항균제에서 minor error율이더높았다. 본연구에서는참고방법으로 Phoenix와비교하기위해 Etest 를이용하였는데일치율이나감수성결과에차이가있을수있기때문에정확한비교를위해서는 CLSI 미량액체배지희석법과의비교를고려해볼수있다. Phoenix SMIC/ID-2 panel을이용한폐렴알균항균제감수성검사는빠르고간편하게 MIC를얻을수있을뿐만아니라, Etest와비교하여대부분의항균제에서높은일치율을보여임상미생물검사실에서유용하게쓰일수있는자동화검사법으로생각된다. 요약배경 : 항균제에내성을보이는폐렴알균 (Streptococcus pneumoniae) 이증가함에따라적절한항균제치료를위해서는정확하고자동화된항균제감수성검사법이필요하다. 본연구에서는 BD Phoenix Automated Microbiology system (Beckton Dickinson Diagnostic Systems, USA) 의 SMIC/ID-2 panel 을이용하여폐렴알균의항균제감수성검사를시행하여그유용성을평가하고자하였다. 방법 : 다양한임상검체에서분리된폐렴알균 113주 (2008 CLSI 판정기준으로 penicillin 감수성 88주, 중간 8주, 내성 17 주 ) 를대상으로하였다. Penicillin, cefotaxime, clindamycin, erythromycin, levofloxacin, trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracycline, vancomycin의 8가지항균제에대해 Etest (AB Biodisk, Sweden) 와 Phoenix를이용한항균제감수성검사를시행한후두방법에의해얻어진최소억제농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC) 를비교분석하였다. 결과 : Etest와비교하여 Phoenix system의 MIC의전체적인일치율은 92.3% 이었다. Very major error와 major error 는관찰되지않았으며 minor error는 6.5% 였다. Minor error 는 penicillin (22.1%), cefotaxime (12.4%), trimethoprim/sulfamethoxazole (11.5%) 에서빈번하게관찰되었다. 결론 : Phoenix SMIC/ID-2 panel을이용한폐렴알균항균제감수성검사는빠르고간편하게 MIC를얻을수있을뿐만아니라, Etest와비교하여대부분의항균제에서높은일치율을보여임상미생물검사실에서유용하게쓰일수있는자동화검사법으로생각된다. REFERENCES 1. Spellerberg B and Brandt C. Streptococcus. In: Murray PR, Baron EJ, et al., eds. Manual of clinical microbiology. 9th ed. Washington DC: ASM press, 2007: Kang ES, Kim KH, Lee SY, Hong KS. Surveillance for antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae among children of attending day Care Centers in Seoul. Korean J Clin Pathol 2000;20: ( 강은숙, 김경효, 이수연, 홍기숙. 서울지역유아원어린이들에서분리된 Streptococcus pneumoniae의항균제내성조사. 대한임상병리학회지 2000;20: ) 3. Lee NY, Song JH, Kim S, Peck KR, Ahn KM, Lee SI, et al. Carriage of antibiotic-resistant pneumococci among Asian children: a multinational surveillance by the Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens (ANSORP). Clin Infect Dis 2001;32: Waites KB, Jones KE, Kim KH, Moser SA, Johnson CN, Hollingshead SK, et al. Dissemination of macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae isolates containing both erm(b) and mef(a) in South Korea. J Clin Microbiol 2003;41: Lee H, Yong D, Lee K, Hong SG, Kim EC, Jeong SH, et al. Antimicrobial resistance of clinically important bacteria isolated from 12 hospitals in Korea in Korean J Clin Microbiol 2005;8: ( 이혁민, 용동은, 이경원, 홍성근, 김의종, 정석훈등. 2004년도국내 12개병원에서분리된주요세균의항균제내성율. 대한임상미생물학회지 2005; 8:66-73.) 6. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Eighteenth informational supplement, M100-S18. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Effects of new penicillin susceptibility breakpoints for Streptococcus pneumoniae-- United States, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2008;57:

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